I-39 Strokovni prispevek/Professional article KONCENTRACIJE NEKATERIH DEJAVNIKOV ANGIOGENEZE V SERUMU PRI DISEMINIRANEM PLAZMOCITOMU: VEGF, bFGF in MMP-9 SERUM CONCENTRATIONS OF SOME ANGIOGENEIC FACTORS IN MULTIPLE MYELOMA: VEGF, bFGF IN MMP-9 Mojca Modic, Jana Kralj, Lara Čibej, Uroš Mlakar Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana Prispelo 2004-02-26, sprejeto 2004-03-05; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 39–42 Keywords: vascular endothelial growth factor; basic fibro- blast growth factor; matrix metalloproteinase-9; multiple myeloma Abstract – Background. Angiogenesis is a crucial process in progression of multiple myeloma. Vascular endothelial growth factor (VEGF), and basic fibro- blast growth factor (bFGF) are multifunctional cytokines that stimulate angiogenesis and myeloma growth. Matrix metallo- proteinase 9 (MMP-9) plays a critical role in osteolytic bone destruction, angiogenesis and invasive growth of myeloma cells. We evaluated serum concentrations of these factors in patients with multiple myeloma. Methods. Levels of active and pro-matrix metalloproteinase 9 (total MMP-9), basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were determined with a commercial quantitative enzyme immunoassay Quantikine (R&D Systems, USA). All of these factors were measured in the serum obtained from pheripheral blood of 36 patients affected by multiple myeloma.This series included 12 patients with disease in plateau phase and without treat- ment, 14 patients on Thalidomide therapy and 10 patients at the beginning of chemotherapy because of active disease. Results. VEGF showed a strong correlation with MMP-9 while VEGF and bFGF did not correlate with each other. Blood platelets correlated with VEGF and MMP-9.The concentration of MMP-9 and VEGF were the highest in group of patients with active disease where the chemotherapy started. The level of bFGF was the lowest in the group devoid of treatment (plateau phase of disease). Conclusions. Production of the angiogenic factors such as VEGF, bFGF and MMP-9 are increased in multiple myeloma patients. The levels of these factors correlate with the activity of disease. Ključne besede: vaskularni endotelijski rastni dejavnik; bazični fibroblastni rastni dejavnik; matriks metaloproti- naza-9; diseminirani plazmocitom Izvleček – Izhodišča. Angiogeneza ima pomembno vlogo v patogenezi in napredovanju diseminiranega plazmocitoma (DP). Žilni endotelijski rastni dejavnik A (VEGF-A) in bazič- ni fibroblastni rastni dejavnik (bFGF, FGF2) sta citokina, ki spodbujata angiogenezo in delitev plazmocitomskih celic. Ma- triks metaloproteaza-9 je encim, ki razgrajuje zunajcelični matriks. Njegovo delovanje je pomembno pri angiogenezi, širjenju celic novotvorbe v sosednje tkivo in za osteolitično razgradnjo kosti pri plazmocitomu. V naši raziskavi smo ana- lizirali serumske koncentracije omenjenih dejavnikov pri DP. Preiskovanci in metode. Koncentracije VEGF-A, bFGF in MMP- 9 smo določili pri 36 bolnikih z DP. Dvanajst bolnikov z DP v obdobju določanja dejavnikov angiogeneze ni potrebovalo zdravljenja, 14 bolnikov je prejemalo talidomid. Pri desetih bolnikih z razširjeno boleznijo smo določili angiogenetične dejavnike tik pred ali kmalu po začetku zdravljenja s citosta- tiki. Serumske koncentracijo MMP-9, VEGF-A in bFGF smo določili na encimsko imunski način z reagenčnimi kompleti Quantikine (R&D