Zaključno poročilo o rezultatih raziskovalnega projekta 4. Poročilo o realizaciji predloženega programa dela oz. ciljev raziskovalnega projekta Sortna pristnost in kakovostno seme sort, ki so prilagojene slovenskim pridelovalnim razmeram, sta ključnega pomena za uspešno kmetijsko pridelavo in posledično za zagotavljanje prehranske varnosti in zmanjšanje tveganja v kmetijski pridelavi. Novejša pravila mednarodne zveze za testiranje semena ISTA (International Seed Testing Association) uvajajo bolj zanesljive postopke določitve sortne pristnosti, ki temeljijo na uporabi DNA markerjev. V okviru delovne skupine OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development) Seed Schemes je bila Služba za uradno potrjevanje semenskega in sadilnega materiala kmetijskih rastlin (SUP) na Kmetijskem inštitutu Slovenije kot slovenski certifikacijski organ pozvana, da se opredeli glede izvajanja biokemičnih in molekulskih analiz za preverjanje sortne čistosti, identifikacije ter hibridizacije znotraj posameznih rastlinskih vrst, za katere bi lahko izvajali analize. Tudi s te strani je močan poudarek na aplikaciji DNA markerjev na račun opuščanja analiz na osnovi biokemičnih markerjev. V zadnjem obdobju si žlahtnitelji vse bolj prizadevajo, da bi imela vsaka sorta ob svojem opisu predpisano tudi metodiko genetske identifikacije ter dostopen genetski profil določenih lokusov v genomu, na podlagi katerih se sorte med seboj zanesljivo in učinkovito loči. Posledično se v smislu zaščite žlahtniteljskih pravic žlahtnitelji vedno bolj poslužujejo uporabe novih zanesljivih metod, ki sorte med seboj učinkovito ločijo, z uporabo DNA markerjev. V praksi se tudi pri potrjevanju semenskih posevkov tekom vegetacije pojavlja problem identifikacije sort netipičnih rastlin, predvsem v posevkih žit in križnic. Uporabnost genetske identifikacije sort se kaže pri analizah kakovosti semena v laboratoriju, ko se na osnovi morfoloških znakov semena pri analizi čistote in klic v postopku kalivosti pojavlja sum na drugo sorto, vrsto ali celo rod. Nove sorte so si namreč vedno bolj morfološko podobne zato je njihova identifikacija na osnovi vidnih znakov vedno težja. Pri določenih vrstah kmetijskih rastlin je identifikacija ter ugotavljanje dovoljenega deleža netipičnih rastlin in rastlin druge sorte, vrste ali celo rodu na podlagi morfoloških lastnosti nezanesljiva in v postopku uradnega potrjevanja semenskih posevkov in partij semena kmetijskih rastlin predstavlja velik problem. Identifikacija na podlagi vizualnih znakov je posebej problematična pri določenih vrstah žit ter križnic. Z modernimi tehnikami, ki omogočajo analizo rastlinskega materiala na nivoju genoma, lahko hitro in učinkovito preverimo sortno pristnost in čistost semena, preden bi bilo seme dano na trg. V okviru mednarodnih organizacij (OECD, ISTA, UPOV) poteka razprava o možnostih uvedbe teh modernih tehnik v uradne postopke, sodelujoče države pa naj bi v ta namen čim prej začele z vzpostavljanjem podatkovne baze genetskih profilov za sorte, ki jih preverjajo v uradnih postopkih. Sistem zanesljive identifikacije rodu/vrste/sorte z uporabo DNA markerjev metodološko do sedaj še ni bil vpeljan, zato se je pojavila potreba po vzpostavitvi zanesljivega in učinkovitega sistema za genetsko identifikacijo predvsem pri določenih vrstah žit in križnic, ki se v Sloveniji pridelujejo oziroma uradno potrjujejo. Ključnega pomena pri tem je pridobitev genetskih informacij za vzpostavitev primerne baze podatkov zlasti tistih sort, ki so v Sloveniji vpisane v sortno listo ali se njihov material prideluje (uradno potrjuje) v Sloveniji. Predvideti je treba izmenjavo teh podatkov z drugimi državami članicami oz. njihovimi uradnimi organi, zato je potrebno pri razvoju sistema upoštevati tudi priporočila mednarodnih organizacij, zlasti OECD. Za namene izvedbe projektnih aktivnosti smo najprej oblikovali sezname sort, ki smo jih po pregledu veljavne SLO sortne liste in semenske pridelave preko uradnih standardnih vzorcev vključili v CRP, vključno s podatkom o tem, katero vrsto standardnega vzorca že hranimo. Skupno smo v projekt vključili 54 sort žit in križnic. V analizah, ki so bile izvedene v ISTA akreditiranem Semenskem laboratoriju KIS smo za vsako sorto opravili analizo kakovosti semena (določili čistoto in kalivost) po veljavnih ISTA protokolih. Na podlagi morfologije semena smo oblikovali podskupine, v primeru da se je seme iste sorte med seboj morfološko razlikovalo. Seme in mlade rastline vsake sorte smo tudi fotografirali. Po končanih analizah v semenskem laboratoriju smo mlade rastline odnesli v Genetski laboratorij KIS za analize z DNA markerji. Vsaka izmed 54-ih sort je bila v genotipizaciji zastopana s 4-imi (za samoprašne rastlinske vrste) ali z 8-imi (za tujeprašne rastlinske vrste) individualnimi rastlinami, da smo lahko pridobili tudi informacijo o variabilnosti znotraj sorte in frekvencah alelov. Skupno smo v analize vključili 277 vzorcev. Sledila je optimizacija ekstrakcije DNA za vsak sklop rastlinske vrste posebej. Preizkusili smo 6 različnih protokolov ekstrakcije DNA, odvisno od vrste pa smo uporabili tri različne protokole (ekstrakcija z uporabo treh komercialnih kitov in/ali uporaba avtomatiziranega sistema za ekstrakcijo nukleinskih kislin). Nadalje smo za namene genomsko-specifičnega in sortnega ločevanja znotraj/med vrstami žit in križnic na podlagi podatkovnih baz ter znanstvenih člankov identificirali 46 različnih DNA markerjev, ki vključujejo 3 različne markerske sisteme; 43 tipa SSR (angl. Short Seguence Repeat), 2 tipa SCAR (angl. Sequence Characterizied Amplified Region) in enega tipa CAPS (angl. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences). Za razločevanje znotraj kompleksa vrst pšenica/rž/tritikala/pira smo uporabili 13 DNA markerjev; za razločevanje znotraj rodu Avena 7 DNA markerjev; za razločevanje znotraj rodu Hordeum 6 DNA markerjev; za raznolikost in razločevanje znotraj in med navadno in tatarsko ajdo 11 DNA markerjev; za raznolikost in razločevanje znotraj in med vrstami družine Brassicaceae pa 9 DNA markerjev. Za vsak marker posebej smo optimizirali reakcijske mešanice in pogoje namnoževanja v verižni reakciji s polimerazo (PCR) ter v fragmenti analizi za pridobitev kvalitativnega (prisotnost/odsotnost namnožka na posameznem lokusu) in kvantitativnega (alelnega) profila sorte. Rezultati fragmentne analize z alelnimi profili sorte v obliki kodominantnih matrik so zahtevali dodatno obdelavo s statističnimi programi in orodji populacijsk e genetike za pridobitev informacije o frekvencah alelov in intra-specifične raznolikosti znotraj posamezne sorte. Rezultati bodo del obsežnega metodološkega dokumenta, ki ga pripravljamo. V projektu smo empirično določili tudi meje detekcije, torej najmanjši možni delež, ki dejansko predstavlja prisotnost netipičnih rastlin v združenem vzorcu/posevku in smo ga s standardnim PCR na kvalitativnem nivoju sposobni določiti. Ugotovili smo, da na kvalitativnem nivoju lahko detektiramo že zelo majhne razlike v genomu za posamezen marker, če le-te obstajajo. Vsak izmed specifičnih SSR markerjev, za katere smo določili, da na nivoju detekcije namnožka na gelu/kvalitativne detekcije, uspešno razločujejo med starši in križanci pri stopnji 1% deleža netipičnih rastlin. Če bi želeli določiti razlike v nižjih deležih netipičnih rastlin (torej 0,1% in/ali 0,3% po shemi za različne kategorije certificiranega semena) bi morali analizo nadaljevati na nivoju alelne detekcije (dražja in časovno ter metodološko bolj zahtevna analiza), ki določi razlike med genotipi na en bazni par natančno, kar je optimalno in popolnoma zanesljivo. Na podlagi kvantitativnih rezultatov smo izrisali tudi filogenetsko drevo, ki nam kaže, da smo na kvalitativnem nivoju sposobni ločevati tudi deleže netipičnih rastlin, ki so nižji od 1%, vendar z nižjo zanesljivostjo. Glavni cilj projekta je bil dosežen. Vzpostavili smo sistem zanesljive identifikacije sort žit in križnic s pomočjo DNA markerjev, kar nam omogoča hitro in učinkovito ter finančno sprejemljivo preverjanje sortne pristnosti in čistosti tako v postopku uradnega potrjevanja semena žit in križnic, kakor tudi v sami pridelavi. Vzpostavljene protokole ter sortno/vrstno specifične DNA markerje je mogoče uporabljati tudi za določanje pristnosti lokalnih sort ter pri nadzoru varne hrane, saj lahko na podlagi testov ciljno primerjamo posejane sorte žit s tistimi v skladišču oziroma specifično moko. Metode smo validirali na dejanskih vzorcih, ki so bili v analizo posredovani na KIS/SUP in smo jih razvrstili v naslednje sklope: ločevanje navadnega in golega ovsa; ločevanje pšenice, pire in tritikale; ločevanje oljne ogrščice in oljne repice; identifikacija netipičnih rastlin znotraj semenskega posevka ječmena; identifikacija netipičnih rastlin v semenskem posevku navadne ajde. Prav tako smo vzpostavili na nacionalnem nivoju krovni dokument, ki metodološko opredeljuje postopke identifikacije sort žit in križnic ter baze podatkov z genskimi profili sort/frekvencami alelov, ki so v Sloveniji vpisane v sortno listo ali se njihov material uradno potrjuje. Ta dokument bo v tiskani obliki širši javnosti in vsem zainteresiranim na voljo do poletja 2022. Na podlagi podatkov v omenjenem dokumentu bomo lahko v Genetskem laboratoriju na KIS hitro in zanesljivo izvedli genetske analize, ki bodo učinkovito odpravile dvom o sortni pristnosti in čistosti, tako za potrebe certifikacijskega organa (v skladu s priporočili OECD), kakor tudi za potrebe ISTA akreditiranega laboratorija, inšpekcijske službe, UVVHR-ja, MKGP-ja ter tudi pridelovalcev, uvoznikov semena in žlahtniteljev. 5. Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev Glavni doseženi cilj projekta je bil, da smo uspešno vzpostavili sistem zanesljive identifikacije žit in križnic s pomočjo DNA markerjev, kar sedaj omogoča hitro in učinkovito ter finančno sprejemljivo preverjanje sortne pristnosti in čistosti tako v postopku uradnega potrjevanja semena žit in križnic, kakor tudi pri pridelavi. Ugotovili smo, da na kvalitativnem nivoju lahko detektiramo že zelo majhne razlike v genomu za posamezen marker, če le-te obstajajo. Za vsakega izmed specifičnih SSR markerjev, za katere smo določili, da na nivoju detekcije namnožka na gelu/kvalitativne detekcije z gotovostjo uspešno razločujejo med starši in križanci pri stopnji 1% deleža netipičnih rastlin. Če bi želeli določiti razlike v nižjih deležih netipičnih rastlin (torej 0,1% in/ali 0,3% po shemi za različne kategorije certificiranega semena) bi morali analizo nadaljevati na nivo alelne detekcije (dražja in časovno ter metodološko bolj zahtevna), ki pa določi razlike med genotipi na en bazni par natančno, kar je optimalno in popolnoma zanesljivo. Vzpostavljene protokole ter sortno/vrstno specifične DNA markerje je mogoče uporabljati tudi pri določanju pristnosti lokalnih sort ter pri nadzoru varne hrane, saj lahko na podlagi testov ciljno primerjali posejane sorte žit s tistimi v skladišču oziroma v moki. Metode v projektu smo namreč tudi ciljno validirali z uporabo na dejanskih vzorcih, ki so bili v analizo posredovani na KIS/SUP za naslednje sklope: ločevanje navadnega in golega ovsa; ločevanje pšenice, pire in tritikale; ločevanje oljne ogrščice in oljne repice; identifikacija netipičnih rastlin znotraj semenskega posevka ječmena; identifikacija netipičnih rastlin znotraj semenskega posevka navadne ajde. Prav tako smo na nacionalnem nivoju vzpostavili krovni dokument, ki metodološko opredeljuje postopke identifikacije sort žit in križnic ter baze podatkov z genskimi profili sort/frekvencami alelov, ki so v Sloveniji vpisane v sortno listo ali se njihov material uradno potrjuje. Ta dokument bo v tiskani obliki širši javnosti in vsem zainteresiranim na voljo do poletja 2022. Na podlagi podatkov v omenjenem dokumentu bomo v Genetskem laboratoriju na KIS sedaj lahko hitro in zanesljivo izvedli genetske analize, ki bodo učinkovito odpravile dvom o sortni pristnosti in čistosti tako za potrebe certifikacijskega organa (v skladu s priporočili OECD), kakor tudi za potrebe ISTA akreditiranega laboratorija, inšpekcijske službe, UVVHR-ja, MKGP-ja ter tudi pridelovalcev, uvoznikov semena in žlahtniteljev samih. 6. Spremembe programa dela raziskovalnega projekta oziroma spremembe sestave projektne skupine 9. Drugi pomembni rezultati projektne skupine 10. Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine 10.1. Pomen za razvoj znanosti Varietal authenticity and high-quality seed of varieties that are adapted to Slovenian growing conditions are crucial for successful agricultural production and, consequently, for ensuring food security and reducing risks in agricultural production. Determining varietal authenticity and purity are essential elements of field inspections. The results of the assessment of these two parameters significantly affect the final breeding stage -the category into which the seed crop will be confirmed. The new rules of the International Seed Testing Association (ISTA) introduce more reliable procedures for determining varietal authenticity based on the use of DNA markers. In general, the most widely used molecular tool for various species is the application of SSR markers, and for certain plant species genotyping using even more precise SNP (Single Nucleotide Polymorphism) markers is also in the phase of introduction. In the recent period, breeders are increasingly striving to ensure that each variety has a prescribed genetic identification methodology along with its description, as well as an accessible genetic profile of certain loci in the genome, based on which the varieties can be reliably and effectively separated from each other. As a result, in terms of protecting breeders' rights, breeders are increasingly using new or reliable methods that effectively separate the varieties from each other, and that is with the use of DNA markers. Also, when confirming seed production during the growing season, the problem of identifying atypical plants arises, especially in the case of cereals and cruciferous vegetables. The same problem arises during the analysis of seed quality in the laboratory, when based on the morphological characteristics of the seed during the analysis of purity and germination, a suspicion of another variety, species or even genus arises. The set of plant species that were the subject of this CRP are varieties of agronomically important types of cereals and crucifers, which are entered on Slovenian or European variety lists, and their material is grown or officially certified in Slovenia. In addition, the set also included species that are difficult to identify and distinguish at the level of phenotype and morphological characteristics of seeds, seedlings, or plants in seed production (e.g., some crucifers such as Brassica rapa (turnip/canola); Sinapis arvensis L. (field mustard); and oat species Avena sativa L. (common oats); Avena nuda L. (bare oats); etc). Different types of DNA markers exist in the literature for plant genera and species from the groups of cereals and crucifers, depending on the informativeness, usefulness and reliability of the marker system for each plant species. The results of the project provide insight into the general diversity of varieties within the cereal group and between varieties within the cruciferous group. Based on the application of various DNA markers, which are related to the separation of individual genomes within varieties and between varieties, we also obtained information about the genomic regions based on which individual varieties differ from each other, which will help the study of the genome also using next-generation sequencing technologies (NGS). The results of the project were presented at numerous professional meetings and gatherings as well as at scientific conferences and symposia. It is important to point out the scientific achievement of the project, the original scientific article on the use of DNA markers for the genetic identification of naked and common oats, and the research work of BIC technical high school students entitled "The use of DNA markers to determine the proportion of atypical plants in seed crops of common wheat (Triticum aestivum L.) " and received Krka's award 2021 as part of the 51st Krka Awards competition (mentor Dr. Barbara Pipan). 11. Vpetost raziskovalnih rezultatov projektne skupine 11.1. Vpetost raziskave v domače okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? v domačih znanstvenih krogih pri domačih uporabnikih Kdo (poleg sofinancerjev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih? 11.2. Vpetost raziskave v tuje okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? v mednarodnih znanstvenih krogih pri mednarodnih uporabnikih Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujimi raziskovalnimi inštitucijami: Kateri so rezultati tovrstnega sodelovanja: 12. Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov Delno F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.06 Razvoj novega izdelka DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, DA NE Zastavljen cilj Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat Ni dosežen Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.28 Priprava/organizacija razstave DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj DA NE Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.32 Mednarodni patent DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.33 Patent v Sloveniji DA NE Zastavljen cilj Uporaba rezultatov Ni uporabljen F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj DA NE Rezultat Dosežen Uporaba rezultatov V celoti F.35 Drugo Zastavljen cilj DA NE 13. Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv G.01. Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02. Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.02. Širitev obstoječih trgov Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.05. Razširitev področja dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.07. Večji delež izvoza Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.08. Povečanje dobička Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.09. Nova delovna mesta Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih G.02.11. Nov investicijski zagon Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03. Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.03.03. Uvajanje novih tehnologij G.04. Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.04.05. Razvoj civilne družbe G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv Podpisa: Zastopnik oz. pooblaščena oseba Andrej Simončič Digitalno podpisano in Vodja programa/projekta Vladimir Meglič Digitalno podpisano ŽIG Datum: 16. 08. 2022 Oznaka obrazca: 11qb-iw4w-oomr-2c4s-057q-57ig-l METODE, POSTOPKI IN REZULTATI PREVERJANJA SORTNE PRISTNOSTI ŽIT IN KRIŽNIC CRP V4-1806: Vzpostavitev sistema uporabe DNA markerjev za genetsko identifikacijo pri preverjanju sortne pristnosti in čistosti pomembnejših vrst žit in križnic kot osnova za kakovostno pridelavo semenskih posevkov ter varno in kakovostno pridelano hrano in krmo METODE, POSTOPKI IN REZULTATI PREVERJANJA SORTNE PRISTNOSTI ŽIT IN KRIŽNIC CRP V4-1806: Vzpostavitev sistema uporabe DNA markerjev za genetsko identifikacijo pri preverjanju sortne pristnosti in čistosti pomembnejših vrst žit in križnic kot osnova za kakovostno pridelavo semenskih posevkov ter varno in kakovostno pridelano hrano in krmo Barbara Pipan, Romana Rutar, Darja Vouk, Lovro Sinkovič, Mateja Fortuna, Teja Krpan, Vladimir Meglič Ljubljana 2022 Izdal in založil KMETIJSKI INŠTITUT SLOVENIJE Ljubljana, Hacquetova ulica 17 Direktor prof. dr. Andrej SIMONČIČ Avtorji in uredniki dr. Barbara PIPAN mag. Romana RUTAR Darja VOUK dr. Lovro SINKOVIČ Mateja FORTUNA Teja KRPAN izr. prof. dr. Vladimir MEGLIČ Fotografije Ana ŠPILAK, Darja VOUK, Aljoša BREGAR, Barbara PIPAN Pregledala in lektorirala dr. Andreja Žibrat Gašparič Ostali notranji in zunanji sodelavci Uroš Benec, Lili Marinček, mag. Ela Žilič,Aljoša Bregar, Ana Špilak, Maša Zupančič Oblikovna zasnova naslovnice AV Studio d.o.o. Elektronska verzija je dostopna na spletni strani Kmetijskega inštituta Slovenije (www.kis.si) Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili vNarodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID 112886019 ISBN 978-961-6998-60-4 (PDF) Publikacija je nastala v okviru projekta CRP V4-1806, sofinanciranega s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije in Ministrstva za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano. Vsebinsko je bil projekt spremljan s strani Uprave za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin. KAZALO VSEBINE 1 UVOD........................................................................................................................................................................ 5 2 SPLOŠNI MATERIALI IN POSTOPKI, UPORABLJENI PRI ANALIZAH VSEH VRST ŽIT IN KRIŽNIC........................................................................................................................................................................... 6 2.1 PRIPRAVA SEZNAMA SORT ŽITIN KRIŽNIC...............................................................................................................................6 2.2 PRIPRAVA TER ANALIZA KAKOVOSTI SEMENA VKLJUČENIHSORT............................................................................................6 2.3 GENETSKA ANALIZA ..............................................................................................................................................................7 2.3.1 Izolacija DNA ter preverjanje kakovosti in količine DNA...............................................................................................7 2.3.2 Priprava in izvedba verižne reakcije s polimerazo (PCR)...............................................................................................8 2.3.3 Kvalitativna obravnava PCR produktov..........................................................................................................................8 2.3.4 Fragmentna analiza in prikaz rezultatov.........................................................................................................................8 3 PŠENICA, PIRA IN RŽ........................................................................................................................................ 10 3.1 SPECIFIČNI/E MATERIALI IN METODE V ANALIZI ....................................................................................................................10 3.2 REZULTATI ANALIZE KAKOVOSTI SEMENA............................................................................................................................13 3.3 Rezultati genetske analize ............................................................................................................................... 18 4 JEČMEN................................................................................................................................................................. 29 4.1 SPECIFIČNI MATERIALI IN METODE V ANALIZI .......................................................................................................................29 4.2 REZULTATI ANALIZE KAKOVOSTI SEMENA............................................................................................................................30 4.3 REZULTATI GENETSKE ANALIZE ...........................................................................................................................................32 5 OVES....................................................................................................................................................................... 35 5.1 SPECIFIČNI/E MATERIALI IN METODE V ANALIZI ....................................................................................................................35 5.2 REZULTATI ANALIZE KAKOVOSTI SEMENA............................................................................................................................36 5.3 REZULTATI GENETSKE ANALIZE ...........................................................................................................................................36 6 AJDA....................................................................................................................................................................... 39 6.1 SPECIFIČNI/E MATERIALI IN METODE V ANALIZI ....................................................................................................................39 6.2 REZULTATI ANALIZE KAKOVOSTI SEMENA............................................................................................................................40 6.3 REZULTATI GENETSKE ANALIZE ...........................................................................................................................................43 7 KRIŽNICE............................................................................................................................................................. 