i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 217 — #1 i
i
i
i
i
i
SPIM: MIKROSKOPIJA Z RAVNINSKO OSVETLITVIJO
MARUŠA VITEK
Fakulteta za matematiko in fiziko
Univerza v Ljubljani
PACS: 87.64.kv, 87.57.qp, 87.18.Nq
Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo je fluorescenčna metoda, pri kateri vzorec osve-
tljujemo pravokotno na os detekcije s tanko svetlobno plastjo. Bledenje vzorca je pri
tem zelo majhno, metoda pa omogoča hitro zajemanje in dobro prostorsko ločljivost. Je
pomembna na področju razvojne biologije, saj z njo lahko slikamo velike žive vzorce na
različnih prostorskih in časovnih skalah.
SPIM: SELECTIVE PLANE ILLUMINATION MICROSCOPY
Selective plane illumination microscopy is a method in which the sample is illuminated
by a thin light plane, perpendicular to the direction of detection. The method is fast and
provides low photo-bleaching and high spatial resolution. It is important in the field of
developmental biology.
Uvod
Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo (ang. selective plane illumination mi-
croscopy, SPIM) je nova metoda fluorescenčne mikroskopije [1]. Razvita
je bila za potrebe eksperimentov na področju razvojne biologije, ki preu-
čuje rast in diferenciacijo celic ter razvoj tkiv, organov in celotne anatomije
živali.
Za opazovanje celotnega poteka razvoja moramo slediti številnim pro-
cesom na zelo različnih prostorskih in časovnih skalah. Prostorska skala se
razteza od nekaj µm za procese znotraj celice do nekaj mm za procese na
ravni zarodka, časovna skala pa se razteza od nekaj sekund do nekaj dni.
Poleg široke prostorske in časovne skale je izziv za opazovanje še dejstvo,
da imamo opravka s precej velikim, tridimenzionalnim, v idealnem primeru
živim vzorcem, ki veliko svetlobe siplje ali absorbira. V raziskavah življenj-
skih procesov potrebujemo neinvazivne metode, ki vzorca ne uničijo. Le
tako lahko opazujemo nespremenjene procese in njihov prispevek k celo-
tnemu razvoju organizma.
Za opazovanje tridimenzionalnih bioloških vzorcev se v veliki meri upora-
bljajo fluorescenčne metode. Vzorci morajo zato vsebovati fluorofore, fluo-
rescenčna barvila, ki se s kovalentno vezjo vežejo na makromolekule. Ob
osvetljevanju se svetloba prave valovne dolžine absorbira in vzbudi mole-
kulo v vǐsje energijsko stanje. Z vibracijskimi prehodi molekula nato preide
v nižje vzbujeno stanje, odkoder se z izsevanjem fotona vrne v osnovno sta-
nje. Izsevana svetloba ima večjo valovno dolžino od vpadne, zato ju lahko
Obzornik mat. fiz. 59 (2012) 6 217
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 218 — #2 i
i
i
i
i
i
Maruša Vitek
ločimo (npr. z dikroičnim zrcalom) in na detektor spustimo le izsevano sve-
tlobo. Tako dobimo sliko opazovanega vzorca.
Pomembna slabost fluoroforov je, da jih določena količina vpadle sve-
tlobe uniči. Vzorec zato s časom bledi, saj zaradi uničevanja fluoroforov
seva vedno manj fluorescentne svetlobe. Čas osvetljevanja mora biti čim
kraǰsi, saj obsežno osvetljevanje lahko poleg bledenja povzroči tudi poškodbe
vzorca [2].
Pri metodi SPIM je čas osvetljevanja posameznega dela vzorca relativno
kratek, osvetljujemo namreč le tisto plast vzorca, katere sliko zajemamo.
Bledenje je zato zelo majhno, malo je tudi poškodb vzorca. Podatke je
mogoče zajemati z veliko hitrostjo [1]. SPIM so razvili leta 2004, temu pa
je sledil še razvoj sorodnih metod, ki so SPIM izbolǰsale in nadgradile.
Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo
SPIM je metoda, pri kateri ločeno slikamo posamezne plasti vzorca. Optično
ločevanje plasti poteka takole: vzorec od strani osvetlimo s tanko navpično
svetlobno plastjo, imenovano osvetlitvena ravnina. Ta sovpada z gorǐsčno
ravnino mikroskopa in je pravokotna na vodoravno os detekcije (slika 1).
Na presečǐsču osi detekcije in osvetlitvene ravnine je v napravo za mikropo-
zicioniranje vpet vzorec v valju agaroze. Agarozni gel zagotavlja primerno
okolje za živ vzorec, hkrati pa vzorec tudi fiksira. Naprava za mikropozi-
cioniranje omogoča sukanje vzorca okoli navpične osi in premikanje vzdolž
treh prostorskih osi.
Valj z vzorcem je potopljen v vodno okolje v komori mikroskopa. Veči-
noma za opazovanje uporabljamo imerzijski objektiv, ki je v stiku z vodnim
okoljem v komori (slika 1), mogoča pa je tudi uporaba običajnega objektiva
zunaj komore.
V vzorcu vpadna svetloba povzroči fluorescenco. S kamero detektiramo
izsevano fluorescentno svetlobo iz poljubne navpične plasti vzorca. Če po-
snamemo slike dovolj gostega zaporedja plasti v eni smeri (ali v več smereh),
lahko sestavimo tridimenzionalno sliko vzorca [1]. Tipični vzorci za opazo-
vanje z metodo SPIM so zarodki rib medake (Oryzias latipes) in cebrice
(Danio rerio) ter zarodki in odrasli osebki vinske mušice (Drosophila mela-
nogaster). Vzorci so gensko spremenjeni, da vsebujejo fluorofore.
Svetlobno plast za osvetlitev vzorca dobimo tako, da kolimiran laserski
snop primerno obrežemo, nato pa ga pošljemo skozi cilindrično lečo, ki snop
v vodoravni smeri fokusira. V navpični smeri snop ostane kolimiran. Defi-
nirajmo koordinatni sistem, kjer je x-os vzporedna s smerjo detekcije, y-os
navpična, z-os pa vzporedna s smerjo propagacije svetlobe v osvetlitveni
plasti. Gorǐsčna ravnina potemtakem leži v ravnini y-z. V tem koordi-
natnem sistemu lahko dobljeno svetlobno plast opǐsemo kot eno od rešitev
218 Obzornik mat. fiz. 59 (2012) 6
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 219 — #3 i
i
i
i
i
i
SPIM: mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo
Slika 1. Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo. (a) Shema komore mikroskopa SPIM.
Vzorec osvetljujemo s tanko svetlobno plastjo. Ta sovpada z gorǐsčno ravnino in je pra-
vokotna na os detekcije. Na presečǐsču osvetlitvene ravnine in osi detekcije je živ vzorec,
denimo ribji zarodek, fiksiran v valju agaroze. Osvetlitev v plasti vzorca povzroči fluore-
scenco, ki jo zaznamo s kamero. Spodaj je prikazano zaporedje dvodimenzionalnih slik, ki
jih lahko združimo v 3D sliko. (b) Projekcija tridimenzionalne slike zarodka ribe medake,
posneta s konvencionalnim mikroskopom. (c) Projekcija tridimenzionalne slike istega
vzorca, posneta z metodo SPIM. V tem primeru je kontrast bistveno bolǰsi. Iz vira [1].
Ponatisnjeno z dovoljenjem AAAS.