Systems, USA). Rezultati. Koncentraciji MMP-9 in VEGF sta bili največji v skupini bolnikov z aktivno boleznijo. Koncentracija bFGF je bila najmanjša pri bolnikih, ki niso potrebovali zdravljenja, ker je bila bolezen v obdobju remisije. Ugotovili smo dobro statistično povezanost med MMP-9 in VEGF. Koncentraciji VEGF in bFGF nista bili medsebojno povezani. Število trom- bocitov pa je bilo povezano z VEGF in MMP-6. Zaključki. Določanje dejavnikov angiogeneze je pomembno pri oceni aktivnosti bolezni. Koncentracije teh dejavnikov so večje pri bolnikih z aktivno razširjeno boleznijo. Uvod Angiogeneza je nastajanje novih kapilar iz obstoječih krvnih žil. Pomembna je za razvoj in rast otroka pred in po rojstvu, pri odrasli ženski pa pri ovulaciji, menstruaciji in razvoju placente. V patoloških okoliščinah igra angiogeneza pomembno vlogo pri celjenju ran, v patogenezi proliferativne retinopatije, rev- matoidnega artritisa in nastanku novotvorb. Angiogeneza omo- goča rast novotvorbe, vdor v sosednje tkivo in nastanek zasev- ZDRAV VESTN 2004; 73: I-39–42 I-40 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I kov. Poteka v več stopnjah: razkroj zunajceličnega matriksa (razgradnja bazalne membrane), migracija, proliferacija in di- ferenciacija endotelijskih celic. Posledica opisanih sprememb je nastanek novih kapilar. Pri razgradnji zunajceličnega matri- ksa, ki omogoči migracijo endotelijskih celic, sodelujejo različ- ne proteaze. Proces angiogeneze uravnavajo številni citokini. Pomembno vlogo pri začetku angiogeneze imata žilni endote- lijski rastni dejavnik A (VEGF-A) in bazični fibroblastni rastni dejavnik (bFGF, FGF2). VEGF-A je glavni predstavnik družine žilnih endotelijskih rast- nih dejavnikov. To je rastni dejavnik, pomemben za preživetje in rast endotelijskih celic. Poleg spodbujanja k delitvi, spodbu- ja tudi migracijo in zavira apoptozo endotelijskih celic. Izločajo ga številne celice, razen endotelijskih. VEGF je glikoprotein z vezalnim mestom za heparin. Ta mu omogoča vezavo na zu- najcelični matriks in olajša povezavo z receptorji na celicah. Fibroblastni rastni dejavniki so skupina citokinov, ki so udele- ženi v angiogenezi in hematopoezi. Najpomembnejši pred- stavnik je bFGF. Proizvajajo ga megakariociti, trombociti, en- dotelijske celice, limfociti T, makrofagi in fibroblasti. Spodbuja zorenje teh celic, med drugimi tudi endotelijskih (1, 2). Matriks metaloproteaze (MMP) so endopeptidaze z atomom cinka na katalitičnem mestu. Razgrajujejo različne sestavine zunajceličnega matriksa in imajo pomembno vlogo pri migra- ciji normalnih in rakavih celic. Glavni izvor MMP so makrofagi. Nastajajo tudi v celicah vezivnega tkiva, endotelijskih celicah in celicah malignih tumorjev. Delovanje MMP se uravnava na treh ravneh: z vplivom na prepisovanje DNK, z aktivacijo proenci- ma in z zaviranjem aktiviranih encimov (tkivni inhibitorji MMP, TIM) (3). Tako kot v drugih tkivih je delitev in zorenje mieloičnega in limfatičnega tkiva odvisno tudi od njihovega ožilja. V zadnjem času se posveča vedno večja pozornost angiogenezi pri mielo- ičnih in limfatičnih novotvorbah. Z našim delom smo želeli določiti referenčne vrednosti serum- skih koncentracij treh dejavnikov angiogeneze (VEGF-A, FGF2 in MMP-9) in analizirati koncentracije omenjenih dejavnikov pri skupini bolnikov z diseminiranim plazmocitomom (DP). Preiskovanci in metode Za določitev referenčnih vrednosti smo naključno