Zdrav Vestn 2008; 77: I-69–74 I-69 UGOTAVLJANJE MUTACIJSKIH SPREMEMB V VARIABILNIH GENIH PREUREJENIH GENOV ZA TEŽKO VERIGO IMUNOGLOBULINA PRI BOLNIKIH S KRONIČNO LIMFOCITNO LEVKEMIJO MUTATIONAL STATUS OF REARRANGED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN VARIABLE GENES IN PATIENTS WITH CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKAEMIA Tadej Pajič, Peter Černelč Klinični oddelek za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1525 Ljubljana Izvleček Izhodišča Metode Rezultati Ugotavljanje mutacijskih sprememb variabilnega gena preurejenega variabilnega dela gena za težko verigo imunoglobulina (IGHV) v klonu limfocitov B je pomemben neodvisen napovedni dejavnik pri oceni napovedi poteka bolezni pri bolnikih s kronično limfo-citno levkemijo (B-KLL). Hitrejši potek bolezni napoveduje prisotnost nemutiranega variabilnega gena za IGHV v levkemičnih celicah, ki se pojavi pri približno 50 % bolnikov z B-KLL. Prisotnost gena VH3-21 pomeni neugoden izid bolezni in ni odvisen od mutacij-skih sprememb. Namen naše raziskave je bil vpeljati in opredeliti mutacijske spremembe IGHV pri preiskovancih z B-KLL, določiti delež vpletenih genov IGHV in izsledke primerjati s tistimi v slovstvu. V raziskavo smo vključili 49 (19 žensk in 30 moških) bolnikov z B-KLL z različno klinično razvojno stopnjo (39 stadij A, 6 stadij B, 4 stadij C), ki prej niso bili zdravljeni s citostatiki. Mediana starosti bolnikov je bila 63 let, razpon od 37 do 88 let. Levkemične celice smo pridobili z gostotnim gradientnim centrifugiranjem venske krvi preko fikola in osamili RNA. Z obratnim prepisovanjem in verižno reakcijo s polimerazo smo pomnožili cDNA segmente preurejenih genov za težko verigo imunoglobulinov. Prisotnost identičnih pridelkov PCR (klonalnost) smo ugotovili po heterodupleksnem pristopu s poliakrilamidno gelsko elektroforezo. S sekvenčno analizo pridelkov PCR smo pridobili nukleotidno zaporedje variabilnega gena za IGH. Izsledke sekvenčne preiskave smo primerjali z najbolj skladnim zaporedjem zarodne imunoglobulinske proge (germline) variabilnega gena. Nemutirani gen IGHV je gen, ki je skladen v več kot 98 % z najbolj skladno zarodno imunoglobulinsko progo. Delež nemutiranih bolnikov s B-KLL je bil 44,9 %, mutiranih 55,1 %. Najpogosteje se je pojavila podskupina genov IGHV3 (34,9 %). Sledita ji podskupini genov IGHV1 in IGHV4, ki sta bili najdeni v 28,5 in v 26,5 %. Podskupino genov IGHV2 smo dokazali pri 2 bolnikih (4,1 %), druge, IGHV2, IGHV5 in IGHV6 pa le pri posameznem bolniku. Najpogosteje vpleteni gen je gen IGHV1-69, ki se pojavi v 18,4 %. Sledita mu gena V4-34 in V4-39, ki se pojavita v 8,2 %. Gen V3-07, V3-11 in V3-23 smo ugotovili v 6,2 %, druge gene v manjšem deležu. Pri bolnikih z nemutiranimi geni IGHV se je najpogosteje pojavil gen V1-69 (32,5 %), pri bolnikih z mutiranimi geni IGHV gen IGHV4-34 (14,8 %). Gena V3-21 pri naših preiskovancih nismo ugotovili. Izsledek se ujema z manjšo pojavnostjo tega gena v sredozemskem prostoru (3 %). Avtor za dopisovanje / Corresponding author: Asist. mag. Tadej Pajič, spec. med. biokem, Specializirani hematološki laboratorij Kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Njegoševa 4, 1525 Ljubljana, e.mail: tadej.pajic@kclj.si I-70 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I