Tine GREBENC*, Marko BAJC*, Hojka KRAIGHER*
udk 630*181.351
poledenodobne migracije mikoriznih rastlin in glivnih partnerjev v
simbiozi: primer RODU tuber
post-glacial migrations of mycorrhizal plants and ectomycorrhizal partners: an example of the genus Tuber
Povzetek: Rod Tuber je ektomikorizni rod gliv, razširjen v večjem delu J in JV Evrope. V raziskavi smo s filogeografskim pristopom ugotavljali, ali izbrane vrste iz rodu izkazujejo geografsko diferenciranost na nivoju genov rRNK. Iz razpoložljivih nukleotidnih zaporedij, ki izvirajo iz večjega dela areala vrst roda Tuber, smo za več vrst ugotovili razporejanje in ločevanje genotipov glede na položaj ledeniških zatočišč v zadnji ledeni dobi in glede na znane poledenodobne migracijske poti ha-plotipov drevesnih partnerjev (hrastov). Območje Slovenije seje izkazalo za območje mešanja več genotipov variabilnih vrst. Prisotnost več genotipov ene vrste gliv nakazuje možnost križanja oziroma mešanja dveh poledenodobnih migracijskih poti, kar daje območju dodatno vrednost s stališča biotske raznovrstnosti. Poznavanje genetske pestrosti in funkcionalne povezave glivnih in rastlinskih genotipov lahko nudi usmeritve pri gospodarjenju z gozdovi, pridobivanju gozdnih proizvodov in morebitnem načrtnem gojenju drevesnih in glivnih partnerjev v simbiozi z namenom pridelave gliv. Ključne besede: biotska raznovrstnost, ektomikoriza, filogeografija gliv, hipogeje glive, južna in jugovzhodna Evropa, molekularna filogenija
Abstract: The genus Tuber is an important ectomycorrhizal genus in Europe, forming symbiosis with a wide range of woody plants. In our research we aimed to apply phylogeography approach to analyse the geographical differentiation of Tuber species based on rDNA analysis. Available nucleotide sequences originating from S and SE Europe showed genetic differentiation and distribution in several Tuber species. The observed phylogenetic clades corresponded to the last glacial refugia pools and post-glacial migration paths of symbiotic plants (oaks). Based on the high number of the analysed Tuber ribotypes found in Slovenia, this area appears to be the encountering zone of two postglacial migration routes and an important biodiversity hot-spot. The knowledge on genetic diversity and geographic distribution of genotypes can contribute to the biodiversity and functional correlations of plant and fungal partners in ectomycorrhiza and subsequently to the forest management planning and potential cultivation of fungi.
Keywords: Biodiversity, Ectomycorrhiza, Phylogeography of fungi, Hypogeous fungi, South and Southeast Europe, Molecular phylogeny
uvod
V kvartarju so se v času med in po poledenitvah številne drevesne vrste odzivale na spremembe v okolju z migracijami (Wilkinson, 1998). V hladnejših obdobjih, predvsem v zadnjem dlje trajajočem hladnem obdobju pred približno
Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana, e-pošta: tine.grebenc@gozdis.si
11-10 tisoč leti je bil precejšnji del Evrope pokrit z ledom, preostale dele so preraščale polpuščavske stepe (Adams in Faure, 1997). Gozdna vegetacija, vključno z ektomikori-znimi partnerji, je bila omejena le na posamezne gorske verige polotokov južne in jugovzhodne Evrope (Adams in Faure, 1997; Randi, 2007). Z ogrevanjem ozračja in umikanjem ledenega pokrova se je do pred ca. 5000 leti oblikovala klima, razporeditev vegetacije (tudi gozdov) in raz-

poreditev genotipov znotraj vrst, kot jo poznamo danes (Grove in Rackham, 2001).