izbrali 79 zdravih oseb, ki so darovale kri na krvodajalskih akcijah na Zavodu RS za transfuzijo krvi. Povprečna starost preiskovanih oseb je bila 38 let (19–63 let). Koncentracije VEGF-A, bFGF in MMP-9 smo določili tudi pri 36 bolnikih (18 moških, 18 žensk) z DP. 25 bolnikov je imelo DP IgG, 6 DP IgA in 5 Bence-Jonesovo vrsto DP. Mediana starosti je bila 69 let (45–92 let). Bolniki z DP so bili v različnih obdob- jih bolezni in zdravljenja. Štirim bolnikom z novo-odkritim simp- tomatičnim DP smo določili koncentracije angiogenetičnih de- javnikov pred začetkom zdravljenja. Šest bolnikov je že preje- malo citostatike (5 bolnikov melfalan, 1 bolnik VAD). Štirinajst bolnikov je prejemalo talidomid. Dvanajst bolnikov zdravlje- nja ni potrebovalo, ker je bila bolezen v obdobju izboljšanja. Pet od teh bolnikov je bilo po avtologni presaditvi krvotvornih matičnih celic. Za določitev celotne (proencim in encim) koncentracije MMP- 9 (gelatinaza, kolagenaza za kolagen IV), VEGF-A in bFGF v serumu smo uporabili 5 ml krvi, ki smo jo odvzeli v epruvete za vakumski odvzem. Epruvete smo pustili 30 minut pri sobni temperaturi, da se je kri strdila. Nato smo vsebino epruvete centrifugirali, serum prenesli v drugo epruveto in ga zamrznili na –20 °C. Pripravljene vzorce smo analizirali po 30 dneh. Pred analizo smo vzorce odtalili na sobni temperaturi. Koncentracijo MMP-9, VEGF-A in bFGF smo določili na encim- sko imunski način z reagenčnimi kompleti Quantikine (R&D Systems, USA). Način uporablja na steno mikrotiterskih plošč pritrjena monoklonska protitelesa in z encimom označena po- liklonska protitelesa proti humanemu MMP-9, VEGF-A ali bFGF. Pri vsaki seriji preiskav smo napravili umeritvene krivu- lje s pomočjo raztopin znanih koncentracij rekombinantnega humanega MMP-9, VEGF-A in bFGF. Vzorce in standarde smo določili dvakrat. Ker slina vsebuje velike koncentracije MMP- 9, VEGF in bFGF smo pri določanju uporabili zaščitne obrazne maske in rokavice. Spodnja meja ločljivosti metode, ki jo nava- ja proizvajalec, je za MMP-9 0,156 ng/ml, za VEGF 9,0 pg/ml in za bFGF 3 pg/ml. Medsebojno povezanost spremenljivk smo ugotavljali s Spe- armanovim koeficientom korelacije (r). Razlike med posame- znimi skupinami bolnikov smo ugotavljali z Mann-Whitneye- vim poskusom. Rezultati Mediana, prvi in tretji kvartil izmerjenih koncentracij pri zdra- vih osebah so prikazani v razpredelnici 1. Za zgornjo referenč- no vrednost smo izbrali 95.centil. Razpr. 1. VEGF, bFGF, MMP-9 pri 79 zdravih osebah. Table 1.VEGF, bFGF, MMP-9 in 79 healthy persons. Me Q1 Q3 95. centil VEGF pg/ml 259 125 425 788 bFGF pg/ml 0 0 0 3,2 MMP-9 ng/ml 315 231 448 748 Me – mediana / median, Q1 – prvi kvartil / first quartile, Q3 – tretji kvartil / third quartile Pri bolnikih z DP smo ugotovili dobro povezavo med VEGF in MMP-9. Število trombocitov je bilo povezano z VEGF in MMP- 6. Koncentracija monoklonskega imunoglobulina (MIg) v se- rumu je bila soodvisna s koncentracijo beta2-mikroglobulinom (B2M) in albuminov (Razpr. 2). Razpr. 