V raziskavi smo ugotovili, da je delež nemutiranega gena IGHV v klonu limfocitov B preiskovanih bolnikov z B-KLL v skladu s podatki v slovstvu, torej okoli 50 %. Pojavnost nekaterih vpletenih genov IGHV in pogostnost somatskih mutacij se ujema z drugimi raziskavami, vendar bi bilo za dokončne zaključke potrebno raziskavo razširiti na večje število preiskovancev. Ta bi omogočila povednejšo geografsko primerjavo in prikazala natančnejšo sliko pojavnosti vpletenih genov IGHV v slovenskem prostoru. Ključne besede kronična limfocitna levkemija; mutacijske spremembe; variabilni geni preurejenih genov za težko verigo imunoglobulina; verižna reakcija s polimerazo Abstract Background Mutational status of rearranged immunoglobulin heavy chain variable genes (IGHV) in leukaemia cells of patients with chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL) is important independent prognostic factor. The outcome of patients with leukaemia cells that use an unmutated IGHV gene is inferior to those patients with leukaemia cells that use a mutated IGHV gene. Unmutated VH genes can be observed in about half of all B-CLL cases. In addition, the VH3-21 gene usage is an unfavourable prognostic marker independent of the IGHV mutational status. The aims of the study were to determine the mutational status and IGHV gene usage in our cohort of patients with B-CLL and compare the results to those published in the literature. Methods 49 B-CLL patients (19 female, 30 male), median age 63 (range from 37 to 88 years) in various Binet stages (39 Binet A, 6 Binet B, 4 Binet C) were included in the study. All the patients were untreated at the time of blood collection. Leukaemia cells were isolated from venous blood samples of patients by the Ficoll density gradient centrifugation. Total cellular RNA was isolated from leukaemia cells and used to the prepare cDNA by reverse transcription. After heteroduplex analysis, clonal PCR products were identified with polyacryla-mide gel electrophoresis. The PCR products were sequenced and mutational status was determined by comparing the sequence of the IGHV region of the patient sample to the most homologous germ line V sequence. Sequence that was homologous more than 98 % with their corresponding germ line sequence was considered unmutated. Results Unmutated and mutated IGHV mutational status in our cohort of patients with B-CLL was found in 44.9 % and 55.1 %, respectively. At the IGH subgroup level, the most frequently used subgroup was IGHV3 (34.9 %), followed by IGHV1 and IGHV4, found in 28.5 % and 26.5 %, respectively. Subgroup IGHV2 was found out in 2 patients (4.1 %). The other subgroups, IGHV2, IGHV5 and IGHV6, were determined in one patient each. At the specific gene level, the most frequently used gene IGHV was IGHV1-69, found out in 18.4 %. Genes V4-34 and V4-39 were determined in 8.2 %, followed by genes V3-07, V3-11 and V3-23 identified in 6,2 % each. The others were identified at the lower frequency. In patients with unmutated IGHV genes, the most frequently observed gene was V1-69 (32.5 %). The most frequently used gene in mutated rearrangements was IGHV4-34 (14.8 %). The gene V3-21 was not found out in our cohort of patients and results bear similarity to the Mediterranean-based study (3 %). Conclusions In the study