Pregledni œlanki - Review Articles
Predpisi za pripravke tkivnega inæenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje
Regulative for tissue engineered medical products and somatic cell therapy
Saøa Puhar, Matjaæ Jeras
Povzetek: Tkivno inæenirstvo je novo, hitro se razvijajoœe interdisciplinarno podroœje biotehnologije, ki se ukvarja z izdelavo kliniœno uporabnih celiœnih, tkivnih in organotipskih kultur in vitro. Sem sodi tudi celiœno inæenirstvo, ki predstavlja osnovo za somatsko celiœno zdravljenje s klin-iœno uporabnimi pripravki iz celic, pridobljenimi iz tkiv œloveøkega izvora in gojenih ex vivo. Nenadzorovana uporaba œloveøkih celic in tkiv lahko pri prejemniku povzroœi bolezni in druge neæelene uœinke. Zato mora biti osnovni kriterij vrednotenja in nadzora pripravkov tkivnega inæenirstva ocena tveganja njihove uporabe za bolnika – prejemnika. Prenos nalezljivih bolezni predstavlja nedvomno najveœjo nevarnost pri tovrstnem zdravljenju, poleg tega pa obstaja tudi tveganje zaradi okuæb celiœnih kultur ter izgube tkivno specifiœnih lastnosti celic, do katerih lahko pride med njihovim gojenjem. Zaradi kompleksnosti pripravkov tkivnega inæenirstva in razmeroma omejenih izkuøenj pri njihovi kliniœni uporabi je nujna pravna ureditev podroœja, in sicer tako, da bo zagotovljena kar najveœja stopnja kakovosti, varnosti in uœinkovitosti tovrstnega zdravljenja.
Kljuœne besede: tkivno inæenirstvo, somatske celice, celiœne kulture, celiœno in tkivno zdravljenje.
Abstract:Tissue engineering is a new and rapidly developing interdisciplinary field of biotechnology, dealing with tissues and organs by applying viable cell-, tissue- and organotypic cultures prepared in vitro. Somatic cell therapy is a part of tissue engineering and it encompasses preparation of viable human cells, cultured ex vivo in a way to achieve sufficient number of cells suitable for the re-implantation into recipient. Beside wanted effect, the application of human cells and tissues may cause transferable diseases and other unwanted effects in the patient. Risk estimation for the recipient is therefore the main criteria for their application. Transmission of infectious diseases thus represents the major threat., along with possible contamination of cell cultures and the loss of specific cell characteristics occurring during their in vitro manipulation. Due to the complexity of tissue engineered medical products and the lack of clinical experience following their application it is necessary to thoroughly regulate this field in order to assure quality, safety and effectiveness.
Key words: tissue engineering, somatic cells, cell cultures, cell and tissue therapy.
1 Uvod
Vse bolj poglobljeno poznavanje patofizioloøkih mehanizmov bolezni na molekularni in biokemijski ravni ter intenziven razvoj biotehnologije sta privedla do novih pristopov k zdravljenju bolezni. Tkivno inæenirst-vo je hitro razvijajoœe se interdisciplinarno podroœje, katerega cilji so obnovitev tkiv s pomoœjo æivih celic, ki jim lahko po potrebi dodamo tudi pomoæne snovi in posamezne izbrane biomolekule (1, 2, 3). Æive tkivne nadomestke lahko uporabimo za obnovo, vzdræevanje ali izboljøanje funkcij posameznih tkiv in organov. Ti pripravki se razlikujejo od klasiœnih zdravil ter drugih ustaljenih oblik zdravljenja v tem, da se za stalno vgradijo v telo in nato s svojimi specifiœnimi lastnostmi vplivajo na zdravljenje oziroma lajøanje bolezni ter poøkodb (3).
S tkivnoinæenirskimi postopki pripravljamo avtologne1 ter alogenske2 tkivne in celiœne pripravke, ki lahko vsebujejo tako æive kot mrtve
celice, katerim po potrebi dodamo pomoæne snovi (3). V najoæjem pomenu tkivno inæenirstvo ne obsega genskega zdravljenja, ksenogenskih3 pripravkov ter pripravkov iz celic, katerih bioloøke lastnosti so znatno spremenjene (le-te ureja zakonodaja o zdravilih za napredno zdravljenje) (4, 5).
