144
Zdrav Var 2007; 46; 144-150
UPORABA BIOMARKERJEV ZA DOLOČANJE VPLIVOV
NANODELCEV
THE USE OF BIOMARKERS FOR ASSESSING EFFECTS OF
NANOPARTICLES
Anita Jemec1, Damjana Drobne2, Kristina Sepčič2, Tatjana Tišler1
Prispelo: 20. 6. 2007 - Sprejeto: 17. 9. 2007
Pregledni znanstveni ~lanek UDK 577.1:615
Izvle~ek
V zadnjem desetletju smo pri~a izrednemu napredku nanotehnologij, ki so nam in nam bodo v prihodnosti prinesle celo vrsto pridobitev za vsakdanje ‘ivljenje. Poleg tega pa se moramo zavedati dejstva, da se bodo v na{em okolju v velikih koli~inah pojavljali novi nanomateriali (velikost vsaj 1-100 nm v eni dimenziji), ki imajo zaradi majhnosti druga~ne fizikalno-kemijske in toksikolo{ke lastnosti kot njihove ve~je oblike. O vplivih teh materialov na ljudi in okolje vemo zelo malo, zato je potrebno raziskati njihove morebitne vplive na razli~nih ravneh biolo{ke organizacije. V prispevku smo predstavili testni sistem z mokrico Porcellio scaber za prou~evanje vplivov nanomaterialov na organizme. Pri ‘ivalih, izpostavljenih 15 nm nanodelcem titanovega dioksida (TiO2), smo opazovali biokemijske biomarkerje, tj. aktivnosti encimov glutation S-transferaze in katalaze, ter fiziolo{ke biomarkerje (stopnja prehranjevanja, iztrebljanje, asimilacijska u~inkovitost, sprememba mase ‘ivali). Opazili smo manj{e vplive TiO2 na stopnjo prehranjevanja mokric in signifikantne spremembe aktivnosti obeh encimov. Menimo, da je predstavljeni pristop testiranja hiter in ponovljiv ter nudi veliko informacij o mehanizmih delovanja nekega nanomateriala. Priporo~amo nadaljnje nano(eko)toksikolo{ke {tudije, ki nam bodo omogo~ile uporabo nanomaterialov s ~im manj{imi posledicami za ~loveka in na{e okolje.
Klju~ne besede: nanomateriali, titanov dioksid, biokemijski biomarkerji, prehranjevanje, kopenski rak Porcellio scaber
Review article UDC 577.1:615
Abstract
During the last decade, an enormous development of nanotechnologies has resulted in numerous improvements for our everyday lives. Nanomaterials (size at least 1-100 nm in one dimension) are new chemical forms of common chemical elements and exhibit unique physico-chemical and toxicological properties that may differ greatly from those of larger particles of the same materials. Until now, not many studies have focused on the effects of nanomaterials on humans and environment, so it is important to investigate their effects at several levels of organization. This paper presents our test system using terrestrial isopod Porcellio scaber as a model organism for the evaluation of the nanomaterials’ effects on organisms. Animals were exposed to 15 nm titanium dioxide (TiO2) nanopar ticles, and afterwards biochemical biomarkers, e.g. the activities of glutathione S-trans-ferase and catalase, and physiological end-points (feeding rate, faeces production, food assimilation efficiency and animal mass change) were evaluated. An insignificant effect of TiO2 on feeding and significant effects on the activities of both enyzmes were noticed. The test system presented in this work proved to be quick, reliable and
Kemijski in{titut Ljubljana, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana
Biotehni{ka fakulteta, Oddelek za biologijo, Ve~na pot 111, 1000 Ljubljana
Kontaktni naslov: e-po{ta: anita.jemec@ki.si
Jemec A., Drobne D., Sep~i} K., Ti{ler T. Uporaba biomarkerjev za dolo~anje vplivov  nanodelcev
145
very informative. Further nano(eco)toxicological studies are recommended to enable the safe use of new nanomaterials.