performed, we have found out that the portion of unmutated IGHV genes of the clonal B lymphocytes was in agreement with the available data from the literature and was approximately 50 %. The gene usage and somatic mutations frequency were similar to those published in the literature. In the future, the population based investigations of IGHV gene use in large series of CLL patients may reveal the true frequencies of different IGHV genes in Slovenian region. Furthermore, the geographic comparison and more definitive conclusions could be made based on it. Key words chronic lymphocytic leukaemia; mutational status; rearranged immunoglobulin heavy chain variable genes; polymerase chain reaction Zaključki Pajič T et al. Ugotavljanje mutacijskih sprememb v variabilnih genih preurejenih genov za težko verigo imunoglobulina I-71 Uvod Kronično limfocitno levkemijo B-celic (B-KLL) uvrščamo med maligne limfome s počasnim naravnim potekom. Je najpogostejša oblika levkemije v zahodnem svetu. Vzroka za nastanek bolezni še ne poznamo. Pri več kot 95 % bolnikov ima klon levkemič-nih celic membranske značilnosti limfocitov B. Klon zrelih levkemičnih limfocitov B se kopiči predvsem v kostnem mozgu in limfnih organih, kjer se normalno nahajajo in prehajajo v kri. B-KLL ločimo od drugih novotvorb zrelih celic B (limfomov) na osnovi citološke ocene, histološke preiskave kostnega mozga in bezgavk in s specifičnimi monoklonskimi protitelesi za posamezne membranske označevalce, ki so značilni za B-KLL.1, 2 Napoved izida bolezni pri bolnikih z B-KLL še vedno temelji na kliničnem sistemu razvrščanja bolezni po Rai3 in Binetu.4 Bolezen razdelimo v klinično razvojne stopnje: v zgodnjo A, srednjo B ali napredovalo obliko bolezni C.1, 3, 4 V 80 % bolezen odkrijemo v zgodnji fazi. Vendar pri približno polovici bolnikov z zgodnjo kliničnorazvojno stopnjo A bolezen hitro napreduje, so neodzivni na običajno zdravljenje, imajo veliko okužb ali avtoimunskih zapletov in imajo bolj neugoden izid kot drugi. Tako oba klinična sistema razvrščanja bolezni ne moreta predvideti bolnikov, ki imajo hitrejši naravni potek in potrebujejo zgodnejše zdravljenje. V zadnjih letih so se raziskave usmerile v proučevanje možnih kliničnih in bioloških dejavnikov, ki bi imele napovedni pomen in bi jih lahko vključili v klasično oceno napovedi in oceni odzivnosti na zdravlje-nje.5–9 Velik napredek v razumevanju in napovedi bolezni sta prispevali raziskavi, ki sta pokazali napove-dni pomen somatskih hipermutacij v variabilnem genu preurejenega gena za težko verigo imunoglobuli-na (IGHV) v klonu limfocitov B.10, 11 Hitrejši potek bolezni napoveduje prisotnost nemutiranega gena V težke verige imunoglobulina v levkemičnih celicah, ki se pojavi pri približno 50 % bolnikov z B-KLL.6, 7, 10, 11 V večini raziskav so pokazali, da je ugotavljanje muta-cijskih sprememb IGHV neodvisen napovedni dejavnik, še posebej pri bolnikih z zgodnjo klinično razvojno stopnjo; vendar obstaja izjema. Nadaljnje raziskave so pokazale napovedni pomen določenih družin genov IGHV. Prisotnost gena VH3-21 pomeni neugoden izid bolezni, ki je neodvisen od mutacijskih sprememb.7, 12–14 Namen naše raziskave je bil vpeljati in opredeliti mutacijske spremembe IGHV pri preiskovancih z B-KLL, določiti delež vpletenih genov IGHV in izsledke