Veœina danaønjih pripravkov tkivnega inæenirstva sestoji iz dveh kljuœnih sestavin (6):
1. Celic, ki so lahko avtolognega ali alogenskega izvora. Teoretiœno bi lahko uporabljali razliœne vrste celic, a znanstvena in tehnoloøka dognanja tega za sedaj øe ne omogoœajo. Celice predstavljajo »glavno uœinkovino«, njihove lastnosti pa so kljuœne za kakovost, uœinkovitost in varnost konœnih pripravkov.
2.  Pomoænih snovi, pri œemer lahko uporabljamo tako naravne kot umetne bioloøko sprejemljive ter najveœkrat razgradljive, vœasih pa
Saøa Puhar, mag. farm., Educell d.o.o., Letaliøka c. 33, 1000 Ljubljana
dr. Matjaæ Jeras, mag. farm., Center za tipizacijo tkiv, Zavod RS za transfuzijsko medicino, Ølajmerjeva 6, 1000 Ljubljana
1  avtologno: uporaba bolnikovih lastnih celic
2 alogensko: uporaba œloveøkih celic drugega dajalca
3 ksenogensko: uporaba æivalskih celic
194 farm vestn 2005; 56
Predpisi za pripravke tkivnega inæenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje
tudi nerazgradljive materiale. Najpogosteje uporabljamo polimere mleœne in poliglikolne kisline, estre hialuronske kisline, razliœne kola-gene, alginate, hidroksiapatit ipd. Tovrstne pomoæne snovi predstavljajo tridimenzionalno okolje, ki omogoœa razrast celic ter pripravo tkiva ex vivo, poleg tega pa zagotavlja ustrezno trdnost konœnih pripravkov, ki je potrebna za uspeøno implantacijo. Interakcije med celicami in pomoænimi snovmi imajo lahko zelo velik vpliv na uœinkovitost konœne-ga pripravka.
Glede na raznolikost pripravkov tkivnega inæenirstva (razliœna tkiva, medceliœnina, sporoœilne molekule...) je tveganje pri njihovi uporabi razliœno. Najpomembnejøe je povezano s prenosom nalezljivih bolezni, pa tudi s stopnjo bioloøke prenosljivosti ter s samo uœinkovi-tostjo pripravkov (6).
Dodatno tveganje predstavlja tudi sam naœin priprave celic ex vivo, saj lahko pride do spremembe njihovih genotipskih in fenotipskih ter s tem bioloøkih lastnosti, kar je lahko posledica razliœnih naœinov njihove osamitve, gojenja ali celo farmakoloøke obdelave (1, 7).
Glede na stopnjo tveganja pri kliniœni uporabi lahko pripravke tkivnega inæenirstva delimo na dve skupini (6, 5):
1.  Pripravki z nizko stopnjo tveganja: Sem uvrøœamo pripravke iz avtolognih ali alogenskih celic oziroma tkiv œloveøkega izvora, katerih bioloøke lastnosti se z uporabljenimi postopki za njihovo pripravo in vitro niso znatno spremenile. Med takøne varne postopke uvrøœamo rezanje tkiv, mehansko in encimsko osamitev celic, centrifugiranje, liofilizacijo, zamrzovanje ipd. Nasprotno pa lahko uporaba posameznih rastnih in diferenciacijskih dejavnikov ali ekstrakcija zno-trajceliœnih sestavin (mineralov, beljakovin) znatno vplivata na lastnosti celic in tkiv.