Key words: nanomaterials, titanium dioxide, biochemical biomarkers, feeding, terrestrial isopod Porcellio scaber
1    Uvod
Smo v obdobju izredno razvijajočega se področja nanotehnologije, t.j. tehnološkega razvoja v nanometrskem merilu, ali po eni izmed prvih definicij: »the design, characterisation, production and applica-tion of structures, devices, and systems by controlling shape and size at nanometre scale« (»načrtovanje, določanje lastnosti, produkcija in uporaba struktur, sredstev in sistemov s kontrolo oblike in velikosti v nanometrskem merilu«) (1). Po mnogih napovedih bo imela izreden vpliv na industrijo, zdravstvo, proizvodnjo hrane in kozmetike, medicino, transport, energijo ter informacijske in komunikacijske tehnologije (2). Nekateri njen potencial primerjajo z industrijsko revolucijo in z odkritjem elektrike in komunikacijskih tehnologij (3). Produkti nanotehnologije so nanomateriali (tj. materiali, ki imajo vsaj eno dimenzijo v območju 1-100 nm) in so različnih oblik, npr. nanodelci, cevke, filmi in površine. Zaradi izredne majhnosti imajo popolnoma drugačne fizikalno-kemijske lastnosti kot njihove večje oblike, zato jih v mnogih ozirih lahko obravnavamo kot nove kemikalije. Slednje pomeni, da imajo tudi drugačne toksikološke lastnosti od znanih kemikalij, zato njihov morebitni vpliv na ljudi in okolje v veliki meri ni znan. Veliko nanomaterialov se že danes uporablja v vsakdanjem življenju (npr. v sončnih kremah, kozmetičnih proizvodih, materialih s samočistilno sposobnostjo, barvah, senzorjih za detekcijo onesnaževal, čiščenju onesnaženja vod in tal, ...), zato so študije o njihovih toksikoloških vplivih nujno potrebne (1). Kot predlagajo mnogi avtorji, mora toksikologija usmerjati pot nanotehnologiji (4). V prispevku predstavljamo naš pristop k študiju mehanizma toksičnega delovanja nanomaterialov. Kot modelni organizem proučujemo kopenskega enakonožnega raka mokrico (Porcellio scaber). Le-ta ima pomembno vlogo v talni favni, in sicer so začetni dekompozitorji organskega materiala, pri čemer mehansko razgradijo material in ga pripravijo za nadaljno mikrobno razgradnjo. Naseljujejo se v bližini človeških bivališč in so primeren indikatorski organizem za onesnaženje tal (5). Prednost študij z mokrico je v tem, da zaradi večletnih izkušenj dela z njim zelo dobro
poznamo njegove odzive na razli~ne fiziolo{ke in kemijske stresne dejavnike. To nam omogo~a t.i. »primerjalni pristop« k ovrednotenju delovanja neke neznane kemikalije/nanomateriala s primerjanjem delovanja znane kemikalije.