primerjati s slovstvom. Preiskavo smo izvedli z obratnim prepisovanjem izolirane RNA iz levkemič-nih celic in z verižno reakcijo s polimerazo (PCR). Pomnožili smo segmente cDNA preurejenih genov za težko verigo imunoglobulinov in prisotnost identičnih pridelkov PCR (klonalnost) ugotovili po hete-rodupleksnem pristopu s poliakrilamidno gelsko elektroforezo. S sekvenčno preiskavo pridelkov PCR smo pridobili nukleotidno zaporedje variabilnega gena za IGH. Izsledke sekvenčne preiskave smo primerjali z najbolj skladnim zaporedjem zarodne imu- noglobulinske proge (germline) variabilnega gena. Nemutirani gen IGHV je skladen v več kot 98 % z najbolj skladno zarodno imunoglobulinsko progo (germline) variabilnega gena.15 Bolniki in metode dela Bolniki V raziskavo smo vključili 49 bolnikov z B-KLL z različno klinično razvojno stopnjo, vodenih v ambulanti Kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana. Bolniki prej niso bili zdravljeni s citostatiki. Ob vključitvi v raziskavo je stadij A imelo 39 bolnikov, 6 bolnikov je imelo stadij B in 4 stadij C. Med bolniki je bilo 19 žensk in 30 moških. Mediana starosti vseh bolnikov je bila 63 let, razpon od 37 do 88 let. Mediana starosti žensk je bila 62, razpon od 37 do 88 let. Mediana starosti moških je bila 64, razpon od 47 do 82 let. Vsi bolniki so imeli ob odvzemu vzorcev limfocitozo (več kot 5 × 109/L) in dokazan klon B-limfocitov z značilnim imunofenotipom za B-KLL (CD19+/CD5+/CD23+). Določitev mutacijskih sprememb variabilnega gena v preurejenm genu za težko verigo imunoglobulina Bolnikom z B-KLL smo odvzeli vensko krvi in pridobili levkemične celice z gradientnim centrifugiranjem periferne krvi preko fikola. Iz njih smo osamili RNA z reagenčnim kompletom High Pure RNA Isolation Kit (ROCHE). RNA smo obratno prepisali v komplementarno DNA (cDNA) z encimom reverzno ranskripta-zo SuperScript II (Invitrogen), heksamernimi oligo-nukleotidi (Applied Biosystems) in drugimi potrebnimi reagenti po navodilih proizvajalca reverzne trans-kriptaze. Z reagenti in po navodilih kompleta IGH Somatic Hypermutation Assay (InVivoScribe Technologies) smo izvedli verižno reakcijo s polimerazo vzorcev cDNA in pomnožili celoten (FR1-FR3) ali del variabilnega (CDR1-FR3) cDNA segmenta gena V preurejenega gena za težko verigo imunoglobulina (geni V/D/J). Prisotnost identičnih pridelkov PCR (klonal-nost) smo ugotovili po heterodupleksnem pristopu s poliakrilamidno gelsko elektroforezo (6 % Tris-borat-EDTA poliakrilamidni gel Novex (Invitrogen), elektro-forezna kadička (XCell SureLock Mini-Cell, Invitro-gen), pogoji, 200 V, 35 min) in barvanjem gelov z barvilom SYBR Gold (Molecular Probes, Invitrogen). He-terodupleksni prisotop vključuje denaturacijo pridelka PCR (DNA) na visoki temperaturi (94 °C, 5 minut), ki ji sledi takojšen padec temperature (4 °C, led, 60 minut). Pri tem se verige DNA ponovno združujejo, vendar se velik del verig DNA nepravilno veže na druge neskladne verige DNA. Nastanejo večje zanke v dvoverižni DNA, ki znatno zmanjšajo možnost potovanja DNA skozi poliakrilamidni gel. Če je večina pridelka PCR identična, se ta v tem postopku ponovno veže s skladnimi pridelki. Ti pridelki PCR normalno potujejo skozi poliakrilamidni gel (Sl. 1). Na tak način izboljšamo ločitev identičnih od ne-identičnih pridelkov PCR. Po