paraksialne valovne enačbe, eliptičen Gaussov snop:
E(x, y, z) =
= E0
√
wx,0
wx(z)
√
wy,0
wy(z)
· exp
(
− x
2
w2x(z)
)
· exp
(
− y
2
w2y(z)
)
· exp(−iϕ(x, y, z)),
(1)
kjer je E0 amplituda, wx,0 in wy,0 širini grl v smeri x in y, wx(z) in wy(z)
širini snopa pri z v smeri x in y in ϕ faza [3]. Grlo snopa je lega, v kateri je
širina snopa najmanǰsa. V smeri y je grlo približno 200-krat širše od širine
grla v smeri x. Valovna narava svetlobne plasti ni pomembna, intenziteta
fluorescentne svetlobe je odvisna le od intenzitete osvetlitvene ravnine
I(x, y, z) = |E0|2
wx,0
wx(z)
· wy,0
wy(z)
· exp
(
− 2x
2
w2x(z)
)
· exp
(
− 2y
2
w2y(z)
)
. (2)
Laserski snop sestavlja svetloba iz modro-zelenega dela spektra z valov-
nimi dolžinami 488 nm in 514 nm, ki prihaja iz argonskega ionskega laserja,
217–224 219
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 220 — #4 i
i
i
i
i
i
Maruša Vitek
ter svetloba, ki prihaja iz dveh He-Ne laserjev in ima valovni dolžini 543
nm in 633 nm [4]. Debelina osvetlitvene plasti je tipično med 3 µm in
10 µm. Omejena je s pogojem, da mora biti plast približno enako debela
na celotnem vidnem polju objektiva (lahko variira do 42 %) [1]. Objektiv z
desetkratno povečavo in numerično aperturo 0.30 ima na primer vidno polje
veliko 660 µm. Da bo na celotnem vidnem polju debelina osvetlitvene plasti
variirala za manj kot 42 %, mora biti grlo plasti v x-smeri široko vsaj 6 µm.
Za detekcijo se uporabljajo CCD kamere. Hitrost zajemanja je od ene
do štirih plasti na sekundo, pri čemer je slika ene plasti velika 1344×1024
pikslov. Vzorec se da vzdolž osi detekcije premikati po korakih velikosti od
0.5 do 5 µm [1].
Zaradi osvetlitve fluorofori v vzorcu izsevajo svetlobo v polni prostorski
kot. Detektiramo le svetlobo, ki se izseva v smeri detektorja. Ker slikamo
tridimenzionalne vzorce, govorimo o prečni ločljivosti v gorǐsčni ravnini in
o osni ločljivosti vzdolž osi detekcije. Prečno ločljivost σxy določa izraz
σxy =
λ√
3− 2 cos θ − cos 2θ
, (3)
kjer je λ valovna dolžina svetlobe, θ pa polovica kota maksimalnega stožca,
iz katerega lahko sistem sprejme svetlobo. Kot θ je povezan z numerično
aperturo objektiva:
NA = n sin θ , (4)
kjer je n lomni količnik okolǐskega medija objektiva.
Osna ločljivost metode je odvisna od osne ločljivosti detektorja in od
debeline osvetlitvene plasti. Vedno je slabša od prečne ločljivosti.
Izbolǰsave metode SPIM
Po letu 2004, ko so metodo SPIM prvič predstavili [1], je ta način slikanja
doživel razcvet. Postal je eno glavnih orodij razvojne biologije, saj je prime-
ren za opazovanje zelo različnih vzorcev: tankih, debelih, prozornih, delno
neprozornih, različno sipajočih, in sicer na zelo različnih časovnih in pro-
storskih skalah. Za različne tipe vzorcev in za različne namene opazovanja
je bilo mogoče metodo še izbolǰsati.
Največji problem pri metodi SPIM povzročata absorpcija in sipanje, saj
imamo opravka z velikimi vzorci s specifično strukturo. Določeni deli vzorca
svetlobo zelo močno absorbirajo. Ko se tak del vzorca znajde v osvetlitveni
ravnini, za njim nastane senca, saj absorbira svetlobo, ki pride do njega.
Prav tako določeni deli vzorca močno sipajo svetlobo. Ko svetloba pride do
takega dela, se siplje v vse smeri. V gorǐsčni ravnini objektiva za takšnim
delom vzorca tako spet nastane senca, zaradi sipane svetlobe pa postanejo
osvetljeni tudi bližnji deli vzorca, ki sicer niso v gorǐsčni ravnini. Ta svetloba,
ki ni v gorǐsču objektiva, prispeva le k ozadju slike in le-to zamegli. Tema
problemoma se lahko delno izognemo z opazovanjem z več zornih kotov.
220 Obzornik mat. fiz. 59 (2012) 6
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 221 — #5 i
i
i
i
i
i
SPIM: mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo
Večinoma vzorec slikamo iz štirih do osmih zornih kotov in pri vsakem kotu
posnamemo 200–300 plasti [1]. Slikanje celotnega vzorca torej traja nekaj
minut, kar omejuje časovno ločljivost mikroskopa. Kvaliteto slike lahko še
dodatno povečamo z uporabo izbolǰsanih metod.