Zaradi velike kompleksnosti naravnega sistema je za najbolj stvarno oceno potrebno prou~iti spremembe na ve~ razli~nih ravneh biolo{ke organizacije. Pri tem se ocenjujejo t.i. biomarkerji, ki so merilo biolo{kega odziva na izpostavljenost in/ali u~inek okoljskemu stresorju na suborganizemski (molekularni, biokemijski) stopnji in na ravni organizma (6). Biokemijski biomarkerji so velikokrat bolj ob~utljivi in specifi~ni kazalci izpostavljenosti in u~inka kemikalij kot odzivi na vi{jih ravneh biolo{ke organizacije, npr. smrtnost. V na{em laboratoriju smo kot dodatek standardnim testom optimizirali metode za merjenje dveh biokemijskih biomarkerjev, glutation S-transferaze (GST) in katalaze (CAT). Omenjena encima sta del skupine antioksidativnih encimov, ki v celici sodelujejo pri uravnavanju ravnovesja med oksidanti in antioksidanti. To se namre~ lahko poru{i, ~e v celico vstopijo kovine ali ksenobiotiki (7). Katalaza odstranjuje prese‘ke nastalega vodikovega peroksida, GST pa odstranjuje produkte po{kodovanih lipidov in ve‘e ksenobiotike, ki so vstopili v celico. Poleg GST in CAT pri uravnavanju ravnovesja reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) sodelujejo tudi drugi encimi, vendar pa smo se za omenjena dva odlo~ili zato, ker sta zelo raz{irjena, tako med prokarionti kot evkarionti. Poleg tega se je na osnovi na{ih predhodnih izku{enj izkazalo, da je njuno merjenje enostavnej{e kot dolo~anje drugih biokemijskih biomarkerjev, npr. glutationa in glutation peroksidaze. Izbrana biokemijska biomarkerja sta primerna za prou~evanje vplivov nanomaterialov, ker naj bi le ti zaradi izredne povr{inske reaktivnosti pozro~ali nastanek ROS (8,9). Predlaganih je bilo ve~ mehanizmov nastanka ROS na povr{ini nanomaterialov, med njimi npr. ob indukciji z UV, po{kodbi nanomaterialov in reakcijami ovojev delcev z okolico (10). Vodikov peroksid je eden izmed ROS, ki nastane kot rezultat nastanka drugih kisikovih radikalov, ki primarno nastanejo zaradi TiO2, npr. superoksidnega radikala in hidroksilnega radikala. Na ravni organizma
146
Zdrav Var 2007; 46
smo spremljali prehranjevanje, in sicer stopnjo hranjenja, stopnjo iztrebljanja, asimilacijsko u~inkovitost ter spremembo mase ‘ivali.
Prou~evali smo vplive nanodelcev titanovega dioksida (TiO2, 15 nm). Titanov dioksid se ‘e nekaj desetletij uporablja v pigmentih in kozmetiki, vendar so bile prve toksikolo{ke {tudije o vplivih razli~nih velikosti teh delcev na plju~no tkivo objavljene {ele leta 1990 (11). Te {tudije so med prvimi pokazale, da je poleg vrste kemikalije pri strupenosti pomembna tudi velikost delcev. O strupenih vplivih nanodelcev TiO2 je bilo objavljenih kar nekaj {tudij, vendar pa je bila velika ve~ina opravljenih na celi~nih kulturah plju~nih tkiv glodalcev, ve~inoma podgan (11, 12). Znano je, da nanodelci TiO2 povzro~ajo nastanek ROS, vendar pa mehanizem nastanka v teh {tudijah ni bil raziskan. Ob stiku nanodelcev TiO2 z UV je nastanek ROS ve~ji, vendar pa le ti nastanejo tudi brez prisotnosti UV (13). Nanodelci naj bi bili v telo sposobni prehajati tudi preko prebavne cevi (14), zato je prehranjevalni poskus z izopodnim kopenskim rakom primeren testni sistem za toksikolo{ke {tudije nanodelcev. Poleg tega pa je potrebno omeniti, da s stali{~a varovanja okolja vemo zelo malo o vplivih nanodelcev na kopenske in vodne organizme. Pred kratkim je bilo objavljenih le nekaj raziskav o vplivih na vodne organizme (15, 16).
2   Metode
2.1        Priprava testne suspenzije TiO2
Uporabili smo komericalno dostopni TiO2 z velikostjo delcev 15 nm, tipa anataza in s povpre~no povr{ino delca 200–220 m2/g (katalo{ka {tevilka sigma 637254). Nanodelce smo zatehtali in dodali v destilirano vodo. Suspenzije nismo sonicirali, kot je to priporo~eno za nanodelce v vodni suspenziji, ker smo v preliminarni {tudiji ugotovili, da s tem procesom {e dodatno pospe{imo agregacijo delcev.
2.2        Prehranjevalna {tudija
V poskusih smo uporabili odrasle ‘ivali obeh spolov, ki smo jih nabrali na neonesna‘enem kraju v Lukovici pri Dom‘alah in gojili v laboratoriju do za~etka poskusov. V poskusih smo izbrali kontrolno in testno populacijo, ki sta bili primerljivi po spolu, masi in levitvi organizmov. Poleg tega smo na osnovi na{ih predhodnih raziskav prepri~ani, da te lastnosti ‘ivali ne vplivajo na aktivnost testiranih encimov.