gelski elektroforezi in barvanju gelov smo I-72 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I iz gela izrezali identični pridelek PCR in ga za sek-venčno reakcijo prečistili z reagenčnim kompletom Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Sekvenčno reakcijo smo naredili z regenti in po protokolu kompleta za sekveniranje (Applied Biosystems) in za sekveniranje uporabili oligonukleotid IGH JH, ki se prilega v genu J preurejenega gena IGH. Z genetskim analizatorjem nukleotidnih zaporedjih (ABI 310 Applied Biosystems) smo pridobili nukle-otidno zaporedje variabilnega gena za IGH v pridelkih PCR. Nukleotidno zaporedje smo vstavili v anali-zno orodje, dostopno v svetovnem spletu (IgBLAST, National Center for Biotechnology Information), ki poišče najbolj skladno zaporedje zarodne imunoglo-bulinske proge (germline) variabilnega gena in določi delež mutacij. Nemutirani gen IGHV je gen, ki je skladen v več kot 98 % z najbolj skladno zarodno imu-noglobulinsko progo.15 M Vz1 Vz2 Vz3 Vz4 Vz5 Vz6 Vz7 NegKT PozKT Sl. 1. Prikaz poliakrilamidne gelske elektroforeze pridelkov PCR bolnikov s kronično limfocitno levkemijo (B-KLL) po heterodupleksnem pristopu. Madeži v pričakovanem razponu (od 395 do 465 bp za cDNA, 480 do 550 bp za DNA) pomenijo prisotnost identičnega (klonalnega) pridelka PCR v vzorcih (1–7); NegKT, negativna (normalna) kontrola DNA za ne-identiče (poliklonalne) pridelke PCR; PozKT, pozitivna kontrolna DNA za identične (klo-nalne) pridelke PCR; M, označevalec DNA velikosti od 100 do 1000 bp. Figure 1. Sample heteroduplex analysis of clonal PCR products on polyacrylamide gel in chronic lympho-cytic leukemia patients (B-CLL). Valid size range (395–465 bp for cDNA, 480–550 for DNA) of amplified PCR products in samples (1–7) indicated clonal PCR product;; NegKT, Negative (Normal) polyclonal control DNA; PozKT, Positive clonal control DNA; M, DNA size marker, the 100 bp ladder. Rezultati Preiskavo določitve mutacijskih sprememb IGHV smo pred kratkim uvedli v naš laboratorij in pri tem spoštovali priporočila Evropske pobude za raziskavo bolezni KLL.15 Do nastanka tega prispevka smo uspeli določiti mutacijske spremembe 49 nezdravljenim bolnikom s kronično limfocitno levkemijo, ki so bili redno spremljani v ambulanti Kliničnega oddelka za hematologijo Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana. Iz primerjave sekvenčnih preiskav naših vzor- cev PCR z mednarodno bazo podatkov za zarodne imunoglobulinske proge (germline) variabilnega gena (gen V) smo določili delež prisotnosti somat-skih hipermutacij v genu V. Z uporabo predlagane meje, kjer je nemutirani gen V gen, ki je skladen v več kot 98 % z najbolj skladno zarodno imunoglobulin-sko progo (germline) gena V, smo določili, da je delež nemutiranih bolnikov 44,9 %, mutiranih 55,1 % (Razpr. 1). Razpr. 