2. Povezave med nekaterimi parametri pri bolnikih z diseminiranim plazmocitomom. Table 2. Correlations between some parameters in patients with multiple myeloma. Korelacija ρ p VEGF – MMP9 0,61 < 0,01 VEGF – Tr 0,67 < 0,01 MMP9 – Tr 0,48 0,03 MIg – B2M 0,45 0,01 MIg – Alb –0,46 0,01 ρ – Spearmanov koeficient korelacije / Spearman’s coefficient of correlation p – statistična značilnost / statistic significance Vrednosti angiogenetičnih dejavnikov pri treh skupinah bolni- kov so prikazane v razpredelnici 3. V prvi skupini (DP kem ) so bili novo-odkriti bolniki z razširjenim simptomatičnim DP tik pred začetkom zdravljenja in bolniki, pri katerih smo začeli zdravlje- nje s citostatiki. V drugi skupini (DP tal ) so bili bolniki z razširjeno boleznijo, ki so prejemali talidomid. V tretjo skupino (DP 0 ) smo uvrstili bolnike, pri katerih zdravljenje ni bilo potrebno, ker je bila bolezen v obdobju remisije. Ta skupina se je statistično po- membno razlikovala od skupine DP tal , in skupine DP kem po majhni koncentraciji bFGF (Mann-Whitneyev poskus, p < 0,05). Skupi- na bolnikov DP tal pa se je razlikovala od skupine DP kem po manjši koncentraciji MMP-9 (p < 0,05). Povečano koncentracijo VEGF nad referenčno vrednostjo so imeli trije bolniki (3/10) v skupini DP kem , dva bolnika (2/14) v DP tal in trije bolniki (3/12) v DP 0 . MMP-9 je bila povečana samo pri treh bolnikih v skupini DP kem . Koncentracija bFGF je bila I-41 povečana pri petih bolnikih (5/10) v DP kem , sedmih (7/14) v DP tal in dveh (2/12) v DP 0 . Pri dveh bolnikih z novo-odkritim simptomatičnim DP so bile sočasno povečane koncentracije VEGF (> 1200 pg/ml), bFGF (> 10 pg/ml) in MMO-9 (> 1000 pg/ml). Sočasno povečanje VEGF in MMP-9 smo ugotovili tudi pri bolniku med zdravlje- njem s citostatiki. Razpr. 3. VEGF, bFGF in MMP-9 glede na način zdravljenja. Table 3. VEGF, bFGF in MMP-9 in three groups of patients. Zdravljenje N VEGF bFGF MMP-9 mediana mediana mediana DPkem 10 560 4,3 253 DP Tal 14 386 3,3 80 DP 0 12 304 0,6 138 DP kem – bolniki na kemoterapiji in novoodkriti pred kemoterapijo, DP Tal – Tali- domid, DP 0 – bolniki brez zdravljenja, N – število bolnikov, DPkem – chemotherapy and newly diagnosed before chemotherapy, DPTal – Tha- lidomide, DP 0 – without therapy, N – number of patients, zdravljenje – therapy, mediana – median Razpravljanje Pri bolnikih z DP so z merjenjem gostote kapilar v kostnem mozgu ugotovili povečan obseg angiogeneze (4–6). Poveča- nje angiogeneze ni samo posledica izločanja citokinov s strani plazmocitomskih celic. Angiogeneza ima tudi pomembno vlo- go v patogenezi in napredovanju bolezni. To predpostavko podpira ugotovitev povezave med povečanim obsegom an- giogeneze in slabo prognozo. VEGF poleg spodbujanja angio- geneze pospešuje tudi delitev plazmocitomskih celic. Delova- nje VEGF poteka preko avtokrine in parakrine zanke. Plazmo- citomske celice izločajo VEGF in imajo hkrati na površini re- ceptorje za VEGF (avtokrino delovanje). Izločen VEGF povzro- či izločanje IL-6 s strani endotelijskih celic in celic strome, kar spodbuja delitev plazmocitomskih celic in poveča tvorbo VEGF (parakrino delovanje) (7, 8). Bolniki z DP imajo v krvi povečano koncentracijo VEGF in bFGF. Glavni izvor teh dejavnikov je kostni mozeg. To potrjuje tudi ugotovitev, da je koncentracija VEGF in bFGF v kostnem mozgu večja kot v krvi (9). Ugotovili so, da sta koncentraciji VEGF in bFGF v plazmi povezani z aktivnostjo plazmocitoma. Obstaja pozitivna soodvisnost med VEGF in reaktivnim prote- inom C (CRP) ter beta2 mikroglobulinom (B2M) in negativna soodvisnost med bFGF in koncentracijo albumina (9). Tudi pri naših bolnikih so bile povečane koncentracije dejavnikov an- giogeneze bolj pogoste v skupini (DP kem ) z bolj aktivno bole- znijo. Le v tej skupini so bili tudi bolniki, ki so imeli hkrati pove- čano koncentracijo več dejavnikov angiogeneze. Soodvisnosti VEGF – B2M in bFGF – albumini pri nas nismo ugotovili, verjet- no zaradi majhnega števila bolnikov v istem obdobju bolezni (npr. ob ugotovitvi bolezni). Podobno kot pri Di Raimondu in sod.