STROKOVNO OURNAL OF 'SLO t t >> L wr///> * r/f * jl//7 v > j Jf Hi J o i t Pot do zdravja f-ía¡ ■■:■■■: sq sai ovi in noim i^udja Sme vt-earc^ü-.o cnaaoio zd*avil i nc^Sirtcr ponuiHM krdatKH :rx> imsa-iiti1*^ tjupo«í eflídvtisvoi ludí v pih>3dn|»i 01 A 70 90 00 | wwwkemcíorrnac¡¡o.5i K KEMOFARMACIJA Farmacevtski vestnik STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE • PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA ŠT. 3 • JULIJ 2009 • LETNIK 60 Odgovorni urednik Borut Štrukelj Častni glavni urednik Aleš Krbavčič Glavna urednica Andrijana Tivadar Uredniški odbor Tajda Gala Miharija Stanko Gobec Katja Gombač Aver Iztok Grabnar Janja Marc Franc Vrečer Izdajateljski svet Stane Srčič Simona Cencelj Boštjan Debelak Mirjana Gašperlin Lili Grosek Mirjam Hočevar Korošec Anamarija Zega Naslov uredništva / Adress of the Editorial Office: Slovensko farmacevtsko društvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana, Telefon (01) 569 26 01 Transakcijski račun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010-0016686585. Izhaja šestkrat letno. Letna naročnina je 70 EUR. Za tuje naročnike 100 US$. Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Naklada: 3.300 izvodov Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published 6 times a year by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 70 EUR other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik is regulary abstracted in: BIOLOGICAL ABSTRACTS, CHEMICAL ABSTRACTS, PHARMACEUTICAL ABSTRACTS, MEDICAL & AROMATIC PLANTS ABSTRACTS AND INBASE / Excerpta Medica UVODNIK Tokratno številko Farmacevtskega vestnika sestavlja pisana paleta sestavkov in člankov iz najširšega področja farmacije in medicine, ki bo popestrila strokovno branje in izobraževanje v poletnih, dopustniških mesecih. Prvi članek avtorjev U. Švajgerja in M. Jerasa predstavlja novo področje, ki ga uspešno razvijajo v laboratoriju doc.dr. Jerasa in predstavlja del sodobnega celičnega zdravljenja, ki bo poleg tkivnega in genskega zdravljenja eden od pomembnih delov bodoče medicine in farmacije. V sestavku o koencimu Q10 je predstavljeno delovanje, vloga in tržišče tega prehranskega dopolnila iz skupine antioksidantov. Temu sledita dva članka iz področja biokemije in fiziologije. Avtorji M. Brunskole, T. Lanišnik Rižner in J. Strojan predstavljajo encimsko skupino dehidrogenaz in reduktaz, ki so vpletene v številne fiziološke in patofiziološke mehanizme, obenem pa so osnovni encimi za metabolizem nekaterih zdravilnih učinkovin in bi lahko služile kot tarča za izdelavo novih učinkovin v bodoče. V sestavku dr. Ferjanove izvemo o regulatorni vlogi Ca2+ ionov pri sproščanju mediatorjev vnetja iz mastocitov, prav tako farmakološki pa je tudi članek S. Obermajer o zdravilih in dezinficientih, ki se uporabljajo za zdravljenje in preprečevanje paradontalnih bolezni. Iz Katedre za farmacevtsko tehnologijo pa prihaja sestavek o sodobnih pristopih k izdelavi trdnih dispenzij, ki omogočajo izboljšano biološko uporabnost učinkovin. Zopet torej mnogo strokovnih novosti. Preberimo jih in poskušajmo razširiti naša strokovna znanja. Tega nam tudi čas recesije ne more vzeti. Z željo po čim lepših dopustniških dnevih vas lepo pozdravljam, Prof.dr. Borut Štrukelj Vsebina Pregledni znanstveni članki - Review scientific articles Urban Švajger, Matjaž Jeras Celična terapija z regulatornimi limfociti T - celice kot zdravila Cell therapy using regulatory T cells - cells playing the role of drugs 143 Janko Žmitek, Katja Žmitek Koencim Q10 kot prehransko dopolnilo in zdravilo Coenzyme Q10 as a Dietary Supplement and Drug 150 Mojca Brunskole, Tea Lanišnik Rižner, Jure Stojan Encimi iz naddružine kratkoverižnih dehidrogenaz/reduktaz kot nove farmakološke tarče Enzymes of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily s new pharmacological targets 159 Ilonka Ferjan Regulatorna vloga Ca2+ ionov pri sproščanju mediatorjev vnetja iz mastocitov The regulatory role of Ca2+ ions in the secretion of inflammatory mediators from mast cells 165 Odon Planinšek Sodobni pristopi k izdelavi trdnih disperzij z izboljšano biološko uporabnostjo učinkovin Contemporary approaches to solid dispersions production with improved drug bioavailability 169 Saša Obermajer Farmakoterapija paradontalnih bolezni Pharmacotherapy of periodontal diseases 177 Iz društvenega življenja 34. skupščina SFD 185 Poročilo o udeležbi na 2. PharmSci Fair v Nici 2009 191 Osebne vesti 192 142 farm vestn 2009; 60 Celična terapija z regulatornimi limfociti T - celice kot zdravila Cell therapy using regulatory T cells - cells playing the role of drugs Urban Švajger, Matjaž Jeras Povzetek: V zadnjih letih je prišlo do velikega napredka v razumevanju biologije regulatornih celic T in načina njihovega delovanja v fizioloških in patofizioloških pogojih. Regulatorne celice T danes uvrščamo med ključne akterje v vzdrževanju imunske homeostaze pri čemer je njihova vloga pri oblikovanju imunskega odziva neizpodbitna. Številna odkritja glede različnih vrst, mehanizmov delovanj, kot tudi razvoj na področju pridobivanja ter manipulacije regulatornih celic T v laboratorijskih pogojih, so sprožila zanimanje za morebitno uporabo regulatornih celic T v terapevtske namene. Imunoterapija z regulatornimi celicami T bi v primerjavi s klasičnimi načini imunosupresije lahko nudila številne prednosti. Kljub obetom, ki jih prikazujejo živalski modeli, pa čakajo prenos tega znanja na ljudi in posledično klinično uporabnost številne prepreke. V tem preglednem članku podajamo najnovejša dognanja na področju regulatornih celic T v smislu njihove uporabnosti za celične terapije. Ključne besede: Regulatorne celice T, Tr1, Treg, celična terapija Abstract: In recent years there has been a major progress in understanding the biology of regulatory T cells and the way they function in physiological and pathophysiological conditions. Today, regulatory T cells are considered cruical players in the maintenance of immune homeostasis and carry an indisputable role in shaping the immune response. Numerous findings revealing various types, mechanisms of action, as well as improved methods of obtaining and manipulating regulatory T cells in laboratory environments, have raised interest in the possibility of using regulatory T cells for therapeutic purposes. Immunotherapy using regulatory T cells could hold many advantages over conventional immunosupression treatments. Despite promising results obtained using animal models, there are still many obstacles in the way of transfering this knowledge to human studies and consequently to clinical use. In this review we summarize the latest findings on regulatory T cells in context of their use for cellular therapies. Keywords: Regulatory T cells, Tr1, Treg, cell therapy 1 Uvod V imunologiji poznamo regulatorne limfocite T že dobri dve desetletji. V zadnjih desetih letih pa se je razumevanje biologije teh celic poglobilo do te mere, da jih danes obravnavamo kot enega od temeljnih dejavnikov, ki so ključni za vzdrževanje imunske homeostaze, in sicer tako v fizioloških kot patofizioloških pogojih. S številnimi raziskavami so nedvoumno dokazali, da sta neustrezno delovanje ali celo odsotnost regulatornih celic T v človeškem organizmu jasno povezana s pojavom avtoimunskih obolenj, medtem ko njihova neokrnjena prisotnost zagotavlja vzpostavitev in vzdrževanje imunske tolerance na telesu lastne in tuje antigene (1-3). Poznamo številne podvrste regulatornih celic T, ki sodijo tako v populacijo CD4+ kakor tudi CD8+ limfocitov T (4). V tem preglednem članku se bomo zaradi obsežnosti področja osredotočili predvsem na dve poglavitni in hkrati najbolj raziskani vrsti regulatornih celic T, ki sta še posebej zanimivi zaradi njune potencialne uporabe za imunske celične terapije. To so CD4+CD25+FoxP3+ regulatorni limfociti T (Treg), ki se med odraščanjem razvijejo v priželjcu kot samostojna celična vrsta in so v posamezniku prisotne že od njegovega rojstva. Prepoznavnost celic Treg je vezana predvsem na njihovo konstitutivno izražanje transkripcijskega dejavnika FoxP3. Druga vrsta regulatornih celic T se oblikuje v periferiji iz naivnih (neaktiviranih, nespominskih) limfocitov CD4+, in sicer pod točno določenimi pogoji. Te tako imenovane regulatorne celice Tri so sposobne proizvajati velike količine imunosupresivnega interlevkina-10 (IL-10), ki igra poglavitno vlogo v zaviranju imunskih odzivov. Obe vrsti celic, Treg in Tri, lahko pridobimo in namnožimo v pogojih in vitro oziroma ex vivo, seveda v specifičnih okoljih, ki jih lahko vzpostavimo v celičnih kulturah. To pa pomeni, da bi tako pripravljene celice ob upoštevanju zahtev dobre proizvodne prakse (GMP), lahko uporabili za terapevtske namene. Prednosti tovrstnih celičnih terapij bi lahko bile, v primerjavi z običajno imunosupresijo, kot jo poznamo danes, številne. Antigensko specifične regulatorne celice bi namreč lahko zavrle prekomerne imunske odzive (kronična vnetna stanja), natanko tam, kjer se dogajajo, torej na točno določenem mestu v telesu, s čimer bi se izognili nespecifični sistemski imunosupresiji, ki povzroča številne neželene učinke. S takšno terapijo različnih avtoimunskih obolenj ter uporabo regulatornih celic T pred in po alogenskih presaditvah tkiv in organov, bi lahko vzpostavili dolgotrajno imunsko regulacijo/toleranco in vivo. Ker bi bile regulatorne Urban Švajger, mag. farm. Zavod RS za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana doc. dr. Matjaž Jeras, mag. farm. Zavod RS za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana celice T pripravljene iz bolnikovih oziroma transplantirančevih lastnih celic, bi s tem odpadla nevarnost aloreaktivnosti in alosenzibilizacije in tako kot smo že omenili, ne bi bilo potrebno uporabljati klasičnih imunosupresivov. Uporabnost imunosupresivnih celičnih terapij je zaradi številnih spodbudnih rezultatov preiskav v živalskih modelih več kot očitna, vendar zaenkrat še vedno obstajajo številne nejasnosti, kdaj in v kolikšni meri bi lahko izsledke tovrstnih predkliničnih študij uporabili pri človeku. Najpomembnejša vprašanja, ki se ob tem porajajo so namreč naslednja: katera vrsta regulatornih limfocitov T bi bila najprimernejša za uporabo v humani celični terapiji, kateri postopek priprave takšnih celic in vitro oz. ex vivo bi bil najvarnejši in najučinkovitejši ter katere človeške bolezni bi bile najprimernejše in najdovzetnejše za takšno obliko zdravljenja. 2 Regulatorne celice T in mehanizmi njihovega delovanja Limfocite T delimo v dve osnovni skupini, in sicer celice CD4+ in CD8+, znane tudi kot celice pomagalke (CD4+) in celice ubijalke (CD8+). Obe skupini vsebujeta številne celične podvrste. Med njimi razlikujemo naivne, ki še niso prišle v stik z antigenom, spominske, aktivirane oziroma efektorske in supresorske oz. regulatorne celice T. Prav zadnje so zaradi sposobnosti nadzorovanja imunskih odzivov v fizioloških in bolezenskih stanjih že nekaj let v središču pozornosti številnih raziskovalcev. Poznamo več vrst regulatornih celic, ki sodijo v obe osnovni skupini limfocitov T, CD4+ in CD8+ (tabela 1). V nadaljevanju bomo podrobneje opisali dve najbolj raziskani vrsti omenjenih celic, in sicer naravno prisotne limfocite Treg, ki jih opredeljuje prisotnost površinsko izraženih molekul CD4+CD25+FoxP3+ ter celice Tri, ki lahko nastanejo na periferiji iz naivnih CD4+ limfocitov T in katerih poglavitna značilnost je obsežno proizvajanje IL-10. Celice Treg nastanejo pri ljudeh po rojstvu v priželjcu in pri odraslem človeku predstavljajo le 510 % vseh CD4+ limfocitov T (5). Ob izplavitvi v periferijo je repertoar njihovih T-celičnih receptorjev (TCR) usmerjen v prepoznavanje organizmu lastnih antigenov. Njihovo proliferacijo v telesu omogoča specifično prepoznavanje lastnih antigenov ob hkratni stimulaciji ko-stimulatorne molekule CD28 in prisotnosti interlevkina 2 (6,7). Za Treg celice je značilno izražanje naslednjih površinskih molekul: CD62L (L-selektin), CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen) ter GITR (Glucocorticoid-Induced Tumour-Necrosis factor Receptor-related protein). Specifični transkripcijski dejavnik FoxP3+je ključnega pomena za imunosupresorsko delovanje celic Treg. V miših, ki so jim odstranili gen za FoxP3, je prišlo do drastičnega upada celic Treg in