HMELJARSKI BILTEN (HOP BULLETIN), 12(2005), strani (pages) 43 - 48	43
IDENTIFIKACIJA SLOVENSKIH SORT HMELJA Z MIKROSATELITSKIMI MARKERJI
Andreja ČERENAK1, Jernej JAKŠE2
UDK/UDC 633.791 : 522.524 (497.4) (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 17. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005
IZVLEČEK
V članku je za identifikacijo slovenskih sort hmelja prikazana uporaba mikrosatelitskih markerjev. V molekulski analizi je bilo analiziranih šestnajst genotipov s tremi pari začetnih oligonukleotidov. Narejena je shema identifikacije sort na osnovi podatkov polimorfnih mikrosatelitov, uporabna za žlahtnitelje hmelja, trgovce in pivovarje.
Ključne besede: hmelj, mikrosatelitski markerji, identifikacija sort
IDENTIFICATION OF SLOVENE HOP VARIETIES USING MICROSATELLITE MARKERS
ABSTRACT
The article reports on the use of microsatellite markers for identification of Slovene varieties. Sixteen genotypes were analysed using three primer pairs for the molecular analysis. A scheme of cultivar identification based on polymorphic microsatellite data is provided which can be used by for hop breeders, merchants, and brewers.
Keywords: hop, microsatellite markers, variety identification
1	dr. znanosti, Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije, Cesta Žalskega tabora 2, SI-3310 Žalec
2	doc., dr. znanosti, Katedra za genetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, Biotehniška Fakulteta, Jamnikarjeva 101, SI-1000 Ljubljana
44	Andreja CERENAK, Jernej JAKŠE
1	UVOD
Zanesljivo ločevanje sort hmelja in ugotavljanje sortne čistosti je v hmeljarstvu zelo pomembno. Nujno potrebno je na številnih področjih panoge, od pridelave, žlahtnjenja, trgovine hmelja do pivovarske industrije. Žlahtnitelji potrebujejo uporabno identifikacijsko orodje za ločevanje sort in posledično uveljavljanje svojih žlahtniteljskih pravic, hmeljarji pa želijo sortno čista hmeljišča za zagotavljanje optimalne pridelave hmelja. Identifikacija sort je pomembna v pivovarstvu, saj sta grenčica in aroma piva neposredno pogojeni z izvorom hmelja.
Za potrjevanje identitete hmeljnih sort se uporablja več tradicionalnih metod na podlagi vrednotenja fenotipa rastline. Že v šestdesetih letih prejšnjega stoletja je Davis [4] predlagal sedem morfoloških značilnosti rastlin za ločevanje sort hmelja. Fenotipska vrednotenja so se v nadaljnjih letih izpopolnjevala in so postala zelo učinkovita, njihova glavna slabost je dolgotrajnost opazovanj. Poleg tega so fenotipske ocene močno pod vplivi okolja kot so rastni pogoji, področje gojenja in tudi čas opazovanj. Vzadnjih 40 letih je bil povečan interes v smeri razvoja identifikacijskih metod na podlagi kemijskih analiz eteričnih olj in grenčičnih komponent hmelja, sestava katerih je genetsko konrolirana [9, 13, 14, 16]. Proučevanje sestave eteričnih olj poteka na IHPS že od leta 1982. S primerjavo organoleptičnega ocenjevanja genotipov, vključenih v poskus v Žalcu in na sorodnem inštitutu v Nemčiji (Institut für Hopfenforshung, Hüll) so ugotovili, daje le-to precej subjektivno, saj so skladne rezultate dosegli le pri 62 % vzorcev. Variabilnost eteričnih olj je intenzivno proučevala Kraljeva s sod. [11], rezultat česar je med drugim razvit min-max model, sistem za klasifikacijo 95 hmeljnih kultivarjevv 14 skupin z uporabo 31 deskriptorjev. Vzadnjih letih so bile v model dodane 3 nove nemške sorte [8], ista avtorja pa sta določila 5 slovenskih komercialno najbolj zanimivih sort hmelja z vključitvijo 78 hmeljnih vzorcev iz različnih področij gojenja v Sloveniji [10]. Vsekakor je večina identifikacij narejenih z uporabo kemijskih analiz svežih ali procesiranih produktov hmelja, na drugi strani pa razvoj metod molekularne genetike vodi k novim alternativam in pristopom.