48 7.1 SPECIFIČNI/E MATERIALI IN METODE V ANALIZI ....................................................................................................................48 7.2 REZULTATI ANALIZE KAKOVOSTI SEMENA............................................................................................................................49 7.3 REZULTATI GENETSKE ANALIZE ...........................................................................................................................................55 1 UVOD Sortna pristnost in kakovostno seme sort, ki so prilagojene slovenskim pridelovalnim razmeram, sta ključnega pomena za uspešno kmetijsko pridelavo in posledično za zagotavljanje prehranske varnosti in zmanjšanje tveganja v kmetijski pridelavi. Veljavni predpisi o semenskem materialu kmetijskih rastlin določajo kriterije kakovosti, ki jih morajo izpolnjevati partije semena, ki so namenjene trženju. Kakovost semena v širšem pomenu predstavljajo ustrezna sortna pristnost in čistost, kalivost, tehnična čistota semena, vsebnost semena drugih vrst rastlin ter njihovo zdravstveno stanje. Za preverjanje kakovosti se uporabljajo uradno sprejete metode, ki temeljijo na metodah mednarodnih organizacij (International Seed Testing Association -ISTA, Organisation for Economic Co-operation and Development -OECD, International Union for the Protection of New Varieties of Plants -UPOV), na katere se sklicuje slovenska in evropska zakonodaja s področja semenskega materiala kmetijskih rastlin. Sortna pristnost in čistost se preverjata med rastjo (vizualni pregledi semenskih posevkov), ob analizi kakovosti semena vzorcev, odvzetih od partij semena pred trženjem (pri ugotavljanju kalivosti, čistosti, vsebnosti števila semen drugih vrst rastlin) in z naknadno kontrolo (analiza inšpekcijsko odvzetih vzorcev semena na trgu). Metode preverjanja sortne pristnosti in čistosti semenskih posevkov in vzorcev semena (poljski pregledi, laboratorijski testi) temeljijo na vizualni oceni izraženih morfoloških lastnosti rastlin v semenskih posevkih in na kontrolnem polju, ter na vizualni oceni semena tekom analize čistote in klic tekom testa kalivosti. Pri določenih vrstah kmetijskih rastlin je identifikacija ter ugotavljanje dovoljenega deleža netipičnih rastlin in rastlin druge sorte, vrste ali celo rodu na podlagi morfoloških lastnosti nezanesljiva in v postopku uradnega potrjevanja semenskih posevkov in partij semena kmetijskih rastlin predstavlja veliko težavo. Identifikacija na podlagi vizualnih znakov je posebej težavna pri določenih vrstah žit in križnic. Z modernimi tehnikami, ki omogočajo analizo rastlinskega materiala na nivoju genoma, lahko hitro in učinkovito preverimo sortno pristnost in čistost semena, preden bi bilo seme dano na trg. V okviru mednarodnih organizacij (OECD, ISTA, UPOV) poteka razprava o možnostih uvedbe teh modernih tehnik v uradne postopke, sodelujoče države pa naj bi v ta namen čim prej začele z vzpostavljanjem podatkovne baze genetskih profilov za sorte, ki jih preverjajo v uradnih postopkih. Sistem zanesljive identifikacije rodu/vrste/sorte z uporabo DNA markerjev metodološko do sedaj še ni bil vpeljan, zato se je pojavila potreba po vzpostavitvi zanesljivega in učinkovitega sistema za genetsko identifikacijo predvsem pri določenih vrstah žit in križnic, ki se v Sloveniji pridelujejo oziroma uradno potrjujejo. Ključnega pomena pri tem je pridobitev genetskih informacij za vzpostavitev primerne baze podatkov zlasti tistih sort, ki so v Sloveniji vpisane v sortno listo ali se njihov material (uradno) prideluje v Sloveniji. Predvideti je potrebno izmenjavo teh podatkov z drugimi državami članicami oz. njihovimi uradnimi organi, zato je potrebno pri razvoju sistema upoštevati tudi priporočila mednarodnih organizacij, zlasti OECD. V tem dokumentu so predstavljene metode, postopki in najpomembnejši rezultati preverjanja sortne pristnosti pomembnejših vrst žit in križnic z vidika preverjanja kakovosti semena ter na genetskem nivoju z uporabo DNA markerjev. Skupno smo v projektu analizirali 53 sort, kar je pomenilo analizo 403 genotipov žit in križnic. V genetski analizi smo uporabili 46 različnih DNA markerjev, ki vključujejo 3 različne markerske sisteme: 43 tipa SSR (angl. Short Seguence Repeat), 2 tipa SCAR (angl. Sequence Characterizied Amplified Region) in enega tipa CAPS (angl. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences). 2 SPLOŠNI MATERIALI IN POSTOPKI, UPORABLJENI PRI ANALIZAH VSEH VRST ŽIT IN KRIŽNIC V tem poglavju bomo predstavili in opisali vse materiale in metode, ki so glede na način izvedbe analiz skupne za vseh pet sklopov rastlinskih vrst žit in križnic (pšenica/pira/rž, ječmen, oves, ajda in križnice). Specifike analiz vsakega sklopa bodo predstavljene v ločenih poglavjih in se bodo navezovale na opise v tem poglavju (točka 2). Literatura, uporabljena in/ali citirana v celotnem dokumentu, je na voljo pri avtorjih publikacije. Fotografij rezultatov analize kakovosti semena/klic v točkah 3.2, 4.2, 5.2, 6.2 in 7.2 nismo številčili, saj smo opise navajali neposredno ob fotografijah in bi dodatno poimenovanje fotografij lahko zmedlo bralca. 2.1 Priprava seznama sort žit in križnic Izbor sort/vrst/rodov smo pripravili na podlagi pregleda strokovne literature, dostopnih baz podatkov, nacionalnih ter internih publikacij. Osredotočili smo se na izbor agronomsko pomembne vrste žit in križnic, ki so vpisane na slovenski ali evropski sortni listi ter se njihov material prideluje ali uradno potrjuje v Sloveniji. Preglednice po sklopih predstavljajo seznam sort, ki smo jih vključili v projekt V4-1806 po pregledu veljavne slovenske sortne liste in semenske pridelave preko uradnih standardnih vzorcev. V projekt so bile dodatno, in sicer z genetsko analizo, vključene tudi vrste, ki jih je na nivoju fenotipa in morfoloških karakteristik semena, klic ali rastlin v semenski pridelavi težko prepoznavati in razločevati. To so vrste Brassica rapa, Sinapis arvensis in Avena nuda, ki jih na spodnjih seznamih ni. Vključena je tudi sorta navadne pšenice Nexera, ki je bila dodatno na sortni listi v letu 2020, ko je projekt že intenzivno tekel in smo jo še lahko smiselno vključili. 2.2 Priprava ter analiza kakovosti semena vključenih sort V analizah, ki so bile izvedene v International Seed Testing Association (ISTA) akreditiranem Semenskem laboratoriju Kmetijskega inštituta Slovenije (KIS), smo za vsako sorto opravili analizo kakovosti semena (tj. določili čistoto in kalivost) po veljavnih ISTA protokolih. Na podlagi morfologije semena smo oblikovali podskupine, če so se semena iste sorte med seboj morfološko razlikovala. Semena in mlade rastline vsake sorte smo tudi fotografirali. Seme vzorcev agronomsko pomembnih vrst oz. sort žit in križnic, ki smo jih vključili v projekt, smo pridobili iz arhiva zbirke standardnih vzorcev semena, katerega skrbnik je KIS. V zbirki so shranjeni standardni vzorci semenskega materiala zavarovanih sort in sort vpisanih v sortno listo v skladu z Zakonom o semenskem materialu kmetijskih rastlin in Zakonom o varstvu novih sort rastlin. Iz vsakega uradnega standardnega vzorca semena smo naključno našteli 100 semen, pri čemer smo dosledno upoštevali definicijo čistega semena, ki jo določajo pravila mednarodne zveze za testiranje semena ISTA. Vezano na definicijo smo med čisto seme šteli vsako seme, ki pripada deklarirani oz. v laboratoriju identificirani rastlinski vrsti, in sicer: . zrelo in nepoškodovano seme osnovne velikosti, . nedozorelo, gluho ali vzklilo seme nad polovico osnovne velikosti, . deli semena večji od polovice osnovne velikosti, . seme ajde, ki nima semenske ovojnice, . golci žit nad polovico osnovne velikosti. Celoten vzorec 100 semen smo natančno pogledali, vsako seme posebej, s prostim očesom, s pomočjo digitalne lupe ali celo s pomočjo binokularnega mikroskopa. V nadaljevanju smo seme glede na enotnost oblike, barve in strukture povrhnjice razvrstili v eno ali več skupin. Nekateri vzorci so bili zelo uniformni in je bilo seme razvrščeno v eno samo skupino, drugi pa precej raznoliki in je bilo seme razvrščeno v več skupin, a največ v tri skupine. Vsak delovni postopek smo dokumentirali z opisi posameznih skupin semena in s fotografijami. Fotografirali smo vsak vzorec naključno naštetih 100 semen posamezne sorte in vzorčke semena posameznih podskupin, čeje bilo seme zaradi raznolikosti dodatno razvrščeno. V nadaljevanju smo za potrebe pridobitve mladih rastlin izvajali kalilne poskuse za vsako skupino semen. Iz posamezne skupine smo za postopek kalitve našteli največ 50 semen; v primeru, da je bilo v posamezni skupini manj kot 50 semen, pa smo v postopek kalitve vključili vse. Poskusi so potekali pripogojih, kijih za posamezno rastlinsko vrsto določajo pravila ISTA: . za substrat smo uporabili suh kremenčev pesek (velikost delcev: 0,05 do 0,8 mm; pH 6,0 do 7,5; dobavitelj: EKW Kremen, Novo mesto) in vodo iz pipe (pH 6,0 do 7,5); . v majhne plastične posode smo naložili 2 cm substrata, nanj smo razporedili seme in ga prekrili s tanjšo plastjo enakega substrata; . seme je kalilo pri naslednjih pogojih: -seme križnic in žit, razen navadne in tatarske ajde, je kalilo najprej 4 dni v temi pri nizki temperaturi +7 °C, potem pa 8 dni pri višji konstantni temperaturi +20 °C in fotoperiodi z 8 urami teme in 16 urami svetlobe; -seme navadne in tatarske ajde je 6 dni kalilo le pri visoki izmenični temperaturi in fotoperiodi z 8 urami svetlobe pri temperaturi 30 °C in 16 urami teme pri temperaturi 20 °C. Vsaki analizni številki smo pripisali štiri oz. osem individualnih rastlin/genotipov, vsako s svojo laboratorijsko oznako genotipa (preglednice s seznamom vključenih sort pri vsakem sklopu rastlin). Po štiri rastline za vsako sorto smo analizirali pri samoprašnih vrstah, po osem genotipov na sorto pa za tujeprašne rastlinske vrste z namenom ovrednotit molekulsko variabilnost znotraj sorte (rezulati AMOVA in analize glavnih koordinat -PCoA pri vsakem sklopu rastlin). Če smo pri analizah na nivoji fenotipa semena in/ali klic opazili razlike znotraj posamezne sorte, smo le-to razdelili na podvzorce in jih nadalje analiziraliločeno. 2.3 Genetska analiza 2.3.1 Izolacija DNA ter preverjanje kakovostiin količine DNA Izolacija DNA je potekala različno glede na analizirano rastlinsko vrsto in bo predstavljena pri vsakem sklopu rastlin posebej. Skupno vsem sklopom rastlin pa je preverjanje kakovosti in količine izolirane DNA. Prisotnost in kvaliteto genomske DNA smo zaznali s horizontalno gelsko elektroforezo. DNA je negativno nabita in potuje po agaroznem gelu, ki je pod napetostjo. Agarozni gel, ki smo ga pripravili iz agaroze in pufra TBE (borova kislina 44,5 mmol/l; Trizma Base 44,6 mmol/l; EDTA 10 mmol/l), tvori mrežo, po kateri manjši fragmenti DNA potujejo hitreje kot večji fragmenti, kar nam je služilo za zaznavanje morebitne razkrojenosti DNA, v nadaljnjih fazah poskusa pa tudi za ločevanje različno velikih produktov PCR. Ker smo pred potekom elektroforeze dodali fluorescenčno barvilo, ki se veže na DNA (tj. etidijev bromid -v nadaljevanju EtBr), smo lahko DNA vizualizirali pod UV svetlobo. Izolirano DNA smo preverili na 1 % agaroznem gelu. V posamezen žepek agaroznega gela smo nanesli 5 µl izolirane DNA, ki smo jo predhodno zmešali s 5 µl pufra za potovanje nukleinskih kislin (pripravljen iz 6X TriTrack DNA loading dye, Thermo fisher, v nadaljevanju LB). Kot lestvico nukleinskih kislin smo uporabili GeneRuler velikosti 1 kb ( Thermoscientific ™ DNA Ruller ™ 1 kb DNA Ladder ). Ločevanje je potekalo na sistemu za horizontalno elektroforezo (Gibco BRL, Life Technologies). Potovanje celokupne genomske DNA je potekalo pri električni napetosti 100 V, 50 minut. Vizualizacijo gela smo opravili s sistemom GeneGenius, Syngene in programsko opremo GeneSnap, Syngene. Koncentracijo DNA smo izmerili na fluorometru (Qubit™ 3.0; ThermoFisher Scientific, MA, USA), s kitom Qubit™ dsDNA Broad Range Assay (Thermo Scientific). DNA smo pufrom TE redčili do delovne koncentracije 10 ng/µl in jo ponovno preverili na 1 % agaroznem gelu. 2.3.2 Priprava in izvedba verižne reakcije s polimerazo (PCR) Za reakcije namnoževanja markerjev smo uporabili dva različna seta/tipa kemikalij. Primarno so to bile kemikalije Biotools (v nadaljevanju: BT). Za bolj zahtevne vzorce nam je kot robustna alternativa služila zmes kemikalij QuantaBio AccuStart ™ II PCR ThoughMix R (v nadaljevanu: QB), ki smo ji dodali le začetne oligonukleotide in unierzalne fluorescenčne oligonukleotide. Reakcijo smo pripravili po že objavljenih protokolih (Pipan in sod., 2013;Meglič in Pipan 2018; Pipan in Meglič, 2019). V prvem koraku smo vsak marker optimizirali glede na ustrezno reakcijsko mešanico in temperaturniprofil v PCR. Za optimizacijo smo izbrali 7 naključnih vzorcev, na katerih smo izvedli PCR pri različnih pogojih. Ko smo uporabili ustrezen protokol, pri katerem seje tarčno zaporedje uspešno pomnožilo, smo izvedli PCR vseh vzorcev. Uporabili smo PCR protokole, ki so opisani kot: . PCR protokol Piquemal -protokol 1: optimiziran po Pipan in sod., 2013; Pipan in sod., 2016; Pipan in sod., 2017, Pipan in Meglič, 2019; . PCR protokol Modified Piquemal – protokol 2: optimiziran po Pipan in sod., 2013; Pipan in sod., 2016; Pipan in sod., 2017, Pipan in Meglič, 2019; . PCR protokol Qlocus-askura -protokol 3: optimiziran po Asakura in sod., 2009; . PCR protokol SSR-tail – protokol 4: optimiziran po Pipan in Meglič, 2019; . PCR protokol scar7_johns_bt –protokol 5: optimiziran po Iniguez-Luy in sod., 2006; . PCR protokol scar1_johns_bt –protokol 6: optimiziran po Iniguez-Luy in sod., 2006. Reakcije smo izvedli v cikličnih termostatih Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) ali SureCycler 8800 (Agilent Technologies) ter zagnali ustrezen PCR protokol glede na temperaturne zahteve za posamezen marker. V analizi smo uporabili trinajst markerjev, ki določajo nivo razlikovanja znotraj ali med vrstami rži, pire in pšenice. 