posledično do hitrega razvoja hude oblike limfoproliferativnega avtoimunskega sindroma. Podobno bolezensko stanje razvijejo posamezniki, ki trpijo za redko recesivno genetsko motnjo imenovano IPEX (Immunedysregulation, Polyendocrinopathy and Enteropathy, X-linked syndrome). Bolezenski znaki pri takšnih bolnikih se kažejo v zelo agresivnem razvoju avtoimunskih obolenj, ki vodijo v zgodnjo smrt. Vse to pa je posledica različnih mutacij v genu za FoxP3 (8). Mehanizem delovanja limfocitov Treg naj bi bil v veliki meri odvisen od tesnih medceličnih stikov, poleg tega pa tudi od sposobnosti Treg, da proizvajajo in izločajo topne imunosupresivne molekule. Danes vemo, da igrata poglavitni vlogi pri zaviranju imunskih odzivov, s strani Treg, CTLA-4 in površinsko vezani transformirajoči rastni dejavnik b (TGF-b) (9,10). Tabela 1: Različni podtipi CD4+ in CD8+ regulatornih celic T Table 1: Various subtypes of CD4+ and CD8+ regulatory T cells Celični tip Mesto izvora Predlagan mehanizem supresije CD4+ celice T CD4+CD25+FoxP3+ Priželjc In vitro: celični kontakt (Treg) celice In vivo: različni mehanizmi delovanja CD4+IL-10+FoxP3- Periferija IL-10, TGF-b (Tr1) celice (ne nastane v vseh primerih) CD4+TGFb+ (Th3) Periferija TGF-b celice CD8+ celice T CD8+CD25+ celice T Priželjc TGF-b in CTLA-4 CD8+CD28- celice T Periferija ILT3, ILT4 CD8+CD62+CD122+ Ni definirano Ni definirano celice T CD8+IL-10+ celice T Periferija IL-10 Celice Tri, za razliko od Treg nastanejo v periferiji iz naivnih CD4+ limfocitov T, za kar pa so potrebni točno določeni pogoji. Eden izmed najpomembnejših dejavnikov, ki vpliva na razvoj celic Tri je citokinsko mikrookolje. Osrednjo vlogo pri tem igra IL-10. Sprva so ga uvrščali med citokine, ki so jih sposobne proizvajati le celice pomagalke vrste Th2 in ob tem ugotovili, da zavira odzive celic pomagalk vrste Thl (11). Danes vemo, da igra IL-10 osrednjo vlogo pri nadzorovanju poteka vnetnih procesov, saj zavira imunske odzive limfocitov T in ohranja vzpostavljeno imunsko toleranco (12). Celic Tr1 zaenkrat ne moremo opredeliti s pomočjo značilnih površinskih molekulskih označevalcev, saj jih do sedaj še niso odkrili, zato pa imajo zelo specifičen profil proizvodnje citokinov. Tako je za celice vrste Th1 značilno izločanje IL-2 in drugih pro-vnetnih citokinov, med katere sodi interferon-g (IFN-g), ki je med drugim močan aktivator makrofagov. Nasprotno pa celice vrste Th2 proizvajajo citokine, ki ključno vplivajo na razvoj protitelesne (humoralne) imunosti: IL-4, IL-5, IL-13 in IL-10. Limfociti Tr1 tvorijo zelo malo oziroma nič IL-4 in IL-2, imajo pa veliko sposobnost proizvajanja IL-10 in v določenih okoliščinah tudi TGF-b (tabela 1) (13). IL-10 predstavlja osrednji mehanizem imunosupresivnega delovanja celic Tr1. Svoj delež k temu prispeva tudi TGF-b, za katerega pa še ni povsem jasno ali ga celice Tr1 lahko proizvajajo v vseh primerih. Imunosupresorski mehanizmi delovanja celic Treg in Tr1 se med seboj sicer razlikujejo, nikakor pa se ne izključujejo. Vezani so na površinsko izražene molekule in biološko aktivne dejavnike, ki jih omenjene celice izločajo v okolje, kot na primer avtokrino in parakrino delujoči citokini, ki delujejo na vrsto imunskih in tkivnih celic v različnih stopnjah njihove aktivacije, kot je v primeru avtoimunega diabetesa prikazano na sliki 1. Slika 1: Imunska regulacija patologije diabetesa tipa 1 z regulatornimi celicami T. p-celične antigene privzamejo dendritične celice in jih posledično predstavijo celicam T v bezgavkah. CD4+ in CD8+ celice T, specifične za omenjen antigen se aktivirajo ter migrirajo nazaj v Langerhansove otočke kjer poškodujejo pankreatične celice. Tako Tri kot Treg celice lahko kontrolirajo patološko aktivnost efektorskih celic T in dendritičnih celic na mnogih stopnjah razvoja bolezni. Figure 1: The pathogenesis of type 1 diabetes and its control by regulatory T cells. p-cell antigens are taken up by dendritic cells which subsequently present these antigens to T cells in the lymph nodes. CD4+ and CD8+ T cells specific for these antigens are activated and afterwards migrate to Langerhans islets where they cause pathology. Tri as well as Treg cells are able to control the pathological activity of effector T cells and dendritic cells through mutiple stages of disease development. 3 Celične imunske terapije Celične terapije lahko definiramo kot uporabo živih človeških ali živalskih celic za popravilo oziroma nadomestilo okvarjenega tkiva. O celični terapiji je pred 500 leti, v svoji knjigi Die Grosse Wundartznei, govoril že Paracelsus. V prakso jo je leta 1931 vpeljal dr. Paul Niehans, ko je namesto transplantacije paratiroidne žleze junca v bolnico zaradi pomanjkanja časa presadek razkosal na drobne delce ter ga dispergiranega v sterilni slanici neposredno injiciral v umirajočo bolnico. Zdravje se ji je hitro izboljšalo in živela je še nadaljnih 30 let. Imunski odzivi so rezultat kompleksnega delovanja različnih vrst celic, makrofagov, dendritičnih celic, CD4+ in CD8+ limfocitov T, limfocitov B, itd. Te medsebojno komunicirajo preko številnih citokinov, kemokinov, hormonov in ostalih sporočilnih oziroma signalizacijskih blomolekul ter tako bodisi pospešujejo ali zavirajo Imunski odziv. Imunski odzivi lahko organizem varujejo pred nevarnimi dejavniki kot so bakterije, virusi in rakave celice, lahko pa organizmu tudi škodijo, v kolikor se usmerijo proti telesu lastnim antigenom (avtoimunost, kronična vnetja). Tudi v primeru alogenske transplantacije pretirana aloimunska odzivnost organizma na presadek ali presadka na prejemnika nikakor ni zaželena, saj lahko resno ogrozi bolnikovo življenje. Pri zdravih ljudeh obstajajo številni mehanizmi takoimenovane osrednje imunske tolerance, ki poskrbijo, da se potencialno nevarni limfociti, tisti katerih T-celični receptor (TCR) prekomerno prepoznava telesu lastne antigene, odstranijo že med samim nastajanjem repertoarja omenjene celične vrste v priželjcu. Navkljub temu pa se v periferijo vedno izplavi nekaj takšnih celic, ki kažejo določeno zvišano mero avtoreaktivnosti. Njihovo aktivacijo imunski sistem preprečuje predvsem z vzpostavljanjem periferne tolerance, s kompleksnim procesom, v katerem igrajo osrednjo vlogo regulatorne celice T. V okviru imunskega sistema torej delujejo različne vrste celic in drugih dejavnikov, ki omogočajo njegovo aktivacijo ali supresijo. Celična terapija z bolnikovimi regulatornimi limfociti T, predhodno pripravljenimi v dovolj velikih količinah in vitro ter nato prenesenimi nazaj v njegov organizem, ne bi predstavljala le nadomestila njihovega premajhnega števila, pač pa tudi dodatno imunsko celično komponento, ki bi lahko uravnotežila prekomerne lokalne ali sistemske imunske odzive. Celice kot terapevtsko sredstvo, bi torej lahko učinkovito in brez neželenih vplivov nadomestile določene farmakološke učinkovine oziroma bi lahko služile kot dopolnilo klasičnim oblikam zdravljenja (adjuvantna terapija). 4 Načini pridobivanja regulatornih celic Tri in CD4+CD25+FoxP3+ limfocitov Treg Za osamitev limfocitov T iz vzorcev periferne krvi ter nato pripravo želenih celic in vitro za njihovo kasnejšo uporabo in vivo, moramo nujno zagotoviti pogoje dobre proizvodne prakse. Vse korake proizvodnje celičnih pripravkov pa morajo spremljati tudi najvišji standardi kontrole kakovosti, vključno s popolno sledljivostjo (slika 2). 4.1 Pomnoževanje celic Treg in vitro Poglavitna ovira pri pridobivanju limfocitov Treg je njihovo zelo majhno število v periferni krvi vsakega posameznika. Celice Treg predstavljajo namreč le 5-10 % celokupnega števila celic CD4+. Najbolj razširjen postopek za izolacijo specifičnih vrst imunskih celic iz periferne krvi je izolacija s pomočjo feromagnetnih kroglic, na katere so vezana specifična protitelesa, ki prepoznavajo značilne površinske molekule na tarčnih celicah. Po dodatku omenjenega reagenta v celično suspenzijo le-to spustimo skozi kolono, ki jo postavimo v močno magnetno polje. To nato zadrži le ciljno populacijo imunskih celic. Odvisno od namena lahko nato uporabimo bodisi zadržane, na feromagnetne kroglice vezane celice, ali pa tiste, ki so neovirano zapustile kolono. Pri osamitvi limfocitov Treg je bistvenega pomena njihova čistost, ki mora biti nad 99%. V nasprotnem primeru namreč obstaja tveganje, da so v pridobljeni celični suspenziji prisotni tudi pred kratkim aktivirani naivni in spominski limfociti T, ki prav tako izražajo CD25. Kadar torej uspemo osamiti ustrezno čisto populacijo celic Treg, jih lahko ustrezno namnožimo in vitro. Značilnost omenjenih celic je, da se v pogojih in vitro precej nerade množijo. Ta problem lahko rešimo tako, da njihove T-celične receptorje (TCR) poliklonsko stimuliramo s protitelesi proti molekulam CD3 in CD28, ki predstavljajo najpomembnejše elemente v kompleksu aktivacijskih molekul T celičnega receptorja, ob tem pa uporabimo zelo visoke koncentracije IL-2. Tako namnoženi limfociti Treg obdržijo svoje imunosupresivne lastnosti ter izražajo pomembne površinske molekule kot sta L-selektin in kemokinski receptor CCR7, ki omogočajo potovanje celic v bezgavke, potem ko jih vrnemo bolniku. Z opisanim postopkom pa žal lahko poleg celic Treg učinkovito namnožimo tudi morebiti prisotne aktivirane in spominske limfocite T, s čimer seveda zmanjšujemo imunosupresivno učinkovitost takšnega pripravka. V prizadevanjih, da bi to preprečili, so do danes uspeli razviti en sam postopek, s katerim so uspeli doseči selektivno proliferacijo celic Treg, in sicer v prisotnosti rapamicina. Rapamicin je imunosupresivna učinkovina, za katero so ugotovili, da v ustreznih koncentracijah omogoča selektivno namnoževanje limfocitov Treg, medtem ko zavira proliferacijo efektorskih in spominskih celic CD4+CD25+ T (14). 4.2 In vitro priprava celic Tri, ki proizvajajo interlevkin-10 Za pripravo celic Tri in vitro potrebujemo naivne CD4+CD45RA+ limfocite T, osamljene iz periferne krvi darovalca oziroma bolnika. To je populacija celic T brez aktiviranih efektorskih CD4+CD25+ in spominskih CD4+CD45RO+ limfocitov T. Poglavitna prednost priprave celic Tr1 pred pripravo limfocitov Treg je v tem, da je v periferni krvi prisotno veliko večje število izhodnih naivnih celic T (do 30% vseh mononuklearnih krvnih celic) kot pa Treg (le okoli 5% vseh CD4+ T limfocitov). Večina CD4+ limfocitov T v periferiji je naivnih, kar pomeni da še niso prišli v stik z antigenom, ki bi ga lahko prepoznali s svojimi specifičnimi TCR. Če želimo iz naivnih limfocitov celic T pripraviti bodisi efektorske ali regulatorne (imunosupresivne) celice Tri, moramo zagotoviti ustrezne specifične pogoje in vitro, s pomočjo katerih lahko usmerjamo njihovo preobrazbo. Pri tem je odločilen izbor citokinov, ki jih med aktivacijo izhodne populacije celic T dodamo v kulturo. Medtem ko razvoj efektorskih celic T pomagalk vzpodbujajo pro-vnetni citokini kot je na primer IL-12, nastanku limfocitov Tri celic botruje zlasti Slika 2: Celosten prikaz razvoja in vrednotenja pridobivanja regulatornlh celic T za uporabo v terapiji. Prikazani so potrebni koraki za pridobitev regulatornih celic T v obliki medicinskega pripravka. Izolacija, diferenciacija, njihova pomnožitev ter končna infuzija v pacienta morajo biti opravljeni ob upoštevanju pravil dobre proizvodne prakse. Figure 2: General display of development and assessement of preparation of regulatory T cells for use in cell therapy. The necessary steps for generation of regulatory T cellc in terms of a medicinal product are shown. Cell isolation, differentiation, expansion along with the final infusion into the patient should be preformed in accordance with good manufacturing practice (GMP). prisotnost IL-10. V splošnem obstajajo trije različni načini priprave regulatornih celic Tri in vitro: 1. S poliklonskim draženjem TCR s protitelesi proti ko-aktivacijskim molekulam CD3 in CD28, ob prisotnosti interlevkina-10 in interferona alfa (IFN-a) (15). V tem primeru se izognemo predhodni pripravi antigen-predstavljajočih celic (APC), konkretno najučinkovitejših med njimi, dendritičnih celic. 