HMELJARSKI BILTEN (HOP BULLETIN), 12(2005), strani (pages) 65 - 70_65
DOLOČANJE TRANSGENOV V HMELJU PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens
Suzana ŠKOF, Zlata LUTHAR2
UDK/UDC 633.791:579.64:57.084/.085 (045) izvirni znanstveni članek/original scientific article prispelo/received: 17. 10. 2005 sprejeto/accepted: 25. 11. 2005
IZVLEČEK
V nodije hmelja sorte Aurora smo s posredno transformacijo z Agrobacterium tumefaciens vnesli testni gus (uidA) gen in rastlinski selekcijski nptIl gen. Izražanje testnega gus gena smo preverjali z metodo histokemičnega GUS testa aktivnosti p-glukuronidaze v poganjkih nastalih na transformiranih izsečkih. Na podlagi GUS testa je bilo 10,7 % nastalih regenerantov uspešno transformiranih. Z molekulsko analizo modro obarvanih regenerantov (GUS pozitivnih regenerantov) smo s PCR metodo (polimerazno verižno reakcijo) preverili vključenost testnega in selekcijskega gena v rastlinski genom in v večini primerov potrdili vključenost obeh transgenov.
Ključne besede: hmelj, transformacija, Agrobacterium tumefaciens, gus gen, nptll gen
IDENTIFICATION OF TRANSGENES IN HOP AFTER Agrobacterium-MEDIATED TRANSFORMATION
ABSTRACT
Agrobacterium-mediated transformation of hop nodal explants was used for the introduction of a gus (uidA) marker gene and nptll plant selection gene into commercial hop cv. Aurora. Expression of the gus gene was evaluated by histochemical analysis of p-glucoronidase (GUS) activity in shoots that emerged on transformed hop explants. GUS staining revealed a relatively high transformation efficiency (10.7 % of all regenerants). Molecular analysis of blue coloured plants (GUS positive regenerants) by the PCR method (polymerase chain reaction) was used to detect integration of marker and selection genes into the hop genome and in the majority of cases confirmed the integration of both transgenes.
Key words: hop, transformation, Agrobacterium tumefaciens, gus gene, nptll gene
asist., univ. dipl. ing. agr., Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Katedra za genetiko, biotehnologijo in žlahtnjenje rastlin, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, Slovenija
2izr. prof., dr., ibid
66	Suzana [KOF, Zlata LUTHAR
1	UVOD
Novejše biotehnološke metode genskih transformacij predstavljajo dopolnitev in privlačno alternativo klasičnemu žlahnjenju hmelja, ki je dolgotrajen postopek tudi zaradi specifičnih lastnosti (dvodomna trajnica). Genske transformacije omogočajo relativno hitro vključitev željenih lastnosti v genom že obstoječih sort hmelja ne da bi spremenili njihove kvalitativne agronomsko pomembne lastnosti.
Predpogoj za učinkovit vnos željenih genov je visok odstotek regeneracije in vitro. Le nekaj avtorjev poroča o uspešni regeneraciji hmelja, največkrat preko oblikovanja kalusa na izsečkih, bodisi divjih varietet [1, 2] ali komercialnih sort hmelja [3]. O direktni regeneraciji dveh čeških kultivarjev hmelja poročata Rakousky in Matoušek [13]. Le nekaj objav poroča o začetkih transformacij pri hmelju. Dosedaj so dosegli le prehodno izražanje gus testnega gena v kalusnem tkivu [12] in stabilno izražanje gus testnega gena in to samo pri dveh tesno sorodnih genotipih hmelja Tettnanger in Saaz [5, 11]. Ker je regeneracija pri hmelju močno odvisna od genotipa [3], je potrebno razviti modificiran protokol regeneracije in posledično transformacije za vsako sorto/kultivar posebej. Do sedaj ni poročil o uspešni regeneraciji in transformaciji katerekoli slovenske sorte oz. divje oblike hmelja.
V raziskavi smo poskušali vzpostaviti učinkovit transformacijski sistem s pomočjo posrednega vnosa genov z bakterijo Agrobacterium tumefaciens pri najbolj razširjeni slovenski sorti hmelja Aurora. Izražanje vnešenega testnega gus (p-glukuronidaza) gena smo preverili s histokemičnim GUS testom, vključitevtestnega in selekcijskega nptIl (odpornost na antibiotik kanamicin) gena v rastlinski genom s PCR analizo.
