445
Pregledni prispevek/Review article
KONFOKALNA MIKROSKOPIJA ROŽENICE
CONFOCAL MICROSCOPY OF THE CORNEA
Kristina Mikek, Marko Hawlina, Brigita Drnovšek-Olup, Vladimir Pfeifer
Očesna klinika Ljubljana, Klinični center, Zaloška 29 a, 1525 Ljubljana
Prispelo 2003-11-29, sprejeto 2004-03-16; ZDRAV VESTN 2004; 73: 445–50
Key words: confocal microscopy; examination; morphologi-
cal changes in the cornea
Abstract – Background. Confocal microscopy is a diagnostic
method used for examination of the morphological structure
of the cornea in vitro as well as in vivo.
Methods. Using a confocal microscope (Confoscan 2.0, Nidek,
Japan), we can determine and analyze morphological chan-
ges in individual layers of the cornea, from epithelial to stro-
mal and endothelial ones in addition, it is possible to observe
keratitis causing agents. According to the findings revealed,
we choose a treatment method and a surgical procedure type.
The investigation is aimed to determine a cellular density in
different layers of the cornea, i. e., that of epithelial cells, stro-
mal keratocytes and endothelial cells. Monitoring cellular den-
sity by layers helps us understand the cell response after cor-
neal damage or surgery of the anterior segment of the eye.
Conclusions. The method is clinically applicable also in an
opaque cornea occurring as a result of epithelial or stromal
edema. Such investigations were not feasible before the intro-
duction of the confocal microscopy.
Ključne besede: konfokalna mikroskopija; potek preiskave;
morfološke spremembe v roženici
Izvleček – Izhodišča. Konfokalna mikroskopija (KM) je pre-
iskovalna metoda, s katero pregledujemo morfološko struktu-
ro roženice in vitro in in vivo.
Metode. S konfokalnim mikroskopom (Confoscan 2,0, Nidek,
Japonska) opazujemo in analiziramo morfološke spremem-
be v posameznih plasteh roženice: epitelne, preko strome do
endotelne plasti. Opazujemo lahko povzročitelja roženične-
ga vnetja in se odločamo o načinu zdravljenja ter o vrsti ki-
rurškega posega. Raziskujemo gostoto celic v posameznih pla-
steh roženice: epitelnih celic, keratocitov v stromi ter endotel-
nih celic. Z opazovanjem gostote celic v posameznih plasteh
roženice ugotavljamo celični odgovor pri poškodbah, vnetjih
roženice ali po operacijah sprednjega segmenta očesa.
Zaključki. S KM opazujemo tudi neprozorno roženico, ki na-
stane zaradi edema epitelne plasti ali strome, česar in vivo
pred odkritjem KM ni bilo mogoče.
Uvod
S konfokalnim mikroskopom (KM) in vivo v roženici opazu-
jemo celične spremembe velikosti manj kot 1 µm, ki smo jih
doslej lahko opazovali le z odvzemom materiala (biopsijo) in
s histološkim preparatom. Analiziramo lahko morfološke spre-
membe v posameznih plasteh roženice ter diagnosticiramo
etiologijo vnetja. S to preiskovalno metodo natančno določi-
mo, v kateri plasti se nahaja roženična patologija, analiziramo
njeno morfologijo ter tako postavimo natančnejšo diagnozo.
Glede na to se odločamo o načinu zdravljenja ter o vrsti kirur-
škega posega. KM je klinično uporabna tudi pri neprozorni
roženici, ki nastane zaradi edema epitelne plasti ali strome,
kar pred odkritjem konfokalne mikroskopije z zrcalnim mi-
kroskopom ni bilo mogoče. Konfokalno mikroskopijo odli-
kujeta večja prečna in globinska ločljivost. Ločljivost KM je za
približno 40% večja od splošnega konvencionalnega mikro-
skopa. KM nam omogoča pregled prozornega odseka tkiva
ter tridimenzionalno rekonstrukcijo (1).
Priprava preiskovancev
Pred preiskavo roženico ohromimo z anestetičnimi kapljica-
mi Novesine® (Ciba Vision Ophthalmics, Atlanta, GA). Stož-
čast nastavek konfokalnega mikroskopa očistimo pred in po
preiskavi s 70-odstotnim izopropilnim alkoholom. Na konico
nastavka namestimo kapljico imerzijskega gela 2,5% hidro-
ksipropil metilceluloze (Ciba Vision Ophthalmics, Atlanta,
GA), ki prepreči neposreden stik objektiva z roženico (Sl. 1).
Pri preiskavi moramo paziti, da mehansko ne poškodujemo
površine roženice. Preiskovancu vedno pregledamo roženi-
co z biomikroskopom pred in po preiskavi s KM (1).
Potek preiskave s konfokalnim
mikroskopom (ConfoScan 2.0, NIDEK,
Japonska)
Konfokalni mikroskop, ki ga uporabljamo na Očesni kliniki v
Ljubljani, je opremljen s halogensko žarnico100 W/12 V kot
izvorom svetlobe. Pri klinično normalni roženici izvor halo-
genske svetlobe namestimo na maksimalno vrednost in s tem
zagotovimo zadostno količino odbite svetlobe iz posameznih
struktur roženice. Drugače pa je v patološko spremenjeni ro-
ženici z brazgotinami. V tem primeru jakost svetlobe zmanj-
šamo na približno polovico (1). Zaradi premikanja očesa je
pomembna lega gibljivega stožčastega nastavka, v katerem je
objektiv (2, 3). Med preiskavo se objektiv preko imerzijskega
ZDRAV VESTN 2004; 73: 445–50
m03.p65 22.5.2004, 4:28445
446 ZDRAV VESTN 2004; 73
gela pravokotno dotakne zunanje površine roženice, medtem
ko preiskovanec gleda naravnost v izvor svetlobe (Sl. 1) (1, 4).