Pojava senc in zmanǰsevanja intenzitete svetlobe vzdolž osvetlitvene rav-
nine se med samim slikanjem lahko znebimo z večsmerno ravninsko osvetli-
tvijo mSPIM (ang. multidirectional SPIM, slika 2) [5]. Vzorec osvetljujemo
z dveh nasprotnih strani hkrati. Poleg tega svetlobno plast v gorǐsčni rav-
nini premikamo tako, da spreminjamo smer širjenja svetlobe med kotoma
−10◦ in 10◦. Zaradi spreminjanja tega kota se spreminja tudi kot senc za
neprozornimi deli vzorca. Spreminjanje nagiba osvetlitvene plasti je hitro
(1 kHz), čas zajemanja slike pa dovolj dolg (10–30 ms), da se sence v času
zajemanja ene slike izpovprečijo (slika 2).
Slika 2. Delovanje metode mSPIM. (a) Shema mikroskopa mSPIM. Na shemi (b) vidimo,
da pri navadni metodi SPIM za deli vzorca, ki absorbirajo, nastanejo sence. Shema (c)
ilustrira, da sence pri metodi mSPIM izginejo, saj vzorec osvetljujemo z obeh strani in
smer širjenja svetlobe spreminjamo med kotoma −10◦ in −10◦. (d, e) Glava 35 ur starega
zarodka cebrice. Na sliki (d), posneti z metodo SPIM, so opazne proge, ki na sliki (e),
posneti z metodo mSPIM, zbledijo. Merilo na slikah je 50 µm. Iz vira [5]. Ponatisnjeno
z dovoljenjem The Optical Society.
Druga izbolǰsava osnovne metode je mikroskopija s strukturirano ravnin-
sko osvetlitvijo SPIM-SI (ang. SPIM with structured illumination, slika 3)
[6]. Z njo lahko ločimo fluorescentno svetlobo, ki se je izsevala iz gorǐsčne
ravnine, od tiste, ki se je izsevala iz bližnjih delov vzorca, osvetljenih s si-
pano svetlobo. Pri tej metodi je pred cilindrično lečo, ki povzroči fokusiranje
kolimiranega snopa v vodoravni smeri, postavljena mrežica, ki povzroči mo-
dulacijo svetlobne ravnine v navpični smeri. Perioda mrežice je 10–150 rež
na mm, zato uklon nima pomembne vloge. Mrežico lahko premikamo v
navpični smeri. Vsako plast vzorca posnamemo pri treh različnih položajih
mrežice. To vsakič premaknemo za tretjino periode v navpični smeri. Za
vsako plast tako posnamemo tri slike I0◦ , I120◦ in I240◦ . Indeks se nanaša
217–224 221
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 222 — #6 i
i
i
i
i
i
Maruša Vitek
Slika 3. Metoda SPIM-SI. Shema (a) prikazuje tlorisni pogled, ki je enak kot pri metodi
SPIM. Razliko prikazuje shema (b). Povsem na levi je mrežica, ki povzroča strukturira-
nost osvetlitvene plasti: namesto enotne plasti dobimo tanke pasove. Mrežico premikamo
za tretjino periode mrežice v navpični smeri. Za vsako osvetljeno plast vzorca posna-
memo tri slike pri različnih pozicijah mrežice, ustrezni osvetlitveni vzorci so prikazani
desno zgoraj. Spodaj sta sliki rilčka vinske mušice. Slika (c) je posneta z navadno me-
todo SPIM, slika (d) pa z metodo SPIM-SI. Na njej so kontrasti bistveno bolǰsi. Iz vira
[6]. Ponatisnjeno z dovoljenjem The Optical Society.
na fazni zamik periodične strukture mrežice zaradi navpičnega premika.