2. Z nezrelimi dendritičnimi celicami (DC). Dendritične celice so najpomembnejše APC in lahko v neaktiviranem oziroma nezrelem stanju vzpodbudijo nastanek regulatornih limfocitov T in vitro. Za ta proces potrebujemo 3 do 4 tedne, znotraj katerih v definiranih pogojih gojimo naivne limfocite CD4+ T v prisotnosti nezrelih DC. Tako pripravljene celice Tr1 proizvajajo velike količine IL-10 (16). V nasprotju s prej omenjenim postopkom takšen način indukcije limfocitov Tr1 ni poliklonski. Kadar izberemo dražilne nezrele DC in odzivne naivne celice T različnih oseb, takšne DC aktivirajo le aloantigensko specifične limfocite T, ki proliferirajo in ustrezno diferenciirajo, medtem ko ostale celice propadejo. V primeru, da so dražilne in odzivne celice avtologne, kar pomeni, da pripadajo istemu darovalcu, moramo nezrelim DC dodati specifičen peptid, ki ga nato predstavijo naivnim limfocitom T in pri tem aktivirajo le tiste odzivne klone, ki so sposobni prepoznati takšen antigen, vezan na lastne molekule poglavitnega kompleksa tkivne skladnosti razreda II (HLA- II). Na takšen način so že uspešno pripravili regulatorne limfocite Tr1, ki so specifično zavrli imunske odzive na točno določene avtoantigene, kot sta naprimer GAD65 (diabetes) ali mielinski bazični protein (multipla skleroza) (17,18). 3. S tolerogenimi DC. Na dendritične celice lahko med njihovo diferenciacijo vplivamo z dodatkom različnih imunosupresivnih citokinov, predvsem IL-10, TGF-p ali pa učinkovin kot so kortikosteroidi, vitamin D3 in njegovi derivati (19) ter drugimi proti-vnetno delujočimi učinkovinami (20) in s tem pridobimo takšne APC, ki imajo izrazite imunosupresivne lastnosti. Z njimi lahko učinkovito izzovemo nastanek potentnih in antigensko-specifičnih regulatornih limfocitov T. Takšen način priprave celic Tr1 je vedno bolj aktualen, saj omogoča njihovo pridobitev v mnogo krajšem času kot ob uporabi nezrelih DC. 5 Bolezni, ki bi jih lahko zdravili z regulatornimi limfociti T Predklinične študije na živalih nazorno kažejo, da si v prihodnosti lahko od uporabe regulatornih limfocitov T veliko obetamo, saj so sposobni uravnavati pretiran obseg imunskih odzivov. Dandanes se v kliniki pogosto srečujejo z neželenimi imunskimi odzivi, še posebej pri avtoimunskih obolenjih in alogenskih presaditvah tkiv in organov. Večino predkliničnih študij so do sedaj opravili na miših, in sicer v okviru različnih modelov avtoimunskih obolenj in transplantacij organov ali kostnega mozga (tabela 2). V okviru tovrstnih raziskav so uspešno preprečili nastanek diabetesa tipa 1, multiplo sklerozo oziroma EAE -eksperimentalno izzvani encefalomielitis, revmatoidni artritis, vnetne črevesne bolezni, sistemski lupus eritematozus in številna druga obolenja (17,18,21-28). Enako uspešen je bil prenos regulatornih limfocitov Tr1 oz. Treg v miši, ki so jim presadili alogenski kostni mozeg ali organe (29-32). Na osnovi uspešnih poskusov na živalih si danes prizadevamo za razvoj takšnih protokolov, ki bi omogočali zdravljenje enakih bolezni tudi pri ljudeh. Ovire, s katerimi se srečujemo na poti k temu cilju pa so predvsem tehnične narave in so vezane na razvoj optimiziranih postopkov, ki bi nam omogočali pridobivanje dovolj velikih količin regulatornih limfocitov T v okviru pogojev, ki jih narekuje dobra proizvodna praksa. Alogenska transplantacija kostnega mozga oziroma krvotvornih matičnih celic (KMC) je primer, v okviru katerega številni imunologi predvidevajo uspešno uporabo regulatornih celic T za ublažitev intenzivnih aloimunskih reakcij, ki lahko nastanejo ob takšnem posegu. Gre za tako imenovano reakcijo GvHD (Graft versus Host Disease), ko efektorske aloimunske celice, ki se nahajajo v presajenem darovalčevem kostnem mozgu prepoznajo prejemnikov organizem kot tuj in ga zato napadejo. Za zdravljenje takšnega stanja v tekočih eksperimentalnih kliničnih študijah preučujejo delovanje in učinkovitost poliklonskih regulatornih celic Treg. Tovrstne limfocite T lahko uporabimo tudi za zdravljenje avtoimunskih bolezni, pri čemer pa so tiste, ki so antigensko specifične, dejansko najučinkovitejše, saj lahko z njimi ne le izboljšamo, ampak celo ozdravimo tovrstna patološka stanja. Antigensko-specifične regulatorne celice Tr1, pripravljene v pogojih in vitro, učinkovito zavirajo avtoimunske reakcije zoper naslednje avtoantigene: inzulin in GAD65, ki sta ključna tarčna antigena pri diabetesu tipa I, mielinski bazični protein pri multipli sklerozi ter kolagen vrste II pri revmatoidnem artritisu (33). Zlasti pri diabetesu bi bila takšna zgodnja imunoregulatorna intervencija, ko je delovanje pankreatičnih p-celic še prisotna, ključnega pomena za ohranitev njihove aktivnosti. Uporaba regulatornih limfocitov T bi bila zaradi njihove netoksičnosti oziroma varnosti zelo primerna tudi v primeru alogenskih presaditev organov. Na takšen način bi namreč lahko vzpostavili dolgotrajno imunsko toleranco na presajene aloantigene in s tem zagotovili popoln sprejem transplantov. Večina danes uporabljanih imunosupresivnih učinkovin zaradi svojih nespecifičnih sistemskih učinkov izzove številne nežele reakcije. S pripravo aloantigensko-specifičnih regulatornih limfocitov T in vitro (predvsem Tr1) pa bi lahko doživljenjsko zavirali škodljive aloimunske odzive na različne presadke. Tako naprimer v znanstvenem inštitutu San Raffaele v Italiji preiskujejo možnost imunosupresivnih intervencij z antigensko-specifičnimi limfociti Tr1, in sicer v kombinaciji z imunosupresivi, ki ne vplivajo na aktivnost omenjenih celic (34). Genetske bolezni, ki pogojujejo zmanjšano sposobnost zaviranja imunskih odzivov so prav tako željeni cilj zdravljenja z imunoregulatornimi limfociti T. V primeru recesivne motnje IPEX, kjer gre za mutacije v genu FoxP3, je vzdrževanje imunske homeostaze v telesu močno okrnjeno. V miših s podobnim sindromom so s prenosom avtolognih limfocitov Treg, pripravljenih in vitro, uspešno omilili nastanek številnih avtoimunskih obolenj. Pri ljudeh pa je omenjena situacija veliko bolj zapletena, saj FoxP3 ne izražajo le regulatorne celice T, temveč tudi aktivirani efektorski limfociti T. Podrobnejše poznavanje takšnih in podobnih mehanizmov imunogenetskih motenj je vsekakor bistveno za uspešne terapije na tem področju (35). Tabela 2: Celična terapija imunsko posredovanih bolezni z regulatornimi celicami T je uspešna v številnih živalskih modelih. Table 2: Cell therapy of immune-mediated diseases using regulatory T cells has met with success in many animal models. Bolezen Vrsta regulatornih celic T Živalski model Učinek na bolezen Viri Avtoimune bolezni Diabetes tipa 1 CD4+CD25+FoxP3+ celice specifične za BDC2.5 antigen Tr1 celice specifične za GAD65 antigen NOD.Rag-'- miši s prenesenimi diabetogenimi celicami T NOD.SCID miši s prenesenimi diabetogenimi celicami T Preprečitev bolezni Preprečitev bolezni 21 17 Multipla skleroza OVA-specifične Tr1 celice Miši, imunizirane s homogenatom hrbtenjače Preprečitev inducirane bolezni 18 Revmatoidni artritis CD4+CD25+FoxP3+ celice Miši - artritis induciran s kolagenom Preprečitev napredovanja bolezni v zgodnji fazi 25 Vnetne črevesne bolezni CD4+CD25+FoxP3+ celice OVA-specifične Tr1 celice Imunokompromirane miši s prenesenimi patološkimi celicami T Imunsko oslabljene miši s prenesenimi patološkimi celicami T Ozdravitev že vzpostavljene bolezni Preprečitev nastanka bolezni 27 26 Sistemski lupus eritematozus Iz priželjca izolirane CD4+CD25+FoxP3+ celice Mišji model Vzpostavljen nadzor nad patološkim procesom 28 Transplantacije Graft-versus-host-disease (GVHD) CD4+CD25+FoxP3+ celice Presaditev alogenskega kostnega mozga pri miših Preprečitev smrti zaradi GVHD 29 Aloantigensko-specifične Tr1 celice Presaditev alogenskega kostnega mozga pri miših Preprečitev smrti zaradi GVHD 30 Zavrnitev presajenega organa CD4+CD25+FoxP3+ celice pomnožene ex vivo Presaditev alogenih pankreasnih otočkov pri miših Preprečena zavrnitev presadka 32 Tr1 celice inducirane in vivo Presaditev alogenih pankreasnih otočkov pri miših Preprečena zavrnitev presadka 31 6 Zaključek Regulatorni limfociti T so bili na področju imunologije še nedolgo tega deležni le malo zanimanja, v zadnjih letih pa so se uveljavili kot poglavitni regulatorji imunskih odzivov in danes predstavljajo obetajoče dejavnike, namenjene zdravljenju imunsko pogojenih bolezni. Celične terapije avtoimunskih in kroničnih vnetnih bolezni, kakor tudi imunomodulacije poteka alogenskih transplantacij predstavljajo nove terapevtske pristope, ki bi lahko v mnogočem presegli ustaljene načine zaviranja neželenih oziroma prekomernih učinkov delovanja imunskega sistema. Poglavitna slabost uporabe klasičnih imunosupresivov, kot so kortikosteroidi, ciklosporin, rapamicin in ostalih je namreč v tem, da poleg številnih ostalih stranskih učinkov, nespecifično in na splošno zavirajo imunsko reaktivnost, kar lahko vodi v večjo dovzetnost za infekcije in večje tveganje za nastanek malignih obolenj. Z uporabo antigensko specifičnih, avtolognih, torej posameznemu bolniku ali prejemniku presadka lastnih regulatornih celic T, pripravljenih in vitro, pa bi se v celoti izognili vsem omenjenim neželenim učinkom. Kljub tako obetajočim napovedim oziroma pričakovanjem pa še vedno obstajajo številna vprašnja, na katera bomo morali odgovoriti, preden bomo začeli regulatorne limfocite T uporabljati v humani medicini. Eno od najpomembnejših je vsekakor tehnična izvedba priprave tovrstnega celičnega terapevtskega sredstva. Tako bo naprimer osamitev zadostne izhodne količine CD4+CD25+FoxP3+ limfocitov Treg, zaradi njihovega zelo omejenega števila v periferni krvi vedno težavna, še zlasti pri bolnikih z avtoimunskimi boleznimi, pri katerih naj bi bilo njihovo število še manjše. Regulatorne celice Tr1 lahko, kot smo že omenili, pridobimo iz naivnih CD4+ limfocitov T, ki jih je v perifernem krvnem obtoku dovolj, vendar pa zaenkrat še nimamo na razpolago dovolj učinkovitih protokolov, s katerimi bi lahko v razmeroma kratkem časovnem obdobju pripravili obsežne populacije tovrstnih antgensko-specifičnih celic in vitro. Ne glede na vrsto in začetno število izhodnih populacij limfocitov T, jih bo v vsakem primeru potrebno zelo učinkovito gojiti, funkcijsko usmerjati in pomnoževati ter pri tem ves čas izpolnjevati zahteve in pogoje, ki jih narekuje dobra proizvodna praksa. Poleg tega je, v nasprotju s transgenimi mišmi, pri ljudeh prisotna izrazita inter-individualna biološka variabilnost. Pri tem moramo omeniti zlasti razlike v izjemno polimorfnih genih in molekulah HLA (Human Leukocyte Antigens), ki sodijo v poglavitni kompleks tkivne skladnosti in ki pogojujejo učinkovitost predstavljanja, tako telesu lastnih kot tujih antigenov, limfocitom T. To dejstvo seveda še dodatno povečuje zahtevnost priprave učinkovitih antigensko-specifičnih regulatornih celic T. In nenazadnje, laboratorijska oprema, visoko izobraženo in specializirano osebje in vsi potrebni reagenti, ki jih potrebujemo za izdelavo celičnih terapevtikov, predstavljajo velik finančni zalogaj. Kljub številnim zahtevnim izzivom pa ostaja področje raziskav optimalne priprave, delovanja in potencialne klinične uporabe regulatornih limfocitov T še naprej zelo aktualna tema. O tem priča izjemno veliko število znanstvenih publikacij, ki so bile na tem področju objavljene v zadnjih nekaj letih. K temu pa je in bo tudi v prihodnje, po svojih najboljših močeh, prispevala tudi naša raziskovalna skupina. Avtorji se želijo zahvaliti Tomažu Dolinarju za grafično oblikovanje prispevka. 7 Literatura 1. Salomon B, Lenschow DJ, Rhee L et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 2000; 12: 431-440 2. Malek TR, Bayer A. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nature Rev. Immunol. 2004; 4: 665-674 3. Brunkow ME, Jeffery EW, Hjerrild KA et al. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat. Genet. 2001; 27: 6873 4. Schevach EM. From vanilla to 28 flavors: multiple varieties of T regulatory cells. Immunity 2006; 25: 195-201 5. Sakaguchi S, Setoguchi R, Yagi H et al. Naturally arising FoxP3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in self-tolerance and autoimmune disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2006; 305: 51-66 6. Lerman MA, Larkin J, Cozzo C et al. CD4+CD25+ regulatory T cell repertoire formation in response to varying expression of a neo-self-antigen. J. Immunol. 2004; 173: 236-244 7. Tang Q, Henriksen KJ, Boden EK et al. CD28 controls peripheral homeostasis of CD4+CD25+ regulatory T cells. J. Immunol. 