Predhodno smo herbarizirali liste leske (Corylis avellana), jih stehtali in navla‘ili zaradi la‘je aplikacije nanodelcev. Suspenzijo TiO2 smo nanesli na liste po standardnem postopku, ki ga uporabljamo v na{em laboratoriju (17). Suspenzijo smo odpipetirali na spodnjo stran lista in jo s ~opi~em enakomerno porazdelili po celotni povr{ini. Na ta na~in smo zagotovili homogenost nanosa testne snovi na liste. Tak na~in aplikacije je v preteklosti pokazal, da so dejanske izmerjene koncentracije nane{ene kemikalije (npr. kovine) enake tistim, ki smo jih prvotno ‘eleli nanesti. Po nanosu TiO2 smo liste su{ili en dan in suhe ponudili ‘ivalim Pripravili smo kontrolo in 3 razli~ne koncentracije TiO2 (1000, 2000 in 3000 µg TiO2/g lista). Te koncentracije smo izbrali na osnovi preliminarnih {tudij, kjer se je izkazalo, da imajo ni‘je koncentracije (1000 µg TiO2/g lista) po 14 dneh izpostavljanja ‘e u~inek na iste encime v izopodnem raku. Zato smo v 3 dnevnih poskusih testirali vi{je koncentracije. Za vsako koncentracijo smo izpostavili 10 ‘ivali, in celoten poskus trikrat lo~eno ponovili. Ves ~as poskusa smo vzdr‘evali primerno vla‘nost v testnem sistemu. Po 3 dneh smo pre{teli {tevilo iztrebkov in jih po 3-dnevnem su{enju v eksikatorju stehtali. Stehtali smo maso listov in ‘ivali. Iz dobljenih podatkov smo izra~unali maso zau‘itega lista, maso iztrebljene hrane in iz razlike teh dveh parametrov dolo~ili asimilacijsko u~inkovitost, tj. koliko hrane je ‘ival asimilirala. @ivali smo secirali in izolirali prebavno ‘lezo, iz katere smo pripravili vzorec za encimske analize (Slika 1).
Kot referenca za dobro opravljen poskus in ustrezno populacijo testiranih ‘ivali so nam slu‘ile kontrolne vrednosti biomarkerjev po koncu poskusa, ki smo jih primerjali z ‘e znanimi vrednostmi, ki smo jih v preteklosti dobili za zdravo populacijo ‘ivali. Tako smo zagotovili, da je bila testirana populacija primerna za uporabo v testu, in da je bil poskus izveden korektno.
2.3       Merjenje encimskih aktivnosti
Prebavno ‘lezo smo s steklenim Elvehjem-Potterjevim homogenizerjem 3 minute homogenizirali v 0,8 mL 50 mM kalijevega fosfatnega pufra pH 7.0. Vzorce smo centrifugirali 25 min pri obratih 15000 g in temperaturi 4 °C. Aktivnosti encimov smo merili v sve‘e pripravljenih vzorcih. Aktivnost GST smo dolo~ali z 1-kloro-2,4-dinitrobenzenom (CDNB) kot substratom (18) s
Jemec A., Drobne D., Sep~i} K., Ti{ler T. Uporaba biomarkerjev za dolo~anje vplivov  nanodelcev
147
l.dan Day 1
2.dan Day2
3.dan      4.dan  5.dan       6.dan Day3      Day4  Day5      Day6
7.dan Day7
-Naberemo živali (collect animals) -Stehtamo liste (weight leaves)
-na liste nanesemo Ti02 (apply Ti02 on leaves)
-izpostavimo živali (expose animals)
-merimo / measure encimske aktivnosti (enyzme activities)
-opazujemo prehranjevanje (observe feeding) -sekcija (section) - pripravimo encimski vzorec (prepare enzvme sample)
Slika 1.     Shema 3-dnevnega prehranjevalnega poskusa z mokrico.