Za pregled roženice s KM uporabljamo objektive z različnimi
povečavami in velikostmi odprtine zaslonke objektiva: od 25-
krat/0,65, 40-krat/0,75 ali 50-krat/1,0 (1, 5). Volumenski od-
sek tkiva, ki ga želimo pregledati, je odvisen od izbrane veli-
kosti odprtine zaslonke objektiva in povečave leče. Boljšo glo-
binsko ločljivost dosežemo z večjo odprtino zaslonke objek-
tiva in večjo lečno povečavo. Pri našem KM uporabljamo ob-
jektiv s 40-kratno povečavo in odprtino zaslonke objektiva
0,75, kar prikazujemo na sliki 1. Tako dosežemo prečno loč-
ljivost 1 µm, debelina (globinska ločljivost) preiskovanega pod-
ročja pa je 10 µm. Nastavljeni parametri dovoljujejo delovno
razdaljo približno 1,92 mm (1, 5–10). Slike posname digitalna
video kamera med potekom preiskave in jih shrani na trdem
disku računalnika. Slabe posnetke računalnik avtomatično iz-
loči (1).
S KM posnete slike analiziramo z računalniškim programom.
Posnete slike prikažemo na tri načine:
– morfologija roženice – ugotavljamo kakovost posameznih
normalnih in patoloških značilnosti v roženici tako, da jih
primerjamo s posnetki že objavljenih podatkov v atlasu ro-
ženice, narejenim s konfokalnim mikroskopom;
– morfometrična preiskava – obsega kvantitativno vrednote-
nje posameznih struktur v roženici od velikosti bazalnih epi-
telijskih in endotelijskih celic, strukture živčnega nitja, go-
stote in površine jeder keratocitov v različnih plasteh ter
ugotavljanje števila presnovnih depozitov v stromi roženi-
ce;
– tridimenzionalna in kinetična rekonstrukcija posnetkov po-
sameznih plasti roženice (1).
Anatomija in histologija roženice
– pri pregledu s konfokalnim
mikroskopom
Normalna roženica je avaskularna. S kisikom se oskrbuje pre-
ko sprednje površine roženice, dodatne hranljive sestavine
pa se prenašajo preko zadnje endotelne plasti roženice iz pre-
katne vodke. Roženica je ovalne oblike. Horizontalni premer
je 12,6 mm, vertikalna krivina je dolžine 11,7 mm. Centralna
optična krivina roženice je premera 7,8 mm. Roženica ima
+48,0 dioptrij in je del refrakcijskega sistema očesa (11). Zad-
nja krivina roženice je bolj sferična kot sprednja krivina. Zato
je roženica na sredini tanjša (520 µm) kot na periferiji (650 µm
ali več) (11, 12).
Roženico sestavljajo naslednje plasti (Sl. 2): epitel, Bowma-
nova membrana, stroma, Descemetova membrana in endo-
telna plast. Z zunanje strani varuje roženico solzni film, no-
tranjost pa omejuje prekatna vodka sprednjega prekata (11).
S KM s spreminjanjem objektiva v aksialni smeri (z koordina-
ta) posnamemo vzporedne, tangencialne odseke roženice
(1, 10). Epitel roženice je debel 50 µm. Epitel sestavljajo povr-
šinske epitelijske celice, katerim sledijo tri plasti prehodnih
(angl. wing cells) celic. Prehodne celice se preoblikujejo iz
zadajšnje, bazalne plasti epitelijskih celic, kjer potekajo mito-
tične delitve. Epitelna plast se obnavlja enkrat tedensko (11).
Površinske epitelne celice so kronološko najstarejše in so
najbolj diferencirane (11). S KM vidimo, da so različnih oblik
(dolžine 40 do 50 µm in debeline 4 µm), z visoko ali nizko
odbojnostjo (Sl. 3A). Prehodne ali »wing« celice težko razliku-
jemo, še posebej njihove sprednje plasti, notranje plasti pa
spoznamo po odbojnosti celičnih mej. Bazalne epitelne celi-
ce se lahko lateralno premikajo in proliferirajo. V procesu
obnavljanja epitela se bazalne epitelijske celice odcepijo od
bazalne lamine in potujejo proti površini. Preoblikujejo se v
prehodne celice ter nato v superficialne epitelijske celice, ki
na površini roženice razpadejo v procesu deskvamacije. Ba-
zalne epitelijske celice so manjše, kroglaste (visoke 20 µm in
premera 10 µm). Urejene so v spoznavni strukturi satovja in
so pritrjene na Bowmanovo membrano (bazalna lamina) (1).
Kinetika celične proliferacije, diferenciacije in migracije epi-
telijskih celic še ni razjasnjena in je še vedno predmet raz-
iskav (14). Bowmanova membrana je bazalna lamina, debe-
la 8 do 12 µm, ki jo tvorijo bazalne epitelijske celice s svojimi
zunajceličnimi produkti (11). Je neodbojna plast, ki jo spo-
znamo s KM le po živčnih končičih in mestu, kjer se nahaja.