2003; 171: 3348-3352 8. Walker MR, Kasprowicz DJ, Gersuk VH et al. Induction of FoxP3 and acquisition of T regulatory activity by stimulated human CD4+CD25- T cells. J. Clin. Invest. 2003; 112: 1437-1443 9. Bluestone JA, Abbas AK. Natural versus adaptive regulatory T cells. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 253-257 10. Tanq Q, Boden EK, Henriksen KJ et al. Distinct roles of CTLA-4 and TGF-b in CD4+CD25+ regulatory T cell function. Eur. J. Immunol. 2004; 34: 29963005 11. Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF et al. Homology of cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) to the Epstein -Barr virus gene BCRFI. Science 1990; 248: 1230-1234 12. Moore KW, de Waal-Malefyt R, Dang MN et al. Interleukin-10 and the Interleukin-10 receptor. Annu. Rev. Immunol. 2001; 19: 683-765 13. Battaglia M, Gregori S, Bacchetta R et al. Tr1 cells: From discovery to their clinical application. Semin. Immunol. 2006; 18: 120-127 14. Battaglia M, Stabilini A, Roncarolo MG. Rapamycin selectively expands CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood 2005; 105: 4743-4748 15. Levings MK, Sangregorio R, Galbiati F et al. IFN-a and IL-10 induce the differentiation of human type 1 T regulatory cells. J. Immunol. 2000; 166: 5530-5539 16. Jonuleit H, Schmitt E, Schuler G et al. Induction of interleukin 10-producing , nonproliferating CD4+ T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 1213-1222 17. Chen C, Lee WH, Yun P et al. Induction of autoantigen-specific Th2 and Tr1 regulatory T cells and modulation of autoimmune diabetes. J. Immunol. 2003; 171: 733-744 18. Barrat FJ, Cua DJ, Boonstra A et al. In Vitro generation of interleukin 10-producing regulatory CD4+ T cells is induced by immunosuppressive drugs and inhibited by T helper type 1 (Th1)- and Th2-inducing cytokines. J. Exp. Med. 2002; 195: 603-616 19. Morelli AE, Thomson AW. Tolerogenic dendritic cells and the quest for transplant tolerance. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 610-621 20. Svajger U, Vidmar A, Jeras M. NFA renders dendritic cells tolerogenic and up-regulates inhibitory molecules ILT3 and ILT4. International Immunopharmacology 2008; 8: 997-1005 21. Tang Q, Henriksen KJ, Bi M et al. In Vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 2004; 199: 1455-1465 22. Tarbell KV, Yamazaki S, Olson K et al. CD25+CD4+ T cells, expanded with dendritic cells presenting a single autoantigenic peptide, suppress autoimmune diabetes. J. Exp. Med. 2004; 199: 1467-1477 23. Masteller EL, Warner MR, Tang Q et al. Expansion of functional endogenous antigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells from nonobese diabetic mice. J. Immunol. 2005; 175: 3053-3059 24. Ding Q, Lu L, Wang B et al. B7H1-Ig fusion protein activates the CD4+ IFN-g receptor+ type 1 T regulatory subset through IFN-g-secreting Th1 cells. J. Immunol. 2006; 177: 3606-3614 25. Morgan ME, Flierman R, van Duivenvoorde LM et al. Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells. Arthritis Rheum. 2005; 52: 2212-2221 26. Groux H, O'Garra A, Bigler M et al. A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis. Nature 1997; 389:737-742 27. Mottet C, Uhlig HH, Powrie F. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+ regulatory T cells. J. Immunol. 2003; 170: 3939-3943 28. Scalapino KJ, Tang Q, Bluestone JA et al. Suppression of disease in New Zealand Black/New Zealand White lupus-prone mice by adoptive transfer of ex vivo expanded regulatory T cells. J. Immunol. 2006; 177: 1451-1459 29. Taylor PA, Lees CJ, Blaazar BR. The infusion of ex vivo activated and expanded CD4+CD25+ immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood 2002; 99: 3493-3499 30. Zeller JC, Panoskaltsis-Mortari A, Murphy WJ et al. Induction of CD4+ T cell alloantigen-specific hyporesponsiveness by IL-10 and TGF-b. J. Immunol. 1999; 163: 3684-3691 31. Battaglia M, Stabilini A, Draghici E et al. Rapamycin and interleukin-10 treatment induces T regulatory type 1 cells that mediate antigen-specific transplantation tolerance. Diabetes 2006; 55: 40-49 32. Gregori S, Casorati M, Amuchastegui S et al. Regulatory T cells induced by 1a,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. J. Immunol. 2001; 167: 1945-1953 33. Roncarolo MG, Battaglia M. Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to self antigens and alloantigens in humans. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7: 585-598 34. Spletna stran: http://www.sanraffaele.org/static/upl/Sc/SciRep2007.pdf 35. Bacchetta R, Passerini L, Gambineri E et al. Defective regulatory and effector T cell functions in patients with FOXP3 mutations. J. Clin. Invest. 2006; 116: 1713-1722. Koencim Q10 kot prehransko dopolnilo in zdravilo Coenzyme Q10 as a Dietary Supplement and Drug Janko Zmitek, Katja Zmitek Povzetek: Koencim Q10 (CoQ10) ima nenadomestljivo vlogo prenašalca elektronov med kompleksi mitohondrijske dihalne verige ter aktivnega nosilca protonov prek notranje mitohondrijske membrane, s čimer sodeluje v procesu nastajanja gradienta protonov in sinteze ATP. CoQ10 je hkrati tudi edini endogeni maščobotopni antioksidant v telesu. Del ga zaužijemo tudi s hrano. Njegova biološka vloga temelji na redoks ravnotežju med (oksidirano) ubikinonsko in (reducirano) ubikinolno obliko, med katerima neprestano prehaja. Redoks stanje zaužitega CoQ10 (ubikinon / ubikinol) ne vpliva na njegovo funkcijo v telesu. Študije kažejo, da se koncentracije celokupnega CoQ10 v najaktivnejših telesnih organih s staranjem zmanjšujejo, raziskovalci pa so pokazali tudi pozitiven prispevek dodajanja CoQ10 pri različnih zdravstvenih stanjih. Ker se zaradi svojih fizikalnih lastnosti tako ubikinon kot ubikinol zelo slabo absorbirata iz prebavnega trakta, je potrebno posebno pozornost posvečati biodostop-nosti proizvodov. Prvi večji korak za povečevanje biodostopnosti CoQ10 predstavlja razvoj oljnih suspenzij (mehkih kapsul) z ubikinonom in kasneje ubikinolom, nadaljnjega pa razvoj vodotopnih oblik CoQ10. Predstavljen je tudi pregled izdelkov s CoQ10 na slovenskem tržišču. Ključne besede: CoQ10, ubikinon, ubikinol, biorazpoložljivost, biodostopnost, varnost, koencim Q10 Abstract: Coenzyme Q10 is a lipophilic compound playing an important role in the mitochondrial respiratory chain, where it acts as an electron carrier and as a carrier of proton transfer across membranes. It is also well known for its antioxidant properties. In the body CoQ10 mostly has an endogenous origin and is only partly derived by food. The biological role of CoQ10 is built on its redox equilibrium and continuous transformation between (oxidised) ubiquinone and (reduced) ubiquinol forms. Its function in the body is not affected by the form in which it is consumed. A decline in CoQ10 levels can be observed with increasing age, especially in the most active organs, while the beneficial effect of supplementation has been observed in many medical conditions. Due to its physical properties CoQ10 is very poorly absorbed from the gastrointestinal tract. Oil suspensions (soft-gel capsules) of ubiquinone and later ubiquionol represent the first important steps in increasing the bioavailability, while a further breakthrough was achieved with the development of water-soluble forms. An overview of CoQ10 products available on the Slovenian market is presented. Key words: CoQ10, ubiquinone, ubiquinol, bioavailability, safety, coenzyme Q10 1 Uvod Koencimi Q so lipofilne molekule, ki so naravno prisotne v vsaki živi celici, zaradi njihove velike razširjenosti v naravi (ubikvitete) pa jih imenujemo tudi ubikinoni (1). Kemijsko gre za 2,3-dimetoksi-5-metil-6-poliizoprenil-1,4-benzokinone, ki jih poimenujemo glede na dolžino poliizoprenske verige: stranska veriga koencima Q10, sicer najpogostejše oblike v človeku in večini sesalcev, je tako sestavljena iz 10 izoprenskih enot. Prvič so ga izolirali leta 1957 v okviru raziskav mitohondrijskega transportnega sistema, v naslednjih letih pa so potrdili tudi njegovo ključno vlogo v procesih oksidativne fosforilacije (1). Pomembne raziskave za razumevanje vloge koencima Q10 v celičnih energetskih procesih je vodil Peter D. Mitchell, ki je leta 1978 za svoje delo prejel Nobelovo nagrado. Koencim Q10 je amfifilna molekula, ki ima zaradi dolge nepolarne stranske verige močno prevladujoč lipofilni značaj. Zato se v telesu pojavlja le v treh oblikah: v micelnih agregatih, v lipidnih membranah, ali vezan na proteine (2). Večinoma se nahaja v membranah mitohondrijev, medtem ko je v citosolu le okrog 10% skupnega koencima Q10 (2). Vse biološke funkcije CoQ10 temeljijo na njegovem redoks ravnotežju, saj relativno enostavno prehaja med (polno oksidirano) ubikinonsko, semikinonsko in (polno reducirano) ubikinolno obliko (Slika I), pri čemer redoks potencial ubikinon/ubikinol [Em(70)] znaša okrog 0,1 V (1). Za enostavnejšo obravnavo v tem prispevku je termin koencim Q10 (CoQ10) uporabljen za ravnotežno zmes, medtem ko sta termina ubikinon in ubikinol uporabljena, ko govorimo neposredno o oksidirani oz. reducirani obliki. doc. dr. Janko Zmitek, univ. dipl. kem., Visoka šola za storitve, Cesta na Brdo 69, Ljubljana (e-naslov: janko.zmitek@vist.si) dr. Katja Zmitek, univ. dipl. kem., Institut »Jožef Stefan« in Visoka šola za storitve (trenutni naslov) Slika I: Redoks stanja koencima Q10 Figure I: Redox forms of coenzyme Qm Medtem ko je CoQ10 koencim različnim membranskim encimom, je najbolje raziskana njegova ključna vloga v kompleksih mitohondrijske dihalne verige: NADH-CoQ10 reduktazi (kompleksu I), sukcinat-CoQ10 reduktazi (kompleksu II) in ubikinol-citokrom c reduktazi (kompleks III) (2). Ima zelo pomembno vlogo prenašalca elektronov med navedenimi kompleksi in tako sodeluje pri nastajanju membranskega gradienta protonov, potrebnega za delovanje ATP sintaze. Ker sta za redukcijo ubikinona v ubikinol poleg dveh elektronov potrebna tudi dva protona, bi bil CoQ10 lahko v proces nastajanja gradienta protonov vključen tudi neposredno, če bi redukcija in oksidacija CoQ10 potekali na nasprotni strani membrane (3). Slednje je bilo z veliko verjetnostjo potrjeno pri kompleksu III, medtem ko mehanizem uporabe redoks energije za prenos protonov preko notranje mitohondrijske membrane v komplesih I in II še ni povsem jasen (2). Za natančnejši opis vloge CoQ10 v mitohondrijskih procesih priporočamo ogled preglednega članka na to temo, ki so ga pred kratkim pripravili Lenaz in sodelavci (2). Znano je, da procesi oksidativne fosforilacije (še posebej v kompleksih I in III) predstavljajo največji izvor reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS, reactive oxygen species), npr. peroksidov in radikalov (2). Ireverzibilna škoda, ki jo le-te povzročajo na različnih biološko pomembnih molekulah v celicah, je tesno povezana s procesi staranja. Zelo Slika II: Položaj redoks ravnotežja CoQ10 v različnih organih in plazmi (7) Figure II: CoQ10 redox equilibrium in different organs and plasma (7) pomembno lastnost CoQ10 zato predstavljajo njegove antioksidativne lastnosti. CoQ10 je ključna komponenta telesnega obrambnega mehanizma zoper ROS, saj je edini endogeni maščobotopni antioksidant (4). Pri tem ne gre zanemariti, da ga je največ prav v mitohondrijih, glavnem izvoru ROS (4). Dokazano je bilo tudi njegovo sinergistično delovanje z drugimi antioksidanti, npr. a-tokoferolom (5). Koncentracije CoQ10 so v različnih delih telesa zelo različne; največ ga je v najbolj aktivnih organih, t.j. v srcu, ledvicah in jetrih (6). Tudi položaj redoks ravnotežja CoQ10 je v različnih delih telesa različen. Tako je npr. v plazmi in ledvicah ravnotežje pomaknjeno v smeri reducirane oblike, medtem ko se v možganih in pljučih CoQ10 nahaja pretežno v obliki ubikinona (Slika II). 