2.  Pripravki z visoko stopnjo tveganja (t.i. zdravila za napredno zdravljenje): Sem uvrøœamo pripravke iz œloveøkih avtolognih ali alo-genskih celic in tkiv, katerih bioloøke lastnosti so se med pripravo ex vivo znatno spremenile. Tipiœna primera sta namnoæitev (proliferacija) in antigensko specifiœna aktivacija avtolognih imunsko zmoænih celic ex vivo (npr. za privzeto oziroma adoptivno imunsko zdravljenje) ter uporaba alogenskih celic, zdruæenih z neceliœnimi sestavinami (npr. mikrokapsule, intrinziœni ogrodni nosilci, medicinski pripomoœki). V to skupino sodijo tudi pripravki æivalskega izvora oziroma ksenogenske celice in tkiva.
2 Somatsko celiœno zdravljenje
Pri somatskem celiœnem zdravljenju uporabljamo æive œloveøke avtologne ali alogenske ter æivalske somatske celice, pripravljene ex vivo, in sicer za zdravljenje, preventivno ter diagnostiœno uporabo. Uœinek je lahko lokalen ali sistemski (7, 8, 9).
Pripravke za somatsko celiœno zdravljenje pripravljamo iz æivih somatskih celic, ki jih osamimo iz doloœenih tkiv in jih gojimo tako dolgo, da jih pripravimo v zadostnem øtevilu, potrebnem za uspeøno implantacijo. Celice lahko kombiniramo tudi z neceliœnimi sestavinami in tako omogoœimo zdravljenje v zelo kratkem œasu. (1, 7).
Prednosti somatskega celiœnega zdravljenja so (6):
1. imunosupresija bolnika pri presaditvah avtolognih pripravkov ni potrebna;
2.  dostopnost izhodnega tkiva je obiœajno lahka, poleg tega pa najveœkrat potrebujemo le majhen delœek zdravega tkiva;
3.  omogoœa uœinkovito nadomestitev funkcij poøkodovanega organa ali tkiva;
4.  zagotovljen dolgotrajen uœinek v primerjavi s kroniœno uporabo klasiœnih zdravil.
3 Kontrola kakovosti
Bioloøki pripravki so najveœkrat zelo kompleksni, zato njihove sestave pogosto ne moremo popolnoma opredeliti. Zaradi tega ne moremo vedno ugotoviti prisotnosti doloœenih naœistot, pa tudi konœna kontrola ni vedno uœinkovita, zato jih pogosto opredelimo z nadzorom procesa priprave (postopki izdelave, oprema, prostori in osebje) (8, 10).
Sprva je predelava oziroma priprava celic ex vivo obsegala le njihovo shranjevanje v tekoœem duøiku, postopek, ki so ga izvajali v transfuzijskih bolniøniœnih centrih ali v ustreznih raziskovalnih laboratorijih. V tem obdobju sta bila standardizacija in nadzor postopkov predelave celic zelo omejena in popolnoma prepuøœena izbiri izvajalcev. Danes lahko postopki predelave obsegajo veœ stopenj, npr. razliœne naœine osamitve in selekcije celic, gojenje celic ex vivo, celiœno aktivacijo in diferenciacijo, gensko modificiranje ipd. Vse to pa znatno poveœuje tveganje pri uporabi tovrstnih pripravkov in zato terja poostren nadzor priprave, validacijo uporabljenih postopkov ter ustrezno dokumentiranje (11).
3.1 Pomembni dejavniki, potrebni za razvoj in vrednotenje celiœnih pripravkov
Kljuœni dejavniki pri razvoju in vrednotenju celiœnih pripravkov so: izbira zaœetnega tkiva oziroma dajalcev, predelava celic ex vivo ter shranjevanje (1, 8, 12, 13, 14).
1. Izbor celic
Pri izboru celic so pomembni podatki o vrsti celic oziroma odvzetega tkiva, ki predstavlja njihov vir. Pri dajalcih (æivih ali mrtvih) moramo opraviti vse potrebne medicinske preiskave, s pomoœjo katerih lahko z veliko verjetnostjo predvidimo varnost tako zanje kot za prejemnike ter s tem tudi za uspeh posega.
