doi:10.14720/aas.2014.104.2.5
COBISS: 1.01 Agris category code: L50
CELULOSOMI IN CELULAZNI KONZORCIJ Ruminococcus flavefaciens 007C 1
Maša VODOVNIK :
Delo je prispelo 24. novembra 2014, sprejeto 12. decembra 2014. Received November 24, 2014; accepted December 12, 2014.
Celulosomi in celulazni konzorcij Ruminococcus flavefaciens 007C
Ruminococcus flavefaciens sodi med najpomembnejše celulolitične bakterijske vrste v vampu prežvekovalcev in debelem črevesu monogastričnih rastlinojedih sesalcev. Njena izjemna učinkovitost pri anaerobni razgradnji (hemi) celuloznih substratov je povezana s sintezo zunajceličnih multiencimskih kompleksov celulosomov. V pričujočem delu smo preučili genomski potencial za sintezo celulosomov in celulaz seva 007C, izražanje slednjih pa analizirali z encimogrami. V osnutku genoma tega seva smo identificirali v celoti ohranjeno gručo genov, ki kodirajo skafoldine, na osnovi njihove modularne zgradbe pa smo predvideli zgradbo celulosomov tega seva. Nabor genov za celulaze, ki smo jih identificirali v genomu seva 007C, obsega po en zapis za encima s katalitskima domenama GH48 in GH44 ter širok spekter domnevnih endoglukanaz iz družin GH9 in GH5. Pri večini teh encimov smo identificirali doker-inske domene, kar kaže na to, da so vezani v celulosome. Module za vezavo na celulozo smo identificirali le v kombinaciji s katalitskimi domenami GH9. Ugotovili smo tudi, da se večje endoglukanaze izražajo konstitutivno, manjše encime pa smo zaznali le v supernatantu kultur, ki so daljši čas rasle na mikrokristalinični celulozi.
Ključne besede: mikrobiologija / molekularna genetika / Ruminococcus flavefaciens / celulosomi / glikozid hi-drolaze / anaerobna razgradnja celuloze
Ruminococcus flavefaciens 007C cellulosomes and cellulase consortium
Ruminococcus flavefaciens is among the most important cellulolytic bacterial species in rumen and gastrointestinal tract of monogastric herbivorous animals. Its efficiency in degradation of (hemi)cellulosic substrates is associated with the production of remarkably intricate extracellular multienzyme complexes, named cellulosomes. In the present work we investigated the cellulolytic system of 007C. The bioinformatic analysis of the draft genome sequence revealed identical organization of sca gene cluster as has previously been found in four other strains of R. flavefaciens. The cluster consists of five genes in the following order: scaC-scaA-scaB-cttA-scaE. The cellulases of R. flavefaciens 007C belong to four families of glycoside hydrolases, namely GH48, GH44, GH9 in GH5. Majority of these enzymes are putative endoglucanases, belonging to families GH5 and GH9, whereas only one gene encoding GH44 and GH48 was found. Apart from catalytic domains, most of these proteins also contain dockerins - signature sequences, which indicate their attachement to cellulosomes. On the other hand, carbohydrate-binding modules were only found coupled to GH9 catalytic domains. Zymogram analysis showed that larger endoglucanases were mostly constitutively expressed, wheras smaller enzymes were only detected in later phases of Avicel-grown cultures.
Key words: microbiology / molecular genetics / Ruminococcus flavefaciens / cellulosomes / glycoside hydrolases / anaerobic cellulose degradation
1	Prispevek je del doktorske disertacije z naslovom »Celulolitični sistem sevov 007C in 007S bakterije Ruminococcus flavefaciens«, ki jo je doc. dr. Maša Vodovnik izdelala pod mentorstvom prof. dr. Romane Marinšek Logar / This article is a part of the doctoral dissertation »Cellulolytic system of bacterium Ruminococcus flavefaciens strains 007C and 007S«, issued by Maša Vodovnik, supervisor Prof. Romana Marinšek Logar, Ph.D.
2	Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Katedra za mikrobiologijo in mikrobno biotehnologijo, Groblje 3, 1230 Domžale, Slovenija, e-naslov: masa.vodovnik@bf.uni-lj.si
1 UVOD
Razgradnja rastlinske biomase je ključnega pomena v kmetijstvu ter procesih recikliranja odpadne organske biomase iz agroživilskega sektorja in papirne industrije, poleg tega pa v zadnjem času predstavlja vse pomembnejšo alternativno možnost proizvodnje bioe-nergije, ki bi lahko delno nadomestila (po mnogih napovedih kmalu izčrpana) fosilna goriva. Iz celuloznih odpadkov je namreč mogoče z mikrobno hidrolizo polimerov in nato fermentacijo nastalih produktov pridobivati energetsko bogata topila, kot so etanol, propanol ali butanol (Lütke-Eversloh, 2011; Chandel in sod., 2012). Okolju prijaznen nadomestek tekočim gorivom predstavlja tudi bioplin (metan), ki ga pridobivajo z optimizirano mikrobno razgradnjo organskih odpadkov v anaerobnih razmerah (Čater in sod., 2014). Po vizijah Evropske unije naj bi uporaba bio-goriv leta 2030 predstavljala približno 25 % vseh transportnih energentov (Jeihanipour in sod., 2010).
Med najzahtevnejše tehnološke izzive, s katerimi se sooča energetska biotehnologija, sodi optimizacija encimske hidrolize (ligno)celuloze do sladkornih mo-nomerov, ki predstavljajo neposredni substrat za kasnejšo fermentacijo. Omejujoči dejavnik razgradnje je hidroliza celuloznih regij z visoko stopnjo urejenosti, t.i. kristaliničnih regij (Beckham in sod., 2011). Večina pristopov k optimizaciji hidrolize celuloznih substratov temelji na uporabi spoznanj, ki izvirajo iz preučevanja encimskih sistemov, ki so se med evolucijo razvili v naravi. V okoljih z nizkim redoks potencialom je učinkovita izraba substratov še posebno pomembna, zato ni presenetljivo, da so najbolj dovršene sisteme za razgradnjo celuloze našli prav pri nekaterih anaerobnih mikroorganizmih. Slednji encime, ki sodelujejo pri razgradnji rastlinskih celičnih sten povezujejo v komplekse, imenovane celulosomi, kar omogoča boljše sodelovanje med njimi (Fontes in Gilbert, 2010; Zorec in sod. 2014). Do danes najkompleksnejši znani celulosomski sistem so pred nedavnim odkrili pri vampni bakteriji Rumino-coccus flavefaciens. Kljub temu da je bila vrsta prvotno izolirana iz vampa govedi (Stewart in sod., 1981), so bližnje sorodnike kasneje našli tudi v prebavilih konj (Jul-liand in sod., 1999), nekaterih divjih rastlinojedih živali (Matsui in sod., 2010) in celo ljudi (Chassard in sod., 2011). Trenutno je R. flavefaciens edina znana vampna bakterijska vrsta, za katero so uspeli dokazati, da tvori celulosome (Brulc in sod., 2011).