2.3.3 Kvalitativna obravnava PCR produktov Po končanem PCR smo produkte preverili na horizontalni gelski elektroforezi na 1,4 % (oziroma 2 % v primeru markerja CAPS) agaroznem gelu in ga fotografirali z UV svetlobo (GeneGenius in GeneSnap, Syngene). Pri vsakem vzorcu smo za posamezen marker lahko razbrali prisotnost pomnoženega fragmenta, za orientacijo nam je služil podatek o pričakovani velikosti fragmenta, ki smo ga dobili v literaturi, in lestvica nukleinskih kislin. Ta tip analize je bil končen pri CAPS markerju (skupina pšenica/pira/rž) ter pri SCAR markerjih (skupina križnic). 2.3.4 Fragmentna analiza in prikaz rezultatov Pri SSR (Simple Sequence Repetas) markerjih smo za najbolj natančno razlikovanje in določanje polimorfizmov opravili primerjavo alelnih profilov (fragmentna analiza) na sekvenatorju 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems; ABI 3130). Elektroferograme smo prebrali v programu GeneMapper 6.0 ter na podlagi kodominantnih vhodnih matrik izvedli analizo podatkov z uporabo programov in programskih paketov s področja populacijske genetike (GenAleX, Arlequin, Populations, Genetix, MsToolkit, Structure). Prikazali smo najbolj pomembne rezultate, in sicer: . frekvence alelov posameznega markerja pri posamezni vrsti/sorti/podvzorcu sorte; . ustreznost/sposobnost posameznega markerja za razločevanje med vrstami/sortami/podvzorci in znotraj njih glede na odstopanje od Hardy-Weinbergovega ravnotežja (HWE); . izračunali smo genetsko podobnost med vrstami/sortami/podvzorci glede na Nei-jevo standardno genetsko razdaljo (Nei, 1972); . izračunali delež molekulske variabilnosti (AMOVA) med vrstami/sortami/podvzorci sort, znotraj vključenih genotipov in med njimi; . prikazali delež pojasnjene molekulske variabilnosti v analizi glavnih koordinat (PCoA). PŠENICA, PIRA IN RŽ V analizi smo uporabili 16 sort pšenice (Preglednica 1). Pri sortah Anđelika, Gorolka, Marinka, Savinja in Zvezdana smo imeli po dva različna fenotipa semen, vsakemu izmed njiju je pripadala svoja analizna številka. Vsaki analizni številki smo pripisali štiri individualne rastline/genotipe, vsako s svojo laboratorijsko oznako genotipa. Po štiri rastline za vsako sorto smo analizirali pri samoprašnih vrstah, po osem genotipov na sorto pa za tujeprašne rastlinske vrste. V tem sklopu analiz je bila izjema sorta Zvezdana, kjer smo pri enem fenotipu imeli na voljo le tri rastline. Za sorte Ficko, NS Metka, Primorka, Reska, Simonida, Vulkan, smo imeli le eno analizno številko, za vsako smo uporabili štiri individualne rastline. Za sorte Xt 88.86 (Xt 86) ŽS, Nexera 86, Nexera 923, Xt 88.86, Xt 9.23 in Xt 9.28 smo za genotipizacijo uporabili izolirano DNA iz prejšnjih internih analiz. Pri teh smo uporabili izolirano DNA štirih individualnih rastlin, razen pri Xt 88.86 (Xt 86) ŽS, kjer smo uporabili izolirano DNA osmih individualnih rastlin, kot pri vseh tujeprašnih rastlinah. Ker smo uporabljali predhodno izolirano DNA, nimamo podatka o analizni številki in o fenotipu rastlin (NP = ni podatka). Uporabili smo dve sorti pire, Mursko belo in Mursko dolgoklaso. Pri obeh smo imeli opravka s semeni brez plev in s semeni v plevah. Za vsako različico semena – analizno številko – smo vzeli štiri individualne rastline. Rž je predstavljala ena sorta, Belokranjska rž, ki je združevala tri različne fenotipe semen. Za vsak fenotip smo vzeli osem individualnih rastlin. 3.1 Specifični/e materiali in metode v analizi Preglednica 1: Seznam sort, analizne številke, število individualnih rastlin vanalizi in laboratorijske oznake genotipov pri analizi navadne pšenice, pire in rži (NP = ni podatka) . Pšenica . Rž Sorta Analizna številka Število individualnih Laboratorijska oznaka genotipa rastlin v analizi Anđelika 1208-1/19 in 1208-2/19 4 + 4 34-1a…34-1d in 34-2a…34-2d Gorolka 1210-1/19 in 1210-2/19 4 + 4 36-1a…36-1d in 36-2a…36-2d Marinka 1211-1/19 in 1211-2/19 4 + 4 37-1a…37-1d in 37-2a…37-2d Savinja 1215-1/19 in 1215-2/19 4 + 4 41-1a…41-1d in 41-2a…41-2d Zvezdana 1218-1/19 in 1218-2/19 4 + 3 44a…44d in 44-2a…44-2c Xt 88.86 (Xt 86) ŽS NP 4 48a…48d Ficko 1209-1/19 4 35a…35d NS Metka 1212-1/19 4 38a…38d Primorka 1213-1/19 4 39a…39d Reska 1214-1/19 4 40a…40d Simonida 1216-1/19 4 42a…42d Sorta Analizna številka Število individualnih Laboratorijska oznaka genotipa rastlin v analizi Vulkan 1217-1/19 4 43a…43d Xt 88.86 (Xt 86) ŽS NP 4 49a…49d Nexera 86 NP 4 50a…50d Nexera 923 NP 4 51a…51d Xt 9.23 NP 4 53a…53d Xt 9.28 NP 4 54a…54d Xt 88.86 NP 4 52a…52d . Pira Sorta Analizna številka Število individualnih rastlin v Laboratorijska oznaka analizi genotipa Murska bela (semena brez plev) 1219a-1/19 4 45-1a…45-1d Murska bela (semena v plevah) 1219b-1/19 4 45-2b…45-2d Murska dolgoklasa (semena brez plev) 1220a-1/19 4 46-1a…46-1d Murska dolgoklasa (semena v plevah) 1220b-1/19 4 46-2a…46-2d Sorta Belokranjska rž Analizna številka 1206-1/19 Število individualnih rastlin v analizi 8 Laboratorijska oznaka genotipa 32-1a…32-1h Belokranjska rž 1206-2/19 8 32-2a…32-2h Belokranjska rž 1206-3/19 8 32-3a…32-3h Izolacijo genomske DNA posameznih vzorcev smo opravili na robotu za izolacijo nukleinskih kislin MagMax ™ (Applied Biosystems). Uporabili smo kemikalije iz kompleta za izolacijo DNA BioSprint 15 DNA Plant (Qiagen). Izolacijo DNA smo izvedli po optimiziranem protokolu (opisan v Pipan in Meglič 2019). Slika 1: Priprava rastlinskega tkiva za izolacijo DNA Preglednica 2: Seznam markerjev in njihove aplikacije pri rži, piri in navadni pšenici Ime markerja (oznaka v laboratoriju) Xgwm261-2D (a) Xgwm408-5B (b) Tip markerja SSR SSR Nivo razlikovanja Raznolikost pšenice Ločevanje znotraj visoko sorodnimi sortami pšenice in tritikale PCR protokol Piquemal Modified Piquemal Uporabljena kemija v PCR BT QB Dolžinski standard v fragmentni analizi ROX 500 ROX 500 Xgwm577-7B (c) SSR Raznolikost in razločevanje med pšenica/rž/tritikala Modified Piquemal BT ROX 500 SCM138 (d) SCM268 (e) SCM9 (f) SSR SSR SSR Raznolikost rži Raznolikost rži Raznolikost in razločevanje med pšenica/rž/tritikala Modified Piquemal Modified Piquemal Modified Piquemal QB QB QB ROX 500 ROX 500 ROX 500 SCM120 (g) SSR Raznolikost in razločevanje med pšenica/rž/tritikala Piquemal BT ROX 500 SCM28 (h) SSR Raznolikost in razločevanje med ržjo in tritikalo Piquemal QB ROX 500 SCM86 (i) SSR Raznolikost in razločevanje med ržjo in tritikalo Modified Piquemal QB ROX 500 BARC176 (j) SSR Specifičen za pšenico in trikalo Piquemal QB ROX 500 VMS159 (l) VMS182 (m) L1 in R1 (k) SSR SSR CAPS Razločevanje med pšenico in piro Razločevanje med pšenico in piro Razločevanje med pšenico in piro Piquemal Modified Piquemal Qlocus Askura QB QB BT ROX 500 ROX 500 NA Analiza CAPS (angl. cleaved amplified polymorphic sequences) makerjev je potekala v treh korakih: 1. PCR s specifičnimi začetnimi oligonukleotidi, 2. restrikcija PCR produktov z endonukleazo (restrikcijski encim) in 3. ločevanje produktov restrikcije na gelu. Pomnožene fragmente smo po preverjanju na 1,4 % agaroznem gelu v drugem koraku razrezali z restrikcijskim encimom FastDigest MspI (Thermo Scientific). Po končanem PCR smo produkte preverili na horizontalni gelski elektroforezi na 2 % gelu v primeru markerja CAPS agaroznem gelu in gel fotografirali (GeneGenius in GeneSnap, Syngene). Pri vsakem vzorcu smo lahko razbrali prisotnost pomnoženega fragmenta, za orientacijo nam je služil podatek o pričakovani velikosti fragmenta, ki smo ga dobili v literaturi in lestvica nukleinskih kislin. 3.2 Rezultati analize kakovosti semena Za vsako analizno številko navadne pšenice, pire in rži smo zabeležili število semen, ki smo jih dali na test kalivosti, število normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic ter mrtvih semen (Preglednica 3-5), klice pa smo tudi fotografirali. . Pšenica Preglednica 3: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih in nenormalnih klic, mrtvih semen ter delež normalnih in nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte navadne pšenice Sorta Analizna številka Število individualnih rastlin v analizi Laboratorijska oznaka genotipa Anđelika 1208-1/19 in 1208-2/19 4 + 4 34-1a…34-1d in 34-2a…34-2d Gorolka 1210-1/19 in 1210-2/19 4 + 4 36-1a…36-1d in 36-2a…36-2d Marinka 1211-1/19 in 1211-2/19 4 + 4 37-1a…37-1d in 37-2a…37-2d Savinja 1215-1/19 in 1215-2/19 4 + 4 41-1a…41-1d in 41-2a…41-2d Zvezdana 1218-1/19 in 1218-2/19 4 + 3 44a…44d in 44-2a…44-2c Xt 88.86 (Xt 86) ŽS NP 4 48a…48d Ficko 1209-1/19 4 35a…35d NS Metka 1212-1/19 4 38a…38d Primorka 1213-1/19 4 39a…39d Reska 1214-1/19 4 40a…40d Simonida 1216-1/19 4 42a…42d Vulkan 1217-1/19 4 43a…43d Xt 88.86 (Xt 86) ŽS NP 4 49a…49d Nexera 86 NP 4 50a…50d Nexera 923 NP 4 51a…51d Xt 9.23 NP 4 53a…53d Xt 9.28 NP 4 54a…54d Xt 88.86 NP 4 52a…52d 1.) Sorta Anđelika: kalivost semen z analiznima številkama 1208-1/19 (1) in 1208-2/19 (2) je bila 97 % in 98 % (razvoj normalnih klic). 2.) Ficko: kalivost semen z analizno številko 1209-1/19 je bila 88 %. 3.) Gorolka: kalivost semen z analiznima številkama 1210-1/19 (1) in 1210-2/19 (2) je bila 74 % in 66 %. 4.) Marinka: kalivost semen z analiznima številkama 1211-1/19 (1) in 1211-2/19 (2) je bila 98 % in 100 %. 5.) NS Metka: kalivost semen z analizno številko 1212-1/19 je bila 100 %. 6.) Primorka: kalivost semen z analizno številko 1213-1/19 je bila 96 %. 7.) Reska: kalivost semen z analizno številko 1214-1/19 je bila 98 %. 8.) Savinja: kalivost semen z analiznima številkama 1215-1/19 (1) in 1215-2/19 (2) je bila 52 % in 24 %. 9.) Simonida: kalivost semen z analizno številko 1216-1/19 je bila 40 %. 10.) Vulkan: kalivost semen z analizno številko 1217-1/19 je bila 96 %. 11.) Zvezdana: kalivost semen z analiznima številkama 1218-1/19 (1) in 1218-2/19 (2) je bila 42 % in 100 %. . Pira Preglednica 4: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte pire Sorta Analizna številka ŠT.SEME N na test kalivosti REZULTATI -število klic/semen NORMA NENOR MRTV LNE MALNE A klice klice semena REZULTATI -delež klic/semen (%) NORMA NENORMAL MRTVA LNE klice NE klice semena Murska Bela (seme brez plev) 1219a­1/19 50 48 0 2 96 0 4 Murska Bela (seme v plevah) 1219b­1/19 50 45 0 5 90 0 10 Murska dolgoklasa (seme brez plev) 1220a­1/19 50 45 0 5 90 0 10 Murska dolgoklasa (seme v plevah) 1220b­1/19 50 43 0 7 86 0 14 Pri obeh sortah smo imeli opravka z dvema različicama semen (ena so bila v plevah, druga brez plev). 1.) Murska Bela: kalivost semen z analiznima številkama 1219a-1/19 -brez plev (a) in 1219b-1/19 -v plevah (b), je bila 96 % (1a) in 90 % (1b) (razvoj normalnih klic). 2.) Murska Bela: kalivost semen z analiznima številkama 1220a-1/19 – brez plev (a) in 1220b-1/19 – v plevah (b), je bila 90 % (2a) in 86 % (2b). . Rž Preglednica 5: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih in nenormalnih klic, mrtvih semen ter delež normalnih in nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte rži Sorta Analizn a številka ŠT.SEME N na test kalivosti REZULTATI -število klic/semen NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena REZULTATI -delež klic/semen (%) NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena Belokranjsk a rž Belokranjsk a rž Belokranjsk a rž 1206­1/19 1206­2/19 1206­3/19 50 19 12 49 0 1 18 0 1 10 1 1 98 0 2 95 0 5 84 8 8 Pri sorti Belokranjska ržje bila kalivost semen z analiznimi številkami 1206-1/19 (1), 1206-2/19 (2) in 1206­3/19 (3), 98 %, 95 % in 84 % (razvoj normalnih klic). Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 3.3 Rezultati genetske analize Slika 2: Frekvenca posameznih alelov po lokusih glede na vrsto/sorto/podvzorec pšenice, rži in pire Rezultati analize s CAPS markerjem L1 in R1 je podal uniformne pomnožke pšenice, 323 bp, vendar so bile prisotne posamezne razlike med naključnimi genotipi znotraj sort, kjer se marker ni pomnožil. Pri rži se nipomnožil, pri piri pa je vseboval dva fragmenta velikosti 137 bp in 186 bp. Preglednica 6: Ustreznost posameznega markerja za razločevanje med pšenico, ržjo in piro ter zmožnost ločevanja znotraj njih glede na rezultate Hardy-Weinbergovega ravnotežja Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 32-1 Xgwm261 27,556 0,025 * 32-1 Xgwm408 32,889 0,005 ** 32-1 Xgwm577 16,000 0,014 * 32-1 SCM138 11,810 0,066 ns 32-1 SCM268 8,000 0,005 ** 32-1 SCM9 24,000 0,008 ** 32-1 SCM120 16,000 0,001 ** 32-1 SCM28 14,857 0,462 ns 32-1 SCM86 24,000 0,065 ns 32-1 BARC176 30,000 0,092 ns 32-1 VMS159 40,000 0,066 ns 32-1 VMS182 25,209 0,238 ns 32-2 Xgwm261 8,000 0,238 ns 32-2 Xgwm408 8,000 0,629 ns 32-2 Xgwm577 10,032 0,018 * 32-2 SCM138 18,000 0,055 ns 32-2 SCM268 8,000 0,046 * 32-2 SCM9 29,333 0,015 * 32-2 SCM120 16,960 0,321 ns 32-2 SCM28 32,000 0,006 ** 32-2 SCM86 24,000 0,065 ns 32-2 BARC176 25,778 0,215 ns 32-2 VMS159 30,667 0,079 ns 32-2 VMS182 24,320 0,060 ns 32-3 Xgwm261 24,000 0,065 ns 32-3 Xgwm408 24,000 0,008 ** 32-3 Xgwm577 16,000 0,014 * 32-3 SCM138 18,311 0,050 * 32-3 SCM268 1,653 0,199 ns 32-3 SCM9 2,880 0,090 ns 32-3 SCM120 32,000 0,006 ** 32-3 SCM28 40,000 0,066 ns 32-3 SCM86 27,111 0,167 ns 32-3 BARC176 40,000 0,297 ns 32-3 VMS159 20,500 0,154 ns 32-3 VMS182 27,556 0,153 ns 34-1 Xgwm261 12,000 0,062 ns 34-1 Xgwm408 12,000 0,679 ns 34-1 Xgwm577 12,000 0,062 ns 34-1 SCM138 4,000 0,046 * 34-1 SCM268 NA NA 34-1 SCM9 4,000 0,046 * 34-1 SCM120 4,000 0,677 ns 34-1 SCM28 12,000 0,062 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 34-1 SCM86 8,000 0,046 * 34-1 BARC176 4,000 0,046 * 34-1 VMS159 4,000 0,261 ns 34-1 VMS182 6,667 0,353 ns 34-2 Xgwm261 16,000 0,100 ns 34-2 Xgwm408 16,000 0,100 ns 34-2 Xgwm577 20,000 0,172 ns 34-2 SCM138 4,000 0,261 ns 34-2 SCM268 0,082 0,775 ns 34-2 SCM9 9,000 0,174 ns 34-2 SCM120 4,000 0,261 ns 34-2 SCM28 1,440 0,696 ns 34-2 SCM86 4,000 0,261 ns 34-2 BARC176 12,000 0,062 ns 34-2 VMS159 12,000 0,062 ns 34-2 VMS182 10,000 0,440 ns 35 Xgwm261 12,000 0,679 ns 35 Xgwm408 12,000 0,285 ns 35 Xgwm577 6,667 0,353 ns 35 SCM138 4,000 0,046 * 35 SCM268 NA NA 35 SCM9 4,000 0,046 * 35 SCM120 5,000 0,544 ns 35 SCM28 4,160 0,245 ns 35 SCM86 12,000 0,285 ns 35 BARC176 4,000 0,261 ns 35 VMS159 4,000 0,261 ns 35 VMS182 4,000 0,261 ns 36-1 Xgwm261 16,000 0,100 ns 36-1 Xgwm408 12,000 0,285 ns 36-1 Xgwm577 12,000 0,062 ns 36-1 SCM138 4,000 0,046 * 36-1 SCM268 NA NA 36-1 SCM9 4,000 0,046 * 36-1 SCM120 4,000 0,677 ns 36-1 SCM28 4,160 0,245 ns 36-1 SCM86 12,000 0,679 ns 36-1 BARC176 NA NA 36-1 VMS159 6,667 0,353 ns 36-1 VMS182 8,000 0,629 ns 36-2 Xgwm261 9,000 0,174 ns 36-2 Xgwm408 12,000 0,285 ns 36-2 Xgwm577 12,000 0,062 ns 36-2 SCM138 4,000 0,046 * 36-2 SCM268 NA NA 36-2 SCM9 12,000 0,062 ns 36-2 SCM120 8,000 0,046 * 36-2 SCM28 16,000 0,100 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 36-2 SCM86 20,000 0,172 ns 36-2 BARC176 1,440 0,230 ns 36-2 VMS159 4,000 0,261 ns 36-2 VMS182 4,000 0,261 ns 37-1 Xgwm261 4,000 0,261 ns 37-1 Xgwm408 12,000 0,285 ns 37-1 Xgwm577 4,000 0,261 ns 37-1 SCM138 4,000 0,261 ns 37-1 SCM268 0,082 0,775 ns 37-1 SCM9 4,000 0,677 ns 37-1 SCM120 1,000 0,801 ns 37-1 SCM28 4,000 0,261 ns 37-1 SCM86 3,360 0,339 ns 37-1 BARC176 0,444 0,505 ns 37-1 VMS159 4,889 0,558 ns 37-1 VMS182 8,000 0,629 ns 37-2 Xgwm261 20,000 0,521 ns 37-2 Xgwm408 12,000 0,285 ns 37-2 Xgwm577 12,000 0,062 ns 37-2 SCM138 12,000 0,285 ns 37-2 SCM268 NA NA 37-2 SCM9 4,000 0,046 * 37-2 SCM120 1,444 0,695 ns 37-2 SCM28 5,000 0,544 ns 37-2 SCM86 8,000 0,629 ns 37-2 BARC176 16,000 0,100 ns 37-2 VMS159 28,000 0,464 ns 37-2 VMS182 8,000 0,238 ns 38 Xgwm261 12,000 0,679 ns 38 Xgwm408 12,000 0,679 ns 38 Xgwm577 12,000 0,285 ns 38 SCM138 4,000 0,261 ns 38 SCM268 NA NA 38 SCM9 4,000 0,261 ns 38 SCM120 12,444 0,256 ns 38 SCM28 16,000 0,382 ns 38 SCM86 20,000 0,521 ns 38 BARC176 4,000 0,046 * 38 VMS159 4,000 0,046 * 38 VMS182 12,000 0,285 ns 39 Xgwm261 12,000 0,679 ns 39 Xgwm408 12,000 0,062 ns 39 Xgwm577 20,000 0,172 ns 39 SCM138 1,440 0,230 ns 39 SCM268 4,000 0,046 * 39 SCM9 12,000 0,285 ns 39 SCM120 0,444 0,931 ns 39 SCM28 8,000 0,046 * Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 39 SCM86 4,000 0,261 ns 39 BARC176 8,000 0,046 * 39 VMS159 12,000 0,285 ns 39 VMS182 8,000 0,046 * 40 Xgwm261 12,000 0,679 ns 40 Xgwm408 11,111 0,349 ns 40 Xgwm577 12,000 0,062 ns 40 SCM138 4,000 0,261 ns 40 SCM268 0,444 0,505 ns 40 SCM9 8,000 0,629 ns 40 SCM120 8,000 0,629 ns 40 SCM28 4,000 0,261 ns 40 SCM86 12,000 0,285 ns 40 BARC176 16,444 0,353 ns 40 VMS159 20,000 0,521 ns 40 VMS182 5,111 0,530 ns 41-1 Xgwm261 8,160 0,227 ns 41-1 Xgwm408 8,000 0,238 ns 41-1 Xgwm577 12,000 0,062 ns 41-1 SCM138 4,000 0,046 * 41-1 SCM268 NA NA 41-1 SCM9 12,000 0,062 ns 41-1 SCM120 3,333 0,766 ns 41-1 SCM28 0,082 0,775 ns 41-1 SCM86 1,440 0,696 ns 41-1 BARC176 8,000 0,046 * 41-1 VMS159 12,000 0,285 ns 41-1 VMS182 12,000 0,285 ns 41-2 Xgwm261 8,444 0,207 ns 41-2 Xgwm408 12,000 0,062 ns 41-2 Xgwm577 12,000 0,062 ns 41-2 SCM138 4,000 0,046 * 41-2 SCM268 1,440 0,230 ns 41-2 SCM9 4,000 0,261 ns 41-2 SCM120 4,160 0,245 ns 41-2 SCM28 4,160 0,245 ns 41-2 SCM86 2,333 0,506 ns 41-2 BARC176 0,444 0,505 ns 41-2 VMS159 4,000 0,261 ns 41-2 VMS182 3,333 0,766 ns 42 Xgwm261 1,440 0,696 ns 42 Xgwm408 4,000 0,261 ns 42 Xgwm577 12,000 0,062 ns 42 SCM138 4,000 0,046 * 42 SCM268 NA NA 42 SCM9 12,000 0,062 ns 42 SCM120 8,444 0,207 ns 42 SCM28 5,000 0,172 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 42 BARC176 NA NA 42 VMS159 4,000 0,261 ns 42 VMS182 4,000 0,261 ns 43 Xgwm261 12,000 0,285 ns 43 Xgwm408 12,000 0,285 ns 43 Xgwm577 12,000 0,285 ns 43 SCM138 4,000 0,046 * 43 SCM268 1,440 0,230 ns 43 SCM9 4,000 0,261 ns 43 SCM120 14,000 0,526 ns 43 SCM28 9,000 0,174 ns 43 SCM86 14,000 0,526 ns 43 BARC176 9,000 0,174 ns 43 VMS159 20,000 0,172 ns 43 VMS182 8,444 0,586 ns 44-2 Xgwm261 0,120 0,729 ns 44-2 Xgwm408 3,000 0,392 ns 44-2 Xgwm577 3,000 0,392 ns 44-2 SCM138 3,000 0,083 ns 44-2 SCM268 3,000 0,083 ns 44-2 SCM9 12,000 0,285 ns 44-2 SCM120 NA NA 44-2 SCM28 NA NA 44-2 SCM86 3,000 0,083 ns 44-2 BARC176 NA NA 44-2 VMS159 3,000 0,392 ns 44-2 VMS182 4,500 0,609 ns 44 Xgwm261 0,082 0,775 ns 44 Xgwm408 4,000 0,261 ns 44 Xgwm577 4,000 0,261 ns 44 SCM138 4,000 0,046 * 44 SCM268 NA NA 44 SCM9 4,000 0,046 * 44 SCM120 4,000 0,677 ns 44 SCM28 5,000 0,172 ns 44 SCM86 12,000 0,285 ns 44 BARC176 0,082 0,775 ns 44 VMS159 4,000 0,261 ns 44 VMS182 4,000 0,046 * 45-1 Xgwm261 4,000 0,677 ns 45-1 Xgwm408 12,000 0,285 ns 45-1 Xgwm577 12,000 0,062 ns 45-1 SCM138 4,000 0,046 * 45-1 SCM268 0,082 0,775 ns 45-1 SCM9 12,000 0,679 ns 45-1 SCM120 8,444 0,586 ns 45-1 SCM28 20,000 0,172 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 45-1 SCM86 20,000 0,172 ns 45-1 BARC176 6,667 0,756 ns 45-1 VMS159 12,000 0,679 ns 45-1 VMS182 8,000 0,046 * 45-2 Xgwm261 3,360 0,339 ns 45-2 Xgwm408 6,667 0,756 ns 45-2 Xgwm577 12,000 0,285 ns 45-2 SCM138 4,000 0,046 * 45-2 SCM268 NA NA 45-2 SCM9 12,000 0,679 ns 45-2 SCM120 14,000 0,526 ns 45-2 SCM28 16,000 0,382 ns 45-2 SCM86 20,000 0,521 ns 45-2 BARC176 14,000 0,526 ns 45-2 VMS159 6,667 0,353 ns 45-2 VMS182 0,444 0,505 ns 46-1 Xgwm261 0,444 0,931 ns 46-1 Xgwm408 4,000 0,261 ns 46-1 Xgwm577 4,000 0,261 ns 46-1 SCM138 4,000 0,046 * 46-1 SCM268 1,440 0,230 ns 46-1 SCM9 12,000 0,679 ns 46-1 SCM120 3,333 0,766 ns 46-1 SCM28 12,000 0,062 ns 46-1 SCM86 12,000 0,062 ns 46-1 BARC176 16,000 0,100 ns 46-1 VMS159 12,000 0,285 ns 46-1 VMS182 0,082 0,775 ns 46-2 Xgwm261 12,000 0,285 ns 46-2 Xgwm408 12,000 0,062 ns 46-2 Xgwm577 14,000 0,526 ns 46-2 SCM138 4,000 0,046 * 46-2 SCM268 4,000 0,046 * 46-2 SCM9 12,000 0,062 ns 46-2 SCM120 3,333 0,766 ns 46-2 SCM28 1,440 0,696 ns 46-2 SCM86 20,000 0,172 ns 46-2 BARC176 12,000 0,062 ns 46-2 VMS159 4,000 0,261 ns 46-2 VMS182 NA NA 48 Xgwm261 20,000 0,172 ns 48 Xgwm408 8,444 0,207 ns 48 Xgwm577 12,000 0,062 ns 48 SCM138 4,000 0,046 * 48 SCM268 4,000 0,046 * 48 SCM9 4,000 0,046 * 48 SCM120 4,000 0,046 * 48 SCM28 12,000 0,062 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 48 SCM86 8,000 0,046 * 48 BARC176 16,444 0,353 ns 48 VMS159 8,000 0,046 * 48 VMS182 0,082 0,775 ns 49 Xgwm261 9,000 0,532 ns 49 Xgwm408 16,444 0,353 ns 49 Xgwm577 14,000 0,526 ns 49 SCM138 4,000 0,261 ns 49 SCM268 12,000 0,062 ns 49 SCM9 12,000 0,062 ns 49 SCM120 20,000 0,172 ns 49 SCM28 16,000 0,100 ns 49 SCM86 24,000 0,293 ns 49 BARC176 16,000 0,100 ns 49 VMS159 20,000 0,172 ns 49 VMS182 0,082 0,775 ns 50 Xgwm261 8,000 0,238 ns 50 Xgwm408 12,000 0,062 ns 50 Xgwm577 12,000 0,062 ns 50 SCM138 12,000 0,285 ns 50 SCM268 8,000 0,046 * 50 SCM9 4,000 0,261 ns 50 SCM120 12,000 0,285 ns 50 SCM28 20,000 0,172 ns 50 SCM86 12,000 0,679 ns 50 BARC176 1,000 0,317 ns 50 VMS159 1,000 0,317 ns 50 VMS182 1,000 0,317 ns 51 Xgwm261 0,444 0,931 ns 51 Xgwm408 4,000 0,677 ns 51 Xgwm577 8,000 0,046 * 51 SCM138 4,000 0,046 * 51 SCM268 4,000 0,046 * 51 SCM9 4,000 0,046 * 51 SCM120 2,222 0,528 ns 51 SCM28 12,000 0,062 ns 51 SCM86 12,000 0,285 ns 51 BARC176 NA NA 51 VMS159 NA NA 51 VMS182 NA NA 52 Xgwm261 0,444 0,505 ns 52 Xgwm408 4,000 0,261 ns 52 Xgwm577 16,000 0,100 ns 52 SCM138 4,000 0,046 * 52 SCM268 4,000 0,046 * 52 SCM9 8,000 0,046 * 52 SCM120 6,667 0,756 ns 52 SCM28 20,000 0,172 ns Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 52 BARC176 NA NA 52 VMS159 NA NA 52 VMS182 NA NA 53 Xgwm261 0,082 0,775 ns 53 Xgwm408 4,000 0,261 ns 53 Xgwm577 6,667 0,353 ns 53 SCM138 4,000 0,046 * 53 SCM268 12,000 0,062 ns 53 SCM9 8,000 0,046 * 53 SCM120 12,000 0,285 ns 53 SCM28 8,000 0,046 * 53 SCM86 12,000 0,285 ns 53 BARC176 NA NA 53 VMS159 NA NA 53 VMS182 NA NA 54 Xgwm261 1,440 0,696 ns 54 Xgwm408 12,000 0,062 ns 54 Xgwm577 12,000 0,285 ns 54 SCM138 4,000 0,046 * 54 SCM268 12,000 0,062 ns 54 SCM9 4,000 0,046 * 54 SCM120 4,000 0,261 ns 54 SCM28 12,000 0,062 ns 54 SCM86 12,000 0,285 ns 54 BARC176 NA NA 54 VMS159 NA NA 54 VMS182 NA NA Legenda: ns=ni statistično značilno, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001; NA-vrstno specifičen marker VPreglednici 6 so z zeleno označeni vrstno in/ali sortno specifični markerji, ki statistično značilno uspešno razločujejo med genomi pšenice, pire, rži in/ali znotraj njih. Z modro barvo so označeni vrstno specifični markerji, ki pa uspešno razločujejo med vrstami pšenice, pire in rži. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Preglednica 7: Podobnost med vrstami/sortami/podvzorci sorte pšenice, ržiin pire na podlagiizračuna Nei-jeve gentske razdalje (Nei, 1972) 32-1 32-2 32-3 34-1 34-2 35 36-1 36-2 37-1 37-2 38 39 40 41-1 41-2 42 43 44-2 44 45-1 45-2 46-1 46-2 48 49 50 51 52 53 54 1,000 32-1 0,666 1,000 32-2 0,756 0,790 1,000 32-3 0,514 0,543 0,697 1,000 34-1 0,486 0,425 0,570 0,821 1,000 34-2 0,490 0,545 0,704 0,891 0,791 1,000 35 0,502 0,522 0,685 0,782 0,722 0,855 1,000 36-1 0,459 0,554 0,675 0,752 0,628 0,847 0,841 1,000 36-2 0,436 0,541 0,587 0,728 0,680 0,747 0,756 0,732 1,000 37-1 0,417 0,513 0,548 0,660 0,688 0,726 0,786 0,754 0,807 1,000 37-2 0,419 0,471 0,521 0,631 0,631 0,719 0,765 0,771 0,775 0,811 1,000 38 0,412 0,502 0,534 0,557 0,486 0,686 0,749 0,867 0,674 0,773 0,742 1,000 39 0,499 0,573 0,602 0,687 0,684 0,731 0,732 0,719 0,777 0,806 0,734 0,729 1,000 40 0,459 0,499 0,600 0,760 0,696 0,766 0,787 0,684 0,821 0,774 0,669 0,614 0,735 1,000 41-1 0,474 0,496 0,504 0,514 0,481 0,612 0,702 0,779 0,651 0,688 0,768 0,847 0,679 0,591 1,000 41-2 0,402 0,499 0,563 0,721 0,630 0,753 0,789 0,787 0,860 0,783 0,725 0,789 0,782 0,798 0,712 1,000 42 0,521 0,561 0,540 0,634 0,618 0,667 0,700 0,630 0,825 0,774 0,736 0,686 0,849 0,769 0,677 0,778 1,000 43 0,391 0,517 0,578 0,560 0,414 0,687 0,722 0,853 0,635 0,612 0,647 0,878 0,601 0,566 0,834 0,723 0,554 1,000 44-2 0,470 0,564 0,712 0,843 0,689 0,893 0,858 0,844 0,781 0,689 0,688 0,717 0,732 0,782 0,646 0,810 0,683 0,775 1,000 44 0,503 0,572 0,556 0,565 0,476 0,544 0,568 0,544 0,579 0,598 0,564 0,544 0,656 0,631 0,504 0,562 0,683 0,465 0,565 1,000 45-1 0,435 0,584 0,528 0,543 0,511 0,560 0,596 0,557 0,601 0,638 0,597 0,537 0,663 0,641 0,491 0,588 0,657 0,449 0,575 0,814 1,000 45-2 0,523 0,605 0,551 0,471 0,364 0,430 0,466 0,481 0,494 0,461 0,442 0,490 0,584 0,533 0,479 0,478 0,583 0,452 0,494 0,724 0,729 1,000 46-1 0,493 0,513 0,500 0,470 0,522 0,486 0,525 0,397 0,505 0,548 0,432 0,436 0,675 0,610 0,385 0,450 0,650 0,290 0,476 0,682 0,700 0,661 1,000 46-2 0,452 0,461 0,370 0,315 0,378 0,363 0,457 0,488 0,417 0,535 0,504 0,600 0,573 0,401 0,634 0,431 0,546 0,499 0,371 0,562 0,619 0,650 0,575 1,000 48 0,461 0,532 0,434 0,424 0,446 0,447 0,538 0,504 0,581 0,609 0,545 0,615 0,718 0,568 0,601 0,549 0,716 0,511 0,487 0,677 0,676 0,684 0,684 0,779 1,000 49 0,401 0,519 0,410 0,350 0,316 0,294 0,375 0,345 0,394 0,412 0,397 0,386 0,472 0,419 0,409 0,378 0,476 0,353 0,331 0,558 0,612 0,689 0,507 0,538 0,583 1,000 50 0,486 0,611 0,545 0,482 0,296 0,453 0,414 0,477 0,507 0,416 0,471 0,452 0,532 0,503 0,479 0,487 0,562 0,482 0,510 0,583 0,568 0,726 0,443 0,495 0,578 0,617 1,000 51 0,443 0,608 0,515 0,491 0,328 0,475 0,437 0,504 0,525 0,460 0,477 0,501 0,526 0,567 0,495 0,537 0,607 0,491 0,551 0,630 0,626 0,725 0,508 0,476 0,542 0,600 0,862 1,000 52 0,474 0,569 0,512 0,492 0,286 0,417 0,411 0,453 0,499 0,418 0,435 0,453 0,480 0,521 0,447 0,505 0,564 0,461 0,512 0,583 0,552 0,732 0,443 0,432 0,527 0,609 0,887 0,879 1,000 53 0,435 0,493 0,420 0,410 0,233 0,351 0,339 0,397 0,424 0,339 0,379 0,419 0,420 0,425 0,408 0,415 0,481 0,443 0,419 0,506 0,480 0,652 0,366 0,472 0,557 0,606 0,866 0,796 0,864 1,000 54 S sivo označene celice pomenijo visoko stopnjo genetske podobnosti (>0,83) med posameznimi vrstami/sortami/podvzorci. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Slika 3: Delež molekulske variabilnosti na podlagi R-statistike Slika 4: Razporeditev genotipov pšenice, ržiin pire na podlagi rezultatov analize glavnih koordinat (PCoA) Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 JEČMEN Pri navadnem ječmenu smo opravili analizo sedmih sort. Sorte Barum, Bc Agram, Matej, Maxim, NS Roman in Zhana so vključevale enoanalizno številko, medtem ko je sorta Novosadksi 294 vključevala dve analizni številki. Vsaki analizni številki smo pripisali štiri individualne rastline, vsako s svojo laboratorijsko oznako genotipa (Preglednica 8). 4.1 Specifični materiali in metode v analizi Preglednica 8: Seznam sort, analizne številke, število individualnih rastlin v analizi in laboratorijske oznake genotipov pri navadnem ječmenu Sorta Barun Analizna številka 1198-1/19 Število individualnih rastlin v analizi 4 Laboratorijska oznaka genotipa 24a…24d Bc Agram 1199-1/19 4 25a…25d Matej 1201-1/19 4 27a…27d Maxim 1202-1/19 4 28a…28d Novosadski 294 NS Roman 1203-1/19 in 1203­2/19 1204-1 4 + 4 4 29-1a…29-1d in 29-2a…29-2d 30a…30d Zhana 1205-1 4 31a…31d Izolacijo genomske DNA posameznih vzorcev smo opravili na robotu za izolacijo nukleinskih kislin MagMax ™ (Applied Biosystems). Uporabili smo kemikalije iz kompleta za izolacijo DNA BioSprint 15 DNA Plant (Qiagen). Izolacijo DNA smo izvedli po optimiziranem protokolu (opisan v Pipan in Meglič 2019). Pri genotipizaciji smo uporabili sedem markerjev, ki določajo nivo razlikovanja znotraj sort in med genotipi navadnega ječmena (Preglednica 9). Preglednica 9: Seznam markerjev in njihove aplikacije pri navadnemječmenu Ime markerja + (oznaka v Tip markerja Nivo razlikovanja PCR protokol Uporabljena kemija v PCR Dolžinski standard v fragmentni analizi laboratoriju) AM2 (ah) SSR Raznolikost znotraj/med Avena in Hordeum vrstami/sortami Piquemal BT ROX 350 Bmac0093 (ai) Bmag0211 (aj) Bmag0009 (ak) HvM36 (al) HvM54 (am) MGB371 (an) SSR SSR SSR SSR SSR Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Raznolikost znotraj Hordeum vrst/sort Piquemal Piquemal SSR-tail Piquemal Piquemal Modified Piquemal QB BT QB BT BT BT ROX 350 ROX 350 ROX 350 ROX 350 ROX 350 ROX 350 Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 4.2 Rezultati analize kakovosti semena Za analizne številke navadnega ječmena smo zabeležili število semen, ki smo jih dali na test kalivosti, število normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic ter mrtvih semen (Preglednica 10). Semena in klice smo tudi fotografirali. Preglednica 10: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte navadnega ječmena SORTA Analizn a številka ŠT.SEME N na test kalivosti REZULTNORMAL NE klice ATI -število klic/NENORMAL NE klice semen MRTV A semena REZULTANORMAL NE klice TI -delež klic/seNENORMAL NE klice men (%) MRTV A semena Barun 1198­ 50 34 2 14 68 4 28 1/19 Bc Agram 1199­ 50 45 0 5 90 0 10 1/19 Matej 1201­ 50 24 7 19 48 14 38 1/19 Maxim 1202­ 50 49 0 1 98 0 2 1/19 Novosads 1203­ 50 50 0 0 100 0 0 ki 294 1/19 Novosads 1203­ 7 7 0 0 100 0 0 ki 294 2/19 NS 1204­ 50 48 0 2 96 0 4 Roman 1/19 Zhana 1205­ 50 47 0 3 94 0 6 1/19 1.) Barum: kalivost semen z analizno številko 1198-1/19 je bila 68 % (razvoj normalnih klic). 2.) Bc Agram: kalivost semen z analizno številko 1199-1/19 je bila 90 %. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 3.) Matej: kalivost semen z analizno številko 1201-1/19 je bila 48 %. 4.) Maxim: kalivost semen z analizno številko 1202-1/19 je bila 98 %. 5.) Novosadski 294: kalivost semen z analiznima številkama 1203-1/19 (1) in 1203-2/19 (2) je bila v obeh primerih 100 %. 6.) NS Romana: kalivost semen z analizno številko 1204-1/19 je bila 96 %. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 7.) Zhana: kalivost semen z analizno številko 1205-1/19 je bila 94 %. 4.3 Rezultati genetske analize Slika 5: Frekvenca posameznih alelov po lokusih glede na sorto/podvzorec ječmena Preglednica 11: Ustreznost posameznega markerja za razločevanje med sortami/podvzorciječmena ter zmožnost ločevanja znotraj njih glede na rezultate Hardy-Weinbergovega ravnotežja Sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 24 AM2 4,000 0,046 * 24 BMAC0093 4,000 0,046 * 24 BMAG009 12,000 0,285 ns 24 BMAG0211 4,000 0,261 ns 24 HvM36 4,889 0,558 ns 24 HvM54 12,000 0,062 ns 24 MGB371 4,160 0,245 ns 25 AM2 4,000 0,261 ns 25 BMAC0093 4,000 0,046 * 25 BMAG009 12,000 0,062 ns 25 BMAG0211 4,889 0,558 ns 25 HvM36 12,000 0,062 ns 25 HvM54 12,000 0,062 ns 25 MGB371 8,000 0,238 ns 27 AM2 8,000 0,046 * 27 BMAC0093 8,000 0,046 * 27 BMAG009 12,000 0,062 ns 27 BMAG0211 4,000 0,046 * 27 HvM36 8,000 0,629 ns Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 27 HvM54 12,000 0,062 ns 27 MGB371 0,082 0,775 ns 28 AM2 12,000 0,062 ns 28 BMAC0093 8,000 0,046 * 28 BMAG009 1,440 0,230 ns 28 BMAG0211 4,000 0,261 ns 28 HvM36 1,440 0,963 ns 28 HvM54 1,440 0,230 ns 28 MGB371 11,111 0,349 ns 29 AM2 4,000 0,261 ns 29 BMAC0093 4,000 0,046 * 29 BMAG009 12,000 0,062 ns 29 BMAG0211 4,000 0,261 ns 29 HvM36 8,160 0,227 ns 29 HvM54 4,160 0,245 ns 29 MGB371 10,000 0,440 ns 29-2 AM2 4,000 0,046 * 29-2 BMAC0093 4,000 0,046 * 29-2 BMAG009 8,444 0,207 ns 29-2 BMAG0211 4,000 0,046 * 29-2 HvM36 12,000 0,285 ns 29-2 HvM54 8,444 0,207 ns 29-2 MGB371 10,000 0,440 ns 30 AM2 3,360 0,339 ns 30 BMAC0093 8,000 0,046 * 30 BMAG009 20,000 0,172 ns 30 BMAG0211 8,000 0,046 * 30 HvM36 12,000 0,285 ns 30 HvM54 16,000 0,100 ns 30 MGB371 4,000 0,261 ns 31 AM2 4,160 0,245 ns 31 BMAC0093 12,000 0,062 ns 31 BMAG009 12,000 0,285 ns 31 BMAG0211 8,000 0,238 ns 31 HvM36 4,000 0,677 ns 31 HvM54 8,000 0,046 * 31 MGB371 8,000 0,238 ns Legenda: ns=ni statistično značilno, *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001; V Preglednici11 so z zeleno označeni sortno specifični markerji, ki statistično značilno uspešno razločujejo med sortamiječmena in/ali znotraj njih. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Preglednica 12: Podobnost med sortami/podvzorciječmena na podlagiizračuna Nei-jeve gentske razdalje (Nei, 1972) 24 25 27 28 29 29-2 30 31 1,000 24 0,781 1,000 25 0,669 0,659 1,000 27 0,534 0,483 0,605 1,000 28 0,491 0,467 0,523 0,757 1,000 29 0,524 0,563 0,617 0,595 0,833 1,000 29-2 0,393 0,497 0,464 0,308 0,326 0,432 1,000 30 0,430 0,465 0,646 0,364 0,483 0,569 0,644 1,000 31 S sivo označene celice v Preglednici 12 pomenijo visoko stopnjo genetske podobnosti (>0,83) med posameznimi sortami/podvzorciječmena. Slika 6: Delež molekulske variabilnosti na podlagi R-statistike Slika 7: Razporeditev genotipov pšenice, ržiin pire na podlagi rezultatov analize glavnih koordinat (PCoA) Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 OVES Pri navadnem in golem ovsu smo opravili analize na sortah Noni in Kamil. Sorta Noni je vključevala eno analizno številko (tj. en fenotip semen) s štirimi individualnimi rastlinami. Pri sorti Kamil smo za genotipizacijo uporabili izolirano DNA iz preteklih internih preverjanj v genetskem laboratoriju. Uporabili smo štiri vzorce različnih individualnih rastlin in jim pripisali laboratorijsko oznako genotipa ( Preglednica 3). Ker smo pri sorti Kamil uporabili predhodno izolirano DNA, o analizni številki za kakovost semena/klic nimamo podatka. 5.1 Specifični/e materiali in metode v analizi Preglednica 13: Seznam sort, analizne številke, število individualnih rastlin v analizi in laboratorijske oznake genotipov pri analizi navadnega in golega ovsa (NP= ni podatka) . Navadni oves Noni Sorta Analizna številka 1176-1/19 Število individualnih rastlin v analizi 4 Laboratorijska oznaka genotipa 1-1a…1-1d . Goli oves Sorta Kamil Analizna številka NP Število individualnih rastlin v analizi 4 Laboratorijska oznaka genotipa 47a…47d Izolacijo genomske DNA posameznih vzorcev smo opravili na robotu za izolacijo nukleinskih kislin MagMax ™ (Applied Biosystems). Uporabili smo kemikalije iz kompleta za izolacijo DNA BioSprint 15 DNA Plant (Qiagen). Izolacijo DNA smo izvedli po optimiziranem protokolu (po Pipan in Meglič 2019). Pri genotipizaciji smo uporabili sedem markerjev, ki določajo nivo razlikovanja med vrstama in sortami navadnega in golega ovsa (Preglednica 14). Preglednica 24: Seznam markerjev in njihove aplikacije pri navadnem in golem ovsu Ime markerja (oznaka v laboratoriju) Tip markerja Nivo razlikovanja PCR protokol Uporabljena kemija v PCR Dolžinski standard v fragmentni analizi AM11 (aa) AM14 (ab) AM4 (ac) SSR SSR SSR Raznolikost znotraj in med Avena vrstami/sortami. Razločevanje med navadnim in golim ovsom Raznolikost znotraj in med Avena vrstami/sortami. Razločevanje med navadnim in golim ovsom Raznolikost znotraj rodu Avena Piquemal Modified Piquemal Piquemal QB BT QB ROX 350 ROX 350 ROX 350 AM1 (ae) SSR Raznolikost znotraj rodu Avena Piquemal BT ROX 350 AM03 (af) SSR Raznolikost znotraj rodu Avena Piquemal BT ROX 350 Bmag0120 (ag) SSR Raznolikost znotraj rodu Avena in razločevanje netipičnih genotipov znotraj sort Modified Piquemal QB ROX 350 AM2 (ah) SSR Raznolikost znotraj rodu Avena in Hordeum Piquemal BT ROX 350 Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 5.2 Rezultati analize kakovosti semena Za analizno številko navadnega ovsa smo zabeležili število semen, ki smo jih dali na test kalivosti, število normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic ter mrtvih semen (Preglednica 15). Semena in klice smo tudi fotografirali. Preglednica 15: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte navadnega ovsa SORT A Analizna številka ŠT.SEM EN na test kalivosti REZULTATI NORMALN E klice -število klic/semeNENORMALN E klice n MRTV A semena REZULTATI NORMALN E klice -delež klic/semen NENORMALN E klice (%) MRTV A semena Noni Noni 1176-1 1176-2 50 2 4 0 0 0 46 2 8 0 0 0 92 100 Noni: kalivost semen z analiznima številkama 1176-1 (1) in 1176-2 (2) je bila 8 in 0 % (razvoj normalnih klic). 5.3 Rezultati genetske analize Slika 8: Frekvenca posameznih alelov po lokusih glede na vrsto ovsa Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Preglednica 16: Ustreznost posameznega markerja za razločevanje med sortama ovsa ter zmožnost ločevanja znotraj njih glede na rezultate Hardy-Weinbergovega ravnotežja Sorta/podvzorec sorte Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 1-1ad AM03 4,000 0,261 ns 1-1ad AM1 0,444 0,931 ns 1-1ad AM11 4,000 0,261 ns 1-1ad AM14 0,444 0,505 ns 1-1ad AM2 4,000 0,261 ns 1-1ad AM4 4,000 0,046 * 1-1ad BMAG0120 12,000 0,062 ns 47 AM03 4,000 0,261 ns 47 AM1 12,000 0,285 ns 47 AM11 4,000 0,677 ns 47 AM14 0,082 0,775 ns 47 AM2 1,440 0,696 ns 47 AM4 4,000 0,261 ns 47 BMAG0120 12,000 0,285 ns Legenda: ns=ni statistično značilno, *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001; Na podlagi rezultatov iz Preglednice 16 sklepamo, da gre izrazito podobnost med obema sortama golega in navadnega ovsa na analiziranih lokusih, in da se je marker AM4 (v Preglednici 16 označen z zeleno) izkazal kot najboljinformativen in statistično značilen za razlikovanje. Preglednica 17: Podobnost med vrstama ovsa na podlagi izračuna Nei-jeve gentske razdalje (Nei, 1972) 1-1ad 1,000 0,842 47 1,000 1-1ad 47 S sivo označena celica v Preglednici 17 pomeni visoko stopnjo genetske podobnosti (>0,83) med posameznimi vrstama/sortama ovsa. Slika 9: Delež molekulske variabilnosti na podlagi R-statistike Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 AJDA V analizo smo vključili štiri sorte navadne ajde: Bamby, Čebelica, Darja in Trdinova. Sorti Čebelica in Trdinova sta vključevali po eno analizno številko (en fenotip semen), sorta Čebelica dve in sorta Darja tri analizne številke. Vsaki analizni številki smo pripisali po osem individualnih rastlin s pripadajočimi oznakami genotipov (Preglednica 18). Pri tatarski ajdi smo obravnavali sorti Radohova in Zlata. Sorta Zlata je imela eno, Radohova pa dve analizni številki. Za vsako analizno številko smo imeli štiriindividualne rastline (Preglednica 18). 