1. Ugotavljanje mutacijskih sprememb in variabilnih genov v preurejenem genu za težko verigo imunoglobulina pri preiskovancih s kronično limfo-citno levkemijo (B-KLL). Table 1. Mutational status and gene usage in the rearranged variable regions of the immunoglobulin heavy chains in chronic lymphocytic leukemia patients (B-CLL). Vpleteni gen Mutiran (št. oseb, %) Nemutirani (št. oseb, %) Skupaj (št. oseb, %) Gene usage Mutated Unmutated All (No., %) (No., %) (No., %) V1-02 1 (4,5) 1 (2,0) V1-03 2 (7,4) 2 (4,1) V1-18 1 (3,7) 1 (2,0) V1-24 1 (3,7) 1 (2,0) V1-69 1 (3,7) 8 (36,5) 9 (18,4) V2-05 1 (3,7) 1 (4,5) 2 (4,1) V3-07 3 (11,2) 3 (6,2) V3-11 3 (13,7) 3 (6,2) V3-15 1 (3,7) 1 (2,0) V3-23 2 (7,4) 1 (4,5) 3 (6,2) V3-30 2 (9,1) 2 (4,1) V3-33 2 (7,4) 2 (4,1) V3-48 2 (7,4) 2 (4,1) V -74 1 (3,7) 1 (2,0) V4-04 2 (7,4) 2 (4,1) V4-30 1 (3,7) 1 (2,0) V4-34 4 (14,8) 4 (8,2) V4-39 1 (3,7) 3 (13,7) 4 (8,2) V4-61 1 (4,5) 1 (2,0) V4-59 1 (3,7) 1 (2,0) V5-a 1 (4,5) 1 (2,0) V6-1 1 (3,7) 1 (2,0) V7-4-1 1 (4,5) 1 (2,0) Skupaj All 27 (55,1) 22 (44,9) 49 (100) Pri naših preiskovancih smo določili vseh sedem družin genov IGHV. Najpogosteje uporabljena podskupina gena IGHV pri analiziranih bolnikih je bila podskupina genov IGHV3, najdena pri 17 od 49 bolnikov (34,7 %). Sledita ji podskupini genov IGHV1 in IGHV4, ki sta bili najdeni pri 14 (28,5 %) in 13 bolnikih (24,5). Podskupino gena IGHV2 (V2-05) smo dokazali pri 2 bolnikih (4,1 %), ostale IGHV5, IGHV6 in IGHV7 pa le pri posameznem bolniku (Razpr. 1). Če podrobneje ocenimo vpletene gene IGHV, ugotovimo, da najpogosteje sodeluje pri obravnavanih bolnikih gen IGHV1-69, ki se pojavi pri 9 od 49 bolnikov (18,4 %). Vsak od genov V4-34 in V4-39 se pojavi pri 4 bolnikih (8,2 %). Drugi geni IGHV in njihov delež izmed vseh preiskovanih bolnikov so prikazani v Razpredelnici 1. Pri bolnikih z mutiranim genom IGHV je največ bolnikov imelo vpleteno družino genov IGHV3 (11 bolnikov), sledi mu IGHV4 (8 bolnikov) in IGHV1 (5 bolnikov). V skupini bolnikov z mutiranim statusom je Pajič T et al. Ugotavljanje mutacijskih sprememb v variabilnih genih preurejenih genov za težko verigo imunoglobulina I-73 bil najpogosteje vpletni gen V4-34 (4 bolniki, 14,8 %). Gena V3-21, katerega prisotnost, ne glede na mutacij-ske spremembe, pomeni slab napovedni dejavnik, pri naših preiskovancih nismo ugotovili. Pri bolnikih z nemutiranih statusom se je najpogosteje pojavil gen V1-69 (8 bolnikov, 36,5 %), sledita mu gena V3-11 (3 bolniki, 13,7 %) in V4-39 (3 bolniki 13,7 %). Razpravljanje Določanje mutacijskih sprememb v variabilnem genu preurejenega gena za težko verigo imunoglobuli-na (IGHV) v klonu limfocitov B je pomemben neodvisen napovedni dejavnik pri oceni napovedi poteka bolezni bolnikov z B-KLL.10, 11 Pri 49 obravnavanih bolnikih z B-KLL smo ugotovili prisotnost nemutiranega gena IGHV v 44,9 %. Delež je v skladu z objavljenimi podatki iz slovstva, kjer se ta giblje okrog 50.8–11, 13, 16, 20 Dosedanje raziskave določanja mutacijskih sprememb pri B-KLL so potrdile, da so v preureditev genov IGHV pogosteje vključene določene podskupine in specifični geni. Podskupine genov IGHV, ki so jih najpogosteje ugotovili pri preureditvi genov IGHV pri B-KLL, so IGHV1, IGHV3 in IGHV4.10, 16–19 Tudi v naši raziskavi smo najpogosteje potrdili te podskupine genov, saj zajemajo skupaj kar 89,7 % vseh primerov. Lokus IGHV vsebuje veliko genov V, vendar se nekateri med njimi pogosteje pojavijo pri bolnikih z B-KLL.10, 16–19 Med njimi so geni IGHV1-69, IGHV3-07, IGHV3-23, IGHV4-34 in IGHV4-39, ki so tudi v naši raziskavi pogosteje zastopani (Razpr. 