Največ informacij o celulosomih R. flavefaciens izhaja iz molekularnih in biokemijskih študij seva 17, ki so jim sledile primerjalne analize nukleotidnih zaporedij seva FD-1. Te so pokazale, da je ogrodje celuloso-mov pri omenjenih sevih sestavljeno iz večjega števila
strukturnih proteinov, ki jih kodira gruča genov sca, ta pa je v različni meri ohranjena pri vsaj še štirih drugih sevih vrste R. flavefaciens (Jindou in sod., 2008). Pri obeh bolje preučenih sevih so ugotovili, da imata ključno vlogo pri vezavi encimskih podenot v komplekse dva velika glikozilirana skafoldina, ScaA in ScaB, ki se med sevoma razlikujeta po številu vezavnih mest za encime (kohezinov). Pri obeh sevih se na kohezine ScaA poleg encimov lahko veže tudi najmanjši skafoldin, ScaC, ki deluje kot vmesnik in lahko spremeni nabor encimov, vezanih v kompleks. Poleg tega so pri obeh sevih identificirali še t.i. sidrni skafoldin, ScaE. Ta ima le en kohe-zin, s katerim kovalentno veže C-končni del skafoldina ScaB, preko njega pa celoten celulosom na površino celice (Rincon in sod., 2001; Rincon in sod., 2004; Rincon in sod., 2005). Pri nobenem od skafoldinov R. flavefaciens 17 in FD-1 niso odkrili strukturnih značilnosti že poznanih modulov za vezavo na celulozo (CBM), kar kaže na drugačen mehanizem pritrjanja na substrat, kot ga imajo opisani celulosomi klostridijev. Predpostavljajo, da pri tem sodeluje več dejavnikov, med drugim tudi protein CttA in pili tipa IV (Vodovnik in sod. 2013)..
Korak naprej v razkrivanju (hemi)celulolitičnega sistema R. flavefaciens je bila nedavna analiza genoma seva FD-1. Ta je razkrila več kot 200 zapisov za proteine z ohranjenimi dokerinskimi domenami (Dok), od katerih je približno polovica vsebovala še CBM in/ ali katalitske domene, pri polovici pa niso odkrili nobenega drugega ohranjenega molekularnega podpisa, iz katerega bi lahko sklepali na njihovo funkcijo. Poleg celulosomskih encimov so našli tudi zapise za nekatere proste glikozid hidrolaze (GH), polisaharid liaze in ogljikohidrat esteraze, ki najverjetneje prav tako sodelujejo pri razgradnji rastlinskih celičnih sten (Rincon in sod., 2010).
Kljub precejšnjemu naboru informacij, ki razkrivajo zgradbo celulosomov R. flavefaciens ter velik potencial za sintezo (hemi)celulaz pri omenjenih sevih, nekatera vprašanja o funkcionalnih vidikih razgradnje različnih celuloznih substratov ostajajo odprta, čemur med drugim botrujejo neuspehi pri poskusih genske manipulacije teh mikroorganizmov (Flint in sod., 2008). Eno takšnih vprašanj se nanaša na posebnosti mehanizma razgradnje bombažnih vlaken - oblike celuloze z visoko stopnjo polimerizacije in velikim deležem kristaliničnih regij, ki jo lahko razgrajujejo le redki anaerobni sevi. Med slednjimi je tudi sev 007C, katerega potencial za sintezo celulaz in celulosomov smo preučili v pričujočem delu. Da bi ugotovili, kolikšen delež celu-laznih genov se (v različnih pogojih) tudi izraža, smo v drugem delu z encimogrami analizirali še proteinske frakcije.
2 MATERIALI IN METODE
2.1	GOJENJE SEVA
Sev smo gojili v anaerobnih razmerah z Bryantovo modifikacijo Hungatove tehnike (Bryant, 1972). Kulture smo precepljali in gojili pod zaščitnim plinom (100 % CO2), iz katerega smo sledove kisika odstranili tako, da smo ga vodili preko kolone z bakrovimi opilki, segretimi na 350 °C. Shranjevali smo ga na vbodnikih M2GSC pri -20 °C in jih pred vsakim poskusom najprej prenesli v tekoča gojišča M2GSC (Hobson, 1969). V njem smo jih namnožili do OD654 0,8 ± 0,1 in nato precepili v gojišče po Hungate-u in Stack-u (Bryant in Robinson, 1961; Hungate in Stack, 1982), obogatenim z 5 % (v/v) vampnim sokom (OHS) ter dodanimi posameznimi viri ogljika. Vse kulture smo inkubirali pri 37 °C.
2.2	IDENTIFIKACIJA CELULAZ IN SKAFOLDINOV
V GENOMU R. FLAVEFACIENS 007C
Genom R. flavefaciens seva 007C je bil sekvenciran na inštitutu Sanger (Wellcome Trust) s 55x pokritostjo. 39 genomskih odsekov je dostopnih na lokalnem omrežju inštituta: ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pathogens/Ruminoco-ccus/flavefaciens/007c/Rflav007c.091211.seq.
Nukleotidna zaporedja smo prenesli v program Bioe-dit in ustvarili lokalno podatkovno bazo, v kateri smo nato iskali gene za celulaze in skafoldine. Gensko gručo sca smo poiskali tako, da smo s programom tBlastn znotraj genoma 007C iskali zaporedja z zapisi za proteine, homologne skafoldinom sevov 17 in FD-1 (ki smo jih pridobili iz baze NCBI Protein Database) in analizirali njihovo okolico s kombinacijo programov ORF Finder in Blast.
Pred začetkom iskanja celulaz smo v podatkovni bazi CAZy (Carbohydrate-Active enZyme database) najprej preverili, v katere družine GH se uvrščajo encimi, ki razgrajujejo celulozo pri različnih vrstah rodu Ruminococcus. Nato smo AK zaporedja vseh celulaz, ki so bila dostopna v bazah NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) in CAZy (http://www.cazy.org/), uporabili za iskanje podobnih zaporedij znotraj lokalne baze z odseki genomskega zaporedja seva 007C. Pri tem smo uporabili programa tBlastn BioEdit (Hall in sod., 2011) in ORF Finder (NCBI). Prevedena zaporedja odprtih bralnih okvirjev smo nato analizirali z orodji BlastP, Conserved domains (NCBI) in Interproscan 5^2 (z izbranimi opcijami HMMPfam, BlastProDom, HMMSMART, HMMPIR, Superfamily, Si-gnalPHMM/NN, TMHMM, pattern Scan (Prosite), HM-MPanther, HMMSMART). Področje cepitve signalnih peptidov smo ugotovili s programom SignalP (Petersen in sod., 2011). Molekulske mase (Mw) in izoelektrične točke
(pI) domnevnih proteinov smo izračunali s programom Compute pI/Mw (ExPASy).