Rod Tuber predstavlja 86 različnih vrst gliv iz skupine asko-micet (Tuberaceae, Ascomycotina, Fungi). Rod je splošno razširjen in številčen predvsem v zmernem in mediteranskem pasu vseh kontinentov (Kirk in sod., 2008). Posamezne vrste so v glavnem omejene na en kontinent, oziroma se morfološko podobne vrste med kontinenti na molekularni ravni jasno ločijo na vrstnem nivoju (Wang in sod., 2006, Grebenc in sod., v pripravi). Znotraj družine Tuberaceae je rod Tuber najobsežnejši ektomikorizni rod (Agerer, 1987-2006), ki tvori izključno podzemne (hipo-geje) trosnjake (Paolocci in sod., 2004; Lœss0e in Hansen, 2007). Podzemna rast razmnoževalnih struktur je povezana s specifičnim načinom razširjanja, saj vse vrste iz rodu Tuber ob zorenju trosnjakov proizvajajo značilne hlapne (volatilne) substance, ki privlačijo raznašalce spor. Spore prenašajo v večji meri insekti ter mali sesalci, ostali načini prenosa (na primer z vodo, prenašanjem zemlje ipd.) so redkejši (Frank in sod., 2006). Način prenosa spor tako poteka na relativno kratkih razdaljah, podobno kot pri ar-buskularno mikoriznih glivah (Wilkinson, 1998), in s tem v tesnejši povezavi z migracijami drevesnih partnerjev v ektomikorizi.
Filogeografija je veda, ki razlaga geografsko razporeditev osebkov glede na filogenetsko raznolikost populacij znotraj vrste na osnovi genealogije izbranih genov (Avise, 2000). V literaturi ni znanih veliko primerov filogeografije gliv. Eden od pomembnih razlogov je ta, da zaradi velikega pomena razširjanja na velike razdalje glive (predvsem spore gliv) kažejo široko razširjenost. To velja predvsem za nekatere saprobne vrste (Moncalvo in Buchanan, 2008). Značilne geografske vzorce razporejanja posameznih filogenetskih skupin višjih gliv so do sedaj ugotavljali za ektomikorizne gobane (Boletales) na področju Pacifika (Halling in sod., 2008) in za skupino nemikoriznih (saprob-nih) podzemnih bazidiomicet Hysterangiales (Hosaka in sod., 2008). Podatkov o filogeografiji ektomikoriznih vrst, ki tvorijo izključno podzemne trosnjake (npr. rod Tuber), kljub velikemu pomenu v gozdnih ekosistemih, še ni.
Namen naše študije je prikazati načine ugotavljanja znotraj vrstne pestrosti na ravni DNK in razložiti opaženo pestrost s filogeografskim pristopom. Za potrditev hipoteze o somigracijah partnerjev v simbiozi kot modela izbora in somigracij najprimernejših genotipov obeh partnerjev glede dogajanja v preteklosti in glede na današnje ekološke razmere, smo analizirali izbrana nukleotidna zaporedja za rod Tuber in predhodno objavljene migracijske poti potencialnih drevesnih partnerjev v ektomikorizi.
metodologija
IZBOR PODATKOV IN ANALIZE
Za filogeografske analize lahko uporabljamo katerokoli informativno regijo genoma vzorca, ki je jasno določen do vrste in zanj obstajajo zadostni podatki o nahajališču. Za glive iz rodu Tuber je v javno dostopnih bazah nukleo-tidnih zaporedij deponirano zadovoljivo število nukleoti-dnih zaporedij, pretežno regije rDNK, ki pa so v večji meri brez podatkov o izvoru, predvsem zaradi komercialnih interesov. Za zagotovitev zadostne pokritosti celotnega areala analiziranih vrst s kvalitetnimi in informativnimi spremljajočimi podatki za območje J in JV Evrope, smo poleg zaporedij, deponiranih v javno dostopnih bazah podatkov NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) in UNITE (http:// unite.ut.ee/), v analize vključili tudi nukleotidna zaporedja lastnih predhodnih študij (Marjanović in sod., 2009; Grebenc in sod., v pripravi).
FILOGENETSKA ANALIZA GLIVNIH PARTNERJEV
V	filogenetsko analizo in kasneje filogeografsko opredelitev smo vključili 92 različnih nukleotidnih zaporedij iz rodu Tuber, tako da smo zajeli vrste, ki so izkazovale znotraj vrstno variabilnost v predhodnih študijah, ter izbrane nevariabilne oziroma stabilne vrste. Vsi vzorci so bili na osnovi morfoloških znakov določeni do vrste. Za ugotavljanje filogenetskih odnosov lahko uporabimo kateregakoli od številnih orodij in matematičnih pristopov izdelave filogenetskega drevesa, ki za izbrana nukleotidna zaporedja omogočajo optimalne rezultate.