Bazalna membrana meji v sprednjem delu na bazalne epite-
lijske celice, v zadnjem delu pa na prva jedra keratocitov v
stromi (Sl. 3B) (1). Stroma predstavlja 90% debeline roženi-
ce. Gradijo jo zvezdasto oblikovani keratociti, ki tvorijo s
citoplazemskimi podaljški morfološki in funkcionalen sinci-
cij. Keratocitov je 3 do 5% prostornine strome. Keratociti so
fibroblastom podobne celice, ki sodelujejo pri nastanku, pre-
oblikovanju in razgradnji strome ter imajo zato pomembno
vlogo pri celjenju poškodovane roženice. Keratociti uravna-
vajo velikost kolagenskih vlaken in prerazporeditev proteo-
glikanov v stromi in tako vplivajo na prozornost roženice.
Kolagen, ki sestavlja človeško roženico, je tipa I, nekaj pa je
Sl. 1. Princip preiskave s konfokalnim mikroskopom: stožčast
nastavek konfokalnega mikroskopa se preko imerzijskega ge-
la dotakne površine roženice v pravokotni smeri in se pribli-
žuje in oddaljuje, kot je prikazano na sliki. Pri tem konfokal-
ni mikroskop presvetli plasti roženice.
Figure 1. Mechanism of action of the confocal microscope: the
tip at the end of the microscope approaches the cornea sur-
face through an immersion gel and scans all its layers.
Sl. 2. Shematsko-prečni odsek roženice (13).
Figure 2. Schematic transverse section of the cornea (13).
m03.p65 22.5.2004, 4:28446
447
tudi kolagena tipa III in V. Glavna proteoglikana v stromi sta
glikozaminglikana keratan sulafat in hondroitin sulfat v raz-
merju 3:1 (11, 15). V stromi roženice s KM vidimo le jedra
keratocitov kot svetla področja v temnem polju (Sl. 3C). Me-
stoma vidimo kolagenska vlakna in razvejane živčne konči-
če, ki imajo visoko odbojnost. Oblika in prostorska razpore-
ditev keratocitov v stromi sta odvisni od mesta v stromi. Prva
plast keratocitov, ki je tik za Bowmanovo membrano, ima
značilno morfološko strukturo večoglatih jeder, ki jih nor-
malno ne najdemo v drugih plasteh strome. Prvi plasti sledijo
keratociti z ovalnimi do kroglastimi jedri in občasnimi zare-
zami. V zadnjih plasteh strome so jedra keratocitov bolj po-
dolgovata in vretenasta (1). Opisane tri populacije keratoci-
tov so opazovali v različnih plasteh roženic ljudi in živali (16–
18). Descemetova membrana je bazalna lamina, ki jo tvorijo
sekrecijski produkti endotelijskih celic. Loči stromo roženice
od zadnje enoslojne endotelne plasti (11). S KM jo spozna-
mo le po njeni lokalizaciji (1). Endotelna plast je sestavljena
iz 400.000 celic, ki so 4 do 6 µm debele, heksagonalne oblike,
širine približno 20 µm. Endotelijske celice nimajo sposobno-
sti regeneracije. Izgubi ali poškodbi teh celic sledi le njihovo
povečanje in prerazporeditev. Ob rojstvu je gostota endote-
lijskih celic od 3500 do 4000 celic/mm2, nato pa s staranjem
upada. Pri odraslem človeku je gostota od 1400 do 2500
celic/mm2. Vrzeli v endotelni plasti porušijo endotelno funk-
cijo. Kopičenju vode v stromi sledi zamotnitev roženice in
izguba vidne ostrine (7). S KM lepo prikažemo meje in obli-
ke endotelijskih celic (Sl. 3D). Na posnetkih določimo delež
celic različnih površin – pleomorfizem ter delež medceličnih
stikov – polimegatizem. Mestoma vsebujejo endotelijske ce-
lice granule po fagocitozi, ki jih vidimo kot hiperodbojne
znotrajcelične depozite (1).
Oživčenje roženice
Roženica dobiva senzorna in simpatična vlakna.
Senzorična oskrba poteka preko 5. možganske-
ga živca trigeminusa, katerega telo leži v trigemi-
nalnem gangliju. Telesa živcev simpatičnega nit-
ja pa se nahajajo v zgornjem cervikalnem gan-
gliju. V roženici je število senzornih vlaken več-
je kot število simpatičnih vlaken. Po vstopu živč-
nega nitja skozi sklero, tik nad optičnim živcem,
se živčno nitje razcepi večkrat v suprahoroidal-
nem prostoru. Posamezni živčni končiči so raz-
porejeni cirkularno okrog korneoskleralnega
limbusa, ki je anatomski prehod med sklero in
roženico. Tukaj oživčujejo tudi veznico okrog
limbusa in limbalni epitel roženice (11). Po vsto-
pu v roženico v sprednji tretjini strome tvorijo
živčni končiči gosto subepitelno mrežje. Živčni
končiči predrejo na več mestih Bowmanovo
membrano, kjer tvorijo bazalno epitelno živčno
mrežje, ki se nadaljuje s prostimi živčnimi kon-
čiči na ravni plasti površinskih epitelijskih celic
(11, 19).