2.3	PRIPRAVA PROTEINSKIH FRAKCIJ ZA ENCI-
MOGRAME
Za ločitev frakcij na celične stene vezanih proteinov (pCs) in proteinov supernatanta (pSup) smo uporabili prilagojeni postopek, ki so ga opisali Ding in sodelavci (2001). Sev smo gojili v 600 ml modificiranih gojišč OHS_ AVI (1 % Avicel), OHS_KSIL (0,4 % ksilan) in OHS_CB (0,4 % celobioza). Za analizo izražanja endoglukanaz (kar-boksimetil celulaz, CMC-az) v odvisnosti od faze rasti na mikrokristalinični celulozi smo seva gojili 1, 3, 5, 7, 9 in 12 dni. Za primerjavo izražanja v odvisnosti od substrata pa smo izbrali po tri časovne točke za vsak substrat, kjer so bile kulture v primerljivih fazah rasti (OHS_CB: 14, 24, 48 h; OHS_KSIL: 26, 42, 54 h; OHS_AVI: 7, 9, 12 dni). V vsaki od časovnih točk smo kulture dobro premešali, razdelili v 200 ml centrifugirke in 15 minut centrifugirali pri 9000 x g in 4 °C. Supernatant smo nato 50x skoncentri-rali z ultrafiltacijo (v koncentratorjih Amicon, Millipore), mu dodali po 5 (d/ml mešanice proteaznih inhibitorjev (P2714, Sigma) ter ga takoj zamrznili (frakcija pSup). Pred uporabo smo vzorcem v razmerju 1:1 dodali 2x nanašalni pufer s sestavo: 12,5 % (v/v) 0,5 M TrisHCl, pH = 6,8, 20 g/l NaDS, 10 % (v/v) glicerol, 5 % (v/v) 2-merkaptoetanol, 0,0625 g/l bromfenol modro. Sedimente smo najprej sprali s po 40 ml NaFP, ter jih nato resuspendirali v enaki količini pufra, ki smo mu dodali 2 mM DTT. Pred uporabo smo jih dvakrat zamrznili (pri -20 °C) in odmrznili. Ali-kvote (po 1 ml) smo ponovno centrifugirali pri 16000 x g in sediment resuspendirali v 250 (l 2x nanašalnega pufra (frakcija pCs).Vzorce, pomešane z nanašalnim pufrom, smo denaturirali pri 65 °C 20 min, čemur je sledilo 5 min segrevanja pri 85 °C. Sočasno smo 5 min pri 100 °C segrevali tudi proteinski standard, pri katerem je proizvajalec navedel, da je to potrebno (NaDS 6H2, Sigma).
2.4	PRIPRAVA ENCIMOGRAMOV IN ZAZNAVANJE ENDOGLUKANAZNE AKTIVNOSTI
LOČENIH PROTEINOV
Dvofazne poliakrilamidne gele (z 8 % zamreženostjo v ločevalnem delu) smo pripravili po standardnem postopku (Laemmli, 1970). Za dokazovanje endoglukana-zne aktivnosti smo vanje vključili še 0,2 % (w/v) CMC. Po 25 (l proteinskih frakcij v nanašalnem pufru (v razmerju 1: 1) smo nanesli na gele in jih ločili z elektroforezo pri 40 mA, dokler fronta ni dosegla fazne meje med geloma, nato pa pri 220 V do konca. Ločene encime smo po končani
elektroforezi renaturirali in razvili encimogramevpo postopku, kot so ga opisali v Saul in sodelavci (1990).
3 REZULTATI
3.1 IDENTIFIKACIJA IN BIOINFORMACIJSKA
ANALIZA GRUČE GENOV sca
V genomu R. flavefaciens smo identificirali gručo genov, ki kodirajo celulosomske ogrodne proteine (skafoldi-ne). Izkazalo se je, da je gruča genov sca sestavljena iz petih genov, ki si sledijo v naslednjem vrstnem redu: scaC-scaA--scaB-cttA-scaE. Analiza AK zaporedij prevedenih genov sca je pokazala različne stopnje podobnosti s homologi iz sorodnih sevov, pri čemer je bila ta največja s proteini seva 17 (od 99-100 %) in najmanjša s skafoldini seva FD-1 (od 58-77 %) (pregl. 1). Podobnost se je odražala tudi v modularni zgradbi proteinov. Na N-koncu prevedenega zapisa za ScaC smo tako identificirali kohezin, na C-koncu pa dokerin tipa III. V zapisu za skafoldin ScaA smo identificirali tri kohezine tipa III (ki pri sevu 17 vežejo dokerine nekaterih hidrolitičnih encimov ali skafoldin ScaC). V dostopnem osnutku genoma je nukleotidno zaporedje gena, ki kodira skafoldin ScaB razdeljeno med dva odseka, med katerima manjka del povezovalne regije, kar je onemogočilo neposredno analizo dela zaporedja. V dostopnem delu (2834 bp) smo identificirali 4 enake kohezine tipa III. Podobnost dostopnega dela AK zaporedja ScaB s homolo-
gom seva 17 pa je bila 99,1 %. Znotraj prevedenega zaporedja cttA smo identificirali dva enaka CBM in N-končni tandem X-Dok (ohranjena domena neznane funkcije, ki ji sledi dokerin tipa II). Aminokislinsko zaporedje proteina CttA kaže 99,1 % podobnost s homologom seva 17 in le 71,9 % podobnost s homologom seva FD-1. V zaporedju prevedenega gena scaE smo identificirali kohezin tipa II in N-končni motiv LPXTG, ki ga prepoznava sortaza. Tudi pri tem proteinu smo ugotovili največjo podobnost s homologom seva 17 (99,1 %), najmanjšo pa s homologom seva FD-1 (71,9 %) (pregl. 1).
3.2 ZAPISI ZA CELULAZE V GENOMU SEVA 007C
Katalitske domene encimov, ki katalizirajo hidroli-zo ^-1,4 vezi v molekulah celuloze, se pri R. flavefaciens uvrščajo v družine GH 5, 9, 44 in 48. V genomu seva R. flavefaciens 007C smo identificirali 8 zapisov za GH 5, 16 zapisov za GH 9 ter po 1 zapis za GH44 in GH48 (pregl. 2). Izračunane molekulse mase (Mw(i)) produktov teh genov so med od 36617 in 121269 Da, izoelektrične točke (pI(i)) pa med 4,36 in 5,15.