2 Pomanjkanje in klinična raba V človeškem telesu je skupaj okrog 2 grama CoQ10; njegov povprečni razpolovni čas je 4 dni in telo ga dnevno nadomesti okrog 0,5 g predvsem z endogeno sintezo, deloma pa tudi s hrano (6,8). V splošnem je pomanjkanje CoQ10 v telesu lahko posledica motnje v biosintezi, pomanjkljivega vnosa s hrano, ali pa prevelike porabe v organizmu (9). Njegova biosinteza se začne iz tirozina preko kaskade osmih aromatskih prekurzorjev, v proces pa je vključenih tudi več vitaminov: C, B2, B6, B12, folna kislina, niacin in pantotenska kislina (10). Učinkovitost sinteze s staranjem telesa pada, še posebej velik padec koncentracije CoQ10 pa so opazili v najaktivnejših organih (Slika III) (6). Tako se npr. koncentracija v srcu začne nižati že po 20. letu (110 mg/kg) in se do 80 leta zniža za skoraj 60% (47 mg/kg) (6). Tudi v vranici se v enakem obdobju koncentracija zmanjša za 60%, medtem ko je zmanjšanje v ledvicah in jetrih nekaj manjše (35 oz. 17%). Endogena sinteza CoQ10 je lahko zmanjšana tudi pri rednih uživalcih inhibitorjev HMG-CoA reduktaze, zdravil za zniževanje holesterola (statinov) (11). Statini namreč kompetitivno inhibirajo tvorbo mevalonata, ki je prekurzor tako pri biosintezi holesterola kot koencima Q10, kar je verjetno povezano z nastankom statinskih miopatij (11). Pomanjkanje CoQ10 so opazili tudi v različnih bolezenskih stanjih (12), pri ljudeh z neuravnoteženo prehrano in kadilcih (13). Pomembno vlogo koencima Q10 v klinični rabi sta pred nedavnim v slovenski strokovni literaturi že predstavila Pavlin (14) in Rus (9), zato je v tem prispevku ne bomo podrobneje obravnavali. Dobro poznana je sicer uporaba Q10 pri srčnem popuščanju, kasneje pa so ga kliniki Preglednica I: Vsebnost CoQ10 v nekaterih živilih (18) Table I: CoQ10 content in various foods (18) Slika III: Starostno povezane spremembe koncentracije CoQ10 v nekaterih človeških organih (6) Figure III: Age-related changes in concentrations of CoQ10 in selected human organs (6) kot pomožno zdravilo začeli uporabljati tudi pri mnogih drugih stanjih, npr. pri Parkinsonovi bolezni, akutnem infarktu, migreni, esencialni hipertenziji, Alzheimerjevi bolezni, Friedreichovi ataksiji, statinski miopatiji, makularni degeneraciji, neplodnosti moških, diabetesu, periodontitisu in v kombinaciji s kemoterapijami (14). Indikacijsko območje za klinično rabo se je v zadnjih letih močno razširilo, tudi na področja, kjer nimamo uspešnih zdravil. Objavili so prispevek CoQ10 k zmanjšanju oksidativnega stresa v koži (15), pred kratkim pa tudi prva poročila o njegovih potencialnih vplivih na zaviranje nastanka katarakte (16) ter zmanjšanje možnosti za preeklampsijo med nosečnostjo (17). Za zanesljivo potrditev vpliva CoQ10 na preprečevanje ali zdravljenje različnih bolezni bo potrebno opraviti še več dobro načrtovanih kliničnih raziskav. 3 Eksogeni koencim Q10 in hrana Z upadanjem učinkovitosti endogene sinteze postaja pomembnejši eksogeni vnos. Najbolj logičen zunanji vir je hrana, vendar raziskave kažejo, da je takšen vnos zaradi nizke naravne vsebnosti CoQ10 v živilih majhen. V razvitem svetu dnevno človek, ki uživa uravnoteženo in raznovrstno hrano, zaužije povprečno le 3-6 mg koencima Q10 (18). Doslej znane študije vsebnosti koencima Q10 v hrani je pred kratkim celovito pregledal Pravst s sodelavci(18); ugotovili so, da na vsebnost CoQ10 v živilih precej vpliva tudi geografsko poreklo. Vsebnost CoQ10 v izbranih živilih je prikazana v Preglednici I. S koencimom Q10 so najbogatejši rdeče meso (govedina do 40 mg/kg) in migrirajoče ribe (sardine do 64 mg/kg); opazili so pomembne razlike med posameznimi deli živali. Bogati so tudi oreščki (arašidi 27 mg/kg) in rastlinska olja (olivno do 160 mg/kg). Mnogo manj CoQ10 lahko najdemo v mleku in mlečnih izdelkih, zlasti v tistih z manj maščobami (do 2 mg/kg), v sadju in zelenjavi ga je večinoma pod 5 mg/kg. Med slednjimi so najbogatejši peteršilj (do 26 mg/kg), cvetača (do 9 mg/kg) in avokado (10 mg/kg). V splošnem je opaziti večjo vsebnost CoQ10 v živilih z več maščobami, opazne pa so tudi razlike glede na pridelavo in tehnološko obdelavo. Podatki kažejo, da se s predelavo živil, zlasti z odstranjevanjem Hrana Konc. CoQ10 [mg/kg] Meso - govedina 16-40 - svinjina 13-45 - perutnina 8-25 Ribe - sardine 5-64 - skuše (rdeče meso) 43-67 - skuše (belo meso) 11-16 Olja - koruzno (Italija) 106-139 - olivno (Italija) 109-160 - sončnično (Italija) 10-15 Oreščki - arašidi 27 - orehi 19 - mandlji 5-14 Zelenjava - peteršilj 8-26 - brokoli 6-9 - cvetača 2-7 Sadje - avokado 10 - črni ribez 3 - jagode 1 zmanjšuje. Razlike v objavljenih vsebnostih CoQ10 v enakih živilih so precejšnje, razlog za to pa bi lahko bil tudi v različnih uporabljenih analitskih metodah. Podatke je zato potrebno obravnavati previdno, tiste, ki se ne nanašajo na točno določen izdelek oz. vzorec, pa jemati zgolj kot orientacijske. Z običajnim načinom prehranjevanja ni mogoče zadostiti povečanim potrebam po CoQ10, še zlasti ne z nizkomaščobno hrano. Zato so se na tržišču pojavila funkcionalna živila, obogatena s tem koencimom, s katerimi je mogoče za nekajkrat povečati njegov povprečni naravni dnevni vnos v telo. 4 Dodajanje koencima Q10 V zadnjih letih so pravi razmah doživeli formulirani izdelki s CoQ10 v različnih farmacevtskih oblikah, s katerimi lahko v telo vnašamo precej večje količine tega koencima, kot to lahko dosežemo s hrano. 4.1 Absorpcija in prenos CoQ10 Koencim Q10 je rumena kristalinična snov s tališčem okrog 50°C in relativno veliko molekulsko maso (Mr = 863) (1). Zaradi svoje kemijske zgradbe je netopen v vodi, hkrati pa je omejena tudi njegova topnost v lipidih. Posledično se zelo slabo absorbira iz prebavnega trakta. Učinkovitost absorpcije je odvisna od več dejavnikov, tudi od načina zaužitja in odmerka CoQ10. Absorpcijo lahko povečamo s hkratnim uživanjem hrane (19) in z delitvijo enega večjega na več manjših maščob, v katerih se koencim Q10 raztaplja, njegova vsebnost odmerkov CoQ10tekom dneva (20). Studije na glodalcih so p°kazale Preglednica II: Delež odmerka CoQ10 v plazmi po zaužitju v času najvišje koncentracije Table II: The amount of CoQ10 in plasma following a single oral dose at the time of the peak plasma level Zaužita oblika CoQ10 Delež odmerka v plazmi v času tmax Referenca obrok, pripravljen iz svinjskega srca (hrana) 3,9% (2S) kristalinični CoQ10 0,2-1,6% (24,25) oljne suspenzije ubikinona 1,6-3,6% (25,26) oljne suspenzije ubikinola 1,8-2,6% (24,27) CoQ10 v obliki vodotopnega Q10CD kompleksa (slika IV) 4,5-4,8% (26) Opomba: Predpostavljen volumen plazme 2,5L. le 2-3% absolutno absorpcijo CoQ10(21), pri ljudeh pa je nekoliko višja - predvidoma nekje do 10% (22). Učinkovitost absorpcije CoQ10 je zelo odvisna tudi od oblike, v kateri učinkovino zaužijemo. Rezultati farmakokinetičnih študij na ljudeh so pokazali, da je v krvi v času maksimalne krvne koncentracije CoQ10 (tmax) navadno do 5% zaužitega odmerka CoQ10 (nekaj primerov je navedenih v Preglednici II) -najmanj v primeru kristalinične učinkovine (0,2-1,6%), in največ po zaužitju vodotopnih oblik CoQ10 (4,5-4,8% za vodotopni Q10CD kompleks). Poudariti je potrebno, da izračunane vrednosti predstavljajo le stanje v izbranem času (tmax) in jih zato ne smemo obravnavati kot približke absolutne absorpcije, temveč le kot njen minimum. prebavni trakt iml.i jetra "li- za nekatere druge v vodi netopne snovi. Kot smo že omenili Ima na absorpcijo CoQ10 največji vpliv uporabljena oblika učinkovine oz. formulacija proizvoda. Oljne suspenzije ubikinona Za povečevanje absorpcije in s tem biodostopnosti so raziskovalci uporabili različne strategije v smeri optimizacije formulacij in razvoja novih oblik CoQ10 (29). Pogost princip v takšnih primerih je zmanjševanje delcev do mikro in nano velikosti, vendar v tem primeru tak pristop ni bil učinkovit. Prvi uspešni pristop je bila tvorba suspenzij v različnih oljih (mehke kapsule), pri čemer na povečevanje absorpcije CoQ10 iz teh izdelkov pomembno vplivajo mnogi dodatki, npr. emulgatorji, kot je pokazal npr. Weis s sodelavci z raziskavami vpliva formulacije in dodatkov na biodostopnost CoQ10. Mehke želatinske kapsule s CoQ10 v sojinem olju z dodatki polisorbata 80 samega ali v Slika IV: Shematski prikaz absorpcije in transporta CoQ1c Figure IV: Scheme absorption and transport of CoQ1c Mehanizem absorpcije in prenosa CoQ10 (Slika IV) je zelo podoben kot pri a-tokoferolu (vitamin E), podobni lipofilni molekuli. Sama absorpcija temelji predvsem na emulzifikaciji s pomočjo žolčnih kislin v tankem črevesu; ni znano, da bi kateri del črevesa pri tem imel specifično vlogo. Med absorpcijo pride v enterocitih do naravne redukcije koencima, ki se v krvi pojavi predvsem v reducirani obliki (28). Metabolizem CoQ10 pri človeku ni dobro raziskan; večina raziskav je bila narejena na živalih. Kot kaže se CoQ10 metabolizira v vseh tkivih, izloča pa se predvsem z blatom (28). Maksimalno koncentracijo v krvni plazmi dosežemo v 2-6 urah po zaužitju (29), po prenehanju dodajanja pa se krvna koncentracija v nekaj dneh povrne na izhodiščno raven ne glede na obliko zaužite substance. 4.2 Povečevanje biodostopnosti Poglavitni vzrok za nizko biodostopnost ubikinona in ubikinola je nezadosten čas za absorpcijo v prebavnem traktu, kar je značilno tudi Slika V: Primerjava dveh študij relativne biodostopnosti CoQ10: v prvi so mehke kapsule s suspenzijo CoQ10 v sojinem olju (Pharma Nord) [PN oljna susp.] primerjane s kristalinicnim CoQ10 [Weis in sodelavci (25)], v drugi pa z vodotopno obliko CoQ10 (kompleks z ß-ciklodekstrinom; Q10CD) [Žmitek in sodelavci (26)] Figure V: Comparison of two relative bioavailability studies for CoQ10: soft-gel capsules with CoQ10 in a soybean oil suspension (Pharma Nord) [PN oljna susp.] were compared to crystalline CoQ10 in the first study [Weis et al. (25)], and with a water-soluble form of CoQ10 (complex with ß-cyclodextrin; Q10CD) in the second one [Žmitek et al. (26)] kombinaciji z lecitinom je primerjal s trdimi kapsulami, v katerih je bil kristalinični CoQ10 (25). Rezultati so pokazali velik vpliv sestavin na biodostopnost CoQ10, ki je bila pri najučinkovitejši formulaciji na ravni 162% biodostopnosti osnovnega kristaliničnega CoQ10 (Slika V) (25). Oljne suspenzije ubikinola Okrog leta 2000 so se na tržišču pojavile mehke kapsule s suspenzijo reducirane oblike CoQ10. O razmeroma dobri biodostopnosti posebnih t.i. aktivnih kapsul, v katerih je bila ta substanca emulgirana z digliceril monooleatom in lecitinom v repičinem olju, je poročal Hosoe s sodelavci (27). Študija žal ni bila izvedena primerjalno proti drugim proizvodom in je zato neposredna primerjava z ostalimi oblikami CoQ10 dokaj problematična, testirana formulacija aktivnih kapsul pa na slovenskem tržišču ni dostopna. Ne glede na to lahko z upoštevanjem doslej znanih podatkov sklepamo, da je biodostopnost oljnih suspenzij ubikinola boljša od kristalinične učinkovine, morda pa tudi od oljnih suspenzij ubikinona. Za potrditev tega bodo potrebne dodatne raziskave, saj po naših informacijah primerjalna študija biodostopnosti oljne suspenzije ubikinola glede na oljno suspenzijo ubikinona še ni bila izvedena. Tudi deleži odmerka CoQ10, ki so bili določeni v krvi v času maksimalne koncentracije (po zaužitju CoQ10 v obliki oljnih suspenzij ubikinola) niso zelo prepričljivi (Preglednica II). Solubilizirane (vodotopne) oblike CoQl0 Solubilizacija lipofilnih snovi je pogosta strategija za povečevanje njihove absorpcije v telesu (30). Pristopi za dosego tega cilja so v praksi zelo različni, npr. izdelava različnih inkluzijskih kompleksov, tvorba micel, idr. Slednja strategija je bila za povečevanje biodostopnosti koencima Q10 prvič uporabljena leta 1997, ko je Chopra s sodelavci na zdravih prostovoljcih pokazal, da je biodostopnost testirane solubilizirane oblike CoQ10 za 90% večja od biodostopnosti kristaliničnega CoQ10 (31). Uspešnost tega pristopa se je pokazala še pri nekaterih drugih solubiliziranih oblikah CoQ10 (32), tudi pri vodotopnem kompleksu koencima Q10 in b-ciklodekstrina (Q10CD, Slika VI) (26,33). Vodotopnost je v tem primeru posledica specifične strukture b-ciklodekstrina, ki ima hidrofobno notranjost, v katero se ujame molekula CoQ10, in precej bolj hidrofilno zunanjost. Po razpadu kompleksa pod vplivom želodčnega soka, s čimer se sprostijo posamezne molekule CoQ10 za absorpcijo, pa se b-ciklodekstrin izloči iz organizma v nespremenjeni obliki. Ta derivat škroba se tudi sicer pogosto uporablja v farmaciji za solubilizacijo lipofilnih susbstanc ter stabilizacijo. Povečano biodostopnost vodotopnega Q10CD napram mehkim kapsulam z oljno suspenzijo je najprej pokazala študija na psih (33), kasneje pa je bilo to potrjeno tudi na zdravih prostovoljcih (26). Rezultati slednje študije so pokazali, da je biodostopnost testirane vodotopne oblike Q10CD v povprečju na ravni 220% biodostopnosti referenčnih oljnih kapsul (Slika V) (26). Žal zaradi izkazane dobre biodostopnosti nekaterih vodotopnih oblik CoQ10 vse pogosteje prihaja do zlorab tega termina. Nekateri proizvajalci tako svoje proizvode zavajujoče označujejo kot vodotopne in jim pripisujejo povečano absorpcijo CoQ10, čeprav takšnih lastnosti dejansko ne izkazujejo. Primeri takšnih oblik, ki v vodi večinoma tvorijo bolj ali manj stabilne suspenzije, so različne zmesi, v katerih je npr. učinkovina adsorbirana na trden matriks (npr. na SiO2 ali celulozo). Slika VI: Shematski model vodotopnega Q10CD - inkluzijskega kompleksa CoQ10 in p-ciklodekstrina (18) Figure VI: Schematic model of water-soluble QCD- inclusion complex of CoQ10 and p-cyclodextrin (18) 4.3 Ubikinon proti ubikinolu Vlogo koencima Q10 v telesu določa redoks ravnotežje med ubikinonsko in ubikinolno obliko (Slika I), zato nobena od obeh oblik v nobenem primeru ne more biti obravnavana kot prednostna. Zaužita oblika ne vpliva na funkcijo CoQ10 v telesu, saj takoj po absorpciji ubikinona pride do spontane redukcije, zaradi česar se CoQ10 v krvni plazmi pojavi pretežno v reducirani obliki (28). V znanstveni literaturi nismo našli nobenih opažanj, da bi na učinkovitost pretvorbe ubikinona v ubikinol kakorkoli vplivala starost ljudi, niti ne, da bi s starostjo pešala tvorba endogenega ubikinola bolj kot ubikinona. 