Figure 1.  Experimental set-up of 3-days feeding of the terrestrial isopod Porcellio scaber.
CO
g)     CO
L   5
0,10
D)
i
L¦
TJ
ra
E
en
E.
t:
o
co > In   0,06
o co co
E
o> 0,04
co
c
L    -e   0,02 iS
II
0,00
1000                  2000
TlO (ng/g lista-leaf)
3000
Slika 2:          Vpliv Ti02 na dnevno stopnjo hranjenja mokric (srednja vrednost ± standardna napaka). Simbol
(*) pomeni statistično signifikantno razliko glede na kontrolo (Mann Whitney test, P<0.05).
Figure 2.       The effect of TiOs on the daily feeding rate of isopods. Symbols on the box plot represent maximum and minimum value (-), mean value (',), median value (-) and significant changes compared to control (*) (Mann Whitney test, P<0.05).
148
Zdrav Var 2007; 46
a.)
		40
		35
^-^	r	
<=	a:	
s	S	30
E	n	
o.	ni	
F	b	25
		
I	E o	20
O	F	
L	-s	
		
-^	*j	
Lf	o	
I	> iS m	10
§	S	5 0
0                        1000                     2000                     3000
T102 (ng/g lista-leaf)
b.)
		500
		450
		
C	.E	
m	K	
P	P	
o.	o.	350
I	1	300
F	fc	
i	!	2b0 200
^	n	
>	c	
1	|	
H	co	
t/)	H	
O	S	50
0                        1000                     2000                     3000
Ti02(ng/g lista-leaf)
Slika 3:          Vpliv TiOs na aktivnosti encimov CAT (a) in GST (b) (srednja vrednost ± standardna napaka).
Simbol ( ) pomeni statistično signifikantno razliko glede na kontrolo (Mann Whitney test, P<0.05).
Figure 3.       The effect of TiOs on catalase (a) and glutathione S-transferase (b). Symbols on the box plot represent maximum and minimum value (-), mean value (',), median value (-) and significant changes compared to control (*) (Mann Whitney test, P<0.05).
Jemec A., Drobne D., Sep~i} K., Ti{ler T. Uporaba biomarkerjev za dolo~anje vplivov  nanodelcev
149
pomo~jo ~italca mikrotitrskih plo{~ Bio-Tek® Instruments, USA; PowerWave™ XS. 50 µL 100 mM kalijevega fosfatnega pufra pH 6.5 smo zme{ali z 50 µL 4 mM reduciranega glutationa, 50 µL 4mM CDNB in 50 µL vzorca. Reakcijo smo spremljali 3 min pri 340 nm in 25 °C.
Katalazno aktivnost smo merili na spektrofotometru (Shimadzu UV-2101PC spectrophotometer, Japan) (18). 100 µL vzorca smo dodali k 700 µL 11,5 mM raztopine H2O2 pripravljene v 50 mM kalijevem fosfatnem pufru pH 7.0. Reakcijo smo spremljali 2 minuti pri 240 nm in 25 °C.
Koncentracijo proteinov smo dolo~ali s komercialnim setom BCA™ Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA).
Encimske aktivnosti smo izrazili kot {tevilo molov nastalega produkta/razgrajenega substrata na minuto in jih podali na mg proteina.
3   Rezultati in razprava
3.1        Prehranjevanje
Po statisti~ni obdelavi podatkov smo ugotovili, da testirane koncentracije TiO2 nimajo o~itnega vpliva na prehranjevanje mokric. Statisti~no zna~ilno razliko smo opazili le pri dnevni koli~ini zau‘ite hrane, ki je bila pri najvi{ji koncentraciji TiO2 rahlo pove~ana glede na kontrolne organizme. Nesignifikantno pove~anje je opaziti tudi pri koncentraciji 1000 µg TiO2/g lista (Slika 2). Navadno pri izpostavitvi kemikaliji pri~akujemo zmanj{ano prehranjevanje ‘ivali, vendar pa pojav pove~anja prehranjevanja tudi ni izklju~en. Podoben rezultat smo v preteklosti dobili pri izpostavljanju nekaterim pesticidom (Drobne et al., neobjavljeni rezultati).