2. Predelava in shranjevanje celic
Tkiva in celice moramo skladno s sprejetimi in odobrenimi postopki asepiœno odvzeti in jih ustrezno oznaœiti. Minimalne zahteve terjajo, da morajo oznake na vsebnikih nedvoumno oznaœevati izvor bioloøkega vzorca (npr. »œloveøko tkivo«) ter vsebovati identifikacijsko kodo. Iz priloæene dokumentacije in oznak vsebnika morajo biti razvidni tudi morebitni posebni pogoji ravnanja z vzorci.
Nadzor kakovosti uporabljenih materialov in postopkov predelave celic, validacija opreme oziroma celovit nadzor so kljuœnega pomena. Zagotoviti moramo, da bo ravnanje s celicami in vitro potekalo v takønem okolju, ki bo onemogoœalo moænost nastanka okuæb.
Kadar æelimo celiœne pripravke iz enega samega vira (dajalca) pripraviti veœkrat, moramo vzpostaviti sistem tkivne banke za
farm vestn 2005; 56
Pregledni œlanki - Review Articles
somatske celice. Pri tem moramo upoøtevati zahteve za obiœajne celiœne banke in voditi dokumentacijo o izvoru bioloøkega vzorca ter o opravljenih postopkih predelave celic.
3.2 Kontrola kakovosti celiœnih pripravkov
Nadzor kakovosti celiœnih pripravkov lahko smiselno razdelimo na øtiri glavna podroœja (8):
1. preverjanje varnosti celiœnih pripravkov (sterilnost, prisotnost miko-plazem, bakterijskih endotoksinov, virusov), ki nam zagotavlja, da le-ti ne vsebujejo zdravju økodljivih kontaminantov;
2. ugotavljanje œistosti oziroma identifikacije (øtevilo in æivost celic, istovetenje celic – morfologija, zaostale neœistote...) nam zagotavlja, da celiœni pripravki ustrezajo specifikaciji na ovojnini in da ne vsebujejo znanih neœistot;
3. ugotavljanje uœinkovitosti (citotoksiœnost, metabolna aktivnost...) nam zagotavlja vpogled v funkcionalno uœinkovitost celiœnih pripravkov;
4. ugotavljanje stabilnosti (funkcionalna aktivnost po doloœenem œasu) nam zagotavlja, da celiœni pripravki ohranijo svojo uœinkovitost po doloœenem œasu shranjevanja pri doloœenih pogojih.
Zakonsko je trenutno obvezen le vhodni nadzor odvzetega tkiva na oznaœevalce okuæb zaradi prepreœevanja øirjenja nalezljivih bolezni (seroloøki postopki analize dajalca). Preostala kontrola kakovosti pa je prepuøœena presoji posameznega proizvajalca, obstajajo pa doloœe-na priporoœila zlasti glede konœne kontrole kakovosti, vendar ni predpisov o vrstah analiznih metod, ki naj bi jih pri tem uporabljali (2).
Priporoœila skupin za somatsko celiœno zdravljenje glede kontrole kakovosti (15, 16):
1. Vhodna kontrola kakovosti:
•  seroloøka analiza odvzetega tkiva (ugotavljanje okuæbe z virusom hepatitisa B, hepatitisa C, HIV in s povzroœiteljem sifilisa);
•  analiza mikrobne obremenitve vhodnega materiala.
2. Procesna kontrola kakovosti:
•  celiœni genotip (genotipizacija);
•  celiœna morfologija;
•  æivost celic;
•  aseptiœnost celotnega procesa ravnanja s celicami.
3. Konœna kontrola kakovosti:
•  celiœna morfologija;
•  æivost celic;
•  celiœni fenotip;
•  celiœni genotip;
•  mikrobna kontaminacija;
•  apirogenost (bakterijski endotoksini);
•  ostanki snovi, ki se uporabljajo v postopku proizvodnje (antibiotiki, DMSO, tripsin).
Celiœni pripravki imajo omejen rok uporabnosti, zato jih moramo uporabiti v zelo kratkem œasu po izdelavi, tako da pogosto konœne kontrole ni mogoœe izvesti v celoti. Pred uporabo tako izvedemo identifikacijo celic, ostala testiranja pa izvedemo naknadno in nam sluæijo kot potrditev ustreznosti procesa izdelave (8).