5 Varnost in odmerjanje v zdravju in bolezni Koencim Q10 je naravno prisoten tako v telesu kot hrani, zato ni presenetljivo, da klinična testiranja na tisočih bolnikov z zelo različnimi odmerki (tudi do 3000 mg) niso pokazala pomembnih stranskih učinkov (34). Redko se pojavijo poročila o posameznih blagih gastrointestinalnih težavah, ki pa niso bile povezane z uživanjem CoQ10 (ni povezave med zaužitim odmerkom in odzivom). Ocena tveganja po metodi opaženih varnih vrednosti (OSL, observed safe level) je pokazala veliko varnost dnevnih odmerkov do 1200 mg (34). Rezultati farmakokinetičnih študij kažejo, da zunanji vnos ne vpliva na endogeno sintezo CoQ10, ter da se CoQ10 po končanem dodajanju ne akumulira v plazmi ali tkivih (35). Koencim Q10 je v obliki različnih farmacevtskih oblik po vsem svetu dostopen že preko 20 let, večinoma kot prehransko dopolnilo (35). Priporočen dnevni odmerek (RDA) za CoQ10 ni določen, saj je v telesu le-ta pretežno endogenega izvora in se potrebe med posamezniki lahko bistveno razlikujejo. Trenutno se sme v Sloveniji priporočati dopolnjevanje prehrane do dnevnega odmerka 50 mg CoQ10. Ta odmerek je relativno nizek, tudi v primerjavi z dovoljenimi odmerki v Preglednica III: Okvirni dnevni odmerki CoQ10 v različnih stanjih Table III: Frame guidelines for the supplementation of CoQ10 in different conditions Stanje Odmerek Opomba Zdravi otroci / (po posvetu z zdravnikom) Zdravi ljudje do 40. leta do 50 mg Zdravi ljudje nad 40. letom 50 - 100 mg Zdrave nosečnice in doječe matere / (po posvetu z zdravnikom) Ljudje z dejavniki tveganja (tudi uporabniki statinov) okrog 100 mg (po posvetu z zdravnikom) Bolniki z različnimi bolezenskimi stanji navadno nad 300 mg (po posvetu z zdravnikom) Opombe: V Sloveniji se trenutno sme priporočati dopolnjevanje prehrane do dnevnega odmerka 50 mg CoQ1, nekaterih drugih evropskih državah (npr. 200 mg v Belgiji). Razpon priporočenih odmerkov CoQ10 v literaturi je razmeroma velik in povezan predvsem z namenom uporabe (preventiva, dejavniki tveganja, različna bolezenska stanja) (Preglednica III). Glede na razvoj novih formulacij s povečano biodostopnostjo je v prihodnosti mogoče pričakovati, da bodo priporočila za odmerjanje vezana na uporabljeno obliko. Absolutne kontraindikacije uporabe CoQ10 niso znane (36). Uporaba pri zdravih otrocih, nosečnicah in doječih materah se iz previdnostnih razlogov svetuje po nasvetu zdravnika. V nekaj študijah na posameznih pacientih so opazili potencialno interakcijo z antitrombotikom varfarinom, kar pa so ovrgli s placebo kontrolirano študijo na 24 stabilnih pacientih, ki so 4 tedne poleg varfarina uživali še 100 mg CoQio (36). 6 Izdelki s koencimom Q10 na tržišču Na slovenskem tržišču je dostopnih precej izdelkov z različnimi oblikami CoQ10, ki imajo status zdravila, ki se izdaja brez recepta v lekarnah in specializiranih prodajalnah, ali pa prehranskega dopolnila. Izdelke različnih distributerjev, ki jih je mogoče kupiti v lekarnah, smo zbrali v Preglednici IV. Na pobudo uredništva smo v preglednico vključili tudi maloprodajne cene izdelkov, ki smo jih za enostavnejšo primerjavo preračunali na ceno v EUR za 30 mg CoQ10, običajno priporočenim dnevnim odmerekom. Na podlagi podatkov o sestavi izdelkov smo izdelke glede na dostopne podatke o njihovi potencialni biodostopnosti razdelili v pet razredov: • A: izdelki s kristaliničnim CoQ10, za katerega je značilna slaba absorpcija; • B: izdelki z oljno suspenzijo ubikinona, katere biodostopnost ni bila preverjena, vendar je verjetno boljša od kristaliničnega CoQ10; • C: izdelki z oljno suspenzijo ubikinona, katerih biodostopnost je z objavljenimi študijami dokazano boljša od kristaliničnega CoQ10; • D: izdelki z oljno suspenzijo ubikinola, katere biodostopnost je boljša od kristaliničnega CoQ10; • E: izdelki z vodotopno obliko CoQ10, katere biodostopnost je z objavljenimi študijami dokazano boljša od oljne suspenzije ubikinona (C). V slovenskih spletnih trgovinah po pričakovanju lahko najdemo kar nekaj proizvodov s kristaliničnim CoQ10, ki se iz prebavnega trakta zelo slabo absorbira, natančen pregled stanja na tržišču pa je presenetljivo pokazal, da so takšni izdelki tudi na policah naših lekarn (Preglednica IV). Primer takšnih proizvodov so npr. trde kapsule s 30 mg CoQ10 v zmesi z belim rižem v prahu (NOW Koencim Q10). Na tržišču so tudi proizvodi s kristaliničnim CoQ10, za katere proizvajalci navajajo trditev o vodotopnosti, vendar iz deklaracij proizvodov ni razvidno, da je dejansko uporabljena vodotopna oblika učinkovine. Primeri takšnih proizvodov so npr. pelete s 50 mg CoQ10 v stiku (GOGO Q10 Energy) in trde kapsule s 50 mg CoQ10 (Sensilab Koencim Q10). Za pojasnilo v zvezi s tem in informacijo o uporabljeni obliki učinkovine smo se obrnili na oba distributerja omenjenih proizvodov, ki nista zanikala uporabe kristaliničnega CoQ10, niti nista pojasnila podlage za uporabo trditve o vodotopnosti. Najpogostejša farmacevtska formulacija koencima Q10 so mehke kapsule s CoQ10 v oljni suspenziji; na tržišču so proizvodi z 20 mg (Pharma Effect Koencim Q10) ali 30 mg CoQ10 (Fidi Koencim 10, Natural Wealth Koencim Q10 in BioQinon Q10). Za slednji proizvod je bila dokazana povečana biodostopnost v primerjavi s kristaliničnim CoQ10 (Slika V). Na slovenskem tržišču so dostopne tudi kapsule z oljno suspenzijo ubikinola (Ubiquinol CoQH-CF), za katere se predvideva povečana biodostopnost v primerjavi s kristaliničnim CoQ10, njihove biodostopnosti v primerjavi z oljnimi suspenzijami ubikinona pa niso študirali. V zadnjih letih so se na tržišču pojavili tudi prvi proizvodi z vodotopno obliko Q10CD, za katero so dokazali izboljšano biodostopnost tudi v primerjavi z oljnimi suspenzijami ubikinona (Slika V). Takšno obliko učinkovine vsebujejo šumeče tablete z 10 mg (Sensilab Q10 Koencim mladosti) in tablete s 30 mg CoQ10 (Quvital tablete) ter sirup s 15 mg CoQ10/mL (Quvital forte sirup). Pri primerjavi cen proizvodov na tržišču moramo upoštevati, da se le-te dokaj hitro spreminjajo. Analiza ni pokazala jasne zveze med ceno, farmacevtsko obliko proizvoda in uporabljeno obliko učinkovine. Presenetljiva je relativno visoka cena proizvodov s kristalinično učinkovino (0,39 - 0,61 EUR). V času priprave tega prispevka so bili tako najcenejši kot najdražji tisti proizvodi, ki vsebujejo CoQ10 v obliki vodotopnega kompleksa Q10CD: najcenejše so bile tablete in sirup (Quvital tablete in Quvital forte sirup; 0,33 EUR), dražje pa šumeče tablete (Sensilab Q10 Koencim mladosti; 1,17 EUR), pri katerih pa je potrebno upoštevati, da poleg CoQ10 vsebujejo še vitamine (B1, B2, B6, B12, C, E, biotin, niacin, pantotenska in folna kislina). Mehke kapsule z ubikinonom so dostopne v relativno ozkem cenovnem intervalu med 0,40 in 0,47 EUR (Natural Wealth in Pharma Effect Koencim Q10, Fidi Koencim 10 ter BioQinon Q10), tiste z ubikinolno obliko CoQ10 pa so skoraj enkrat dražje (Ubiquinol CoQH-CF; 0,79 EUR). Preglednica IV: Nekateri izdelki s CoQ10, dosegljivi v Sloveniji kot zdravila brez recepta aH prehranska dopolnila za peroralno uporabo Table IV: Selected products with CoQ10 available in Slovenia in the form of drugs available without prescription or food supplements for peroral use Razred Oblika Izdelek Vsebnost CoQ10 Cena za 30 mg CoQ10 (maj 2009) Opomba Študija biodostopnosti A trde kapsule NOW Koencim Q10 (Bimedia) 30 mg / kap. 0,41 € Q10 / A trde kapsule Sensilab Koencim Q10 (Farmicom) 50 mg / kap. 0,39 € Q10* / A pelete v stiku GOGO Q10 Energy (Fidimed) 50 mg / stik 0,61 € Q10* / B mehke kapsule Fidi Koencim 10® (Fidimed, BRp) 30 mg / kap. 0,44 € SU / B mehke kapsule Natural Wealth Koencim Q10 (Difar) 30 mg / kap. 0,48 € SU / B mehke kapsule Koencim Q10 (Pharma Effect) 20 mg / kap. 0,40 € SU / C mehke kapsule Pharma Nord Bio-Qinone® Q10 (Mic Mengeš) 30 mg / kap. 0,47 € SU (25) D mehke kapsule NOW Ubiquinol CoQH-CF® (Bimedia) 50 mg / kap. 0,79 € SUR / E tablete Quvital tablete® (Novval) 30 mg / tab. 0,33 € Q10CD (26,33) E sirup Quvital® forte sirup (Novval) 15 mg / mL 0,33 € Q10CD (26,33) E šumeče tablete Sensilab Q10 koencim mladosti (Farmicom) 10 mg / tab. 1,17 € Q10CD (26,33) Opombe: V tabelo so vključeni proizvodi, ki so bili pomladi 2009 v prodaji v naključni lekarni (Mariborske lekarne). Imena Izdelkov In blagovne znamke so iz registra zdravil in seznama notificiranih prehranskih dopolnil (poleg imena proizvoda je naveden zastopnik). Večina proizvodov sodi med prehranska dopolnila, eden (označen z oznako BRp) pa je zdravilo, ki je na voljo brez recepta. Pri vsebnosti CoQ10 je navedena vsebnost celokupnega CoQ10, morebitne druge aktivne komponente (npr. vitamini) niso vključene. Maloprodajne cene izdelkov so za enostavnejšo primerjavo enotno preračunane na 30 mg CoQ10. Pri proizvodih, ki so na tržišču dostopni v različnih pakiranjih, smo v tabelo vključili proizvod z najnižjo ceno na 30 mg CoQ10. Okrajšave: Q10 = uporabljen kristaliničen CoQ10; Q10* = proizvajalec navaja vodotopnost, vendar nam ni posredoval dokazov, s katerimi bi to trditev podkrepil; SU = uporabljena oljna suspenzija ubikinona; SUR = uporabljena oljna suspen-zija ubikinola; Q10CD = uporabljen vodotopni kompleks CoQ10 in b-ciklodekstrina (Q10CD). Tako kot na večini svetovnih tržišč ima tudi pri nas glavnina izdelkov s koencimom Q10 status prehranskih dopolnil. Proizvodnja le-teh je v primerjavi s proizvodnjo zdravil manj kontrolirana, so pa proizvajalci skladno z veljavno zakonodajo dolžni zagotoviti ustrezno vsebnost učinkovine in stabilnost proizvoda v predpisanem roku uporabe. Ustreznost prehranskih dopolnil v Sloveniji nadzira Zdravstveni inšpektorat. O njihovi kakovosti se še posebej v povezavi z določenimi proizvajalci med strokovno javnostjo občasno pojavljajo dvomi, katerih upravičenost bi lahko ovrednotili le z rednimi neodvisnimi kontrolnimi pregledi. Da so standardi zagotavljanja kakovosti proizvodov med proizvajalci zelo različni, lahko sklepamo tudi iz izkušenj, ki smo jih dobili ob pripravi tega pregleda. Tako so nam nekateri proizvajalci oz. distributerji sami posredovali dokaj natančno dokumentacijo o prodajanih izdelkih (npr. specifikacije, analitske izvide, analitska poročila o stabilnosti v roku uporabe), nekateri pa so se npr. na naša vprašanja odzvali z informacijo, da gre za poslovne skrivnosti. 