(9) tudi pri nas koncentraciji VEGF in bFGF nista bili med- sebojno povezani. Pri novotvorbah hematopoetičnega tkiva je potrebna previdnost pri sklepanju na povečano angiogenezo iz koncentracij VEGF in bFGF v krvi, ker ta dejavnika proizvaja in sprošča večina krvnih celic. Povečana koncentracija ome- njenih dejavnikov je lahko prisotna tudi pri okužbah in vnetjih. Če merimo VEGF v serumu, je potrebno upoštevati, da je kon- centracija v serumu večja od koncentracije v plazmi. Vzrok je dodatno sproščanje VEGF iz trombocitov med koagulacijo kr- vi (10). Pri naših bolnikih si povezavo števila trombocitov v krvi z VEGF in MMP-9 razlagamo z učinkom citokinov na trombo- poezo. VEGF ima vlogo tudi pri dozorevanju megakariocitov (11). Opazovana soodvisnost med koncentracijo MIg in B2M je posledica povezave obeh kazalcev s številom plazmocitom- skih celic v telesu (tumorsko maso). Prav tako je vzrok za ne- gativno povezavo MIg z albumini večja tumorska masa pri hi- tro napredujočih plazmocitomih. Pri hitro napredujočem pla- zmocitomu se poveča tvorba IL-6, ki zavira sintezo albuminov v jetrnih celicah. Matriks metaloproteaze imajo pomembno vlogo pri preobli- kovanju zunajceličnega matriksa in osteolitični razgradnji ko- sti pri plazmocitomu. Razgradnjo kosti začne MMP-1 (intersti- cijska kolagenaza), ki razgrajuje kolagen vrste I v manjše eno- te. Te potem razgradita želatinazi MMP-2 in MMP-9. Plazmo- citomske celice proizvajajo MMP-9, aktivirajo proencimsko obliko MMP-2 in inducirajo MMP-1 v celicah strome (12). Ker MMP-9 razgrajuje tudi kolagen vrste IV, ki je sestavina bazal- nih membran, je njeno delovanje pomembno pri angiogenezi in širjenju malignih celic v sosednje tkivo. Encimi skupine MMP verjetno tudi pospešujejo delitev plazmocitomskih celic (3). Zato ni presenečenje večja serumska koncentracija MMP-9 pri bolj aktivni obliki plazmocitoma. Talidomid je zdravilo, ki zavira angiogenezo in se uspešno upo- rablja za zdravljenje plazmocitoma. Če je zdravljenje s talido- midom učinkovito, se zmanjša gostota kapilar v kostnem mo- zgu (13). O zmanjšanju koncentracije VEGF in bFGF v krvi po uspešnem zdravljenju s talidomidom so poročali Kakimoto s sod. in Bertolini s sod. (14, 15). Drugi omenjenega zmanjšanja VEGF in bFGF niso ugotovili (16). V naši raziskavi so imeli bol- niki, ki smo jih zdravili s talidomidom, manjše koncentracije MMP-9 kot bolniki z aktivno boleznijo v skupini DP kem . Iwasaki in sod. so ugotovili, da imajo bolniki s slabim odzivom na kemo- terapijo povečano koncentracijo VEGF v serumu pred začet- kom zdravljenja. Povečana je tudi umrljivost (17, 18). Ni še znano, ali je koncentracija VEGF in drugih dejavnikov angioge- neze v serumu neodvisen prognostični dejavnik. Čeprav ima angiogeneza pomembno vlogo v patogenezi DP, bodo šele večje prospektivne raziskave potrdile vrednost določanja raz- ličnih dejavnikov angiogeneze v krvi za oceno prognoze DP. Literatura 1. Orpana A, Salven P. Angiogenic and lympangiogenic molecules in hemato- logical malignancies. Leuk Lymphoma 2002; 43: 219–24. 2. Mangi MH, Newland AC. Angiogenesis and angiogenic mediators in haema- tological malignancies. Br J Haematol 2002; 111: 43–51. 