6.1 Specifični/e materiali in metode v analizi Preglednica 18: Seznam sort, analizne številke, število individualnih rastlin v analizi in laboratorijske oznake genotipov pri analizi navadne in tatarske ajde . Navadna ajda Sorta Bamby Čebelica Darja Trdinova Analizna številka 1192-1/19 in 1192-2/19 1193-1/19 1194-1/19, 1194-2/19 in 1194-3/19 1195-1/19 Število individualnih rastlin v analizi 8 + 8 8 8 + 8 + 8 8 Laboratorijska oznaka genotipa 18-1a…18-1h in 18-2a…18-2h 19a…19h 20-1a…20-1h, 20-2a…20-2h in 20-3a…20-3h 21-1a…21-1h . Tatarska ajda Sorta Radohova Zlata Analizna številka 1196-1/19 in 1196-2/19 1197-1/19 Število individualnih rastlin v analizi 4 + 4 4 Laboratorijska oznaka genotipa 22-1a…22-1d in 22-2a…22-2d 23a-23d Izolacijo DNA posameznih vzorcev smo opravili s kitom DNeasy Plant Pro Kit (Qiagen), brez dodatka PS po protokolu (po Pipan in sod., 2018). V analizi smo uporabili enajst markerjev, ki določajo nivo razlikovanja znotraj ali med vrstama navadne in tatarske ajda (Preglednica 19). Preglednica 19: Seznam markerjev in njihove aplikacije pri navadni in tatarski ajdi Ime markerja Tip Nivo razlikovanja PCR Uporabljena Dolžinski standard (oznaka v markerja protokol kemija v PCR v fragmentni laboratoriju) analizi GB-FE-001(n) SSR Razločevanje med navadno in tatarsko ajdo Piquemal BT ROX 500 GB-FE-025(o) GE-FE-121(p) SSR SSR Razločevanje med navadno in tatarsko ajdo Razločevanje med navadno in tatarsko ajdo Modified Piquemal Piquemal BT BT ROX 500 ROX 500 GB-FE-114(r) GB-FE-121(s) SSR SSR Ustrezno polimorfen znotraj navadne in hkrati tatarske ajde; primeren za analizo raznolikosti znotraj obeh ajd Ustrezno polimorfen znotraj navadne in hkrati tatarske ajde; primeren za analizo Piquemal Piquemal BT BT ROX 500 ROX 500 raznolikosti znotraj obeh ajd Ime markerja (oznaka v laboratoriju) GB-FE-035(t) GB-FE-054(u) Tip markerja SSR SSR Nivo razlikovanja Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde PCR protokol Piquemal Modified Piquemal Uporabljena kemija v PCR BT BT Dolžinski standard v fragmentni analizi ROX 500 ROX 500 GB-FE-014(v) TBP5(z) TBP9(x) TBP6(y) SSR SSR SSR SSR Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde Visoko polimorfen za analizo raznolikosti znotraj navadne ajde SSR-tail Piquemal Piquemal Piquemal BT BT BT BT ROX 500 ROX 500 ROX 500 ROX 500 6.2 Rezultati analize kakovosti semena Za vsako analizno številko navadne in tatarske ajde smo zabeležili število semen, ki smo jih dali na test kalivosti, število normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic ter mrtvih semen (Preglednica 20, 21). Semena in klice smo tudi fotografirali. . Navadna ajda Preglednica 20: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih in nenormalnih klic, mrtvih semen ter delež normalnih in nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte navadne ajde Sorta Analizn a številka ŠT.SEME N na test kalivosti REZULTATI -število klic/semen NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena REZULTATI -delež klic/semen (%) NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena Bamby 1192­1/19 50 43 0 7 86 0 14 Bamby 1192­2/19 43 40 0 3 93 0 7 Čebelica 1193­1/19 50 19 0 31 38 0 62 Darja 1194­1/19 50 36 0 14 72 0 28 Darja 1194­2/19 13 11 0 2 85 0 15 Darja 1194­3/19 16 12 1 3 75 6 19 Trdinov a 1195­1/19 50 33 0 17 66 0 34 Trdinov a 1195­2/19 1 0 0 1 0 0 100 1.) Bamby: imeli smo dva fenotipa semen; kalivost semen z analiznima številkama 1192-1/19 (1) in 1192-2/19 (2) je bila 86 % in 93 % (razvoj normalnih klic). 2.) Čebelica: kalivost semen z analizno številko 1193-1/19 je bila 38 %. 3.) Darja: imeli smo tri fenotipe semen; kalivost semen z analiznimi številkami 1194-1/19 (1), 1194­2/19 (2) in 1194-3/19 (3) je bila 72 %, 85 % in 75 %. 4.) Trdinova: kalivost semen z analiznima številkama 1195-1/19 (1) in 1195-2/19 (2) je bila 66 % oz. 0 %. . Tatarska ajda 1.) Radohova: kalivost semen z analiznima številkama 1169-1/19 (1) in 1169-2/19 (2) je bila 100 % in 81 % (razvoj normalnih klic). Preglednica 21: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte tatarske ajde SORTA Anali zna števil ka ŠT.SEME N na test kalivosti REZULTATI -število klic/semen NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena REZULTATI -delež klic/semen (%) NORMALN NENORMALN MRTV E klice E klice A semena Radohova Radohova Zlata 1196­1/19 1196­2/19 1197­1/19 50 16 50 50 0 0 13 0 3 46 0 4 100 0 0 81 0 19 92 0 8 2.) Zlata: kalivost semen z analizno številko 1197-1/19 je bil 92 %. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 6.3 Rezultati genetske analize Slika 11: Frekvenca posameznih alelov po lokusih glede na vrsto/sorto/podvzorec ajde Preglednica 22: Ustreznost posameznega markerja za razločevanje med vrstama ajde ter zmožnost ločevanja znotraj njiju glede na rezultate Hardy-Weinbergovega ravnotežja Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 18-1ah GB-FE001 8,000 0,238 ns 18-1ah GB-FE014 15,840 0,393 ns 18-1ah GB-FE025 8,000 0,046 * 18-1ah GB-FE035 6,000 0,423 ns 18-1ah GB-FE054 10,889 0,366 ns 18-1ah GB-FE114 6,286 0,392 ns 18-1ah GB FE 121 19,556 0,190 ns 18-1ah TBP5 8,000 0,005 ** 18-1ah TBP6 32,889 0,005 ** 18-1ah TBP9 24,320 0,007 ** 18-2ah GB-FE001 12,667 0,243 ns 18-2ah GB-FE014 23,822 0,302 ns 18-2ah GB-FE025 8,000 0,046 * 18-2ah GB-FE035 12,444 0,256 ns 18-2ah GB-FE054 24,444 0,058 ns 18-2ah GB-FE114 17,600 0,062 ns 18-2ah GB FE 121 19,556 0,003 ** 18-2ah TBP5 4,840 0,028 * 18-2ah TBP6 11,556 0,073 ns 18-2ah TBP9 32,000 0,006 ** 19 GB-FE001 20,800 0,023 * 19 GB-FE014 11,224 0,340 ns 19 GB-FE025 24,000 0,008 ** 19 GB-FE035 56,000 0,126 ns 19 GB-FE054 34,400 0,033 * 19 GB-FE114 17,000 0,319 ns 19 GB FE 121 15,324 0,121 ns 19 TBP5 24,000 0,001 *** 19 TBP6 24,000 0,008 ** 19 TBP9 16,000 0,001 ** 20-1ah GB-FE001 8,327 0,215 ns 20-1ah GB-FE014 40,000 0,066 ns 20-1ah GB-FE025 8,000 0,046 * 20-1ah GB-FE035 52,500 0,206 ns 20-1ah GB-FE054 23,333 0,326 ns 20-1ah GB-FE114 10,000 0,440 ns 20-1ah GB FE 121 20,444 0,493 ns 20-1ah TBP5 8,000 0,005 ** 20-1ah TBP6 8,000 0,046 * 20-1ah TBP9 16,047 0,014 * 20-2ah GB-FE001 9,796 0,134 ns 20-2ah GB-FE014 18,222 0,920 ns 20-2ah GB-FE025 8,000 0,046 * 20-2ah GB-FE035 49,000 0,073 ns 20-2ah GB-FE054 19,911 0,175 ns 20-2ah GB-FE114 16,000 0,100 ns 20-2ah GB FE 121 8,000 0,005 ** 20-2ah TBP5 8,000 0,005 ** 20-2ah TBP6 16,000 0,001 ** 20-2ah TBP9 16,595 0,344 ns 20-3ah GB-FE001 11,200 0,342 ns 20-3ah GB-FE014 23,000 0,344 ns 20-3ah GB-FE025 8,000 0,046 * Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 20-3ah GB-FE035 12,000 0,285 ns 20-3ah GB-FE054 12,000 0,940 ns 20-3ah GB-FE114 11,810 0,693 ns 20-3ah GB FE 121 18,667 0,229 ns 20-3ah TBP5 8,000 0,046 * 20-3ah TBP6 12,971 0,044 * 20-3ah TBP9 10,880 0,012 * 21-1bh GB-FE001 9,240 0,026 * 21-1bh GB-FE014 28,875 0,117 ns 21-1bh GB-FE025 6,000 0,112 ns 21-1bh GB-FE035 9,000 0,532 ns 21-1bh GB-FE054 34,222 0,194 ns 21-1bh GB-FE114 28,000 0,002 ** 21-1bh GB FE 121 21,389 0,435 ns 21-1bh TBP5 22,286 0,014 * 21-1bh TBP6 3,938 0,047 * 21-1bh TBP9 NA NA 22-1ad GB-FE001 NA NA 22-1ad GB-FE014 14,000 0,526 ns 22-1ad GB-FE025 0,750 0,861 ns 22-1ad GB-FE035 NA NA 22-1ad GB-FE054 5,000 0,172 ns 22-1ad GB-FE114 1,440 0,230 ns 22-1ad GB FE 121 0,444 0,505 ns 22-1ad TBP5 4,000 0,261 ns 22-1ad TBP6 4,000 0,046 * 22-1ad TBP9 8,000 0,046 * 22-2ad GB-FE001 NA NA 22-2ad GB-FE014 4,000 0,261 ns 22-2ad GB-FE025 NA NA 22-2ad GB-FE035 NA NA 22-2ad GB-FE054 1,440 0,230 ns 22-2ad GB-FE114 4,000 0,046 * 22-2ad GB FE 121 0,082 0,775 ns 22-2ad TBP5 4,000 0,046 * 22-2ad TBP6 8,000 0,046 * 22-2ad TBP9 4,000 0,046 * 23 GB-FE001 NA NA 23 GB-FE014 8,000 0,238 ns 23 GB-FE025 0,444 0,505 ns 23 GB-FE035 NA NA 23 GB-FE054 6,667 0,353 ns 23 GB-FE114 4,000 0,046 * 23 GB FE 121 0,444 0,505 ns 23 TBP5 4,000 0,046 * 23 TBP6 4,000 0,046 * 23 TBP9 12,000 0,062 ns Legenda: ns=ni statistično značilno, *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001; NA-vrstno specifičen marker V Preglednici 22 so z zeleno označeni vrstno in/ali sortno specifični markerji, ki statistično značilno uspešno razločujejo med genomoma navadne in tatrske ajde in/ali znotraj njiju. Z modro barvo so označeni vrstno specifični markerji, ki pa uspešno razločujejo tudi med vrstama navadne in tatarske ajde. Preglednica 23: Podobnost med vrstama/sortami/podvzorci ajde na podlagi izračuna Nei-jeve gentske razdalje (Nei, 1972) 18-1ah 18-2ah 19 20-1ah 20-2ah 20-3ah 21-1bh 22-1ad 22-2ad 23 1,000 18-1ah 0,859 1,000 18-2ah 0,879 0,825 1,000 19 0,868 0,831 0,894 1,000 20-1ah 0,851 0,803 0,893 0,855 1,000 20-2ah 0,767 0,791 0,825 0,842 0,809 1,000 20-3ah 0,801 0,753 0,878 0,886 0,825 0,780 1,000 21-1bh 0,186 0,169 0,267 0,228 0,192 0,230 0,232 1,000 22-1ad 0,081 0,056 0,138 0,097 0,075 0,129 0,098 0,930 1,000 22-2ad 0,104 0,090 0,186 0,142 0,117 0,162 0,148 0,951 0,915 1,000 23 S sivo označene celice v Preglednici 23 pomenijo visoko stopnjo genetske podobnosti (>0,83) med vrstama/sortami/podvzorci navadne in tatrske ajde. KRIŽNICE Pri navadni ogrščici smo opravili analizo na petnajstih sortah. Pri sortah Daniela, PR46W24, PT200CL, PT228CL, PT240CL, PX113, PX125CL in Starška smo imeli po eno analizno številko, ki smo ji pripisali osem individualnih rastlin s svojo laboratorijsko oznako genotipa. Pri sortah PR45D03, PR45D05, PR46W14, PR46W15, PT211, PT234, PX104 smo imeli po dve analizni številki, ki smo jima prav tako pripisali osem (oziroma v nekaterih primerih manj) individualnih rastlin. Pri beli gorjušici smo opravili analizo na sorti Torpedo, kjer smo imeli po dve analizni številki s pripadajočimi oznakami genotipov (Preglednica 24). 7.1 Specifični/e materiali in metode v analizi . Navadna ogrščica Preglednica 24: Seznam sort, analizne številke, število individualnih rastlin v analizi in laboratorijske oznake genotipov pri navadni ogrščici in beli gorjušici Sorta Analizna Število individualnih rastlin v analizi Laboratorijska oznaka genotipa številka Daniela 1177-1/19 8 2a…2h PR45D03 1178-1/19 in 8 + 8 3-1a…3-1h in 3-2a…3-2h 1178-2/19 PR45D05 1179-1/19 in 8 + 5 4-1a…4-1h in 4-2a…4-2e 1179-2/19 PR46W14 1180-1/19 in 8 + 3 5-1a…5-1h in 5-2a…5-2c 1180-2/19 PR46W15 1181-1/19 in 8 + 1 6-1a…6-1h in 6-2a 1181-2/19 PR46W24 1182-1/19 8 7a…7h PT200CL 1183-1/19 8 8a…8h PT211 1184-1/19 in 8 + 2 9-1a…9-1h in 9-2a…9-2b 1184-2/19 PT228CL 1185-1/19 in 8 10-1a…10-1h 1185-2/19 PT234 1186-1/19 in 8 + 1 12-1a…12-1h in 12-2a 1186-2/19 PT240CL 1187-1/19 8 13a…13h PX104 1188-1/19 in 8 + 8 14-1a…14-1h in 14-2a…14-2h 1188-2/19 PX113 1189-1/19 8 15a…15h PX125CL 1190-1/19 8 16a…16h Starška 1191-1/19 8 17a…17h . Bela gorjušica Sorta Analizna številka Število individualnih rastlin v analizi Laboratorijska oznaka genotipa Torpedo 1207-1/19 in 1207-2/19 8 + 8 33-1a…33-1h in 33-2a…33-2h Izolacijo DNA posameznih vzorcev smo opravili s kitom BioSprint 15 DNA Plant (Qiagen) na robotu za izolacijo nukleinskih kislin MagMax (Applied Biosystems) po objavljanem protokolu (Pipan in Meglič, 2018). Pri genotipizaciji smo uporabili devet markerjev, ki določajo nivo razlikovanja med vrstami in znotraj njih iz družine križnic (Preglednica 25). Preglednica 25: Seznam markerjev in njihove aplikacije pri navadniin beli gorjušici Ime markerja (oznaka v laboratoriju) BN83B1 (ao) Tip markerja SSR Nivo razlikovanja Razločevanje med B. napus in B. rapa in raznolikost znotraj B. napus PCR protokol Piquemal Uporabljena kemija v PCR BT Dolžinski standard v fragmentni analizi ROX 500 B.n.68/1 (ap) SSR Razločevanje med B. napus in B. oleracea in raznolikost znotraj B. napus Piquemal QB ROX 500 Na12-C08 (ar) SSR Razločevanje med B. napus od B. rapa ter B. oleracea od S. arvensis in raznolikost znotraj B. napus Piquemal BT ROX 500 Na10-A08 (as) SSR ločuje med B. napus in B. rapa ter za raznolikost znotraj B. napus Piquemal BT ROX 500 Na12-G05 (at) SSR Raznolikost znotraj B. napus Piquemal BT ROX 500 Ol11-D12 (au) SSR Raznolikost znotraj B. napus SSR-tail BT ROX 500 Ni4-D09 (av) SCAR7 (az) SSR SCAR Raznolikost znotraj B. napus in njenih kompatibilnih sorodnikov Razločevanje znotraj B.rapa/B.nigra/B. oleracea Piquemal scar7_johns_bt BT BT ROX 500 NA SCAR1 (ax) SCAR Razločevanje znotraj B.rapa/B.nigra/B. oleracea scar1_johns_bt BT NA Poleg SSR markerjev smo v tej analizi uporabili še dva PCR-specifična SCAR markerja kot je navedeno v Preglednici 25. 