7 Sklep Koencim Q10 je naravno prisoten v vsaki telesni celici. Ima nenadomestljivo vlogo prenašalca elektronov med kompleksi mitohondrijske dihalne verige in je aktivno vključen v prenos protonov prek notranje mitohondrijske membrane in posledičen nastanek gradienta protonov, kar je gonilo tvorbe ATP. CoQ10 je hkrati tudi edini endogeni maščobotopni antioksidant. V telesu je večinoma endogenega izvora, deloma pa ga zaužijemo tudi s hrano. Vlogo koencima Q10 v telesu določa redoks ravnotežje med ubikinonsko in ubikinolno obliko; njegova funkcija v telesu ni odvisna od tega, ali ga zaužijemo v obliki ubikinona ali ubikinola. Živila sicer vsebujejo relativno malo CoQ10, še največ ga je v rdečem mesu, migrirajočih ribah, nekaterih rastlinskih oljih in oreščkih. Študije kažejo, da se koncentracije CoQ10 v najaktivnejših telesnih organih s staranjem zmanjšujejo. Zato, zaradi dokazane varnosti uživanja in dobrih izkušenj v klinični rabi postaja dodajanje CoQ10 vse popularnejše. Najbolj smotrno je pri stanjih, za katera je bil ugotovljen primanjkljaj CoQ10 v telesu, ali pa pozitiven učinek te učinkovine na potek bolezni ter preventivno zaradi antioksidativnega učinka. Njegov učinek v telesu lahko pripišemo tako vzpostavljanju normalnega toka elektronov v dihalni verigi, kot antioksidativnim lastnostim. V literaturi ni podatkov, da bi zunanji vnos inhibiral endogeno sintezo CoQ10; po prenehanju dodajanja se krvna koncentracija v nekaj dneh povrne na izhodiščno raven. V prihodnosti bo sicer potrebno opraviti še več dobro načrtovanih kliničnih raziskav, da bi lahko zanesljivo potrdili vpliv CoQ10 na preprečevanje ali zdravljenje bolezni. Zaradi svojih fizikalnih lastnosti se tako ubikinon kot ubikinol zelo slabo absorbirata iz prebavnega trakta. Ta vidik mora še posebej upoštevati strokovna javnost, saj širši javnosti ni enostavno razumljiv. Posebno pozornost je potrebno zato posvečati biodostopnosti proizvodov, še posebej, ker je na tržišču kar nekaj proizvodov, za katere se utemeljeno pričakuje slaba absorpcija CoQ10. Zal v želji po čimbolj prepričljivih številkah distributerji pogosto operirajo z zavajujočimi podatki in se sklicujejo na študije, v katerih so bili njihovi ali njihovim podobni proizvodi testirani le v primerjavi z oblikami z dokazano najslabšo biodostopnostjo, npr. s kristalinično učinkovino, ki jih neutemeljeno razglašajo za standardno obliko na tržišču. Najpogostejšo obliko na tržišču sicer predstavljajo mehke kapsule z oljnimi suspenzijami ubikinona, na katerih je bila prvič pokazana boljša absorpcija CoQ10. Izboljšana absorpcija CoQ10 je značilna tudi za oljne suspenzije ubikinola, nadaljnji razvojni korak pa je bil narejen z razvojem vodotopnih oblik CoQ10. Zal so nekateri proizvajalci začeli izkoriščati osveščenost javnosti o dobri biodostopnosti nekaterih takšnih vodotopnih oblik. Na tržišču se namreč pojavljajo proizvodi s kristaliničnim CoQ10, za katere proizvajalci neupravičeno trdijo, da vsebujejo vodotopne oblike koencima Q10. Slabe prakse agresivne promocije izdelkov, ki jih žal vse pogosteje uporabljajo tudi dobro uveljavljeni distributerji, je mogoče pokazati tudi na več drugih primerih. Tako nekateri proizvajalci na svojih izdelkih pretirano izpostavljajo koencim Q10, čeprav ga izdelki dejansko vsebujejo zelo malo (le kakšen miligram), ali pa izdelke oglašujejo z neresničnimi trditvami. Tako npr. uporabo ubikinolne oblike CoQ10 distributer promovira z neresnično trditvijo, da s staranjem pri ljudeh slabi sposobnost pretvorbe ubikinona do ubikinola, ter da naj bi bilo zato uživanje ubikinola bolj primerno. Z uporabo omenjenih promocijskih tehnik, ki jih včasih težko prepozna tudi strokovna javnost, prodajalci z namenom pospeševanja prodaje povzročajo zmedo na tržišču in zavajajo potrošnike, 8 Literatura 1. Coenzyme Q: Biochemistry, bioenergetics, and clinical applications of ubiquinone. Chichester: John Wiley & Sons, 1985. 2. Lenaz G, Fato R, Formiggini G, Genova ML. The role of Coenzyme Q in mitochondrial electron transport. Mitochondrion 2007; 7: S8-S33. 3. Crane FL. Discovery of ubiquinone (coenzyme Q) and an overview of function. Mitochondrion 2007; 7: S2-S7. 4. Bentinger M, Brismar K, Dallner G. The antioxidant role of coenzyme Q. Mitochondrion 2007; 7: S41-S50. 5. Kaikkonen J, Nyyssonen K, Tomasi A, lannone A, Tuomainen TP, Porkkala-Sarataho E, Salonen JT. Antioxidative efficacy of parallel and combined supplementation with coenzyme Q10 and d-alpha-trocopherol in mildly hypercholesterolemic subjects: a randomized placebo-controlled clinical study. Free Radic Res 2000; 33: 329-340. 6. Kalen A, Appelkvist EL, Dallner G. Age-related changes in the lipid compositions of rat and human tissues. Lipids 1989; 24: 579-584. 7. Aberg F, Appelkvist EL, Dallner G, Ernster L. Distribution and redox state of ubiquinones in rat and human tissues. Arch Biochem Biophys 1992: 295: 230-234. 8. Bliznakov EG, Wilkins DJ. Biochemical and clinical consequences of inhibiting coenzyme Q10 biosynthesis by lipid-lowering HMG-CoA reductase inhibitors (statins): A critical overview. Adv Ther 1998; 15: 218228. 9. Rus P, Rus RR. Koencim Q10. Zdrav Var 2008; 47: 89-98. 10. Folkers K. Relevance of the biosynthesis of coenzyme Q10 and of the four bases of DNA as a rationale for the molecular causes of cancer and a therapy. Biochem Biophys Res Commun 1996; 224: 358-361. 11. Littarru GP, Langsjoen P. Coenzyme Q10 and statins: Biochemical and clinical implications. Mitochondrion 2007; 7: S168-S174. 12. Quinzii CM, DiMauro S, Hirano M. Human coenzyme Q10 deficiency. Neurochem Res 2007; 32: 723-727. 13. Elsayed NM, Bendich A. Dietary antioxidants: potential effects on oxidative products in cigarette smoke. Nutr Res 2001; 21: 551-567. 14. Pavlin R. Koencim Q10 - Klinična raba. Zdrav Vestn 2008; 77: 159-162. 15. Blatt T, Mundt C, Mummert C, Maksiuk T, Wolber R, Keyhani R, Schreiner V, Hoppe U, Schachtschabel DO, Stab F. Modulation of oxidative stress in human skin of old donors. Z Gerontol Geriatr 1999; 32: 83-88. 16. Zhang J, Wang S. Topical use of Coenzyme Q10-loaded liposomes coated with trimethyl chitosan: tolerance, precorneal retention and anti-cataract effect. Int. J. Pharm. 2009; doi:10.1016/j.ijpharm.2009.01.001 (In Press). 17. Teran E, Hernandez I, Nieto B, Tavara R, Ocampo JE, Calle A. Coenzyme Q10 supplementation during pregnancy reduces the risk of pre-eclampsia. Int. J. Gyn. Obst. 2009; doi:10.1016/j.ijgo.2008.11.033 (In Press) 18. Pravst I, Zmitek K, Zmitek J. Coenzyme Q10 contents in foods and fortification strategies. Crit Rev Food Sci Nutr 2009; doi: 10.1080/10408390902773037 (In Press). 19. Ochiai A, Itagaki S, Kurokawa T, Kobayashi M, Hirano T, Iseki K. Improvement in intestinal coenzyme Q10 absorption by food intake. Yakugaku Zasshi 2007; 127: 1251-1254. 20. Singh RB, Niaz MA, Kumar A, Sindberg CD, Moesgaard S, Littarru GP. Effect on absorption and oxidative stress of different oral coenzyme Q10 dosages and intake strategy in healthy men. Biofactors 2005; 25: 219-224. 21. Zhang Y, Aberg F, Appelkvist EL, Dallner G, Ernster L. Uptake of dietary Coenzyme Q supplement is limited in rats. J Nutr 1995; 125: 446-453. 22. Weber C. Dietary intake and absorption of Coenzyme Q. In: Kagan VE, Quinn PJ, eds. Coenzyme Q: Molecular mechanisms in health and disease. Boca Raton: CRC Press, 2001: 209-215. 23. Weber C, Bysted A, Holmer G. Intestinal absorption of coenzyme Q10 administered in a meal or as capsules to healthy subjects. Nutr Res 1997: 17: 941-945. 24. Miles MV, Horn P, Miles L, Tang P, Steele P, DeGrauw T. Bioequivalence of coenzyme Q10 from over-the-counter supplements. Nutr Res 2002; 22: 919-929. 25. Weis M, Mortensen SA, Rassing MR, Mollersonnergaard J, Poulsen G, Rasmussen SN. Bioavailability of 4 oral Coenzyme Q10 formulations in healthy volunteers. Mol Aspects Med 1994; 15: 273-280. 26. Zmitek J, Smidovnik A, Fir M, Prosek M, Zmitek K, Walczak J, Pravst I. Relative bioavailability of two forms of a novel water soluble coenzyme Q10. Ann Nutr Metab 2008; 52: 281-287. 27. Hosoe K, Kitano M, Kishida H, Kubo H, Fujii K, Kitahara M. Study on safety and bioavailability of ubiquinol (Kaneka QH™) after single and 4-week multiple oral administration to healthy volunteers. Regul Toxicol Pharmacol 2007; 47: 19-28. 28. Bhagavan HN, Chopra RK. Coenzyme Q10: Absorption, tissue uptake, metabolism and pharmacokinetics. Free Radic Res 2006; 40: 445-453. 29. Zmitek J, Zmitek K, Pravst I. Improving the bioavailability of coenzyme Q10: From theory to practice. Agro Food Ind Hi Tec 2008; 19 (4): 8-10. 30. Water-insoluble drug formulation, Second edition. Boca Raton: CRC Taylor & Francis, 2008. 31. Chopra RK, Goldman R, Sinatra ST, Bhagavan HN. Relative bioavailability of coenzyme Q10 formulations in human subjects. Int J Vitam Nutr Res 1998; 68: 109-113. 32. Bhagavan HN, Chopra RK. Plasma coenzyme Q10 response to oral ingestion of coenzyme Q10 formulations. Mitochondrion 2007; 7: S78-S88. 33. Prosek M, Butinar J, Lukanc B, Fir Milivojevic M, Milivojevic L, Krizman M, Smidovnik A. Bioavailability of water soluble CoQ10 in beagle dogs. J Pharm Biomed Anal 2008; 47: 918-922. 34. Hathcock JN, Shao A. Risk assessment for coenzyme Q10 (Ubiquinone). Regul Toxicol Pharmacol 2006; 45: 282-288. 35. Hidaka T, Fujii K, Funahashi I, Fukutomi N, Hosoe K. Safety assessment of coenzyme Q10 (CoQ10). Biofactors 2008; 32: 199-208. 36. Bonakdar RA, Guarneri E. Coenzyme Q10. Am Fam Phys 2005; 72: 10651070. oskrbujemo lekarne, bolnišnice, zdravstvene domove, veledrogerije ter druge, ki opravljajo zdravstveno in veterinarsko dejavnost & sirom Slovenije I odzivno, kakovostno, učinkovito mju/ Salus, Ljubljana, d. d. Mašera Spasiceva ulica 10 SI -1000 Ljubljana telefon +386 (0)1 589 9100 telefaks +386 (0)1 568 10 22 e-pošta info@salus.si splet www.salus.si Encimi iz naddruzine kratkoveriznih dehidrogenaz/reduktaz kot nove farmakOloške tarče Enzymes of the short-chain dehydrogenase/reductase superfamily as new pharmacological targets Mojca Brunskole, Tea Lanišnik Rižner, Jure Stojan Povzetek: Encimi iz naddružine kratkoverižnih dehidrogenaz/reduktaz (SDR) predstavljajo zelo veliko proteinsko družino. Čeprav jih povezujejo številne strukturne podobnosti, je njihova substratna specifičnost različna. Udeleženi so v metabolizmu steroidnih hormonov, maščobnih kislin, alkoholov, retinoidov, prostaglandinov in ksenobiotikov. V človeškem genomu je identificiranih okrog 70 SDR. Vpleteni so v številne (pato)fiziološke procese, zato so zanimivi s stališča zdravljenja genetskih, hormonsko odvisnih in metaboličnih bolezni, kot so: galaktozemija, fenilketonurija, rak dojke, endometrija, prostate in debelega črevesa, dislipidemija, debelost in arterijska hipertenzija. Ključne besede: kratkoverižne dehidrogenaze/reduktaze (SDR), človeške SDR, metabolične bolezni, hormonsko odvisne bolezni, SDR kot farmakološke tarče Abstract: Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR) constitute a large protein family. Although they have several structural features in common, they act on a highly diverse set of substrates. They are involved in metabolism of steroid hormones, fatty acids, alcohols, retinoids, prostaglandins and xenobiotics. Around 70 SDR members are identified within the human genome. In human body they participate in numerous distinct (patho)physiological processes, thus they are very interesting therapeutic targets for the treatment of genetic, hormone dependent and metabolic diseases like galactosemia, phenylketonuria, breast cancer, endometrium, prostate and colon cancer, dyslipidemia, obesity and arterial hypertension. Key words: short-chain dehydrogenases/reductases (SDR), human SDR, metabolic diseases, hormone dependent diseases, SDR as pharmacological targets 1 Uvod Encimi iz naddružine kratkoverižnih dehidrogenaz/reduktaz (SDR) so postali predmet intenzivnih raziskav predvsem v zadnjem desetletju. Z leti je bilo odkritih vedno več predstavnikov te naddružine - trenutno je poznanih preko 3000 encimov SDR, od tega je okrog 70 človeških (1). Kljub številnim skupnim strukturnim značilnostim imajo ti encimi v živih organizmih zelo raznoliko vlogo. Zaradi njihove vpletenosti v različne patofiziološke procese so zanimivi s terapevtskega stališča kot tarče za nove zdravilne učinkovine pri zdravljenju različnih bolezni. V članku predstavljamo strukturo in delovanje encimov SDR, podrobnejši opis človeških encimov SDR in njihovo vpletenost v bolezenske procese. 