2 MATERIAL IN METODE
2.1 Rastlinski material, kokultivacija z Agrobacterium in regeneracija transformiranih rastlin
Iz in vitro gojenih rastin sorte hmelja Aurora smo narezali nodije in jih gojili tri dni na regeneracijskem gojišču z MS [10] makro in mikroelementi ter vitamini z dodanim inozitolom 100 mg/l, glukozo 20 g/l, TDZ 1 mg/l, IAA0,025 mg/l, acetosiringonom 100 mM inagarjem 8 g/l; pH 5,8.
V tekočem YEB gojišču smo gojili do logaritemske faze rasti Agrobacterium tumefaciens sev LBA4404 z vnešenim pCAMBIA2201 plazmidom, ki je vključeval testni gus gen z intronom in selekcijski nptllgen, oba pod kontrolo CaMV35S promotorja.
Izsečke hmelja - nodije smo potopili v suspenzijo z Agrobacterium (10 min), izpostavili ultrazvoku (60 s) in vakuumu (10 min) ter nato še pustili v bakterijski suspenziji (10 min), posušili na sterilnem filterskem papirju in prestavili na regeneracijsko gojišče s 100 mM acetosiringonom. Po treh dneh kokultivacije smo izsečke sprali z raztopino antibiotika timentin [100:1 tikarcilin : klavulonska kislina] 200 mg/l, osušili na sterilnem filtrskem papirju
DOLOČANJE TRANSGENOV V HMELJU PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens	67
in prestavili na regeneracijsko gojišče s timentinom 150 mg/l, da bi preprečili rast Agrobacterium. Gojili smo jih v rastni komori pri 16/8 h (svetloba/tema) fotoperiodi, temperaturi 24±1°Cinosvetlitvi 40 pmol m-2s-1.
2.2	Histokemični test aktivnosti gus gena
S histokemičnim GUS testom smo testirali aktivnost gus gena v listih novo nastalih poganjkov na kalusnem tkivu. Obarvanje z raztopino X-Gluc (5-bromo-4-kloro-3-indolil glukoronid) smo izvedli 110 dni pookuževanju izsečkovzAgrobacterium [6,4]. Celice, v katerih se izraža gus gen, se obarvajo modro.
2.3	Molekulska analiza rastlinskega materiala s PCR metodo
Celokupno genomsko DNA smo izolirali iztransfomiranih poganjkov z izraženim gus genom in kontrolnih netransformiranih rastlin po protokolu s CTAB detergentom [7]. Koncentracijo izolirane DNAsmo določili z mini DNAfluorometrom(TKO 100) in jo razredčili na 20 ng/pl.
S PCR analizo smo preverili vključitev testnega in selekcijskega gena. Uporabljeni specifični začetni oligonukleotidi (GUS3for/GUS3rev, NPTIIa/NPTIIb) so bili narejeni za pomnožitev fragmenta 408 bp pri gus oz. fragmenta 650 bp pri nptIl genu. PCR reakcijska mešanica je vsebovala 1xPCR pufer, 0,1 mM vsakega deoksinukleotid trifosfata, 0,5 mM ustreznega začetnega oligonukleotida (GUS ali NPT), 1 enoto Taq DNA polimeraze in ustrezen volumen DNA vzorca. Namnoževanje DNA je potekalo v cikličnem termostatu (Thermal Cycler 480) po modificiranem temperaturnem profilu [8]: začetna denaturacija DNA pri 94 °C 5 min, nato 35 ciklov: 1 min pri 94 °C, 1 min pri 58 °C in 1,5 min pri 72 °C ter končno izdolževanje fragmentov 5 min pri 72 °C. Namnožene fragmente smo ločevali na 1,4 %agaroznem gelu in vizualiziralizetidijevim bromidom pod UV svetlobo.
3 REZULTATI
110 dni po okužbi izsečkov z Agrobacterium tumefaciens smo z GUS testom preverili izražanje testnega gus genavregeneriranih poganjkih nastalih na kalusnem tkivu. Med 475 testiranimi poganjki jih je imelo 51 vsaj eno modro točko (preglednica 1) in od teh 14 intenzivnejše modro obarvanje.
Preglednica 1: GUS test na listih poganjkov, nastalih na izsečkih sorte hmelja Aurora 110 dni po okužbi z Agrobacterium
Table 1:	GUS-assay of shoots's leaves formed on explants of hop cv. Aurora performed 110
days afterAgrobacterium-mediated transformation
Testirani poganjki	GUS pozitivni* poganjki	Odstotek transformacije (%)
475	51	10,7
*Vsaj ena modra točka
68	Suzana [KOF, Zlata LUTHAR
Pri 47 GUS pozitivnih poganjkih jih je bilo 14 intenzivneje modro obarvanih in 33 z vsaj eno modro točko. Pri teh smo preverili vključitev testnega gus in selekcijskega nptIl gena v rastlinski genom s PCR metodo (slika 1). Rezultati so prikazani v preglednici 2.