4 Pravni vidiki
Podroœje tkivnega inæenirstva je v Evropi pravno øe vedno razmeroma slabo urejeno in vse kaæe, da bo za izdelavo in sprejem ustrezne zakonodaje potrebnih øe kar nekaj let. Zaradi vse pogostejøe kliniœne uporabe pripravkov tkivnega inæenirstva in zelo intenzivnega razvoja tega podroœja je potrebno œim hitreje in kar najbolje opredeliti predvsem zahteve za kakovost (6).
Izkuønje zadnjih desetih let so pokazale, da najveœje tveganje predstavljajo prenos nalezljivih bolezni, bioloøka prenosljivost in uœinkovi-tost, kar je øtevilne dræave spodbudilo k hitrejøemu pravnem urejanju tega podroœja (6, 17).
V Evropski skupnosti posamezne dræave œlanice zelo razliœno urejajo podroœje tkivne tehnologije. Zakoni in pravilniki s podroœja darovanja organov in tkivnih bank so bili do sedaj sprejeti oziroma posodobljeni le v nekaterih œlanicah (6, 17). Junija 2002 je Svet Evrope sprejel odloœitev, da pripravki iz tkiv œloveøkega izvora potrebujejo posebno direktivo, katera je bila sprejeta marca 2004 – Direktiva 2004/23/EC (2, 18).
V Sloveniji trenutno ni specifiœnih zakonov in pravilnikov, ki bi obravnavali celiœne in tkivne pripravke, pripravljene ex vivo. Imamo pa sodoben Zakon o odvzemu in presaditvi delov œloveøkega telesa zaradi zdravljenja (Ur. l. 12/2000) ter pripadajoœe pravilnike, ki urejajo naœin odvzema delov œloveøkega telesa, izbor in pridobivanje dajalcev ter varovanje osebnih podatkov, vodenje evidenc opravljenih odvzemov in presaditev, naœine shranjevanja in prevoz delov œloveøkega telesa ter izmenjavo delov œloveøkega telesa z drugimi dræavami (Ur. l. 53/2002, 70/2003, 75/2003, 131/2003).
4.1 Kriteriji tveganja pri uporabi pripravkov tkivnega inæenirstva
Glavni kriterij razvrøœanja pripravkov tkivnega inæenirstva je ocena tveganja za prejemnika (bolnika). Pripravke z nizko oceno tveganja, pri katerih bioloøke lastnosti celic niso bile znatno spremenjene med njihovo pripravo ex vivo, v celoti urejajo zakoni s podroœja presajanja organov, tkiv in celic (4, 19, 21).
Kadar pripravki vsebujejo celice z znatno spremenjenimi bioloøkimi lastnostmi, predstavljajo le-ti veœje tveganje za prejemnika in zato sodijo pod okrilje zakonov s podroœja zdravil (zdravila za napredno zdravljenje) in medicinskih pripomoœkov (5, 19, 21).
Na tveganje uporabe celiœnih pripravkov pomembno vpliva tudi odnos med dajalcem in prejemnikom tkiva. Pri avtolognih pripravkih je dajalec in prejemnik ista oseba, to pa pomeni veœjo stopnjo varnosti in zato so v tem primeru moæne tudi doloœene izjeme. Tako lahko takøne pripravke uvrstimo med pripravke z nizko oceno tveganja tudi v primeru, ko imajo doloœene lastnosti, zaradi katerih bi jih sicer uvrstili v skupino pripravkov z veœjim tveganjem (11).
farm vestn 2005; 56
Predpisi za pripravke tkivnega inæenirstva in za somatsko celiœno zdravljenje
5  Sklep
Vse pogostejøa terapevtska uporaba œloveøkih celic in tkiv terja œim prejønjo vzpostavitev standardov kakovosti in varnosti z namenom, da bi uœinkovito prepreœili predvsem prenos nalezljivih bolezni, kar predstavlja najveœje tveganje pri tovrstnem naœinu zdravljenja. Tveganju se lahko izognemo s skrbno oceno ustreznosti dajalcev ter z njihovim doslednim testiranjem v skladu z veljavnimi sodobnimi zahtevami in postopki. Hkrati moramo zagotoviti zanesljiv sistem sledljivosti œloveøkih celic in tkiv vse od dajalca do konœnega prejemnika. (2). Med samo predelavo celic predstavlja najveœjo nevarnost zagotovo kontaminacija celiœnih kultur. Zato moramo obvezno preverjati morebitno navzkriæno kontaminacijo posameznih celiœnih kultur ter seveda vrsto in identiteto povzroœiteljev (20).