Fluorescentna svetloba, ki izhaja iz gorǐsčne ravnine, je vsa prostorsko
modulirana, prispevki, ki ne prihajajo iz gorǐsčne ravnine, pa so posledica
sipanja in niso prostorsko modulirani. Ti prispevki so na vseh treh slikah
iste plasti enaki. Iz treh slik ene plasti izbolǰsano sliko plasti izračunamo
kot
I =
√
1
2
[
(I0◦ − I120◦)2 + (I120◦ − I240◦)2 + (I240◦ − I0◦)2
]
. (5)
Tako se znebimo prispevkov zaradi sipane svetlobe, ne da bi se pri tem
spremenila ločljivost. Dobimo sliko z majhnim ozadjem in velikimi kontrasti.
Čas snemanja treh slik ene plasti je med 0.3 s in 1 s, tako da za celoten
vzorec, razdeljen na denimo 150 plasti, porabimo od 45 do 150 s [6].
222 Obzornik mat. fiz. 59 (2012) 6
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 223 — #7 i
i
i
i
i
i
SPIM: mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo
Mikroskopija z digitalnim laserskim skeniranjem
Mikroskopija z digitalnim laserskim skeniranjem, DSLM (ang. digital scan-
ned laser light sheet fluorescence microscopy) [7], je priredba metode SPIM.
V tem primeru namesto osvetlitvene ravnine uporabimo približno 1 µm de-
bel osvetlitveni žarek, ki ga premikamo v navpični smeri, se pravi vzdolž
y-osi, in s tem skeniramo vzorec. Kamera integrira signal, ki ga dobiva,
medtem ko laserski žarek skenira eno plast. Tako dobimo dvodimenzio-
nalno sliko ene plasti. Vzorec nato enako kot pri metodi SPIM po korakih
premikamo skozi gorǐsčno ravnino, da posnamemo gosto zaporedje plasti.
Ker skeniramo s konstantno hitrostjo, je osvetlitev celotne plasti vzorca
enakomerna. Z uporabo fokusiranega laserskega žarka se močno izbolǰsa iz-
koristek osvetlitve, saj se za osvetljevanje porabi kar 95 % svetlobe, ki pride
iz laserja. Pri metodi SPIM se pri oblikovanju svetlobne ravnine izgubi
velik del svetlobe. Izkoristek osvetljevanja je le 3 % [7]. Zaradi razlike v
izkoristkih pri enakem laserskem izvoru in enakem času osvetljevanja vzorca
dobimo pri metodi DSLM 30-krat več fluorescentne svetlobe kot pri metodi
SPIM. To omogoča bistveno hitreǰse zajemanje podatkov z metodo DSLM.
Eno plast vzorca posnamemo v manj kot 1 ms, celoten vzorec torej slikamo
v nekaj sekundah [7].
Tudi pri metodi DSLM se da prispevek zaradi sipanja zmanǰsati s struk-
turiranim osvetljevanjem (DSLM-SI) [8]. Tu je prehod v strukturirano osve-
tlitev precej preprosteǰsi kot pri metodi SPIM, saj strukturiranost osvetlitve
dosežemo s sinusno modulacijo intenzitete laserskega žarka med skenira-
njem. Frekvenco in fazo modulacije lahko hitro spreminjamo. Tudi tu sliko
ene plasti posnamemo trikrat, pri fazah modulacije 0◦, 120◦ in 240◦ in nato
končno sliko sestavimo po enačbi (5). Pri tem se prispevki zaradi sipanja
spet odštejejo in ostane nam slika z bolǰsim kontrastom. Pri zarodku ribe
medake se kontrast z uporabo metode DSLM-SI v povprečju poveča za 80 %,
pri zarodku vinske mušice, pri katerem je efekt sipanja zelo močan, pa kar
za 260 % [8].
V primerjavi z metodo SPIM-SI ima DSLM-SI tri pomembne prednosti.
Prva je, da je modulacija laserskega žarka lahko zelo hitra, kar omogoča
hitro zajemanje slik s fazno zamaknjenimi strukturami osvetlitve. Druga
prednost je izjemna stabilnost in kvaliteta osvetlitvenega vzorca v naspro-
tju z vzorcem, ki ga pri metodi SPIM-SI tvorimo z mrežico. Ta lahko
rahlo drsi in spreminja lego, zato je manj primerna za dlje trajajoče slikanje
vzorca. Tretja prednost metode DSLM-SI pa je možnost hitrega prilaga-
janja frekvence in faze modulacije intenzitete osvetljevanja, kar omogoča
spreminjanje strukture osvetlitve v skladu s spreminjanjem sipalnih lastno-
sti opazovanega predmeta [8].