3. Kelly T, Borset M, Abe E, Gaddy-Kurten D, Sanderson RD. Matrix metallopro- teinases in multiple myeloma. Leuk Lymphoma 2000; 37: 273–81. 4. Vacca A, Di Loreto M, Ribatti et al. Bone marrow of patients with active multiple myeloma: angiogenesis and plasma cell adhesion molecules LFA-1, VLA-4, LAM 1 and CD44.Am J Hematol 1995; 50: 9–14. 5. Vacca A, Ribatti D, Roncali L, Ranieri G, Serio G, Silvestris F & Dammacco F. Bone marrow angiogenesis and progressionn in multiple myeloma. British Journal of Haematology. 1994; 87: 503–8. 6. Rajkumar SV, Leong T, Roche PC et al. Prognostic value of bone marrow angiogenesis in multiple myeloma. Clinical Cancer Research 2000; 6: 3111–6. 7. Vacca A, Ria R, Ribatti D, Semeraro F, Djonov V, Di Raimondo F, Dammacco F. A paracrine loop in the vascular endothelial growth factor pathway trig- gers tumor angiogenesis and growth in multiple myeloma. Haematologica 2003; 88: 176–85. 8. Podar K, Tai YT, Davies FE et al. Vascular endothelial growth factor triggers signaling cascades mediating multiple myeloma cell growth and migration. Blood 2001; 98: 428–35. 9. Di Raimondo F, Azzaro MP, Palumbo G et al. Angiogenic factors in multiple myeloma: higher levels in bone marrow than in peripheral blood. Haemato- logica 2000; 85: 800–5. 10. Banks RE, Forbes MA, Kinsey SE, Stanley A, Ingham E, Walters C, Selby PJ. Release of the angiogenic cytokine vascular endothelial growth factor (VEGF) from platelets: significance for VEGF measurements and cancer biology. Br J Cancer1998; 77: 956–64. 11. Casella I, Feccia T, Chelucci C et al. Autocrine-paracrine VEGF loops potenti- ate the maturation of megakaryocytic precursors through Flt1 receptor. Blood 2003; 101: 1316–23. 12. Barille S, Akhoundi C, Collette M et al. Metalloproteinases in multiple myelo- ma: production of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9), activation of proM- MP-2, and induction of MMP-1 by myeloma cells. Blood 1997; 90: 1649–55. 13. Singhal S, Mehta J, Desikan R et al. Antitumour activity of thalidomide in refractory multiple myeloma. N Eng J Med. 1999; 341: 1565–71. 14. Kakimoto T, Hattori Y, Okamoto S et al. Thalidomide for the treatment of refractory multiple myeloma: association of plasma concentrations of thali- domide and angiogenic growth factors with clinical outcome. Jpn J Cancer Res 2002; 93: 1029–36. MODIC M, KRALJ J, ČIBEJ L, MLAKAR U. KONCENTRACIJE NEKATERIH DEJAVNIKOV ANGIOGENEZE V SERUMU PRI DISEMINIRANEM PLAZMOCITOMU I-42 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I 15. Bertolini F, Mingrone W, Alietti A et al. Thalidomide in multiple myeloma, myelodysplastic syndromes and histiocytosis. Analysis of clinical results and surrogate angiogenesis markers. Annals of Oncology. 2001; 12: 987–90. 16. Neben K, Moehler T, Kraemer A, Benner A, Egerer G, Ho AD Goldschmidt. Response to thalidomide in progressive multiple myeloma is not mediated by inhibition of angiogenic cytokine secretion. Br J Haematol 2001; 115: 605–8. 17. Iwasaki T, Sano H. Predicting treatment responses and disease progression in myeloma using serum vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor levels. Leuk Lymphoma 2003; 44: 1275–9. 18. Iwasaki T, Hamano T, Ogata A, Hashimoto N, Kitano M, Kakishita E. Clinical significance of vascular endothelial growth factor and hepatocyte growth factor in multiple myeloma. Br J Haematol 2002; 116: 796–802.