Vsi produkti genov s katalitskimi domenami GH5 imajo Mw(i) manjše od 86 kDa, ter vsebujejo molekularne podpise BglC, značilne za endoglukanaze. Poleg tega smo v zaporedju cel5_3 identificirali še motiv Bgl_B, ki je značilen za ^-glukozidaze in ^-galaktozidaze. Štirje encimi s katalitsko domeno GH5 imajo na C-koncu še Dok-
Preglednica 1: Genska gruča sca v genomu seva R. flavefaciens 007C in enakost (podobnost) aminokislinskih zaporedij genskih produktov s homologi iz sorodnih sevov (navedeni v oklepaju)
Table 1: R. flavefaciens 007C sca gene cluster with identity (similarity) of putative gene products to homologues from different strains
Odprt bralni okvir	Genomski odsek	Koordinate znotraj genomskih odsekov		Genski produkt	Dostopne kode homolognih proteinov iz sorodnih sevov	E-vrednost	Enakost (podobnost) AK zaporedij
scaC	00019	4779	5627	celulosomski skafoldin (ScaC)	CAE51046.2 (17) CAQ16964.1 (JM1) CAO00728.1 (C94) ZP_06144572.1 (FD-1)	3e-157 3e-116 5e-102 4e-86	100,0 % (100 %) 75,5 % (90,5 %) 65,4 % (87,9 %) 52,0 % (77,2 %)
scaA	00019	2039	4681	celulosomski skafoldin (ScaA)	CAC34384.3 (17) CAO00729.1 (C94) ZP_06144573.1 (FD-1)	0,0 2e-147 1e-74	98.6	% (99,2 %) 45,8 % (72,1 %) 30.7	% (58,3 %)
scaB	00019 00018	1 115883	2007 116710	celulosomski skafoldin (ScaB)	CAC34385.1 (17) CAO00730.1 (C94 ) ZP_06144574.1 (FD-1)	0,0 0,0 2e-102	98,9 % (99,1 %) 57,2 % (82,4 %) 43,4 % (74,7 %)
cttA	00018	113280	115496	protein za vezavo na celulozo (CttA)	CAH18995.2 (17) CA000731.1 (C94 ) ZP_06144575.1 (FD-1)	0,0 0,0 2e-177	98,3 % (99,1 %) 51,8 % (80,2 %) 44,2 % (71,9 %)
scaE	00018	112270	112976	celulosomski pritrditveni skafoldin (ScaE)	CAH18996.1 (17) CAO00732.1 (C94 ) ZP_06144576.1 (FD-1)	1e-87 7e-43 1e-27	98,7 % (99,1 %) 61,2 % (82,4 %) 49,4 % (70,3 %)
Preglednica 2: Celulaze v genomu seva R. flavefaciens 007C. Mw(i): izračunana Mw, pI(i): izračunana pl. SP: signalni peptid, GHx: katalitska domena glikozid hidrolaze, ki se uvršča v družino x, Dok-1: dokerinska domena tipa I, CBM_x: modul za vezavo na celulozo, ki se uvršča v družino x, CelD_N: N-končna imunoglobulinski podobna domena, značilna za celulaze, PLN00119: domena, značilna za endoglukanaze; Bgl_C: zaporedje, značilno za endoglukanaze; Bgl_B: zaporedje, značilno za j-glukozidaze, j-galaktozidaze in 6-fosfo-j-glukozidaze. TonB_box: ohranjeno zaporedje, ki je značilno za receptorje, povezane s proteinom TonB Table 2: Cellulases identified in R. flavefaciens 007C genome. Mw(i): calculated Mw, pI(i): calculated pi. SP: signal peptide, GHx: glycoside hydrolase catalytic domain from family x, Dok-1: dockerin type I domain, CBM_x: cellulose binding module from family x, CelD_N: N-terminal immunoglobulin-like domain (signature sequence found in cellulases), PLN00119: signature sequence found in endoglucanases; Bgl_C: signature sequence found in endoglucanases; Bgl_B: signature sequence found in j-glucosidases, j-galaktosidases and 6-fosfo-j-glukosidases. TonB_box: conserved motif, found in TonB-associated receptors
Odprt bralni okvir	Družina GH in pripisana funkcija genskega produkta	Mw(i) (Da)	pI(i)	Ohranjeni molekularni podpisi (domene, motivi)	Dostopne kode (domnevnih) proteinov z najbolj podobnimi AK zaporedji	Enakost (podobnost) AK zaporedij
cel5_1	GH5, endo-1,4p-glukanaza	36617	4,94	SP, GH5[pfam00150] BglC[C0G2730]	ZP_06142079.1 ACA61162.1 YP_004104924.1	65 % (78 %) 56 % (71 %) 49 % (64 %)
cel5_2	GH5, endo-1,4p-glukanaza	49241	4,48	SP, GH5[pfam00150] BglC[C0G2730], Dok-1	ZP_06143373.1 YP_003844565.1 CBK96759.1	67 % (81 %) 47 % (64 %) 53 % (70 %)
cel5_3	GH5, endo-1,4-p -glukanaza	49926	4,93	GH5[pfam00150], BglB[C0G2723], BglC[C0G2730]	ADX05698.1 YP_003842446.1 YP_003769498.1	75 % (85 %) 48	% (64 %) 49	% (64 %)
cel5_4	GH5, endo-1,4p-glukanaza	62539	4,59	SP, GH5[pfam00150], BglC[C0G2730]	ZP_06145410.1 AAT48117.1 YP_004104209.1	75 % (79 %) 85 % (86 %) 58 % (63 %)
cel5_5	GH5, endo-1,4p-glukanaza	70150	4,77	SP, GH5 [pfam00150], BglC[C0G2730], Dok-1	ZP_06145411.1 ZP_07327095.1 YP_001039263.1	59 % (63 %) 62 % (65 %) 65 % (69 %)
cel5_6	GH5, endo-1,4p-glukanaza	76748	4,66	SP, GH5[pfam00150], BglC[C0G2730]	ZP_06143262.1 YP_004105745.1 YP_004309759.1	52 % (69 %) 46 % (64 %) 43 % (64 %)
endA	GH5, endo-1,4p-glukanaza	80375	4,52	SP, GH5 [pfam00150], BglC[C0G2730], Dok-1	CAB05881.1 ZP_06144331.1 ZP_06142925.1	94 % (96 %) 56 % (62 %) 55 % (63 %)
cel44A (endB)	GH44, endo-1,4p-glukanaza	84550	4,56	SP, GH44, Dok-1	CAC83072.1 ZP_06143384.1 AAA95959.1	99 % (99 %) 84 % (84 %) 76 % (84 %)
cel5_7	GH5, endoglukanaza	85013	5,15	SP, GH5 [pfam00150], BglC[C0G2730], Dok-1	ZP_06141962.1 ADD61809.1 ZP_04745187.2	54 % (69 %) 52 % (73 %) 52 % (73 %)
cel9_1	GH9, endo-1,4p-glukanaza	85053	4,63	SP, GH9 [pfam00759], PLN00119[PLN00119], CBM_3a[pfam00942]	ZP_06144437.1 CBL16391.1 CAP78918.2	74 % (86 %) 48 % (61 %) 51 % (67 %)
cel9_2	GH9, endo-1,4p-glukanaza	85138	4,84	SP, GH9 [pfam00759], PLN00119[PLN00119], CBM_3a[pfam00942], Dok-1	ZP_06144448.1 CBL18389.1 ZP_07329007.1	64 % (75 %) 51 % (65 %) 47 % (62 %)
cel9_3	GH9, endo-1,4p-glukanaza	87559	4,74	SP, GH9[pfam00759], PLN02613[PLN02613], CBM_3a[pfam00942], Dok-1	ZP_06142678.1 YP_004105562.1 ZP_08160908.1	69 % (82 %) 62 % (74 %) 64 % (76 %)
Nadaljevanje na naslednji strani / Continued overleaf
cel9_4	GH9, endo-1,4p-glukanaza	87629	4,63	SP, GH9[pfam00759], PLN00119[PLN00119]	ZP_08159634.1 YP_004104704.1 ZP_07837901.1	58 % (64 %) 57 % (62 %) 46 % (61 %)
cel9_5	GH9, endo-1,4p-glukanaza	87882	4,68	SP, GH9[pfam00759], PLN00119[PLN00119], CBM_3a[pfam00942]	ZP_06144437.1 CBL16391.1 YP_001036864.1	74 % (86 %) 48 % (61 %) 51 % (67 %)