3.2        Aktivnosti encimov
Pri najvi{jih koncentracijah TiO2 sta bili aktivnosti obeh encimov zmanj{ani (Slika 3). Aktivnosti izbranih encimov sta lahko pod vplivom kemikalije zmanj{ani ali pove~ani, odvisno od koncentracije. Pri nizkih koncentracijah kemikalije sta navadno aktivnosti pove~ani, ker se inducirajo obrambni sistemi, pri visokih koncentracijah pa kemikalija sama po sebi inhibira aktivnost encima ali pa je le ta zmanj{an posredno zaradi splo{no slabega stanja celice. V na{em primeru sta bili aktivnosti obeh encimov signifikantno zmanj{ani, na osnovi ~esar zaklju~ujemo, da imajo testirane koncentracije vpliv na celi~ne sisteme prebavne ‘leze mokrice, vendar
pa u~inek ni bil opazen na vi{jih ravneh razen pri prehranjevanju.
Potrebne so nadaljne {tudije z vi{jimi koncentracijami, kjer bi {tudirali predvsem vpliv nanodelcev na vi{jih organizacijskih ravneh, ter poskusi z ni‘jimi koncentracijami, kjer nas zanima predvsem, ~e se omenjena encima inducirata zaradi nastanka ROS. Predlagamo tudi nadaljnje {tudije z razli~nimi ~asi izpostavljanja.
Trenutno o ekolo{ki relevantnosti na{ih rezultatov te‘ko razpravljamo, saj ni na voljo nobenih podatkov o koncentracijah nanodelcev TiO2 v okolju. Dobljenih rezultatov tudi ne moremo primerjati z drugimi {tudijami, saj je ta {tudija ena imed redkih opravljenih na kopenskih nevrete~arjih. Mo‘na je primerjava z nekaterimi na{imi neobjavljenimi rezultati, kjer smo enake u~inke na aktivnost obeh encimov v enakem testnem sistemu dobili, ko smo ‘ivali izpostavili 100 µg Cd/g lista in 1000 µg Zn/g lista (na{ laboratorij, neobjavljeno). Ti dve koncentraciji kovin sta glede na koncentracije v okolju zelo visoke, saj so mejne vrednosti za vnos v tla 0,5–1 µg Cd/g suhe mase in 160–200 µg Zn/g suhe mase (19). Le ena {tudija je na voljo o u~inkih zau‘itih nanodelcev TiO2 na mi{i, kjer so po oralnem zau‘itju 5 g teh nanodelcev/ kg telesne te‘e opazili histopatolo{ke u~inke na jetrih in ledvicah (20).
4   Zaklju~ek
V prispevku smo predstavili testni sistem z mokrico Porcellio scaber za prou~evanje vplivov nanomaterialov na organizme. Menimo, da je predstavljeni pristop testiranja hiter, ponovljiv in nudi veliko informacij o mehanizmih delovanja neke kemikalije/nanomateriala, saj nam omogo~a prou~evanje vplivov na ve~ ravneh biolo{ke organizacije. Zavedamo se, da so kakr{ne koli korelacije med vplivi nanomaterialov na mokrice in ~lovekom nemogo~e, vendar pa so v za~etni fazi fazi prou~evanja neznanih kemikalij bazi~ne {tudije zelo dobrodo{le. Poleg tega ne smemo pozabiti dejstva, da bo velika uporaba nanomaterialov rezultirala v njihovem pojavljanju v naravnem okolju, kar bo imelo velik vpliv na organizme, ki ‘ive v tem okolju in posledi~no tudi na nas. Opozoriti ‘elimo, da se bomo v prihodnosti sre~ali s posledicami izrednega razvoja nanotehnologij, med katerimi bodo mnoge za nas zelo koristne, s pospe{enimi nanotoksikolo{kimi {tudijami pa moramo poskrbeti, da bo tistih
150
Zdrav Var 2007; 46
negativnih ~immanj. To bo prav gotovo velik izziv javnemu zdravstvu v tretjem tiso~letju.