Preglednica 2: PCR analiza 47 z GUS testom pozitivnih regenerantov hmelja Table 2:	PCR analysis of 47 with GUS-assay positive hop regenerants
Štev. regenerantov		Vgrajeni transgeni		
z vgrajenimi transgeni	gus in nptll	samo gus	samo nptll	brez obeh
14 intenzivno				
modro obarvanih	10	1	1	2
regenerantov				
33 regenerantov z				
le nekaj modrimi	22	3	3	5
točkami				
Od 14 analiziranih poganjkov, ki so bili intenzivneje modro obarvani z GUS testom, jih je imela večina, kar 71,4 % vgrajen tako testni (gus) kot selekcijski (nptll) gen, 7,1 % samo gus ali samo nptll gen in 14,3 % nobenega od transgenov. Podobno smo pri 33 poganjkih z le nekaj modrimi točkami zaznali večinoma prisotnost obeh transgenov (66,7 %), 9,1 % jih je vsebovalo le enega od obeh transgenovter 15,1 % nobenega.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 K P M
Slika 1: PCR analiza vključitve testnega gus (a) in selekcijskega nptll (b) gena v genom 21 transformiranih regenerantov hmelja. 1 do21 -transformirane rastline, K-netransformirana rastlina, P-plazmid pCAMBIA2201, M - markerGeneRuler 100bp DNA Ladder(Fermentas) Figure 1 : PCR analysis of marker gus (a) and selection nptll (b) gene integration into genome of 21 transformant hop regenerants. 1 to 21 - trasformed hops; K - control plant, P - pCAMBIA2201; M -markerGeneRuler 100bp DNA Ladder (Fermentas)
DOLOČANJE TRANSGENOV V HMELJU PO TRANSFORMACIJI Z Agrobacterium tumefaciens	69
Iz slike 1 je razvidno, da se pri transformantih št. 2 in 14 ni namnožil DNA fragment pribl. dolžine 408 bp (gus gen) (slika 1a), medtem ko se je namnožil DNA fragment pribl. dolžine 650 bp, ki potrjujejo vključenost nptIl gena (slika 1b). Pri transformantu št. 21 pase je ravno obratno namnožil DNA fragment, ki potrjuje vključenost gus gena (slika 1a), ni pa fragmenta nptllgena (slika 1b).
4 RAZPRAVA IN SKLEPI
GUS test smo izvedli več kot tri mesece po okužbi izsečkov hmelja z A. tumefaciens, zato je modro obarvanje testiranih regeneriranih poganjkov pokazalo ne le prehodno temveč stabilno izražanje testnega gus gena. Testirani listi nekaterih transgenih regenerantov so imeli večja intenzivno modra področja, drugi le nekaj modrih točk. Opazili smo tudi modro obarvanje pretežno v žilnem tkivu, kar so opazili tudi pri drugih rastlinskih vrstah [9]. Intenzivnost in vzorec modrega obarvanja sta odvisna od mesta vključitve in števila kopij gus gena, ki se naključno vgradi v rastlinski genom in od opremeljenosti gena s promotorjem. Na podlagi GUS testa smo dobili relativno visokodstotek uspešnosti transformacije (10,7% vseh na izsečkih nastalih regenerantov). Horlemann in sod. [5] poročajo o 2,9 % GUS pozitivnih organogenih skupkih.