S KM sledimo razporeditvi živčnih vlaken v po-
sameznih plasteh roženice zaradi njihove viso-
ke odbojnosti (1). Subepitelna živčna mrežja in
prestopna mesta živčnih vlaken skozi Bowma-
novo membrano so zanesljive orientacijske toč-
ke (Sl. 3B). S KM tako najdemo plast ali področje
v roženici, ki ga želimo ponovno preiskovati (20).
Auran s sodelavci je opisal centripetalno rast živč-
nih vlaken bazalnega epitelnega mrežja. Živčna
vlakna rastejo 10 do 20 µm na dan skupaj s plast-
jo bazalnih epitelnih celic. Subepitelno mrežje je
nepremično (21).
Morfološke spremembe v roženici,
povezane s staranjem
Z raziskavami so dokazali, da se povečuje debelina roženice
v prečnem preseku s staranjem (12) in da upada število endo-
telijskih celic (2, 9). Endotelijske celice postajajo večje, ohra-
njajo pravilno heksagonalno obliko, večkrat so prisotni zno-
trajcelični presnovni depoziti (1, 11).
S KM so opazovali slabšo regeneracijo v epitelni plasti rože-
nic starejših. Pri starejših ljudeh so epitelijske celice bolj po-
dolgovate in večje v primerjavi z bazalnimi epitelijskimi celi-
cami mlajših ljudi. Pri starejših ljudeh so v stromi, in sicer v
zunajceličnem matriksu, prisotni visoko reflektivni mikro de-
poziti. Le-ti so ostanki presnovnih aktivnosti keratocitov. Obli-
ka jeder keratocitov se ne spreminja (1). Študiji Moller-Peder-
sena (22) in Patela (23) sta ugotovili upadanje gostote kerato-
citov s staranjem. Mustonen (9) je v svoji raziskavi s KM doka-
zal le upadanje števila endotelnih celic, gostota keratocitov se
s staranjem ni spreminjala.
Uporaba konfokalne mikroskopije
Pomen preiskovalne metode s KM je v tem, da natančno do-
ločimo obseg obolelega področja v roženici in spremljamo
klinični potek bolezni. Glede na izvid določimo medikament-
no zdravljenje (1, 24).
Vnetja roženice
S KM opazimo v posameznih plasteh roženice patološke spre-
membe, ki jih povzročajo paraziti, bakterije in virusi (10). Ta-
ko so opisane spremembe, ki so jih opazovali s KM pri vnetju
s herpesom simpleksom (4, 10, 25), vnetju z adenovirusom
A
C
B
D
Sl. 3. Plasti roženice, posnete s konfokalnim mikroskopom: A – površinske
epitelne celice, B – Bowmanova membrana z živčnimi vlakni, C – stroma
s keratociti in D – endotelna plast.
Figure 3. Individual layers of the cornea recorded using a confocal micro-
scope: A – superficial epithelial cells, B – Bowman layer with nerve fibers,
C – stroma with keratocytes and D – endothelium of the cornea.
MIKEK K, HAWLINA M, DRNOVŠEK-OLUP B, PFEIFER V. KONFOKALNA MIKROSKOPIJA ROŽENICE
m03.p65 22.5.2004, 4:28447
448 ZDRAV VESTN 2004; 73
(1), glivo Aspergillus flavus (26), Fusarium solani, parazitom
Acanthamoebo castellanii (28, 29). Dokazali so okužbo z bak-
terijama Streptococcus viridans in Staphylococcus werneri (30,
31) ter spiroheto Borrelio burgdorferi, posneto v roženici s
KM (32).
Distrofije roženice
Pri epitelni distrofiji bazalne membrane (map-dot-finger print
distrofiji) s KM v epitelnih plasteh vidimo nepravilno razpo-
reditev epitelnih plasti ter prisotnost posameznih cist bazal-
nih celic, ki prehajajo v površinsko plast roženice (1, 33, 34).
V primerih granularne, Reis-Bückler in Lattice distrofije tipa
I, ki zajamejo sprednje plasti roženice, so značilni skupki di-
strofičnega materiala. Globlje plasti strome in endotelna plast
so pri teh distrofijah brez morfoloških sprememb (4, 35). Za
posteriorno polimorfno distrofijo so značilne patološke spre-
membe Descemetove membrane (36). Za endotelno Fuchso-
vo distrofijo so značilne spremembe gutata, ki so posledica
izločkov bolezensko spremenjenih endotelijskih celic. Te spre-
membe opazimo tudi pri normalnem procesu staranja, izrazi-
teje so izražene na obrobju roženice (11). S KM vidimo te spre-
membe kot hipoodbojna okrogla področja, omejena s ple-
omorfno oblikovanimi endotelijskimi celicami različnih veli-
kosti (37, 38).
Keratokonus
Keratokonus je nevnetna ektazija roženice s patološkimi spre-
membami v stromi roženice. Z biomikroskopom vidimo zna-
čilno stanjšanje roženice v centralnem delu in prečne strije v
globljih plasteh strome (11). S KM vidimo v napredovalem
stadiju bolezni vzporedno potekajoče linije (strije) v stromi
roženice, kot prikazujemo na sliki 4.