Filogenetsko analizo rodu Tuber smo izvedli na nukleotidnih zaporedjih, poravnanih v spletni verziji programa MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index. html). Poravnavo zaporedij smo naredili s funkcijo za vzporejanje nukleotidnih zaporedij »E-INS-I« (Kaloh in sod., 2005). Filogenetski položaj smo določili s programom PHYML c2.4.5 in izdelali ML (maximum likelyhood) filogenetsko drevo. Filogenetsko drevo ML za izbrana nukleotidna zaporedja smo izdelali z uporabo modela substitucij GTR - Generalised Time Reversible model (Tavaré, 1986). Končno filogenetsko drevo smo oblikovali in uredili v programu MEGA 4.
GEOGRAFSKA PORAZDELITEV HAPLOTIPOV DREVESNIH PARTNERJEV IN SOVPADANJE S FILOGENETSKO PORAZDELITVIJO GLIVNIH PARTNERJEV
V	EKTOMIKORIZI
Na osnovi razpoložljivih podatkov herbarijskega materiala za analizirane vzorce iz rodu Tuber (Grebenc in sod., v pripravi) se na rastiščih največkrat kot potencialni ektomikorizni partnerji pojavljajo hrasti (Quercus spp.) in beli
Slika 1: Shematski prikaz izhodnih podatkov in analiz v filogeografiji. Figure 1: Data and analyses in the phylogeography approach.
gabri (Carpinus spp.). Poledeniške migracijske poti hrastov so jasno diferencirane glede na območja refugijev zadnje poledenitve in smo jih povzeli po Petit in sod. (2002) in Ferris in sod. (1998). Za razliko od hrastov je geografska razporeditev haplotipov belih gabrov (Carpinus betulus in C. orientalis) manj ugodna za pojasnjevanje dobljenih filo-genetskih rezultatov, saj večji del vseh razpoložljivih vzorcev iz rodu Tuber izvira iz območja enega prevladujočega haplotipa obeh vrst. Poleg tega rod danes ni razširjen na Pirenejskem polotoku, kot enem od območij ledenodobnih zatočišč (Grivet in Petit, 2003).
rezultati in diskusija
FILOGEOGRAFIJA - SHEMATSKI PREGLED METODE IN REZULTATI ANALIZ ZA ROD TUBER
Filogeografski pristop nam poleg povezovanja genetskih in geografskih podatkov omogoča testiranje številnih hipotez, vezanih na sorodstvene odnose, porazdelitev vrst in mehanizmov, ki vodijo speciacijo in posredno navezovanje na razlage vplivov geologije, klime itn., na biotsko raznovrstnost analizirane skupine (Hickerson in sod., 2010). Informacije in nukleotidna zaporedja smo analizirali z izbranim filogenetskim pristopom in izdelali filogenetsko drevo, ki prikazuje sorodstvene odnose v rodu in znotrajvrstno pestrost nekaterih morfološko stabilnih vrst (Slika 1).
Analizirane vrste izhajajo iz treh glavnih področij ledeni-ških refugijev (Apeninski, Balkanski in Pirenejski polotok) in poledeniških migracijskih poti v centralni in južni Evropi. Največjo filogenetsko diferenciacijo kaže vrsta Tuber sp. 1, znotraj katere na osnovi analiziranih nukleotidnih zaporedij obstaja pet različnih končnih grozdov, od katerih trije sovpadajo z ledeniškimi refugiji in poledeniškimi migracijami hrastov. Diferenciacija znotraj morfološke vrste Tuber sp. 2 je manj značilna, ločita se le dve skupini genotipov, prva omejena na Balkanski polotok in druga, ki sega od Slovenije preko večjega dela zahodne Evrope.