Tehnika naključno nanožene polimorfne DNA (RAPD) [1, 7], sekvenčno označena mesta (STS) [2], polimorfizem dolžine pomnoženih restrikcijskih fragmentov (AFLP) [5, 15] in mikrosateliti oz. enostavne ponavljajoče se sekvence (SSR) [3, 6] so metode, ki so do neke mere že bile uporabljene za identifikacijo sort hmelja. Zaradi velike ponovljivosti in primerljivosti rezultatov med različnimi laboratoriji so najbolj obetavni mikrosatelitski markerji, predvsem zaradi robustnosti, enostavne izvedbe amplifikacije in visoke stopnje polimorfnosti. Mikrostelitska DNA sestoji iz zaporedja majhnih ponavljajočih se enot, običajno dolgih 1 do 6 baznih parov, ki so razpršene po celotnem eukariotskem genomu. Polimorfizem mikrosatelitov predstavlja dolžina osnovnega motiva ter število tandemskih ponovitev, ki se lahko enostavno določijo s pomnoževanjem v polimerazni verižni reakciji (PCR). Rezultat kombinacije podatkov več visoko polimorfnih mikrosatelitskih lokusov so individualni alelni profili, ki omogočajo ločevanje genotipov.
Cilj našega dela je bilo zagotoviti sistem identifikacije slovenskih sort hmelja z mikrosatelitskimi markerji. Rezultati dela bodo lahko uporabni za identifikacijo sort ne glede na razvojno stopnjo rastline.
IDENTIFIKACIJA SLOVENSKIH SORT HMELJA Z MIKROSATELITSKIMI MARKERJI	45
2 MATERIAL IN METODE
2.1	Material
V analizo smo vključili vse slovenske sorte hmelja (Aurora, Ahil, Atlas, Apolon, Blisk, Buket, Bobek, Celeia, Cerera, Cicero, Cekin in Savinjski golding) ter štiri tetraploide, pridobljene s kolhicinskim tretiranjem sort Ahil, Apolon, Atlas in Savinjski golding.
2.2	Izolacija DNA
Za izolacijo celokupne genomske DNA hmelja smo uporabili metodo CTAB po uveljavljenem protokolu [12]. Iz svežih, mladih listov hmelja, ki smo jih nabrali v kolekcijskem nasadu na IHPS, smo vzeli približno 1-2 cm2 rastlinskega tkiva in gavterilnici dobro homogenizirali ob dodatku 1 ml CTAB ekstrakcijskega pufra [2 % (w/v) CTAB, 1,4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 % (v/v) -merkaptoetanol], predhodno segretega na 68oC. Vzorce smo ekstrahirali z mešanico fenola, kloroforma in izoamilalkohola v razmerju 25:24:1. DNA smo oborili z dodatkom 1/10 volumna 3 M Na-acetata (pH 5,2, uravnan z ocetno kislino) in z enim volumnom ledeno-hladnega izopropanola. Usedlino (zgoščeno DNA) smo sprali s 70 % etanolom in jo raztopili v TE pufru [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA(pH 8,0)] in vzorce shranili pri 4oC. Koncentracijo DNAsmo izmerili s pomočjo mini fluorometraTK0100 (Hoefer Scientific, San Francisco, ZDA).