Degeneracije roženice
Degenerativne spremembe so posledica dolgotrajnega kro-
ničnega vnetja in dolgotrajnega delovanja toksinov na rože-
nico. V roženici vidimo komaj opazne morfološke spremem-
be, ki ne vplivajo na ostrino vida. S KM so videli epitelne
vključke (depozite) v roženici po zdravljenju s Cordaronom
pri srčnih aritmijah. Pri pasasti keratopatiji vidimo subepitel-
ne depozite kalcijevega fosfata na ravni Bowmanove mem-
brane. Degenerativne spremembe v stromi opazimo kot po-
daljške keratocitov, ki jih ni v zdravi roženici. Značilna je
večja odbojnost fibroznega tkiva z odbojnimi zrni lipofusce-
ina (1).
Kirurški posegi v roženici
S KM lahko primerjamo morfološke spremem-
be roženice pred in po kirurškem posegu. S
presaditvijo roženice nadomestimo motno ro-
ženico bolnika z roženico umrlega dajalca. Pre-
gled s KM pogojuje tehniko operacije. S KM
vrednotimo, v kateri plasti je patologija, in se
odločamo za penetrantno keratoplastiko, kjer
zamenjamo celotno debelino roženice, ali pa
za lamelno keratoplastiko, kjer prejemniku
presadimo le povrhnje plasti roženice. Po ope-
raciji s KM opazujemo vraščanje tkiva. Tako
lahko čim prej odkrijemo zgodnje in pozne po-
operativne zaplete, ki z navadnim mikrosko-
pom še niso vidni (1).
V refraktivni kirurgiji spremenimo obliko ro-
ženice in s tem refrakcijo očesa z laserjem ex-
cimer. Tako popravimo dalekovidnost, kratko-
vidnost ali astigmatizem. Gre za poseg v zdra-
vo roženico. V svetu poteka veliko raziskav, ki
s KM proučujejo posledice tovrstnih operacij
in jih primerjajo med seboj. Ocenjujemo spremembe v epi-
telni plasti roženice, opazujemo reakcijo keratocitov in okol-
nega stromalnega tkiva ter ponovno vraščanje živčnih konči-
čev (1, 4, 8, 10, 39–44). Na ta način bo mogoče kvalitativno
oceniti, katera tehnika refraktivnih operacij z laserjem exci-
mer je za roženico najmanj škodljiva (1).
Merjenje gostote celic
S KM merimo gostoto celic v posameznih plasteh roženice in
jih analiziramo. Gostoto celic od povrhnje epitelne preko ke-
ratocitov v stromi do notranje endotelne plasti so raziskovali
pri ljudeh (8, 9, 18, 23) in pri poizkusnih živalih (17, 45). Pred
uvedbo KM so lahko z zrcalnim mikroskopom kvantitativno
analizirali le epitelno in endotelno plast roženice (6, 46, 47).
Gostota bazalnih epitelijskih celic in superficialnih epitelijskih
celic se s starostjo ne spreminja (9). V stromi roženice je go-
stota keratocitov največja v sprednjih plasteh. Nato gostota
keratocitov upada proti zadajšnjim plastem roženice in se ne-
koliko poveča tik pred Descemetovo membrano (17, 18). Po-
leg že dokazanega upadanja števila endotelijskih celic s stara-
njem so nekatere raziskave dokazale tudi sorazmerno upada-
nje gostote keratocitov (22, 23). Meritve gostote keratocitov s
KM in s histološkim preparatom so primerljive, kar potrjuje
primernost konfokalne mikroskopije (23, 45). Gostoto kera-
tocitov so merili pri zdravih ljudeh (9, 18, 22, 23, 48), v bole-
zensko spremenjeni roženici, in sicer keratokonusu (49), ter
pri ljudeh po operacijah v roženici (8, 39, 50–54).
Frueh je primerjal gostoto keratocitov pred in po fotorefrak-
tivni keratektomiji (PRK) z laserjem excimer. V prvem in četr-
tem mesecu po operaciji je ugotovil statistično pomembno
povečanje števila keratocitov v sprednji plasti strome roženi-
ce. Kasneje se je gostota keratocitov zmanjšala na normalo
(8). Ne vemo, kaj je vzrok za spremembo gostote keratocitov
po operaciji z laserjem excimer: razpad celic (55), celična de-
litev (56) ali celično premikanje (»migracija«) (40, 41). Takoj
po operaciji z laserjem excimer so jedra keratocitov dvakrat
večja in taka ostanejo tudi še eno leto po operaciji (39). Povi-
šanje gostote keratocitov po refraktivni operaciji sovpada z
večjo reflektivnostjo subepitelne brazgotine in kliničnim po-
javom prehodne meglice (»haze«) v roženici. Keratociti so lah-
ko odgovorni za ta pojav (57). Gostota keratocitov se poveča
le v sprednji plasti strome roženice. V srednjem in zadnjem
delu strome roženice se ne spremeni, nespremenjena ostane
tudi gostota endotelijskih celic (8).
Pri operaciji presaditve roženice je veliko raziskav, ki so v po-
operativnem obdobju dokazale upadanje števila endotelnih
Sl. 4. Morfološke spremembe pri keratokonusu, posnete s konfokalnim mikro-
skopom: levo – začetni keratokonus, desno – napredovala oblika kerato-
konusa.