PCR se lahko uporablja kot rutinsko analitično orodje za hitro analizo prisotnosti transgenov v transformiranih rastlinah. Ker je bil gus gen v našem primeru opremljen z intronom, kateri onemogoča izražanje gena v bakteriji, so bili preprečeni PCR lažno pozitivni rezultati zaradi možne kontaminacije rastlinskega materiala z Agrobacterium, ki lahko ostane v kulturi. Od testiranih 47 GUS pozitivnih regenerantov jih je imela večina, kar 70% vgrajena tako testni kot selekcijski gen, manjši del 8 % le enega od obeh in 14 % nobenega od obeh (pregledica 2). Pri transformaciji se vgradi v rastlinski genom celotni genski konstrukt (v našem primeru gus in nptIl gen). V primerih, ko smo detektirali le enega od obeh transgenov, je lahko prišlo do mutacij/delecij ali modifikacij samo v enem delu genskega konstrukta, še posebej je to verjetneje za nptll gen, kerv gojišču za regeneracijo ni bilo selekcijskega antibiotika. Lahko je šlo tudi za himerno tkivo (samo del celic je bil uspešno tranformiran) in je sčasoma netransformirano tkivo preraslo transgeno tkivo, kar se je najverjetneje zgodilo tudi v primerih, ko v predhodno GUS pozitivnih regenerantih nismo detektirali nobenega od transgenov. Horlemann in sod. [5] so s PCR preverili vključitev le selekcijskega nptll gena in ugotovili, da so imeli vsi GUS pozitivni organogeni skupki, ki so rasli na selekciji tudi vključen selekcijski (nptll) gen. V primeru, če se genski konstrukt vgradi na mesto v genom, ki ni kodirajoče se ga lahko dokaže z molekulskimi analizami, vendar se gen ne izraža, ni funkcionalen in ne zasledimo produkt oz. lastnost. Stabilnost transgena je potrebno testirati tako na DNA nivoju, kot njegov produkt oz. produkte tudi na potomcih.
Vzpostavljeni transformacijski protokol je prvi objavljeni pri slovenski sorti hmelja Aurora in nam bo služil kot osnova za vnos agronomsko pomembnih lastnosti (npr. odpornost na bolezni) v najbolj razširjeno slovensko sorto.
70	Suzana [KOF, Zlata LUTHAR
5 LITERATURA
1.	Batista, D., Sousa, M.J., Pais, M.S., Plant regeneration from stem and petiole-derived
callus of Humuluslupulus L. (hop) clone Bragangaand var. Brewers's Gold.-In Vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 32(1996) s. 37-41.
2.	Batista, D., Ascensao, L., Sousa, M.J., Pais, M.S., Adventitious shoot mass production
of hop (Humulus lupulus L.) var. Eroica in liquid medium from organogenic nodule cultures.-Plant Science, 151(2000) s. 47-57.
3.	Gurriaran, M.J., Revilla, M.A., Tames, R.S., Adventitious shoot regeneration in cultures
of Humulus lupulus L. (hop) cvs. Brevers Gold and Nugget.- Plant Cell Reports, 18(1999)s. 1007-1011.
4.	Hiei, Y., Ohta, S., Komari,T., Kumashiro, T., Efficient transformation of rice (Oryzasativa
L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.-The Plant Journal, 6(1994) 2, s. 271-282.
5.	Horlemann, C., Schwekendiek, A., Hohnle, M., Weber, G., Regeneration and
Agrobacterium-mediated transformation of hop (Humulus lupulus L.).- Plant Cell Reports, 22(2003)s. 210-217.
6.	Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bewan, M.W., GUS fusions: ¿-glucuronidase as a
sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants.- The EMBO Journal, 6(1987) s. 3901-3907.
7.	Kump, B., Svetek, S., Javornik, B., Izolacija visokomolekularne DNA iz rastlinskih tkiv.-
ZbornikBiotehniskefakultete UniverzevLjubljani, Kmetijstvo, 59(1992)s. 63-66.
8.	Lakshmi, S.G., Sreenivas, G.L., Bhattacharya, A., Agrobacterium mediated
transformation of sandalwood (Santalum album L.) a tropical forest tree.- Plant Tissue Culture and Biotechnology, 4(1998)s. 189-195.
9.	Mercuri, A., De Benedetti, L., Burchi, G., Schiva, T., Agrobacterium-mediated
transformation of African violet.- Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 60(2000) s. 39-46.
10.	Murashige, T., Skoog, F., A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco
tissue cultures.-PhysiologiaPlantarum, 15(1962) s. 473-497.
11.	Okada, Y., Saeki, K., Inaba, A, Suda, N., Kaneko, T., Ito, K., Construction of a gene
expression system in hop (Humulus lupulus) lupulin gland using valerophenone synthase promoter.-Journal of Plant Physiology, 160(2003) s. 1101-1108.
12.	Oriniakova, P., Pavingerova, D., Matousek, J., Methodical aspects of hop Humulus
lupulus L.) genetic transformation.-RostlinnaVyroba, 45(1999) s. 219-227.
13.	Rakousky, S., Matousek, J., Direct organogenesis in hop-a prerequisite for the
application of A. tumefaciens-mediated transformation.- Biologia Plantarum, 36(1994)s.191-200.