7.2 Rezultati analize kakovosti semena Za vsako analizno številko smo zabeležilištevilo semen, ki smo jih dali na test kalivosti, število normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic ter mrtvih semen (Preglednici 26 in 27). Semena in klice smo tudi fotografirali ŠT.SEMEN REZULTATI -število klic/semen REZULTATI -delež klic/semen (%) na test SORTA Analizna številka kalivosti NORMALNE klice NENORMALNE klice MRTVA semena NORMALNE klice NENORMALNE klice MRTVA semena Daniela 1177­ 1/19 100 44 1 5 88 2 10 PR45DO3 1178­ 50 40 1 9 80 2 18 1/19 PR45DO3 1178­ 2/19 33 15 2 16 45 6 49 PR45DO5 1179­ 50 47 0 3 94 0 6 1/19 PR45DO5 1179­ 2/19 7 5 0 2 71 0 29 PR46W14 1180­ 1/19 50 48 1 1 96 2 2 PR46W14 1180­ 2/19 4 3 0 1 75 0 25 1181­ PR46W15 50 26 0 2452 0 48 1/19 1181­ PR46W15 61 0 5170 83 2/19 1182­ PR46W24 50 47 0 394 0 6 1/19 1183­ PT200CL 50 49 0 198 0 2 1/19 1184­ PT211 5050 0 01000 0 1/19 1184­ PT211 22 0 01000 0 2/19 1185­ PT228CL 50 48 0 296 0 4 1/19 1186­ PT234 5046 0 492 0 8 1/19 1186­ PT234 11 0 01000 0 2/19 1187­ PT240CL 50 44 1 588 2 10 1/19 1188­ PX104 50 39 1 1078 2 20 1/19 PX104 11882/19 15 14 0 1 93 0 7 1189­ PX113 5046 1 392 2 6 1/19 1190­ PX125CL 50 50 0 0100 0 0 1/19 1191­ Starška 50472 1944 2 1/19 . Navadna ogrščica Preglednica 26: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorte navadne ogrščice REZULTATI -število klic/semen REZULTATI -delež klic/semen (%) na test ŠT.SEMEN Analizna NORMALNE NENORMALNE MRTVA NORMALNE NENORMALNE MRTVA kalivosti SORTA številka klice klice semena klice klice semena 1177­ Daniela 100 44 1 588 2 10 1/19 1178­ PR45DO3 50 40 1 980 2 18 1/19 1178­ PR45DO3 33 15 2 1645 6 49 2/19 1179­ PR45DO5 50 47 0 394 0 6 1/19 1179­ PR45DO5 75 0 2710 29 2/19 1180­ PR46W14 50 48 1 196 2 2 1/19 1180­ PR46W14 43 0 1750 25 2/19 1181­ PR46W15 50 26 0 2452 0 48 1/19 PR46W15 1181­2/19 6 1 0 5 17 0 83 PR46W24 1182­1/19 50 47 0 3 94 0 6 PT200CL 1183­ 50 49 0 1 98 0 2 1/19 PT211 1184­1/19 50 50 0 0 100 0 0 PT211 1184­2/19 2 2 0 0 100 0 0 PT228CL 1185­1/19 50 48 0 2 96 0 4 PT234 1186­1/19 50 46 0 4 92 0 8 PT234 1186­2/19 1 1 0 0 100 0 0 PT240CL 1187­1/19 50 44 1 5 88 2 10 PX104 1188­1/19 50 39 1 10 78 2 20 PX104 11882/19 15 14 0 1 93 0 7 PX113 1189­1/19 50 46 1 3 92 2 6 PX125CL 1190­1/19 50 50 0 0 100 0 0 Starška 1191­ 50 47 2 1 94 4 2 1/19 1.) Daniela: kalivost semen z analizno številko 1117-1/19 je bila 88 %. 2.) PR45DO3: kalivost semen z analiznima številkama 1178-1/19 (1) in 1178-2/19 (2) je bila 80 in 45%. 3.) PR45DO5: kalivost semen z analiznima številkama 1179-1/19 (1) in 1179-2/19 (2) je bila 94 in 71%. 4.) PR46W14: kalivost semen z analiznima številkama 1180-1/19 (1) in 1180-2/19 (2) je bila 96 in 75%. 5.) PR46W15: kalivost semen z analiznima številkama 1181-1/19 (1) in 1181-2/19 (2) je bila 52 % in 17%. 6.) PR46W24: kalivost semen z analizno številko 1182-1/19 je bila 94 %. 7.) PT200CL: kalivost semen z analizno številko 1183-1/19 je 98 %. 8.) PT211: kalivost semen z analiznima številkama 1184-1/19 (1) in 1184-2/19 (2) je bila v obeh primerih 100 %. 9.) PT228CL: kalivost semen z analizno številko 1185-1/19 je bila 98 %. 10.) PT234: kalivost semen z analiznima številkama 1186-1/19 (1) in 1186-2/19 (2) je bila 92 % in 100%. 11.) PT240CL: kalivost semen z analizno številko 1187-1/19 je bila 88 %. 12.) PX104: kalivost semen z analiznima številkama 1188-1/19 (1) in 1188-2/19 (2) je bila 78 in 93 %. 13.) PX113: kalivost semen z analizno številko 1189-1/19 je bila 92 %. 14.) PX125CL: kalivost semen z analizno številko 1190-1/19 je bila 100 %. 15.) Starška: kalivost semen z analizno številko 1191-1/19 je bila 94 %. . Bela gorjušica Preglednica 27: Podatki o številu semen, ki smo jih dali na test kalivosti, številu normalnih, nenormalnih klic, mrtvih semen in delež normalnih, nenormalnih klic in mrtvih semen za sorto bele gorjušice Sorta Analizna številka ŠT. SEMEN na test kalivosti REZULTATI -število klic/semen NORMALNE NENORMALNE MRTVA klice klice semena REZULTATI -delež klic/semen (%) NORMALNE NENORMALNE MRTVA klice klice semena Torpedo Torpedo 1207­1/19 1207­2/19 50 12 45 3 2 11 0 1 90 6 4 92 0 8 1.) Torpedo: kalivost semen z analiznima številkama 1207-1/19 (1) in 1207-2/19 (2) je bila 90 % in 92 %. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 7.3 Rezultati genetske analize Slika 14: Frekvenca posameznih alelov glede na vrsto/sorto/podvzorec križnic Preglednica 28: Ustreznost posameznega markerja za razločevanje med dvema vrstama križnic ter zmožnost ločevanja znotraj njih glede na rezultate Hardy-Weinbergovega ravnotežja Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 0-1ah BN68-1 12,082 0,007 ** 10-1ah BN83B1 25,469 0,005 ** 10-1ah Na12-C08 25,469 0,227 ns 10-1ah Ol11-D12 24,640 0,055 ns 10-1ah Ni4 D09 8,000 0,005 ** 10-1ah Na10-A08 24,000 0,065 ns 10-1ah Na12-G05 16,000 0,100 ns 12-1ah BN68-1 16,000 0,001 ** 12-1ah BN83B1 18,311 0,050 * 12-1ah Na12-C08 15,147 0,441 ns 12-1ah Ol11-D12 35,333 0,026 * 12-1ah Ni4 D09 8,327 0,215 ns 12-1ah Na10-A08 16,000 0,014 * 12-1ah Na12-G05 16,000 0,001 ** 12-2a BN68-1 1,000 0,317 ns 12-2a BN83B1 1,000 0,317 ns 12-2a Na12-C08 1,000 0,317 ns 12-2a Ol11-D12 1,000 0,317 ns 12-2a Ni4 D09 1,000 0,317 ns 12-2a Na10-A08 1,000 0,317 ns 12-2a Na12-G05 1,000 0,317 ns 13 BN68-1 8,000 0,046 * 13 BN83B1 16,889 0,010 ** 13 Na12-C08 24,000 0,008 ** 13 Ol11-D12 28,136 0,136 ns 13 Ni4 D09 8,327 0,215 ns 13 Na10-A08 40,000 0,297 ns 13 Na12-G05 12,000 0,062 ns 14-1ah BN68-1 16,000 0,001 ** 14-1ah BN83B1 10,469 0,015 * 14-1ah Na12-C08 14,857 0,137 ns 14-1ah Ol11-D12 20,082 0,003 ** 14-1ah Ni4 D09 8,000 0,005 ** 14-1ah Na10-A08 18,000 0,055 ns 14-1ah Na12-G05 9,796 0,134 ns 14-2ah BN68-1 10,032 0,018 * 14-2ah BN83B1 4,840 0,184 ns 14-2ah Na12-C08 10,032 0,018 * 14-2ah Ol11-D12 28,444 0,128 ns 14-2ah Ni4 D09 8,000 0,046 * 14-2ah Na10-A08 14,329 0,159 ns 14-2ah Na12-G05 24,000 0,001 *** 15 BN68-1 16,000 0,001 ** 15 BN83B1 10,469 0,015 * 15 Na12-C08 24,000 0,008 ** 15 Ol11-D12 23,556 0,073 ns 15 Ni4 D09 8,356 0,213 ns 15 Na10-A08 34,880 0,173 ns 15 Na12-G05 16,889 0,010 ** 16 BN68-1 10,032 0,018 * 16 BN83B1 8,320 0,040 * 16 Na12-C08 24,000 0,001 *** 16 Ol11-D12 30,400 0,344 ns 16 Ni4 D09 8,000 0,005 ** Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 16 Na12-G05 14,857 0,021 * 17 BN68-1 14,000 0,173 ns 17 BN83B1 16,320 0,012 * 17 Na12-C08 28,000 0,140 ns 17 Ol11-D12 11,755 0,068 ns 17 Ni4 D09 15,467 0,116 ns 17 Na10-A08 16,889 0,077 ns 17 Na12-G05 16,889 0,010 ** 2 BN68-1 11,755 0,697 ns 2 BN83B1 16,163 0,013 * 2 Na12-C08 24,000 0,065 ns 2 Ol11-D12 8,000 0,005 ** 2 Ni4 D09 11,200 0,738 ns 2 Na10-A08 8,000 0,238 ns 2 Na12-G05 8,000 0,005 ** 3-1ah BN68-1 16,000 0,001 ** 3-1ah BN83B1 11,769 0,301 ns 3-1ah Na12-C08 24,720 0,259 ns 3-1ah Ol11-D12 40,000 0,007 ** 3-1ah Ni4 D09 8,000 0,046 * 3-1ah Na10-A08 24,000 0,008 ** 3-1ah Na12-G05 16,000 0,014 * 3-2ah BN68-1 16,000 0,001 ** 3-2ah BN83B1 18,000 0,055 ns 3-2ah Na12-C08 19,556 0,550 ns 3-2ah Ol11-D12 24,000 0,008 ** 3-2ah Ni4 D09 8,000 0,046 * 3-2ah Na10-A08 17,067 0,073 ns 3-2ah Na12-G05 8,000 0,046 * 33-1ah BN68-1 0,426 0,514 ns 33-1ah BN83B1 0,036 0,850 ns 33-1ah Na12-C08 8,000 0,046 * 33-1ah Ol11-D12 18,000 0,006 ** 33-1ah Ni4 D09 16,000 0,001 ** 33-1ah Na10-A08 18,163 0,052 ns 33-1ah Na12-G05 8,000 0,046 * 33-2ah BN68-1 16,000 0,001 ** 33-2ah BN83B1 12,500 0,253 ns 33-2ah Na12-C08 2,880 0,410 ns 33-2ah Ol11-D12 16,000 0,100 ns 33-2ah Ni4 D09 16,000 0,001 ** 33-2ah Na10-A08 16,163 0,095 ns 33-2ah Na12-G05 11,755 0,302 ns 4-1ah BN68-1 16,000 0,001 ** 4-1ah BN83B1 18,000 0,055 ns 4-1ah Na12-C08 25,600 0,042 * 4-1ah Ol11-D12 4,444 0,217 ns 4-1ah Ni4 D09 8,000 0,005 ** 4-1ah Na10-A08 8,000 0,046 * 4-1ah Na12-G05 8,000 0,005 ** 4-2ah BN68-1 10,000 0,019 * 4-2ah BN83B1 11,250 0,338 ns 4-2ah Na12-C08 6,806 0,339 ns 4-2ah Ol11-D12 18,333 0,246 ns 4-2ah Ni4 D09 5,000 0,025 * 4-2ah Na10-A08 15,000 0,132 ns 4-2ah Na12-G05 10,000 0,019 * Vrsta/sorta/podvzorec Lokus/marker Vsota kvadratov Verjetnost Statistična značilnost 5-1ah BN68-1 11,358 0,078 ns 5-1ah BN83B1 14,480 0,152 ns 5-1ah Na12-C08 20,444 0,156 ns 5-1ah Ol11-D12 10,222 0,116 ns 5-1ah Ni4 D09 8,000 0,046 * 5-1ah Na10-A08 8,000 0,046 * 5-1ah Na12-G05 8,000 0,005 ** 5-2ac BN68-1 3,000 0,083 ns 5-2ac BN83B1 3,000 0,083 ns 5-2ac Na12-C08 0,750 0,386 ns 5-2ac Ol11-D12 3,000 0,083 ns 5-2ac Ni4 D09 3,000 0,083 ns 5-2ac Na10-A08 3,000 0,392 ns 5-2ac Na12-G05 3,000 0,083 ns 6-1ah BN68-1 11,556 0,009 ** 6-1ah BN83B1 24,000 0,001 *** 6-1ah Na12-C08 10,500 0,398 ns 6-1ah Ol11-D12 26,000 0,038 * 6-1ah Ni4 D09 8,762 0,187 ns 6-1ah Na10-A08 16,000 0,014 * 6-1ah Na12-G05 16,000 0,014 * 6-2a BN68-1 1,000 0,317 ns 6-2a BN83B1 1,000 0,317 ns 6-2a Na12-C08 1,000 0,317 ns 6-2a Ol11-D12 1,000 0,317 ns 6-2a Ni4 D09 1,000 0,317 ns 6-2a Na10-A08 1,000 0,317 ns 6-2a Na12-G05 1,000 0,317 ns 7 BN68-1 11,876 0,065 ns 7 BN83B1 16,099 0,097 ns 7 Na12-C08 11,469 0,075 ns 7 Ol11-D12 24,000 0,008 ** 7 Ni4 D09 25,778 0,004 ** 7 Na10-A08 8,000 0,238 ns 7 Na12-G05 8,000 0,005 ** 8 BN68-1 10,765 0,013 * 8 BN83B1 24,000 0,001 *** 8 Na12-C08 32,000 0,059 ns 8 Ol11-D12 24,000 0,008 ** 8 Ni4 D09 8,000 0,046 * 8 Na10-A08 16,000 0,014 * 8 Na12-G05 16,000 0,001 ** 9-1ah BN68-1 18,469 0,005 ** 9-1ah BN83B1 16,000 0,014 * 9-1ah Na12-C08 22,756 0,089 ns 9-1ah Ol11-D12 27,556 0,025 * 9-1ah Ni4 D09 8,327 0,215 ns 9-1ah Na10-A08 12,500 0,052 ns 9-1ah Na12-G05 16,000 0,001 ** 9-2ab BN68-1 2,000 0,157 ns 9-2ab BN83B1 0,222 0,637 ns 9-2ab Na12-C08 2,000 0,572 ns 9-2ab Ol11-D12 2,000 0,157 ns 9-2ab Ni4 D09 2,000 0,157 ns 9-2ab Na10-A08 2,000 0,157 ns 9-2ab Na12-G05 2,000 0,572 ns Legenda: ns=ni statistično značilno, *P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001 V Preglednici 28 so z zeleno označeni vrstno in/ali sortno specifični markerji, ki statistično značilno uspešno razločujejo med genomoma navadne ogrščice in bele gorjušice in/ali znotraj njiju. Rezultati kvalitativne analize s SCAR markerjema so pokazali, da sta sortno specifična glede na genom navadne ogrščice, vrstno pa razlikujeta med genomoma navadne ogrščice in bele gorjušice, saj pri beli gorjušici nismo določili prisotnega namnožka. Metode, postopki in rezultati preverjanja sortne pristnosti žit in križnic CRP V4-1806 Preglednica 29: Podobnost med vrstama/sortami/podvzorci križnic na podlagiizračuna Nei-jeve gentske razdalje (Nei, 1972) 10-1ah 12-1ah 12-2a 13 14-1ah 14-2ah 15 16 17 2 3-1ah 3-2ah 33-1ah 33-2ah 4-1ah 4-2ah 5-1ah 5-2ac 6-1ah 6-2a 7 8 9-1ah 9-2ab 1,000 10-1ah 0,746 1,000 12-1ah 0,700 0,813 1,000 12-2a 0,790 0,703 0,660 1,000 13 0,535 0,519 0,449 0,645 1,000 14-1ah 0,664 0,678 0,607 0,719 0,827 1,000 14-2ah 0,784 0,741 0,666 0,872 0,763 0,720 1,000 15 0,601 0,816 0,719 0,659 0,679 0,794 0,708 1,000 16 0,695 0,730 0,594 0,717 0,753 0,679 0,892 0,766 1,000 17 0,612 0,729 0,547 0,562 0,379 0,538 0,559 0,728 0,709 1,000 2 0,869 0,782 0,660 0,679 0,425 0,633 0,682 0,619 0,644 0,735 1,000 3-1ah 0,806 0,769 0,663 0,586 0,347 0,587 0,567 0,577 0,534 0,695 0,951 1,000 3-2ah 0,313 0,357 0,062 0,187 0,190 0,128 0,284 0,267 0,353 0,333 0,425 0,398 1,000 33-1ah 0,300 0,409 0,098 0,196 0,208 0,137 0,281 0,279 0,368 0,377 0,410 0,412 0,876 1,000 33-2ah 0,717 0,891 0,723 0,500 0,315 0,541 0,533 0,703 0,579 0,756 0,845 0,872 0,403 0,444 1,000 4-1ah 0,807 0,875 0,753 0,626 0,498 0,618 0,689 0,733 0,701 0,741 0,826 0,801 0,330 0,348 0,913 1,000 4-2ah 0,736 0,871 0,758 0,505 0,325 0,560 0,530 0,674 0,568 0,742 0,873 0,899 0,362 0,396 0,974 0,918 1,000 5-1ah 0,744 0,784 0,864 0,646 0,445 0,634 0,660 0,658 0,595 0,588 0,700 0,658 0,063 0,079 0,736 0,790 0,750 1,000 5-2ac 0,833 0,875 0,819 0,620 0,454 0,574 0,685 0,700 0,681 0,691 0,794 0,783 0,335 0,359 0,877 0,907 0,888 0,859 1,000 6-1ah 0,781 0,731 0,714 0,614 0,417 0,640 0,620 0,594 0,582 0,623 0,672 0,621 0,062 0,078 0,723 0,843 0,737 0,840 0,807 1,000 6-2a 0,901 0,764 0,743 0,703 0,391 0,614 0,643 0,630 0,599 0,702 0,850 0,843 0,279 0,291 0,795 0,821 0,808 0,753 0,852 0,785 1,000 7 0,766 0,900 0,737 0,531 0,373 0,561 0,582 0,668 0,617 0,714 0,852 0,869 0,423 0,459 0,954 0,912 0,964 0,743 0,893 0,759 0,783 1,000 8 0,629 0,793 0,591 0,399 0,303 0,480 0,453 0,599 0,545 0,721 0,800 0,836 0,488 0,516 0,914 0,815 0,921 0,564 0,766 0,581 0,682 0,912 1,000 9-1ah 0,497 0,627 0,364 0,272 0,181 0,360 0,298 0,472 0,363 0,590 0,633 0,643 0,453 0,422 0,731 0,658 0,740 0,354 0,588 0,473 0,524 0,723 0,848 1,000 9-2ab S sivo označene celice v Preglednici 29 pomenijo visoko stopnjo genetske podobnosti (>0,83) med vrstama/sortami/podvzorci navadneogrščice in bele gorjušice. Slika 16: Razporeditev genotipov iz družine križnic na podlagi rezultatov analize glavnih koordinat (PCoA)