somigracije ektomikoriznih gliv in drevesnih partnerjev
Migracijske poti rastlinskih vrst v začetku holocena, predvsem po zadnji ledeni dobi, so relativno dobro znane, tako na osnovi palinoloških raziskav, kot tudi iz značilne geografske razporeditve genotipov (haplotipov) analiziranih vrst (Adams in Faure, 1997; Randi, 2007; Ballian in sod., 2006). Za razliko od drevesnih partnerjev je manj znanega o pomenu in (so)migraciji glivnih partnerjev v ektomikorizi (Wilkinson, 1998). Dogodki, ki bi lahko pripeljali do diferenciacije gliv na genetskem nivoju med posameznimi refugiji in kasneje migracijskimi potmi, so:
► Umikanje termofilne in zmerne vegetacije z ektomi-
koriznimi glivami v južne predele Evrope, pretežno na hribovite dele polotokov, kjer se je ohranila v refugiju v času mlajšega driasa, pred ca. 10.500 leti (Randi, 2007)
►	Zmanjševanja pestrosti in števila drevesnih in predvidoma tudi ektomikoriznih partnerjev v času ledene dobe. Tako je v obdobju mlajšega driasa (10.500-6.000 pr.n.š.) prišlo do t.i. ozkega grla (Adams in Faure, 1997), kar so dokazali pri ektomikorizni vrsti Tuber melano-sporum (Murat in sod., 2004).
►	Po umiku ledu konec mlajšega driasa, in najkasneje do ca. 5.000 let pr.n.š., so se preživeli genotipi rastlin in njihovih partnerjev v ektomikorizi postopno začeli vračati v ponovno ugodna rastišča osrednjih delov Evrope, predvsem v smeri SV in SZ (za primer hrastov glej Petit in sod., 2002), dokler niso dosegli današnje razširjenosti (Dawson, 1996).
►	Na območjih, kjer so se migracijske poti križale ali mešale, je prišlo do pojavljanja večjega števila genotipov iste vrste. Posledica mešanja je velika biološka raznovrstnost teh območij (Myers in Cowling, 1999). Področje Slovenije je tak primer vroče točke (Mršič in Gantar, 1997) za nekatere vrste ektomikoriznih gliv.
Rod Tuber je s stališča biotske raznovrstnosti na območju južne (Montecchi in Sarasini, 2000; Jeandroz in sod., 2008) in jugovzhodne Evrope (Halasz in sod., 2005, Piltaver in Ratoša, 2006; Marjanović in sod., 2009) dobro poznan in v zadnjem desetletju zadovoljivo vzorčen, filogeografsko pa je bila do sedaj opredeljena le vrsta Tuber melanospo-rum (Murat in sod., 2004).
Filogenetska študija je podprla predhodno opažene razlike genov rRNK znotraj posameznih vrst (Pomarico in sod., 2007, Jeandroz in sod., 2008, Marjanović in sod., 2009, Gre-benc in sod., v pripravi). Korelacija z geografskim izvorom je pokazala, da se nekatere vrste iz posameznega filoge-netskega grozda značilno pojavljajo vzdolž razporeditve enega od haplotipov hrastov (Slika 2). Rezultati potrjujejo predhodno opažena razporejanja genotipov za vrsto Tuber melanosporum, kjer so avtorji uspeli povezati migracijske poti haplotipov hrastov in genotipov gomoljike na področju Francije in severne Italije (Murat in sod., 2004).
Kot zanimivo območje mešanja dveh različnih filogenet-skih tipov obeh variabilnih vrst se je pokazalo območje Slovenije, predvsem prehodni del med Dinarskim in Su-bmediteranskim področjem. Dobljeni rezultati potrjujejo predvidene dogodke v preteklosti, vključno s poledeniškimi migracijami, saj velika molekularna pestrost (Gre-benc in sod., v pripravi) nakazuje na možnost križanja oziroma mešanja dveh migracijskih poti na tem področju. To daje omenjenemu območju dodatno vrednost s stališča biotske raznovrstnosti. Poznavanje genetske pestrosti in funkcionalne povezave glivnih in rastlinskih genotipov sta nujna tudi za uspešno obnavljanje gozda, usmerje-
Slika 2: Geografska distribucija genotipov variabilnih vrst iz rodu Tuber, glede na poledeniške migracijske poti hrastov (povzeto po Petit in sod., 2002). Krogi predstavljajo genotipe in področje vzorčenja trosnjakov. Figure 2: Geographic distribution of genotypes from the variable tuber species in regard to the postglacial migration of oak haplotypes (adapted from petit et al., 2002). Dots represent genotype and the area of ascocarp sampling.