cel9_6	GH9, endo-1,4p-glukanaza	88900	4,63	SP, CBM_4_9[pfam02018], GH9[pfam00759], CelD_N[pfam02927], Dok-1	ZP_06141671.1 CBL16782.1 ZP_07837973.1	72 % (82 %) 62 % (75 %) 52 % (68 %)
cel9_7	GH9, endo-1,4p-glukanaza	91719	4,86	SP, GH9[pfam00759], PLN00119[PLN00119], Dok-1	ZP_06142866.1 CBL17554.1 ZP_06143411.1	51 % (63 %) 50 % 64 %) 45 % (60 %)
cel48 (cel48A)	GH48, ekso-1,4p-glukanaza	91995	4,73	SP, TonB_box [PS00430] GH48[pfam02011], Dok-1	ZP_06145360.1 CBL17316.1 ZP_08158497.1	67 % (78 %) 49 % (63 %) 41 % (56 %)
cel9_8	GH9, endo-1,4p-glukanaza	92177	4,46	SP, GH9[pfam00759], PLN00119[PLN00119], CBM_3a[pfam00942], Dok-1	ZP_06142593.1 BAB64431.1 YP_004104243.1	73 % (82 %) 72 % (80 %) 72 % (80 %)
cel9_9	GH9, endo-1,4p-glukanaza	94917	4,64	SP, GH9[pfam00759], CelD_N[pfam02927], PLN00119[PLN00119], CBM_4_9[pfam02018]	ZP_06141900.1 YP_004104210.1 ZP_08159524.1	71 % (82 %) 64 % (77 %) 64 % (78 %)
cel9_10	GH9, endo-1,4p-glukanaza	97381	4,59	SP, GH9[pfam00759], PLN00119[PLN00119], CBM_3a[pfam00942], Dok-1	ZP_06142598.1 ZP_08159963.1 YP_004104517.1	74 % (83 %) 46 % (60 %) 46 % (60 %)
cel9_11	GH9, endo-1,4p-glukanaza	106291	4,68	SP, GH9[pfam00759], CelD_N[pfam02927], Dok-1	YP_004103692.1 YP_004105561.1 ZP_08160859.1	43 % (58 %) 42 % (57 %) 42 % (57 %)
cel9_12 (cel9B)	GH9, endo-1,4p-glukanaza	108900	4,87	SP, GH9[pfam00759], CelD_N[pfam02927], CBM_4_9[pfam02018], Dok-1	YP_004105561.1 ZP_08160859.1 ZP_06142679.1	55 % (65 %) 51 % (64 %) 54 %(59 %)
cel9_13	GH9, endo-1,4p-glukanaza	108032	4,62	SP, GH9[pfam00759], CelD_N[pfam02927]	ZP_08160859.1 AAR01216.1 YP_004105561.1	42	% (58 %) 43	% (58 %) 42 % (57 %)
cel9_16	GH9, endo-1,4p-glukanaza; GH16, 1,3-1,4-p-glukanaza	121269	4,36	SP, GH9[pfam00759, PLN00119[PLN00119], GH16[cd02175]	ZP_06142866.1 CBL17554.1 ZP_06141843.1	73	% (82 %) 53 % (67 %) 74	% (83 %)
1, pri nobenem pa nismo odkrili ohranjene regije CBM. Med geni, ki kodirajo GH5 smo identificirali tudi homolog gena endA seva R. flavefaciens 17. Podobnost med AK zaporedjem encima EndA in prevedenim zaporedjem homologa seva 007C je 99 %.
Izračunane molekulske mase produktov s katalit-skimi domenami GH9 so večje od 85 kDa. Pri večini od njih (9 od 14) smo na C-koncu identificirali Dok-1. Poleg tega smo v zaporedjih šestih genov identificirali tudi ohranjena zaporedja za CBM_3a, pri treh pa CBM_4_9. Pri
vseh smo zaznali tudi motive, značilne za endoglukanaze PLN00119, PLN02613, PLN2927, CelD_N. Pri največji od celulaz seva 007C smo poleg katalitske domene GH9 in ohranjenega motiva, značilnega za endoglukanaze, identificirali še drugo katalitsko domeno (GH16), značilno za encime z 1,3-1,4-^-glukanazno funkcijo.
Poleg zapisov za encime s katalitskimi domenami GH5 in GH9 smo identificirali tudi en zapis za encim s katalitsko domeno GH44 in Dok-1 (homolog endoglukanaze Cel44A R. flavefaciens 17). Identificirali smo tudi en
zapis za encim s katalitsko domeno GH48 in Dok-1 (cel48) in motivom, ki je značilen za receptorje, povezne s prote-inom TonB (TonB_box). Pri vseh celulaznih genih, z izjemo cel5_3, smo zaznali tudi signalna zaporedja.
3.3 IZRAŽANJE ENDOGLUKANAZ V ODVISNOSTI OD SUBSTRATA
Za analizo izražnja endoglukanaz v odvisnosti od substrata, smo seva gojili v gojiščih z Avicelom, celobiozo ali ksilanom kot edinim virom ogljika ter analizirali CMC--azne profile kultur v primerljivih fazah rasti (Vodovnik, 2012).
V frakciji pCs smo neodvisno od substrata in časa inkubacije najmočnejšo CMC-azno aktivnost zaznali v območju proteinov z navideznimi Mw med 97 in 114 kDa (znotraj tega je program ob manjši količini nanešenih pro-teinov zaznal tri slabo ločene vrhove aktivnosti, ki bi po Mw lahko ustrezali produktom cel9_10, cel9_11, cel9_12, cel9_13). Neodvisno od substrata se je izražala tudi endo-glukanaza z navidezno Mw 78,1 ± 2,3 kDa, aktivnost dveh drugih encimov z navideznima Mw 71,2 ± 1,4 kDa in 92,1 ± 2,3 kDa pa je bila nekoliko močneje izražena v vzorcih kultur, ki so rasle v gojiščih z Avicelom. Po Mw sodeč bi lahko šlo za produkta genov cel5_5 in cel9_8. Aktivnost v območju med 250 in 300 kDa (kar ne ustreza navidezni Mw nobenega produkta predvidenih celulaznih genov,
Slika 1: Primer encimograma, ki prikazuje izražanje na celice vezanih endoglukanaz (frakcija pCs) R. flavefaciens 007C v odvisnosti od vira ogljika v gojišču. Proge CB 1, 2, 3: vzorci kultur, ki so 14, 24 in 48 h rasle v gojišču s celobiozo; KSI1, 2, 3: vzorci kultur, ki so 26, 42 in 54 h rasle v gojišču s ksilanom; AVI 1, 2, 3 vzorci kultur, 7, 9 in 12 dni rasle v gojišču z Avicelom Figure 1: Zymogram showing substrate-related expression patterns of cell-bound endoglucanases (fraction pCs) R. flavefaciens 007C. Lines CB 1, 2, 3: cultures grown on cellobiose for 14, 24 and 48 hours; KSI 1, 2, 3: cultures grown on xylan for 26, 42 and 54 hours; AVI 1, 2, 3: cultures grown on Avicel for 7, 9 and 12 days
Slika 2: Primer encimograma, ki prikazuje izražanje endoglukanaz v supernatantu R. flavefaciens 007C (pSup) v odvisnosti od razpoložljivega vira ogljika v gojišču. Proge CB 1, 2, 3: vzorci kultur, ki so 14, 24 in 48 h rasle v gojišču s celobiozo; KSI 1, 2, 3: vzorci kultur, ki so 26, 42 in 54 h rasle v gojišču s ksilanom; AVI 1, 2, 3 vzorci kultur, 7, 9 in 12 dni rasle v gojišču z Avicelom Figure 2: Zymogram showing substrate-related expression patterns of endoglucanases found in supernatant of R. flavefa-ciens 007C (fraction pSup). Lines CB 1, 2, 3: cultures grown on cellobiose for 14, 24 and 48 hours; KSI 1, 2, 3: cultures grown on xylan for 26, 42 and 54 hours; AVI 1, 2, 3: cultures grown on Avicel for 7, 9 and 12 days
zato sklepamo, da gre verjetno za ostanke protenskih kompleksov) smo zaznali le pri vzorcih kultur, ki so rasle v gojiščih, kjer je vir ogljika predstavljal Avicel (slika 1).