Zahvala
Želimo se zahvaliti za financiranje s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost RS (P2-0150) ter Slovenski znanstveni fundaciji za štipendiranje Anite Jemec (štipendija s strani VVorld Federation of Scien-tists).
Literatura
1.    The Royal Society & The Royal Academy of Engineering. Nanoscience and nanotechnologies, julij 2004. Pridobljeno 20.5.2007 s spletne strani: http://www.nanotec.org.uk/ finalReport.htm.
2.    Friedrichs S, Schulte J. Environmental, health and safety as-pects of nanotechnology-implications for the R&D in (small) companies. Sci Technol Adv Mat 2007; 8: 12-18.
3.    Nel A, Xia T, Mädler L, Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science 2006; 311: 622-7.
4.    Holsapple MP, Lehman-McKeeman LD. Forum Series:Research Strategies for Safety Evaluation of Nanomaterials. Toxicol Sci 2005; 87: 315.
5.    Drobne D. Terrestrial isopods- a good choice for toxicity test-ing of pollutants in the terrestrial environment. Environ Toxicol and Chem 1997; 16: 1159-64.
6.    Adams SM. Biological indicators of aquatic ecosystem stress. American Fisheries Society, Bethesda, Maryland, 2002.
7.    Hallivvell B, Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine. 3 rd edition. Clarendon, Oxford, 1999.
8.    Stone V, Shaw J, Brown DM, Macnee W, Faux SP, Donaldson K. The role of oxidative stress in the prolonged inhibitor/ effect of ultrafine carbon black on epithelial celi function. Toxicol in Vitro 1998; 12: 649-59.
9.    Oberdörster G, Stone V, Donaldson K. Toxicology of nanoparticles:A historical perspective. Nanotoxicology 2007; 1: 2-25.
10.  Gould P. Nanomaterials face control measures. Nanotoday 2006; 1: 34-9.
11.  Oberdörster G, Ferin J, Finkelstein G, Wade P, Corson N. Increased pulmonan/ toxicity of ultrafine particles? II. Lunge lavage studes. J Aerosol Sci 1990; 21: 384-7.
12.  Afaq F, Abidi P, Matin R, Rahman Q. Cytotoxicity, pro-oxidant effects and antioxidant depletion in rat lung alveolar macroph-age exposed to ultrafine titanium dioxide. J Appl Toxicol 1998; 18: 307-12.
13.  Gurr JR, Wang ASS, Chen, CH, Jan KY. Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicol-ogy 2005; 213(1/2): 66-73.
14.  Borm PJA, Robbins D, Haubold S, Kuhlbusch T, Fissan H, Donaldson K, et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol 2006; 3: 11.
15.  Lovern SB, Klaper R. Daphnia magna mortality when exposed to titanium dioxide and fullerene (Ce„) nanoparticles. Environ Toxicol Chem 2006; 25: 1132-7.
16.  Hund-Rinke K, Simon M. Ecotoxic effect of photocatalytic ac-tive nanoparticles (Ti02) on algae and daphnids. Environ Sci & Pollut Res 2006; online first 1-8.
17.  Stanek K, Drobne D, Trebše P. Linkage of biomarkers along levels of biological complexity in juvenile and adult diazinon fed terrestrial isopod (Porcellio scaber, Isopoda, Crustacea). Chemosphere 2006; 64: 1745-52.
18.  Jemec A, Drobne D., TišlerT, Trebše P, Roš M, Sepčič K. The applicability of acetylcholinesterase and glutathione S-trans-ferase in Daphnia magna toxicity test. Comp Biochem Physiol 2007; 144 C: 303-9.
19.  Pravilnik o obremenjevanju tal z vnašanjem odpadkov, Uradni list RS 3/2003, str.25.
20.  Wang J, Zhou G, Chen C, Yu H, Wang T, Ma Y, et al. Acute toxicity and biodistribution of different sized titanium dioxide particles in mice after oral administration. Toxicology Letters 2007; 168:176-85.