no sajenje, dolgoročno stabilnost gozdnega ekosistema in končno tudi kot usmeritev pri morebitnem načrtnem gojenju drevesnih in glivnih partnerjev v simbiozi z namenom pridelave gliv.
zahvale
Večino uporabljenih sekvenc smo povzeli po člankih Mar-janović in sod., 2009 in Grebenc in sod., (v pripravi). Vsem soavtorjem se najlepše zahvaljujemo za možnost uporabe podatkov. Analizo in pripravo publikacije so sofinancirali projekti EUREKA E!3835 EUROAGRI- CULTUBER "Improvement of truffle cultivation via novel quality control, soil analysis and inoculation methods", SYNTHESYS ES-TAF-1729, CRP »Konkurenčnost Slovenije 2006-2013« V4-0492 (ARRS in MKGP) in Raziskovalni program P04-0107 »Gozdna biologija, ekologija, tehnologija« v okviru ARRS. Andreju Verliču se zahvaljujemo za tehnično pomoč pri urejanju besedila.
literatura
1.	Adams J.M., Faure H. (1997). QEN members. Review and Atlas of Palaeovegetation: Preliminary land ecosystem maps of the world since the Last Glacial Maximum (1997) Oak Ridge National Laboratory, TN, USA. http://www.esd.ornl.gov/projects/qen/adams1.html (17. 3. 2010)
2.	Agerer R. (1987-2006) Colour Atlas of Ectomycorrhizae. 13th ed. Einhorn-Verlag Schwabisch Gmund, München, (loč. pag.)
3.	Avise J.G. (2000) Phylogeography: the history and formation of species. Harvard University Press, Cambridge, USA, 447
4.	Ballian D., Grebenc T., Božič G., Melnik v., Wraber T., Kraigher H. (2006) History, genetic differentiation and conservation strategies for disjunct populations of Sibiraea species from Southeastern Europe and Asia. Conservation Genetics, 7: 895-907
5.	Dawson A.G. (1996) Ice age Earth: late Quaternary geology and climate. Routledge, New York, 293
6.	Ferris C., King R.A., Väinölät R., Hewitt G.M. (1998) Chloroplast DNA recognizes three refugial sources of European oaks and suggests independent eastern and western immigration to Finland. Heredity, 80: 584-593
7.	Frank J.L., Barry S., Southworth D. (2006) Mammal mycophagy and dispersal of mycorrhizal inoculum in Oregon White oak woodlands. Northwest Science, 80, 4: 264-273
8.	Grivet D., Petit R.J. (2003) Chloroplast DNA phylogeography of the hornbeam in Europe: Evidence for a bottleneck at the outset of postglacial colonization. Conservation Genetics, 4: 47-56
9.	Grove A.T., Rackham O. (2001) The nature of Mediterranean Europe: An ecological history. Yale University Press, New Haven, CT, 384
10.	Halasz K., Bratek Z., Szego D., Rudnoy S., Racz I., Lasztity D.,
Trappe j.M. (2005) Tests of species concepts of the small, white, European group of Tuber spp. based on morphology and rDNA ITS sequences with special reference to Tuber rapaeodorum. Mycolo-gical Progress, 4: 281-290
11.	Hailing R.E., Osmundson T.W., Neves M.-A. (2008) Pacific bo-letales: Implication for biogeographic relationship. Mycological Research, 112, 4: 437-447
12.	Hickerson M.J., Carstens B.C., Cevander-Bares j., Crandall K.A., Graham C.H., johnson j.B., Rissler L., victoriano P.F., Yoder a.D. (2010) Phylogeography's past, present and future: 10 years after Avise, 2000. Mol. Phylogenet. Evol., 54, 1: 281-301
13.	Hosaka K., Castellano, M.A., Spatafora, j.W. (2008) Biogeo-graphy of Hysterangiales (Phallomycetidae, Basidiomycota). Mycological Research, 112, 4: 448-462
14.	jeandroz S., Murat C., Wang Y., Bonfante P., le Tacon F. (2008) Molecular phylogeny and historical biogeography of the genus Tuber, the »true truffles«. Journal of Biogeography, 35, 5: 815-829