Večja raznolikost izražanja endoglukanaz v odvisnosti od vira ogljika se je pokazala pri analizi supernatanta R. flavefaciens 007C, iz katere je bilo razvidno, da Avicel inducira izražanje najširšega spektra celulaz z navideznimi molekulskimi masami od 36 do 120 kDa. Te ustrezajo Mw(i) produktov genov, ki kodirajo tako encime s kata-litskimi domenami GH5 (cel5_1, cel5_2, cel5_3, cel5_4, cel5_5 in cel5_7), kot GH9 (cel9_1, cel9_2, cel9_10, cel9_11, cel9_12, cel9_13 in cel9_16 (slika 2). Medtem ko smo encime z navideznimi Mw večjimi od 80 kDa zaznali že v prvih treh dneh inkubacije, je aktivnost manjših encimov prag detekcije dosegla šele po 7 dneh rasti na Avicelu (rezultati niso prikazani). V supernatantih kultur, ki so kot vir ogljika uporabljale celobiozo ali ksilan, smo ne glede na čas inkubacije, ponovljivo zaznali le prisotnost ene močnejše in dveh šibkih lis, ki nakazujejo celulazno aktivnost encimov z navideznimi Mw med 85 in 115 kDa (kar ustreza Mw(i) produktov genov cel9_1, cel9_2, cel9_10, cel9_11, cel9_12 oz. cel9_13).
4 DISKUSIJA
Dosedanje študije so pokazale, da imajo različni sevi vrste R. flavefaciens kljub ohranjeni osnovni zgradbi najverjetneje precej raznoliko sestavljene celulosome.
Slednje je razvidno tako iz razlik v številu zapisov za ska-foldine in njihovi modularni zgradbi kot tudi iz nabora razpoložljivih encimov, ki se nanje lahko vežejo. Informacije o specifičnostih zgradbe celulolitičnih sistemov posameznih sevov v povezavi z informacijami o njihovem delovanju bi lahko omogočile razkritje nekaterih funkcionalnih vidikov razgradnje celuloze (Jindou in sod., 2008; Berg Miller in sod., 2009).
V opisani raziskavi smo v genomu seva 007C poiskali zapise za sintezo celulosomskih ogrodnih proteinov (skafoldinov) in celulaz ter analizirali modularno zgradbo njihovih produktov in podobnost s proteini iz sorodnih sevov in vrst. Analiza osnutka genoma je pokazala, da ima R. flavefaciens 007C enako ureditev gruče genov sca, kot so jo do sedaj potrdili še pri štirih drugih sevih te vrste: 17, FD-1, C94 in JM1 (Jindou in sod., 2008). Gruča je v celoti ohranjena in jo v zapisanem zaporedju sestavljajo geni scaC-scaA-scaB-cttA-scaE, katerih produkti so po aminokislinskih zaporedjih skoraj identični skafoldinom seva 17 (podobnost je v vseh primerih večja od 99 %) (pregl. 1). Ker se v slednjih zrcali tudi modularna zgradba proteinov, od katere je odvisno sestavljanje celulosomov, smo na osnovi teh podatkov lahko predvideli zgradbo celulosomov, kot jo prikazuje slika 3. Pri tem smo predpostavili, da v manjkajočem delu zaporedja gena scaB ni večjih razlik, ki bi vplivale na modularno zgradbo tega skafoldina.
Nabor genov za celulaze, ki smo jih identificirali v osnutku genoma seva 007C, obsega po en zapis za encima s katalitskima domenama GH48 in GH44 ter širok spekter domnevnih endoglukanaz iz družin GH9 (14 zapisov) in GH5 (8 zapisov) (pregl. 2). Za vse encime, ki spadajo v prvo od obeh družin, je značilna katalitska domena s 3D strukturo sodčka (a/a)6 ter invertni mehanizem hidro-lize, medtem ko v družino 5 spadajo encimi s strukturo sodčka (p/a)8 in ohranitvenim mehanizmom delovanja (Beguin in Lamaire, 1996). Ohranjenost strukturnih značilnosti in mehanizma delovanja encimov znotraj posamezne družine GH kaže na evolucijsko povezanost med njimi, zato lahko domnevamo, da sta se široka spektra encimov s katalitskimi domenami, ki spadajo v družini 5 in 9 verjetno razvila s podvajanjem in kopičenjem mutacij v dveh izvornih genih. Pri tem so nastali encimi, ki se le malo razlikujejo v specifičnosti in kinetičnih lastnostih in za R. flavefaciens očitno predstavljajo evolucijsko prednost, saj se v nasprotnem primeru dolgoročno ne bi ohranili v genomu. Pomembno vlogo raznolikega spektra GH5 in GH9 za preživetje širše skupine celulolitičnih predstavnikov reda Clostridiales potrjuje tudi dejstvo, da zapisi za te encime številčno prevladujejo tudi v genomu C. thermocellum (Flint in sod., 2008; Berg Miller in sod., 2009). Pri večini celulaz R. flavefaciens 007C smo poleg katalitskih domen identificirali tudi dokerinske, kar
Slika 3: Genska gruča, ki kodira skafoldine in model celulosoma R. flavefaciens 007C, kot smo ga predvideli na osnovi njihove modularne zgradbe ter podobnosti s sevom 17 Figure 3: Sca gene cluster and R. flavefaciens 007C cellulosome model as predicted from modular architecture of scaffoldins and comparison with strain 17
kaže, da so encimi povezani v celulosome. Po drugi strani smo module za vezavo na substrat zaznali izključno v kombinaciji s katalitskimi domenami GH9. Podobno kot pri sevu FD-1, tudi pri encimih seva 007C številčno prevladujejo moduli za vezavo na kristalinično celulozo (CBM_3a), čeprav smo pri nekaterih našli tudi takšne, ki se vežejo le na amorfne oblike tega substrata (CBM_4_9). Pri petih endoglukanazah smo poleg katalitske domene zaznali tako Dok-1 kot CBM, kar nakazuje potencialno vlogo teh encimov pri pritrjanju celulosomov na substrat. Multimodularnost, ki je značilna za celulaze seva R. flavefaciens 007C, kaže, da so v njihovem evolucijskem razvoju (poleg podvajanja genov in točkovnih mutacij) pomembno vlogo odigrali tudi dogodki, kot sta premeščanje domen in združevanje genov (Flint in sod., 2008; Berg Miller in sod., 2009; Fontes in Gilbert 2010).