1). V naši raziskavi nekoliko odstopa gen V3-11, ki smo ga ugotovili pri 3 bolnikih, vendar je tudi število preiskovancev v primerjavi z drugimi raziskavami manjše. Za dokončne zaključke bi bilo potrebno raziskavo razširiti na večje število preiskovancev. Tudi pogostnost so-matskih hipermutacij v genih IGHV ni enovita. Zaznati je mogoče hierarhijo prisotnosti somatskih hipermu-tacij v genih IGHV, saj je največ genov mutiranih v podskupini IGHV3, sledi ji podskupina genov IGHV4 in IGHV1, kar smo dobili tudi pri naši preiskavi (11 bolnikov IGHV3, 8 bolnikov IGHV4, 5 IGHV1). Ta pojav je še bolj viden pri posameznih genih. Tako je za gen IGHV1-69 značilno, da nosi izredno malo mutacij, tudi v naši raziskavi, kjer je delež tega gena med nemutiranimi največji, kar 36,5 % in je v skladu z opažanji drugih preiskav. Po drugi strani je vrsta genov, IGHV3-07, IGHV3-23 in IGHV4-34, ki imajo zelo visok delež mutacij.10, 13, 16–20 Ti geni so najpogosteje zastopani tudi pri naših bolnikih z mutiranimi muta-cijskimi spremembami (Razpr. 1). Nedavne raziskave so pokazale, da neodvisno od mutacijskih sprememb pomeni prisotnost gena IGHV3-21 slabši izid bolezni. V severni Evropi (Skandinavske države in Velika Britanija) je delež tega gena pri B-KLL bolnikih velik, med 8 in 11 %.20–22 V Skandinavskih državah je po pogostnosti na drugem mestu, takoj za genom IGHV1-69.20 Ravno nasprotno je v mediteranskem prostoru, kjer je večja raziskava držav Francije, Španije, Grčije in Italije pokazala prisotnost gena le v 3 %.16 V našem naboru bolnikov z B-KLL tega gena nismo dokazali, kar potrjuje, da je lahko pojavnost tega gena v slovenskem prostoru pri B-KLL bolnikih manjša in se približuje k deležu, ki je značilen za sredozemski prostor. Razlogi za različno geografsko pojavnost genov niso poznani. V splošnem sklepajo na vpliv specifičnega genetskega ozadja, odvisnega od raznolikosti sestave zarodne proge lokusa IGHV ali določenega neznanega dejavnika iz okolja.16 Zaključki Določitev mutacijskih sprememb v variabilnem genu preurejenega gena za težko verigo imunoglobulina (IGHV) v klonu limfocitov B je neodvisen dejavnik pri oceni napovedi poteka bolezni bolnikov z B-KLL, ki smo jo uspešno uvedli v delo našega laboratorija. V raziskavi smo ugotovili, da je pojavnost nekaterih vpletenih genov IGHV in pogostnost somatskih mutacij podobna tistim iz slovstva, vendar bi bilo za dokončne zaključke potrebno raziskavo razširiti na večje število preiskovancev. Ta bi omogočila ustreznejšo geografsko primerjavo in prikazala natančnejšo sliko pojavnosti in delež mutacij vpletenih genov IGHV v slovenskem prostoru. Nenazadnje je pomen uvedbe preiskave tudi v tem, ker omogoča naše nadaljnje raziskave pri bolnikih z B-KLL. Literatura 1. Černelč P. Limfatične novotvorbe. Kocjančič A, Mrevlje F, Štajer D, eds. Interna medicina. 3. izdaja. Ljubljana: Littera Picta; 2005. p. 1250–68. 2. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW, eds. Mature B-cell neoplasms in pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues World Health Organization Classification of tumours. Lyon: IARC Press; 2001. 3. Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP, Chanana AD, Levy RN, Paster-nack BS. Clinical staging of chronic lyphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219–34. 4. Binet Jl, Lepoprier M, Dighiero G, et al. A clinical staging system for chronic lyphocytic leukemia: prognostic significance. Cancer 1977; 40: 855–64. 