15.	Katoh K., Kuma K., Toh H., Miyata t. (2005) MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment. Nucleic Acids Research, 33, 2: 511-518
16.	Kirk P.M., Cannon P.F., Minter D.W., Stalpers j.A. (2008) Ains-worth & Bisby's Dictionary of the Fungi, 10th edition. CABI Publishing, Surrey, UK., 708
17.	Lœss0e T., Hansen K. (2007) Truffle trouble: what happened to the Tuberales? Mycological Research, 111: 1075-1099
18.	Marjanović Ž., Grebene T, Marković M., Glišić A., Milenković, M. (2009) Ecological specificity and molecular diversity of truffles (genus Tuber) originating from mid-west of the Balkan Peninsula. Sydowia (in print)
19.	Moncalvo j.-M., Buchanan P.K. (2008) Molecular evidence for long distance dispersal across the Southern Hemisphere in the Ga-noderma applanatum-australe species complex (Basidiomycota). Mycological Research, 112, 4: 425-436
20.	Montecchi A., Sarasini M. (2000) Fungi ipogei d'Europa. A.M.B. Fondazione Centro Studi Micologici, Vicenza, Italy, 714
21.	Mršič N., Gantar P. (1997) Biotic diversity in Slovenia : Slovenia - the »hot spot« of Europe. Ministry for Environment and Spatial Planning, Ljubljana, 129
22.	Murat C., Diez j., Luis P., Delaruelle C., Dupre C., Chevalier G., Bonfante P., Martin F. (2004) Polymorphism at the riboso-mal DNA ITS and its relation to postglacial re-colonisation routes of the Perigord truffle Tuber melanosporum. New Phytologist, 164: 401-411
23.	Myers N., Cowling R.M. (1999) Mediterranean Basin. V: Hotspots: Earth's Biologically Richest and Most Endangered Terrestrial Ecore-gions. Mittermeier R.A. (ur.), Meyers N. (ur.), Robles Gil P. (ur.), Mittermeier C.G. (ur.), CEMEX, Mexico: 254-267
24.	Paolocci F., Rubini A., Riccioni C., Topini F., Arcioni S. (2004) Tuber aestivum and Tuber uncinatum: two morphotypes of two species? FEMS Microbiology Letters, 235: 109-115
25.	Petit R.j., Brewer S., Bordacs S., Burg K., Cheddadi R., Coart
E.,	Cottrell j., Csaikl U.M., van Dam B.C., Deans j.D., Fineschi S., Finkeldey R., Glaz I., Goicoechea P.G., jensen j.S., König A.O., Lowe A.j., Madsen S.F., Matyas G., Munro R.C., Popescu
F.,	Slade D., Tabbener H., de Vries S.M.G., Ziegenhagen B., de Beaulieu j.-L., Kremer A. (2002) Identification of refugia and post-glacial colonization routes of European white oaks based on chloroplast DNA and fossil pollen evidence. Forest Ecology and Management, 156: 49-74
26.	Piltaver A., Ratoša I. (2006) Prispevek k poznavanju podzemnih gliv v Sloveniji. Gozdarski Vestnik, 64, 7/8: 303-312, 329-330
27.	Pomarico M., Figliuolo G., Rana G.L. (2007) Tuber spp. biodiversity in one of the southernmost European distribution areas. Biodivers. Conserv., 16: 3447-3461
28.	Randi E. (2007) Phylogeography of South European mammals. V: Phylogeography of Southern European refugia. Weiss S. (ur.), Fer-rand N. (ur.), Springer, 101-126
29.	Tavaré S. (1986) Some probabilistic and statistical problems in the analysis of DNA Sequences. American Mathematical Society: Lectures on Mathematics in the Life Sciences, 17: 57-86
30.	Wang Y., Tanm Z.M., Zhang D.C., Murat C., jeandroz S., Le Tacon F. (2006) Phylogenetic relationships between Tuber pseu-doexcavatum, a Chinese truffle and other Tuber species based on parsimony and distance analysis of four different gene sequences. FEMS Microbiology Letters, 259: 269-281
31.	Wilkinson D.M. (1998) Mycorrhizal fungi and Quaternary plant migrations. Global Ecology and Biogeography Letters, 7: 137-140