Figure 4. Morphological changes in keratoconus patient record using a con-
focal microscope: left – keratoconus in an early stage, right – keratoconus
in an advanced stage.
m03.p65 22.5.2004, 4:28448
449
celic (53). V zadnjem času pa se z uporabo konfokalnega mi-
kroskopa lahko in vivo raziskuje tudi vloga keratocitov v stro-
mi roženice po operaciji presaditve. V 36 transplantiranih ro-
ženicah, kjer je bila narejena penetrantna keratoplastika, so
določali gostoto keratocitov v obdobju 1 meseca do 20 let po
operaciji. Prišli so do zanimivih rezultatov: število keratoci-
tov/mm2 v centralnem delu je po operaciji ostalo nespreme-
njeno (p = 0,68), medtem ko je število keratocitov pri kontrol-
ni skupini normalnih roženic upadalo s staranjem (p < 0,001).
Po drugi strani pa se je gostota celic (keratociti/mm3) v trans-
plantiranih roženicah v pooperativnem obdobju zmanjšala
(53). V isti raziskavi so podrobno sledili 5 transplantiranim
roženicam v zgodnjem pooperativnem obdobju in opisovali
»aktivirane keratocite« (53). Te so opazili tudi v transplantira-
nih roženicah, kjer je bila prisotna pozna endotelna zavrnit-
vena reakcija (56). Na Očesni kliniki smo analizirali gostoto
keratocitov in površino njihovih jeder v roženicah po pene-
trantni keratoplastiki. Skupino 20 transplantiranih roženic (sta-
rost roženice dajalca 4 do 71 let) smo primerjali s starostno
primerljivo skupino 24 zdravih roženic. Upoštevali smo do
sedaj objavljene raziskave v zdravih roženicah ljudi, ki so po-
trdile upadanje gostote keratocitov s staranjem (22, 23). Ob-
dobje po operaciji je bilo 8 do 77 mesecev. V primerjalni raz-
iskavi smo dokazali, da presaditev roženice ne vpliva na go-
stoto keratocitov in površino njihovih jeder v centralnem de-
lu presajene roženice. Pri bolnikih po presaditvi roženice pa
smo dokazali, da starost dajalca ob odvzemu roženice za pre-
saditev vpliva na povečanje površine jeder keratocitov samo
v zadnji plasti strome roženice (50). Še vedno ni natančno
pojasnjeno, ali keratociti v transplantirani roženici nastajajo z
delitvijo obstoječih ali pa gre morda za potovanje keratocitov
iz periferije (58).
Zaključki
Sklepamo, da je konfokalna mikroskopija zelo uporabna ne-
invazivna preiskovalna metoda, s katero natančno pregledu-
jemo celične procese v živem tkivu in situ. Sprejemljiva je ta-
ko s strani preiskovanca kot zdravnika. S KM sledimo patolo-
škim spremembam v tkivu ter uspešnosti medikamentnega
in kirurškega zdravljenja. Konfokalna mikroskopija je prispe-
vala k raziskovanju celjenja roženice po poškodbah in kirur-
ških posegih sprednjega segmenta očesa.
Konfokalno mikroskopijo uporabljamo le v največjih klinič-
nih centrih. Pri analiziranju posnetkov roženičnega tkiva še
vedno naletimo na nepojasnjene spremembe, pri katerih se
lahko vprašamo, kaj je zdravo in kaj je patološko. Pred krat-
kim so bile opisane patološke spremembe v roženici pri raz-
ličnih redkejših boleznih (59–61). Počasi odkrivamo popol-
noma nove in doslej neznane mikroskopske spremembe, ki
so morda začetne faze še neznanih bolezni roženice. Z zelo
izpopolnjeno diagnostično preiskavo diagnosticiramo pato-
logijo roženice v začetnem stadiju bolezni, kjer klinična slika
še ni značilna. Razvoj konfokalne mikroskopije obeta, da bo-
mo in vivo lahko pregledovali tudi globlje dele očesa.
Literatura
1. Böhnke M, Masters BR. Confocal microscopy of the cornea. Retinal and eye
research 1999; 18: 553–628.
2. Laing RA, Sandstrom MM, Leibowitz HM. In vivo photomicrography of the
corneal endothelium. Arch Ophthalmol 1975; 93: 143–5.
3. Koester CJ. Scanning mirror microscope with optical sectioning characteri-
stics: applications in ophthalmology. Appl Opt 1980; 19: 1749–57.
4. Cavanagh HD, Petroll WM, Alizadeh H et al. Clinical and diagnostic use of in
vivo confocal microscopy in patients with corneal disease. Ophthalmology
1993; 100: 1444–54.
5. Wiegand W, Thaer AA, Kroll P, Geyer OC, Garcia AJ. Optical sectioning of
the cornea with a new confocal in vivo slit-scanning videomicroscope. Oph-
thalmology 1995; 102: 568–75.
6. Koester CJ, Auran JD, Rosskothen HD, Florakis GJ, Tackaberry RB. Clinical
microscopy of the cornea utilizing optical sectioning and a high-numerical-
aperture objective. J Opt Soc Am A 1993; 10: 1670–79.
7. Masters BR, Thaer AA. Real-time scanning slit confocal microscopy of the in
vivo human cornea. Appl Optics 1994; 33: 695–701.
8. Frueh BE, Cadez R, Böhnke M. In vivo confocal microscopy after photore-
fractive keratectomy in humans. Arch Ophthalmol 1998; 116: 1425–31.