2.3	Namnoževanje mikrosatelitskih markerjev
Za namnoževanje mikrosatelitskih lokusovsmo uporabili predhodno objavljene pare začetnih oligonukleotidov [3]. Lokusno specifični začetni oligonukleotidi so bili izdelani pri MWG-Biotech (Ebersberg, Nemčija). PCR reakcija je vsebovala 50 ng genomske DNA, 1 enoto Taq DNA polimeraze (Boehringer Mannheim, Nemčija), 1x PCR pufer (10 mM Tris-HCl, 1,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, pH 8,3), 0,5 mM koncentracijo vsakega začetnega oligonukleotida in0,2 mM koncentracijo vsakega deoksinuklotidtrifosfata (Boehringer Mannheim, Nemčija). Po 3 minutni denaturaciji pri 94oC je sledilo 26 ciklovs ponavljanjem:
■	45 sekund pri 94oC
■	30 sekund pri 55oC
■	90 sekund pri 72oC
s končno inkubacijo vzorcev 7 minut pri 72oC v Perkin Elmer 480 cikličnem termostatu.
2.4	Zaznavanje namnožene DNA
Namnožene mikrosatelitske markerje smo ločili z uporabo vertikalne denaturacijske poliakrilamidne gelske elektroforeze (S2; Life Technologies, Carlsbad, California). Po pravilnem tretiranju obeh plošč smo med plošči nanesli denaturacijski poliakrilamidni gel pripravljen iz 7,5 M uree, 1x TBE elektroforetskega pufra in 5% raztopine akrilamid: bisakrilamid, pripravljene iz 40% založne raztopine z razmerjem 19:1. Raztopino smo po filtraciji vakumirali, pred vlitjem gela pa smo dodali 0,5 mI TEMED-a in 2 mI 10% amonpersulfata. Elektroforeza in zaznavanje namnožene DNA po barvanju s srebrom sta potekala po protokolu Promega Silver Sequence™ z manjšimi modifikacijami [6].
44	Andreja CERENAK, Jernej JAKŠE
Dolžina alelov je bila določena s primerjavo z dolžinskimi AFLP 10 bp dolgimi fragmenti. Najdaljši alel je bil označen s črko A, sledili so mu krajši aleli, označeni z naslednjimi črkami abecede.
3 REZULTATI IN DISKUSIJA
Pri vseh namnožitvah smo dobili jasne in nedvoumne DNA produkte. Prisotnost dveh fragmentov na enem lokusu smo smatrali za heterozigoten genotip in namnožitev le enega fragmenta za homozigotno stanje (Slika 1). Prisotnosti treh alelov nismo zasledili, kar je v skladu s pričakovanji, saj triploidi niso bili vključeni v raziskavo.
Preglednica 1: Dolžina alelov na mikrosatelitskih lokusih vbaznih parih Table 1:	Length of alleles at microsatellite loci in base pairs
			Aleli		
Lokus	A	B	C	D	E
5-2	184	182	180	178	166
11a59	196	194	184		
3a88	198	194			
Predstavljena raziskava je del širše zasnovanega proučevanja genotipov z več mikrosatelitskimi markerji. V članku je izpostavljena shema določevanja slovenskih sort hmelja v primeru, da je potrebno analizirati hmeljni vzorec neznanega porekla. Z uporabo lokusa 5-2, ki smo ga uvrstili na začetek določevanja sort, smo slovenske sorte razdelili na 7 enot. Sorte Atlas, Ahil, Blisk in Celeia so bile s specifičnim genotipom določene že v prvi fazi analize. Velika večina ostalih sort je bila ločenaz namnoževanjem na lokusu 11a59, pri čemer smo na tej stopnji uspešno določili sorte Aurora, Apolon, Buket, Bobek, Cekin, Cicero in Cerera. Slednjo sorto, Savinjski golding smo določili z lokusom 3a88. Vsi tetraploidni genotipi, dobljeni stretiranjem s kolhicinom so imeli elektroforetski profil enak diploidnemu donorju, zato v skladu s pričakovanji niso bili ločljivi. Njihovo ločevanje za samo panogo ni pomembno, saj setetraploidivslovenskih hmeljiščih ne pridelujejo.
Zaključimo lahko, da so mikrosatelitski markerji uspešen markerski sistem za ločevanje slovenskih sort hmelja. Poudariti je potrebno, da je za analizo primeren katerikoli del rastline ne glede na stopnjo razvoja, na rezultat analize pa ne vpliva področje gojenja in drugi vplivi okolja.