Da se širok nabor zapisov za endoglukanaze, ki jih najdemo v genomu R. flavefaciens, tudi izraža (in ne gre zgolj za pseudogene, ki se še niso odstranili iz genoma), smo potrdili na encimogramih. Podobno kot pri sevu 007S (Vodovnik in Marinšek Logar, 2012) lahko endo-glukanaze mutante 007C glede na vzorec izražanja razdelimo na (vsaj štiri) konstitutivno izražene in (vsaj sedem) inducibilnih (tiste, katerih izražanje je bilo specifično povezano z rastjo na celulozi) (sliki 1, 2). V začetnih fazah rasti na celulozi je bila večina endoglukanaz vezanih na celice ter je po Mw ustrezala celulosomskim GH9 (ter dvema celulosomskima GH5), v kasnejših fazah rasti (po 7 dneh) pa se je spekter razširil še na encime, katerih na-
videzne Mw so manjše od 77 kDa in v večini sovpadajo z Mw(i) prostih GH5 (Vodovnik, 2012). Te smo zaznali izključno v supernatantu. Če ne gre za posttranslacijsko spremenjene ali proteolitično razcepljene encime, lahko domnevamo, da igrajo v začetnih fazah hidrolize mikro-kristalinične celuloze pomembnejšo vlogo encimi, ki so povezani v celulosome (predvsem endoglukanaze iz družine GH9), medtem ko proste GH5 najverjetneje cepijo šele produkte kasnejših faz razgradnje, ki se sprostijo z netopnega substrata v gojišče. Poleg razlik v specifičnosti in mehanizmih hidrolize predstavnikov različnih družin endoglukanaz je zgodnje izražanje GH9 lahko povezano tudi z dejstvom, da ima večina teh encimov CBM, ki sodelujejo pri pritrjanju encimskih kompleksov in amorfo-genezi celuloznih vlaken, kar je še posebno pomembno v začetnih fazah razgradnje kristaliničnih regij (Fontes in Gilbert, 2010). Po drugi strani odsotnost CBM (in Dok-1) pri manjših GH5 ter dejstvo, da smo jih zaznali le v su-pernatantu, nakazuje, da bi lahko šlo za celodekstrinaze, katerih primarna funkcija je cepitev (topnih) produktov hidrolize celuloznih vlaken, ki so se s substrata sprostili v prvi fazi razgradnje, a so še preveliki za neposreden prenos v celice. Zgornja hipoteza je skladna tudi z ugotovitvijo, da encimov, katerih Mw bi ustrezale prostim GH5, nismo zaznali v nobeni od frakcij kultur, ki so rasle na celobiozi ali ksilanu, medtem ko se je večina večjih endoglukanaz izražala neodvisno od substrata. Konstitutivno izražanje izbranih celulaz, katerih delovanje je ključno za začetne stopnje razgradnje celuloze, je energetsko varčnejše kot sočasno izražanje celotnega nabora encimov tudi kadar celuloznega substrata ni na razpolago, po drugi strani pa celicam omogoča, da ob stiku z njim pride do sproščanja manjših količin produktov cepitve, ki lahko vzpodbudijo izražanje preostalih encimov, potrebnih za učinkovitejšo razgradnjo substrata (Gold in Martin, 2007). Molekularni mehanizem zaznavanja vira ogljika in prenosa signalov, ki uravnavajo izražanje genov celulolitičnega sistema pri R. flavefaciens še ni pojasnjen. Domnevajo, da gre za večkomponentni sistem (trans)membranskih in citopla-zemskih proteinov, preko katerih se zunajcelični signal do DNK prenaša s fosforilacijo in defosforilacijo, podobno kot pri široko razširjenih dvokomponentnih sistemih, preko katerih večina bakterij zaznava različne druge zunanje dejavnike (Vercoe in sod., 2003). Naše ugotovitve kažejo, da je izražanje širšega spektra celulaz inducirano z rastjo na celulozi, ne pa tudi celobiozi (disaharid, ki neposredno vstopa v celice) ali ksilanu (polisaharid, ki se razcepi v ksilo-oligosaharide in ksilozo), iz česar lahko sklepamo, da imajo specifično vlogo signalnih molekul v tem sistemu najverjetneje celodekstrini s stopnjo polime-rizacije večjo od 2. Pri sevu R. flavefaciens FD-1 so ugotovili, da izražanje celodekstrinaze in nekaterih drugih celulaz do določene mere inducira celotrioza, vendar je
stopnja indukcije večja, kadar je prisotna netopna celuloza, kar nakazuje na to, da izražanje teh genov uravnavajo tudi večje molekule (Zhang in sod., 2005). Kako velike so molekule, ki (še lahko) sprožijo izražanje širšega spektra celulaz R. flavefaciens in po kateri poti poteka prenos signala do DNK, so vprašanja, ki jih bo v prihodnje potrebno bolje raziskati.
Izsledki naše raziskave pomembno prispevajo v mozaik razumevanja izražanja celulaz v enem najkompleksnejših do danes opisanih celulolitičnih sistemov. Ta predstavlja model razgradnje celuloznih substratov s široko uporabnostjo v različnih biotehnoloških panogah, od papirniške in krmilne industrije, do bioenergetike.
5 VIRI
Bayer E.A., Lamed R., White B., Flint, H.J. 2008. From cel-lulosomes to cellulosomics. Chemical record, 8: 364-77, doi:10.1002/tcr.20160 Beckham G.T., Matthews J.F., Peters B., Bomble Y.J., Himmel M.E., Crowley M.F. 2011. Molecular-level origins of biomass recalcitrance: decrystallization free energies for four common cellulose polymorphs. The Journal of Physical Chemistry B, 115: 4118-4127, doi:10.1021/jp1106394 Béguin P., Lemaire M. 1996. The cellulosome: an exocellular, multiprotein complex specialized in cellulose degradation. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 31: 201-236, doi:10.3109/10409239609106584 Berg Miller M.E. in sod. 2009. Diversity and Strain Specificity of Plant Cell Wall Degrading Enzymes Revealed by the Draft Genome of Ruminococcus flavefaciens FD-1. PLoS ONE 4, 8: e6650 Brulc J.M. in sod. 2011. Cellulosomics, a Gene-Centric Approach to Investigating the Intraspecific Diversity and Adaptation of Ruminococcus flavefaciens within the Rumen. PLoS ONE 6: e25329, doi:10.1371/journal.pone.0025329 Bryant M.P., Robinson I.M. 1961. Some Nutritional Requirements of the Genus Ruminococcus. Applied microbiology, 9: 91-5
Bryant M.P. 1972. Commentary on the Hungate technique for culture of anaerobic bacteria. American Journal of Clinical Nutrition: 1324-1328 CAZY. The Carbohydrate Active enZYmes database.