Vse intenzivnejøa izmenjava tkiv med posameznimi dræavami in regijami terja tudi hitro vzpostavitev skupnih smernic za zagotavljanje kakovosti, varnosti in uœinkovitosti. Zakonodaja in ukrepi regulatornih organov morajo zagotoviti, da bodo imele œloveøke celice in tkiva, pripravljena v razliœnih podroœjih sveta primerljivo kakovost in varnost (2).
6  Literatura
1.    Points to consider on manufacture and quality control of human somatic cell therapy medical products. EMEA 2001, London; CPMP/BWP/41450/98: 1-10.
2.    Directive 2004/23/EC. Official Journal of the European Union, 2004; L102: 46-94.
3.    Need for a legislative framework of Human tissue engineering and tissue-engineered products. European Commission 2002; Consultation document: 1-5.
4.    Proposed Approach to regulation of cellular and tissue-based products. FDA, CBER 1997; 97N-0068: 1-37.
5.    Directive 2003/63/EC. Official Journal of the European Union, 2003: L159; 46-94.
6.    Tissue engineered medical products (TEMPs): A prelude to risk management. RIVM Report 605148 009, 2001: 1-57.
7.    Guidance for Human Somatic Cell Therapy and Gene Therapy, Guidance for Industry. FDA, CBER 1998:1-27.
8.    Guidance on application for products comprised of living autologous cells manipulated ex vivo and intended for structural repair or reconstruction. FDA, CBER 1996; 95N-0200: 1-10.
9.    Directive 2001/83/EC, Annex 1, part IV. European Commission 2001; Working document 2002: 53-57.
10.  Guidance concerning demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products. FDA, CBER, CDER 1996: 1-9.
11.  Burger SR. Current regulatory issues in cell and tissue therapy. Cytotherapy 2003, Vol.5, No.4: 289-298.
12.  Zakon o odvzemu in presaditvi delov œloveøkega telesa zaradi zdravljenja. Uradni list RS, Ljubljana; 12/00:1569-1572.
13.  Pravilnik o naœinu shranjevanja in prevoza delov œloveøkega telesa, namenjenih za presaditev. Uradni list RS, Ljubljana; 70/03:10825-10827.
14.  Pravilnik o naœinu varstva osebnih podatkov dajalcev in prejemnikov delov œloveøkega telesa zaradi zdravljenja. Uradni list RS, Ljubljana 2003; 75/03:11369-11370.
15.  Guidance for the submission of chemistry, manufacturing, and controls information and establishment description for autologous somatic cell therapy products. FDA, CBER 1997; 95N-0200: 1-19.
16.  Opinion on the state of the art concerning tissue engineering. European Commission 2001; SANCO/SCMPMD/2001/0006 Final: 1-15.
17.  Warwick RM, Kearney JN. Safety of human tissues and cells for transplantation. Future Strategies for tissue and organ replacement. Imperial College Press 2002: 381-419.
18.  Human Tissue and cell engineering products. European Commission; Commission’s Consultation paper 2004: 1-12.
19.  Smith DS. Understanding external controls over the commercial introduction of engineered human tissue. Tissue engineering 1999: Vol.26, No 4: 537-548.
20.  Validation of procedures for processing of human tissue intended for transplantation. Guidance for industry. FDA, CBER 2002: 1-3.
21.  Human tissue engineering and beyond: Proposal for a Community regulatory framework on advanced therapies. European Commission 2005; Consultation document: 1-15.
farm vestn 2005; 56