IDENTIFIKACIJA SLOVENSKIH SORT HMELJA Z MIKROSATELITSKIMI MARKERJI	45
Slika 1: Shema identifikacije slovenskih sort hmelja z mikrosatelitskimi markerji. Krogi označujejo genotip (preglednica 1), romboidi palokuse, uporabljene vanalizi.
Figure 1: Flowchart for the identification of Slovene varieties using microsatellite markers. Circles indicate obtained genotypes (Table 1) and rhomboids indicate loci used in analysis.
4 VIRI
1.	Abbot, M.S., Fedele, M.J., A DNA-based varietal identification procedure from hop leaf
tissue.-J. Inst. Brew. 100 (1994), s. 283-285.
2.	Araki, S., Tsuchiya, Y., Takashio, M., Tamaki, T., Shinotsuka, K., Identification of hop
cultivars by DNA marker analysis.- J. Amer. Soc. Brew. Chem. 56 (1998), s. 81130.
3.	Brady, J.L., Scott, N.S., Thomas, M.R., DNA typing of hops (Humulus lupulus) through
application of RAPD and microsatellite marker sequences converted to sequence tagged sites (STS).-Euphytica 91(1996), s. 277-284.
4.	Davis, E.L., Variation in cultivated varieties of Humulus lupulus L. and its relation to the
possible sources of these varieties. - Doct. Diss. Ser., Publ. no. 17(1956), Univ. microfilms, Ann Arbor, Michigan.
44	Andreja CERENAK, Jernej JAKŠE
5.	Hartl, L., Seefelder, S., Diversity of selected hop cultivars detected byfluorescentAFLPs.-
Theor. Appl. Genet. 96(1998), s. 112-116.
6.	Jakše, J., Kindlhofer, K., Javornik, B., Assessment of genetic variation and differentiation
of hop (Humulus lupulus L.) genotypes by microsatellite and AFLP markers.-Genome 44(2001), s. 773-782.
7.	Jakše, J., Šuštar-Vozlič, J., Javornik, B., Identification of hop cultivars by RAPD markers.-
Proc. Int. Colloq. Impact Plant Biotech. Agric., Rogla, Slovenia, 5-7 December 1994. Ljubljana, Centre for Plant Biotechnology and Breeding, University of Ljubljana, Agronomy Department, s. 147-151.
8.	Kač, M., Kovačevič, M., Solid phase microextraction of hop volatiles. Potential use for
determination and verification of hop varieties.- J. Cromatogr. A 918 (2001), s. 159167.
9.	Kenny, S.T., Identification of US-grown hop cultivars by hop acid and essential oil
analysis.-J. Amer. Soc. Brew. Chem. 48(1988), s. 3-8.
10.	Kovačevič, M., Kač, M., Determination and verification of hop varieties by analysis of
essential oils. -Food Chem. 77(2002), s. 489-494.
11.	Kralj, D., Zupanec, J., Vasilj, D., Kralj, S., Pšeničnik, J., Variability of essential oils of
hops, Humulus lupulus L. - J. Inst. Brew. 97(1991), s. 197-206.
12.	Kump B., Svetek S., Javornik B., Izolacija visokomolekularne DNK iz rastlinskih tkiv.-
Zbornik Biotehniške Fakultete Univerze v Ljubljani, Kmetijstvo, 59(1992), s. 63-66.
13.	Lemmens, G.W.C., The breeding and parentage of hop varieties.- Brew. Dig. May
(1998),s. 16-26.
14.	Perpete, P., Varietal Discrimination of hop pellets by essential oil analysis I. Comparison
of fresh samples.- J. Amer. Soc. Brew. Chem. 56(1998),s. 104-108.
15.	Townsend M.S., Henning J.A., Moore, D.L., AFLP analysis of DNA from Dried Hop
Cones.-Crop Sci. 40(2000), s. 1383-1386.
16.	Wagner, T., The quantity and composition of bitter resins chemotaxonomic
characteristics of hop varieties.-Pharm. J. Slov. 34(1983), s. 77-83.