http://www.cazy.org/ Chandel A.K., Chandrasekhar G., Silva M.B., Da Silva S.S. 2012. The realm of cellulases in biorefinery development. Critical Reviews in Biotechnology, 32/3: 187-202, doi:10.3109/073 88551.2011.595385 Chassard C., Delmas E., Robert C., Lawson P.A., Bernalier-Donadille A. 2011. Ruminococcus champanellensis sp. nov., a cellulose-degrading bacteria from the human gut micro-biota. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62: 138-143, doi:10.1099/ijs.0.027375-0 Čater M., Zorec M., Marinšek Logar R. 2014 Methods for improving anaerobic lignocellulosic substrates degradation
for enhanced biogas production. Springer science reviews, in press
Ding S.Y. in sod. 2001. Cellulosomal scaffoldin-like proteins from Ruminococcus flavefaciens. Journal of Bacteriology, 183: 1945-1953, doi:10.1128/JB.183.6.1945-1953.2001 Flint H.J., Bayer E. A, Rincon M.T., Lamed R., White B.A. 2008. Polysaccharide utilization by gut bacteria: potential for new insights from genomic analysis. Nature reviews: Microbiology, 6: 121-131, doi:10.1038/nrmicro1817 Fontes C.M., Gilbert H.J. 2010. Cellulosomes: highly efficient nanomachines designed to deconstruct plant cell wall complex carbohydrates. Annual review of biochemistry, 79: 655-681, doi:10.1146/annurev-biochem-091208-085603 Gold N.D., Martin V.J.J. 2007. Global View of the Clostridium thermocellum Cellulosome Revealed by Quantitative Pro-teomic Analysis. Journal Of Bacteriology, 189: 6787-6795, doi:10.1128/JB.00882-07 Hall T. 2011. BioEdit Software. Informer Technologies Inc,
http://software.informer.com/ Hungate R.E., Stack R.J. 1982. Phenylpropanoic Acid: Growth Factor for Ruminococcus albus. Applied and Environmental Microbiology, 44: 79-83 Jeihanipour A., Karimi K., Taherzadeh M.J. 2010. Enhancement of ethanol and biogas production from high-crystalline cellulose by different modes of NMO pretreatment. Biotechnology and Bioengineering, 105: 469-476, doi:10.1002/ bit.22558
Jindou S. in sod. 2008. Cellulosome gene cluster analysis for gauging the diversity of the ruminal cellulolytic bacterium Ruminococcus flavefaciens. FEMS microbiology letters, 285: 188-194, doi:10.1111/j.1574-6968.2008.01234.x Julliand V., De Vaux A., Millet L., Fonty G. 1999. Identification of Ruminococcus flavefaciens as the predominant cel-lulolytic bacterial species of the equine cecum. Applied and Environmental Microbiology, 65: 3738-3741 Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685, doi:10.1038/227680a0 Lùtke-Eversloh T., Bahl H. 2011. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum: recent advances to improve butanol production. Current Opinion in Biotechnology, 22: 1-14, doi:10.1016/j.copbio.2011.01.011 Matsui H. in sod. 2010. Microbial diversity in ostrich ceca as revealed by 16S ribosomal RNA gene clone library and detection of novel Fibrobacter species. Anaerobe, 16: 83-93, doi:10.1016/j.anaerobe.2009.07.005 Petersen T.N., Brunak S., Von Heijne G., Nielsen H. 2011. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods, 8: 785-786, doi:10.1038/ nmeth.1701
Rincon M.T. in sod. 2003. Novel organization and divergent dockerin specificities in the cellulosome system of Rumino-coccus flavefaciens. Journal of Bacteriology, 185: 703-713, doi:10.1128/JB.185.3.703-713.2003 Rincon M.T. in sod. 2004. ScaC, an Adaptor Protein Carrying a Novel Cohesin That Expands the Dockerin-Binding Repertoire of the Ruminococcus flavefaciens 17 Cellulosome. Journal of Bacteriology 186: 2576-2585, doi:10.1128/ JB.186.9.2576-2585.2004
Rincon M.T. in sod. 2005. Unconventional mode of attachment of the Ruminococcus flavefaciens cellulosome to the cell surface. Journal of bacteriology, 187, 7569-7578, doi:10.1128/ JB.187.22.7569-7578.2005 Rincon M.T. in sod. 2007. A novel cell surface-anchored cellulose-binding protein encoded by the sca gene cluster of Ruminococcus flavefaciens. Journal of bacteriology, 189: 4774-83, doi:10.1128/JB.00143-07 Rincon M.T. in sod. 2010. Abundance and Diversity of Dock-erin-Containing Proteins in the Fiber-Degrading Rumen Bacterium, Ruminococcus flavefaciens FD-1. PLoS ONE, 5/8: e12476-e12476, doi:10.1371/journal.pone.0012476 Rincon M.T., McCrae S.I., Kirby J., Scott K.P., Flint H.J. 2001. EndB, a multidomain family 44 cellulase from Ruminococ-cus flavefaciens 17, binds to cellulose via a novel cellulose-binding module and to another R. flavefaciens protein via a dockerin domain. Applied and Environmental Microbiology, 67: 4426-4431, doi:10.1128/AEM.67.10.4426-4431.2001 Saul D.J. in sod. 1990. celB, a gene coding for a bifunctional cellulase from the extreme thermophile "Caldocellum sac-charolyticum". Applied and Environmental Microbiology, 56: 3117-3124
Stewart C., Duncan S., McPherson C.A., Richardson A., Flint H.J. 1990. The implications of the loss and regain of cotton-degrading activity for the degradation of straw by Rumino-coccus flavefaciens strain 007. Journal of Applied Microbiology, 68: 349-356 Stewart C.S., Duncan H.S., Flint H.J. 1990. The properties of forms of Ruminococcus flavefaciens which differ in their ability to degrade cotton cellulose. FEMS Microbiology Letters, 1-2: 47-50, doi:10.1111/j.1574-6968.1990.tb03859.x Stewart C.S., Paniagua C., Dinsdale D., Cheng K.J., Garrow S.H. 1981. Selective isolation and characteristics of Bacteriodes succinogenes from the rumen of a cow. Applied and Environmental Microbiology, 41: 504-510 Vercoe P.E., Kocherginskaya, S.A., White B.A. 2003. Differential protein phosphorylation-dephosphorylation in response to carbon source in Ruminococcus flavefaciens FD-1. Journal of applied microbiology, 94: 974-980, doi:10.1046/j.1365-2672.2003.01929.x Vodovnik M., Marinšek Logar R. 2012. Expression patterns of Ruminococcus flavefaciens revealed by zymogram approach. Folia microbiologica, 57, 4: 367-370, doi:10.1007/ s12223-012-0144-3 Vodovnik M. in sod. 2013. Expression of cellulosome components and type IV pili within the extracellular proteome of Ruminococcus flavefaciens 007. PLOS ONE, 8, 6: 1-11, doi:10.1371/journal.pone.0065333 Wilkesman J., Kurz L. 2009. Protease analysis by zymography: a review on techniques and patents. Recent patents on biotechnology, 3/3: 175-184, doi:10.2174/187220809789389162 Zhang Y.-H.P., Lynd L.R. 2005. Regulation of Cellulase Synthesis in Batch and Continuous Cultures of Clostridium thermocellum. Journal Of Bacteriology, 187: 99-106, doi:10.1128/JB.187.1.99-106.2005 Zorec M., Vodovnik M., Marinšek Logar R. 2014. Cellulose and hemicellulose degradation by rumen bacteria. Food Technology and Biotechnology, 52/2: 210-221