Sklep
Mikroskopija z ravninsko osvetlitvijo vzorca je nova metoda, pomembna
predvsem v razvojni biologiji. Z metodo digitalnega laserskega skeniranja
217–224 223
i
i
“Vitek” — 2013/1/15 — 21:15 — page 224 — #8 i
i
i
i
i
i
Maruša Vitek
so denimo posneli tako imenovan
”
digitalni zarodek“ ribe cebrice. To je
baza podatkov, ki vsebuje lege in hitrosti 92 % celičnih jeder zarodka vse
od prve celične delitve do vzpostavitve bitja srca.
SPIM omogoča slikanje celotnih živih vzorcev, velikih do nekaj mili-
metrov. Je edina metoda, pri kateri je možno opazovanje celotnih živih
organizmov s tako visoko ločljivostjo (∼ µm). Zelo pomembno je, da je ne-
destruktivna, tako da omogoča vpogled v življenjske procese in razvoj. Pri
tovrstnih vzorcih zaradi absorpcije svetlobe in sipanja prihaja do težav, ki
pa se jim lahko izognemo z večsmernim in s strukturiranim osvetljevanjem.
Zaradi uspešnosti metode SPIM v razvojni biologiji se je njena uporaba
začela širiti tudi na druga področja. V fiziki razvijajo sorodno visokoločljivo
metodo za optično sledenje nanodelcem.
SPIM je metoda z visoko ločljivostjo, hitrim zajemanjem, veliko pene-
tracijsko globino ter odličnim razmerjem med signalom in šumom. Slabost
metode pa je, da z njo lahko opazujemo samo vzorce, ki vsebujejo fluoro-
fore. To navadno pomeni, da morajo biti vzorci gensko spremenjeni in torej
niso več enaki izvornim. Leta 2011 je bil objavljen članek, ki predstavlja
nizkokoherenčno mikroskopijo z ravninsko osvetlitvijo za slikanje bioloških
vzorcev brez fluorescence [9]. V to smer bo verjetno tekel tudi nadaljnji
razvoj, saj je končni cilj dobiti metodo, s katero bi lahko z visoko prostorsko
in časovno ločljivostjo opazovali žive nespremenjene vzorce.
LITERATURA
[1] J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbrodt in E. H. K. Stelzer, Optical Sectio-
ning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy, Science
305, 1007–1009 (2004).
[2] J. Huisken in D. Y. R. Stainier, Selective plane illumination microscopy techniques
in developmental biology, Development 136, 1963–1975 (2009).
[3] U. Kržič, Multiple-view microscopy with light-sheet based fluorescence microscope,
Combined faculties for the natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-
Carola University of Heidelberg, Germany, doktorska disertacija, 2009.
[4] K. Greger, J. Swoger in E. H. K. Stelzer, Basic building units and properties of
a fluorescence single plane illumination microscope, Rev. Sci. Instrum. 78, 023705
(2007).
[5] J. Huisken in D. Y. R. Stainier, Even fluorescence excitation by multidirectional
selective plane illumination microscopy (mSPIM), Opt. Lett. 32, 2608–2610 (2007).
[6] T. Breuningen, K. Greger in E. H. K. Stelzer, Lateral modulation boosts image qua-
lity in single plane illumination fluorescence microscopy, Opt. Lett. 32, 1938–1940
(2007).
[7] P. J. Keller, A. D. Schmidt, J. Wittbrodt in E. H. K. Stelzer, Reconstruction of
Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy, Science
322, 1065–1069 (2008).
[8] P. J. Keller, A. D. Schmidt, A. Santella, K. Khairy, Z. Bao, J. Wittbrodt in
E. H. K. Stelzer, Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light
sheet-based structured-illumination microscopy, Nat. Methods 7, 637–642 (2010).
[9] Z. Xu in T. E. Holy, Development of Low Coherence Light Sheet Illumination Micro-
scope for Fluorescence-free Bioimaging, Proc. SPIE 8129, 812908 (2011).
224 Obzornik mat. fiz. 59 (2012) 6