5. Byrd JC, Stilgenbauer S, Flinn IW. Chronic lymphocytic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2004; 163–83. 6. Magnac C, Porcher R, Davi F, et al. Predictive value of serum thymidine kinase level for Ig-V mutational status in B-CLL. Leukemia 2003; 17: 133–7. 7. Stilgenbauer S. Chronic lymphocytic leukemia: genetics for predicting outcome. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006; 185–90. 8. Krober A, Seiler T, Benner A, Bullinger L, Bruckle E, Lichter P, et al. V(H) mutation status, CD38 expression level, genomic aberrations, and survival in chronic lyphocytic leukaemia. Blood 2002; 100: 1410–16. 9. Montserrat E. New prognostic markers in CLL. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2006; 279–84. 10. Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A, Oscier DG, Stevenson FK. Unmutated IgV(H) genes are associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1848–54. 11. Damle RN, Wasil T, Fais F, et al. Ig VH gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 1999; 94: 1840–47. 12. Thorsélius M, Kröber A, Murray FThunberg U, Tobin G, Bühler A, et al., Strikingly homologous immunoglobulin gene rearrangements and poor outcome in V H3-21-using chronic lymphocy-tic leukemia patients independent of geographic rigin and mu-tational status. Blood 2006; 107: 2889–94. I-74 Zdrav Vestn 2008; 77: SUPPL I 13. Tobin G. The immunoglobulin genes: structure and specifity in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia and Lymphoma 2007; 48: 1081–86. 14. Potter KN, Orchard J, Critchley E, Mockridge CI, Jose A, Stevenson FK. Features of the overexpressed V1-69 genes in the unmu-tated subset of chronic lymphocytic leukemia are distinct from those in the healthy elderly repertoire; Blood 2003; 101: 3082–4. 15. Editorial. ERIC recommendations on IGHV gene mutational status analysis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2007: 21: 1–3. 16. Ghia P, Stamatopoulos K, Belessi C, Moreno C, Stella S, Guida G, et al. Geographic patterns and pathogenetic implications of IGHV gene usage in chronic lymphocytic leukemia: the lesson of the IGHV3-21 gene. Blood 2005; 105: 1678–85. 17. Fais F, Ghiotto F, Hashimoto S, Sellars B, Valetto A, Allen SL, e tal. Chronic lymphocytic leukemia B cells express restricted sets of mutated and unmutated antigen receptors. J Clin Invest 1998; 102: 1515–25. 18. Kipps TJ, Tomhave E, Pratt LF, Duffy S, Chen PP, Carson DA. Developmentally restricted immunoglobulin heavy chain variable region gene expressed at high frequency in chronic lymphocytic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86: 5913–7. 19. Schroeder HW Jr, Dighiero G. The pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia: analysis of the antibody repertoire. Immunol Today 1994; 15: 288–94. 20. Tobin G, Thunberg U, Johnson A, Eriksson I, Söderberg O, Karls-son K, Merup M, et al. Chronic lymphocytic leukemias utilizing the VH3-21 gene display highly restricted V2-14 gene use and homologous CDR3s: implicating recognition of a common antigen epitope. Blood 2003; 101: 4952–7. 21. Lin K, Manocha S, Harris RJ, Matrai Z, Sherrington PD, Pettitt AR. High frequency of p53 dysfunction and low level of VH mutation in chronic lymphocytic leukemia patients using the VH3-21 gene segment. Blood 2003; 102: 1145–6. Prispelo 2008-02-27, sprejeto 2008-03-03