9. Mustonen RK, McDonald MB, Srivanneboon S et al. Normal human corneal
cell populations evaluated by in vivo scanning slit confocal microscopy.
Cornea 1998; 17: 485–92.
10. Cavanagh H, El-Agha MS, Petroll WM, Jester JV. Specular microscopy, con-
focal microscopy and ultrasound biomicroscopy. Cornea 2000; 19: 712–22.
11. Klyce SD, Beuerman RW. Structure and function of the cornea. In: Kaufman
HE, Barron BA, McDonald MB eds. The cornea. 2nd ed. Boston: Butterworth-
Heinemann, 1998: 3–50.
12. Hitzenberger CK, Drexler W, Fercher AF. Measurement of corneal thickness
by laser Doppler interferometry. Invest Ophthalmol Vis Sci 1992; 33: 98–
103.
13. Green WT, Muir MGK. The cornea. In: Spalton DJ, Hitchings RA, Hunter PA
eds. Atlas of clinical ophthalmology 2nd ed. Mosby, 1994: 6: 2–30.
14. Beebe DC, Masters BR. Cell lineage and the differentiation of corneal epit-
helial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1996; 37: 1815–25.
15. Müller LJ, Pels L, Vrensen FJM. Novel aspects of the ultrastructural organiza-
tion of human corneal keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995; 36:
2557–67.
16. Poole CA, Brookes NH, Clover GM. Keratocyte networks visualised in the
living cornea using vital dyes. J Cell Sci 1993; 106: 685–91.
17. Petroll WM, Boettcher K, Barry P, Cavanagh HD, Jester JV. Quantitative as-
sessment of anteroposterior keratocyte density in the normal rabbit cor-
nea. Cornea 1995; 14: 3–9.
18. Hahnel C, Somodi S, Weiss DG, Guthoff RF. The keratocyte network of
human cornea: a three-dimensional study using confocal laser scanning
fluorescence microscopy. Cornea 2000; 19: 185–93.
19. Müller LJ, Pels L, Vrensen FJM et al. Architecture of human corneal nerves.
Invest Ophthalmol Vis Sci 1997; 38: 985–94.
20. Masters BR, Thaer AA. Real-time confocal microscopy of in vivo human
corneal nerves. Bioimages 1996; 4: 129–34.
21. Auran JD, Koester CJ, Kleiman NJ et al. Scanning slit confocal microscopic
observation of cell morphology and movement within the normal human
anterior cornea. Ophthalmology 1995; 102: 33–41.
22. Moller-Pedersen T. A comparative study of human corneal keratocyte and
endothelial cell density during aging. Cornea 1997; 16: 333–8.
23. Patel SV, McLaren JW, Hodge DO, Bourne WM. Normal human keratocyte
density and corneal thickness measurement by using confocal microscopy
in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42: 333–9.
24. Beuerman RW. Confocal microscopy: Into the clinic. Cornea 1995; 14: 1–2.
25. Lemp MA, Mathers WD, Gold JB. Surface cell morphology of the anesthetic
human cornea: a color specular microscopic study. Acta Ophthalmol Suppl
1989; 192: 102–7.
26. Winchester K, Mathers WD, Sutphin JE. Diagnosis of Aspergillus keratitis in
vivo with confocal microscopy. Cornea 1997; 16: 27–31.
27. Florakis GJ, Moazami G, Schubert H, Koester CJ, Auran JD. Scanning slit
confocal microscopy of fungal keratitis. Arch Ophthalmol 1997; 115:
1461–63.
28. Auran JD, Starr MB, Koester CJ, LaBombardi VJ. In vivo scanning slit confo-
cal microscopy of Acanthamoeba keratitis. Cornea 1994; 13: 183–5.
29. Winchester K, Mathers WD, Sutphin JE, Daley TE. Diagnosis of Acantha-
moeba keratitis in vivo with confocal microscopy. Cornea 1995; 14: 10–17.
30. Chew SJ, Beuerman RW, Assouline M et al. Early diagnosis of infectious
keratitis with in vivo real-time confocal microscopy. CLAO J 1992; 18:
197–201.
31. Kaufman SC, Laird JA, Cooper R et al. Diagnosis of bacterial contact lens
related keratitis with the white-light confocal microscope. CLAO J 1996; 22:
274–7.
32. Linna T, Mikkila H, Karma A et al. In vivo confocal microscopy: a new pos-
sibility to confirm the diagnosis of Borrelia keratitis? Cornea 1996; 15:
639–42.
33. Sherif ZAR, Pleyer U, Rieck P, Hartmann C. Confocal microscopy in corneal
dystrophies. Klin Monatsbl Augenheilkd 1999; 214: 12–21.
34. Rosenberg ME, Tervo TMT, Petroll WM, Vesaluoma MH. In vivo confocal
microscopy of patients with corneal recurrent erosion syndrome or epithe-
lial basement membrane dystrophy. Ophthalmology 2000; 107: 565–73.
35. Werner LP, Werner L, Dighiero P, Legeais JM, Renard G. Confocal micro-
scopy in Bowman and stromal corneal dystrophies. Ophthalmology 1999;
106: 1697–704.
36. Chiou AG, Kaufman SC, Beuerman RW, Maitchouk D, Kaufman HE. Confo-
cal microscopy in posterior polymorphous corneal dystrophy. Ophthal-
mologica 1999; 213: 211–3.
37. Mustonen RK, McDonald MB, Srivannaboon S et al. In vivo confocal Fuchs´
endothelial dystrophy. Cornea 1998; 17: 493–503.
38. Chiou AG, Kaufman SC, Beuerman RW et al. Confocal microscopy in cor-
nea guttata and Fuchs´ endothelial dystrophy. Br J Ophthalmol 1999; 83:
185–9.
39. Corbett MC, Prydal JI, Verma S et al. An in vivo investigation of the structu-
res responsible for corneal haze after photorefractive keratectomy and
their effect on visual function. Ophthalmology 1996; 103: 1366–80.
MIKEK K, HAWLINA M, DRNOVŠEK-OLUP B, PFEIFER V. KONFOKALNA MIKROSKOPIJA ROŽENICE
m03.p65 22.5.2004, 4:28449
450 ZDRAV VESTN 2004; 73
40. Beuerman R, McDonald M, Shofner R et al. Quantitative histological studies
of primate corneas after eximer laser photorefractive keratectomy. Arch
Ophthalmol 1994; 112: 1103–10.
41. Lohmann C, Gartry D, Muir KM et al. Haze in photorefractive keratectomy:
its origins and consequences. Lasers and light in ophthalmology 1991; 4:
15–34.
42. Linna T, Tervo T. Real-time confocal microscopic observations on human
corneal nerves and wound healing after excimer laser photorefractive ke-
ratectomy. Curr Eye Res 1997; 16: 640–9.
43. Buhren J, Kohnen T. Stromal haze after laser in situ keratomileusis: clinical
and confocal microscopy findings. J Cataract Refract Surg 2003; 29:
1718–26.
44. Lee BH, McLaren JW, Erie JC, Hodge DO, Bourne WM. Reinervation in the
cornea after LASIK. Invest Ophthalmol Vis Sci 2002; 43: 3660–4.
45. Patel SV, McLaren JW, Camp JJ, Nelson LR, Bourne WM. Automated quanti-
fication of keratocyte density by using confocal microscopy in vivo. Invest
Ophthalmol Vis Sci 1999; 40: 320–6.
46. Fitzke FW, Masters BR, Buckley RJ, Speedwell L. Fourier transform analysis
of human corneal endothelial specular photomicrographs. Exp Eye Res
1997; 65: 205–14.
47. Doughty MJ, Müller A, Zaman ML. Assessment of the reliability of human
corneal endothelial cell-density estimates using a noncontact specular mi-
croscope. Cornea 2000; 19: 148–58.
48. Berlau J, Becker HH, Stave J, Oriwol C, Guthoff RF. Depth and age-
dependent distribution of keratocytes in healthy human corneas: a study
using scanning-slit confocal microscopy in vivo. J Cataract Surg 2002; 28:
611–6.
49. Erie JC, Patel SV, McLaren JW et al. Keratocyte density in keratoconus. A
confocal microscopy study. Am J Ophthalmol 2002; 134: 689–95.
50. Mikek K, Hawlina M, Pfeifer V. Comparative study of human keratocyte
density after corneal grafting by using confocal microscopy in vivo. Klin
Monatsbl Augenheilkd 2003; 220: 830–4.
51. Mitooka K, Ramirez M, Maguire LJ et al. Keratocyte density of central human
cornea after laser in situ keratomileusis. Am J Ophthalmol 2002; 133:
307–14.
52. Perez-Gomez I, Efron N. Change to corneal morphology after refractive
surgery (myopic laser in situ keratomileusis) as viewed with a confocal
microscope. Optom Vis Sci 2003; 80: 690–7.
53. Bourne WM. Cellular changes in transplanted human corneas. Cornea 2001;
20: 560–9.
54. Luo L, Liu Z, Chen J et al. Confocal microscopy in transplanted human cor-
neas. Yan Ke Xue Bao 2003; 19: 201–5.
55. Fantes FE, Hanna KD, Waring GO et al. Wound healing after eximer laser
keratomileusis (photorefractive keratectomy) in monkeys. Arch Ophthal-
mol 1990; 108: 665–75.
56. Kratz-Owens KL, Hageman GS, Schanzlin DJ. An in vivo technique for mo-
nitoring keratocyte migration following lamellar keratoplasty. J Refract Cor-
neal Surg 1992; 8: 230–4.
57. Somodi S, Slowik C, Guthoff R. The stromal keratocyte in human and porci-
ne corneas: visualization by conventional and confocal fluorescence mi-
croscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995; 36: Suppl: 299–9.
58. Fini ME. Keratocyte and fibroblast phenotypes in the repairing cornea. Prog
Retinal Eye Res 1999; 18: 529–51.
59. Watson SL, Hollingsworth J, Tullo AB. Confocal microscopy of Thygeson’s
superficial punctate keratopathy. Cornea 2003; 22: 294–99.
60. Kobayashi A, Ohkubo S, Tagawa S, Uchiyama K, Kazuhisa S. In vivo confo-
cal micoscopy in the patients with cornea farinata. Cornea 2003; 22: 578–81.
61. Lopez JD, Benitez del Castillo JM, Lopez CD, Sanchez G. Confocal micro-
scopy in ocular chrysiasis. Cornea 2003; 22: 573–5.
m03.p65 22.5.2004, 4:28450