2 Predstavitev encimov SDR Encimi SDR tvorijo veliko, po delovanju zelo raznoliko skupino proteinov, s trenutno znanimi preko 3000 primarnimi strukturami (1, 2). Najdemo jih pri bakterijah, glivah, rastlinah, žuželkah in vretenčarjih (3). Naddružino SDR so vpeljali po odkritju razlik med alkohol-dehidrogenazami žuželk in vretenčarjev (4). Alkohol-dehidrogenaza vinske mušice se je razlikovala od tedaj znanih jetrnih in glivnih alkohol-dehidrogenaz po vezavnem mestu za koencim NAD+, ki se je nahajalo na N-terminalnem delu. Novo odkritim alkohol-dehidrogenazam so določili drugačen mehanizem delovanja ter visoko ohranjeno YxxxK zaporedje, ki je vključevalo aminokislini aktivnega mesta. Čeprav je prvotno prevladovalo mnenje, da je SDR naddružina sestavljena le iz prokariontskih dehidrogenaz in alkohol-dehidrogenaz žuželk, se je zanimanje zanjo povečalo z odkritjem sesalske 15-hidroksiprosta-glandin-dehidrogenaze in 17b-hidroksisteroid-dehidrogenaze, ki sta tipična predstavnika naddružine SDR (5). Osnovna struktura večine encimov SDR je sestavljena iz 250 do 350 aminokislinskih preostankov, pogosto imajo tudi N- oz. C-terminalne transmembranske domene, pripete signalne peptide ali pa so del asist. Mojca Brunskole, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Institut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana izr. prof. dr. Tea Lanišnik Rižner, univ. dipl. kem., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Institut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana prof. dr. Jure Stojan, dr. med., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Institut za biokemijo, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana multiencimskih kompleksov (2). Čeprav Imajo encimi SDR le 15-30 % Identičnih aminokislinskih preostankov, imajo vsi podobno tridimenzionalno zgradbo - enodomenski vzorec zvitja, kjer se izmenjuje 7 ali 8 a-vijačnic s 7 ali 8 b-ploskvami (a/b-vzorec zvitja, znan kot Rossmannovo zvitje) (5, 6). Večina encimov SDR je v dimerni ali tetramerni obliki (5). Znani so le trije encimi SDR, ki so aktivni v monomerni obliki: prašičja testikularna karbonil-reduktaza ter človeški karbonil-reduktazi 1 in 3 (7, 8). Za encime SDR je značilno, da imajo številne visoko ohranjene segmente (preglednica 1). Primerjave aminokislinskih zaporedij, kemijske modifikacije, točkovno usmerjene mutacije in kristalografske analize so pokazale, da večina teh segmentov sodeluje pri vezavi koencimov ali pa so del katalitičnega mesta encimov SDR (9). Visoko ohranjeno zaporedje TGxxxGxG na N-terminalnem delu in NNAG motiv vzdržujeta strukturo središčne b-ploskve in predstavljata del vezavnega mesta za koencim. Olajšata pravilno postavitev in vezavo koencima, čeprav se z njim ne povežeta direktno. S koencimom pa se lahko povežejo nekateri drugi aminokislinski preostanki - Asp, Ala, Thr ter Pro ali Gly iz PG motiva (preglednica 1). V aktivnem mestu se nahajajo katalitični aminokislinski preostanki Ser, Tyr in Lys, pri čemer je v celotni naddružini SDR najbolj ohranjen Tyr (2). Novejši podatki kažejo, da je za katalitično aktivnost pomemben tudi visoko ohranjen Asn, ki tako s Ser, Tyr in Lys pri večini SDR tvori katalitično tetrado (2, 10). Raziskave so pokazale, da Ser stabilizira lego substrata, hidroksilna skupina Tyr pa deluje kot katalitična baza. Pri znižanju pKa hidroksilne skupine Tyr sodeluje Lys, ki se poveže z nikotinamidno ribozo kofaktorja. Vsi trije tako tvorijo sistem za prenos naboja pri kislinsko-bazični katalizi (2). Asn s povezavo z Lys preko vmesne molekule vode stabilizira lego Lys, dodatno pa omogoča tudi prenos protona med koencimom, substratom, Tyr, 2'-OH riboze, Lys, vodo in Asn v aktivnem mestu (10). Podobno zvitje encimov SDR in ohranjeno YxxxK zaporedje kažeta na to, da imajo ti encimi tudi podoben reakcijski mehanizem. Encimske reakcije sledijo zaporednemu bi-bi mehanizmu, kjer se v aktivno mesto najprej veže koencim, nato substrat. Sledi encimska reakcija, aktivno mesto potem najprej zapusti produkt in šele nato spremenjen koencim. Preglednica 1: Motivi zaporedij pri encimih SDR (oštevilčenje položajev se nanaša na oštevilčenje aminokislinskih preostankov pri 3p/17p-HSD (PDB koda 1HXH)) (2) Table 1: Sequence motifs found in SDR enzymes (positions refer to residue numbering as in 3p/17p-HSD (PDB code 1HXH)) (2) MOTIV POLOŽAJ VLOGA TGxxxGxG 12 - 19 območje vezave koencima; vzdrževanje središčne b-ploskve D 60 stabilizacija žepa, kamor se veže adeninski obroč; šibka vezava s koencimom NNAG 86 - 89 stabilizacija središčne b-ploskve N 111 aktivno mesto S-Y-K 138, 151, 155 aktivno mesto N 179 povezava med zanko, ki pokrije aktivno mesto in aktivnim mestom PG 183 - 184 povezava s koencimom T 188 vodikova vez s karboksamidnim delom nikotinamidnega obroča Sproščanje koencima iz aktivnega mesta pri tem predstavlja hitrost omejujočo stopnjo celotne encimsko katalizirane reakcije (9). Koencimsko specifičnost encimov SDR določajo aminokislinski ostanki v babmotivu na začetku Rossmannovega zvitja (11). Pomemben je elektrostatski naboj aminokislinskega ostanka v neposredni bližini 2'-hidroksi (oz. fosfatne) skupine adenozinske riboze koencimov. Kristalografsko določene tridimenzionalne strukture klasičnih encimov SDR so pokazale, da je pri od NAD(H)-odvisnih encimih SDR na koncu druge b-ploskve kislinski ostanek, pri od NADP(H)-odvisnih pa bazični (11, 12). Od NAD(H)-odvisne encime glede na položaj kislinskega preostanka za drugo b-ploskvijo razdelimo na poddružine cD1d, cD1e, cD2 in cD3. Glede na položaj bazičnega preostanka pa od NADP(H)-odvisne encime razdelimo v cP1, cP2 ali cP3 poddružino (11). Encime SDR nadružine lahko razvrstimo v več EC (Enzyme Commission) razredov: oksidoreduktaze (EC 1), liaze (EC 4) in izomeraze (EC 5), pri čemer je med njimi večina oksidoreduktaz (2). Vpleteni so v metabolizem steroidov, prostaglandinov, alifatskih alkoholov in ksenobiotikov. Izničenje genov in genetske variacije so pokazale, da imajo SDR pomembno vlogo tudi pri razvoju in homeostazi pri ljudeh, žuželkah in rastlinah (2, 13). 3 Encimi SDR pri ljudeh Čeprav se v človeškem genomu nahaja okrog 70 genov, ki kodirajo za encime iz SDR naddružine, sta med njimi delno opisani le dve tretjini. Za nekatere je poznano izražanje v različnih tkivih in substratna specifičnost, vendar pa je večina človeških SDR slabo opisana -strukturne informacije na primer so na voljo za samo okrog 20 encimov (1). Glede na delovanje lahko človeške SDR razdelimo v tri glavne skupine: • encimi intermediarnega metabolizma (kemijske reakcije pri presnavljanju molekul iz hrane v molekule celičnih in zunajceličnih struktur); • encimi metabolizma hormonov, mediatorjev in ksenobiotikov; • encimi z neznano vlogo, ki so bili identificirani kot odprti bralni okvirji (ORF) (14). 3.1 Encimi intermediarnega metabolizma Encimi intermediarnega metabolizma sodelujejo pri kemijskih reakcijah pretvorbe sladkorjev, sinteze aminokislin, b-oksidacije maščobnih kislin, ketogeneze, idr. Med encime SDR iz te skupine uvrščamo: UDP-galaktoza-epimerazo, ki katalizira epimerizacijo UDP-glukoze (slika 1) in UDP-N-acetilglukozamina v UDP-galaktozo in UDP-N-acetilgalaktozamin; sepiapterin-reduktazo in dihidroksipteridin- '-glukoza Slika 1: Epimerizacija UDP-glukoze v UDP-galaktozo z UDP-galaktoza-epimerazo Figure 1: Epimerization of UDP-glucose to UDP-galactose by UDP-galactose epimerase reduktazo, ki imata pomembno vlogo pri sintezi tetrahidrobiopterina; ter R-3-OH-butirat-dehidrogenazo, dienoil-CoA-reduktazo ter frans-enoil-CoA-reduktazo, ki so vključene v P-oksidacijo maščobnih kislin in ketogenezo (14). 3.2 Encimi metabolizma hormonov, mediatorjev in ksenobiotikov Encimi metabolizma hormonov, mediatorjev in ksenobiotikov predstavljajo največjo skupino človeških encimov SDR. Mednje so uvrščeni encimi s hidroksisteroid-dehidrogenazno (HSD) in prostaglandin-dehidrogenazno aktivnostjo ter encimi, ki metabolizirajo retinoide: • 3P-hidroksisteroid-dehidrogenaze/ A5-A4-izomeraze; • 11b-hidroksisteroid-dehidrogenaze; • 17b-hidroksisteroid-dehidrogenaze; • retinol/retinal-dehidrogenaze; • karbonil-reduktaze/PGDH (14). 3b-hidroksisteroid-dehidrogenazni/ A5-A4-izomerazni (3P-HSD) izo-encimi so odgovorni za oksidacijo in izomerizacijo A5-3b-hidroksisteroidnih prekurzorjev v A4-ketosteroide (slika 2) -katalizirajo torej nujno potreben korak sinteze vseh vrst steroidnih hormonov (glukokortikoidov, mineralokortikoidov, progesterona, estrogenov in androgenov). Pri človeku sta znani dve izoobliki 3P-HSD: tip I, ki se nahaja v placenti in perifernih tkivih ter tip II, ki se v glavnem izraža v nadledvični žlezi, jajčnikih in testisih. V obeh primerih gre za bifunkcionalna encima, torej encima s 3P-HSD in A5-A4 izomerazno aktivnostjo, pri čemer sta obe stopnji reakcije povezani s koencimom - NAD+ se s 3P-HSD aktivnostjo reducira v NADH, le-ta pa potem aktivira izomerazno aktivnost istega encima (15). 11P-hidroksisteroid-dehidrogenazi (11P-HSD) tipa 1 in 2 uravnavata delovanje glukokortikoidnega hormona kortizola (slika 3) - uravnavata pretvorbo med ligandom, ki se veže na receptor, kortizolom in njegovim pregnennlon progesteron Slika 2: Pretvorba pregnenolona v progesteron s 3p-HSD Figure 2: Conversion of prognenolone to progesterone by 3p-HSD Slika 3: Pretvorba med kortizonom in kortizolom z 11p-HSD tipoma 1 in 2 Figure 3: Interconversion between cortisone and cortisol by 11b-HSD type 1 and 2 prekurzorjem kortizonom, ki se na receptor veže z manjšo afiniteto. 11P-HSD1 reducira neaktivne glukokortikoide v aktivne in s tem omogoča njihovo vezavo na receptorje, 11P-HSD2 pa deluje kot dehidrogenaza in tako zaščiti intrinzično neselektivne periferne mineralokortikoidne receptorje v ledvicah pred aktivacijo s kortizolom, namesto z aldosteronom (1). 17b-hidroksisteroid-dehidrogenaze (17P-HSD) so encimi, vključeni v zadnjo stopnjo biosinteze androgenov in estrogenov in katalizirajo oksidoredukcijske reakcije hidroksi oz. keto skupine na mestu 17 steroida (16). Pretvarjajo visoko aktivne 17-hidroksisteroide v nizko oz. neaktivne 17-ketosteroide in obratno. Danes je poznanih že 14 tipov 17P-HSD, vendar je med njimi le 11 takšnih, ki jih uvrščamo v naddružino SDR in jih najdemo tudi pri človeku: tip 1, 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14. Med seboj se razlikujejo po koencimski in substratni specifičnosti, znotrajcelični lokalizaciji in tkivno specifičnem izražanju (1). 17P-HSD tip 1, 2 in 3 so ključni encimi pri homeostazi steroidnih hormonov (16). 17P-HSD tip 1 (slika 4) je dimerni encim, ki katalizira redukcijo estrona v estradiol (1). V glavnem je izražen v jajčnikih, dojkah in placenti (1). Tudi 17P-HSD tip 2 je vključen v metabolizem estrogenov, vendar je njegovo delovanje ravno obratno delovanju tipa 1 - katalizira oksidacijo estradiola v estron (testosterona v andro -stendion, ...) in s tem zmanjša izpostavljenost tkiv pred delovanjem estrogenov. Izražen je v številnih tkivih: dojkah, maternici, prostati, jetrih, ledvicah in različnih epitelijskih celicah (17). 17P-HSD tip 3 je ključni encim sinteze testosterona - izražen je predvsem v testisih in katalizira redukcijo androstendiona v testosteron (slika 5) (16). Ostali tipi 17P-HSD imajo širšo substratno specifičnost. 17P-HSD tip 4 je vpleten v metabolizem steroidov in P-oksidacijo maščobnih kislin: oksidira estradiol v estron, dolgoverižne in razvejane maščobne kisline, sodeluje pri sintezi žolčnih kislin. Encim je prisoten v številnih tkivih, vendar pa je v največji meri izražen v jetrih (16). 17P-HSD tip 7 katalizira pretvorbo estrona v estradiol v rumenem telescu (močno je izražen v drugi polovici nosečnosti), ima pa tudi 3-keto reduktazno aktivnost, ki inaktivira dihidrotestosteron - katalizira torej aktivacijo estrogenov in inaktivacijo androgenov. Našli so ga v placenti, jajčnikih, dojkah, testisih, prostati in jetrih (18). Vloga 17P-HSD tip 8 v človeškem telesu še ni popolnoma jasna. Nahaja se v jetrih, ledvicah, jajčnikih in testisih ter nekaterih drugih tkivih (16). Katalizira inaktivacijo estradiola, testosterona in dihidrotestosterona, domnevajo, da je vpleten tudi v metabolizem maščobnih kislin (18). 17P-HSD tip 10 je homotetramerni mitohondrijski encim s široko substratno specifičnostjo: katalizira pretvorbo estradiola in dihidrotestosterona, ima 3a-HSD aktivnost, oksidira lahko 20P- in 21-hidroksilni skupini, katalizira metabolizem izolevcina ter oksidacijo razvejanih in nerazvejanih maščobnih kislin, sodeluje pa tudi pri metabolizmu žolčnih kislin (16, 19). V možganih naj bi bil odgovoren za metabolizem nevrosteroidov - katalizira oksidacijo alopregnanolona in alotetrahidrodeoksikortikosterona, ki sta pozitivna alosterična modulatorja GABAa receptorja. Izražen je v prostati, jetrih, možganih in srcu (19). 17P-HSD tipi od 11 do 14 so bili odkriti v zadnjih nekaj letih. 17P-HSD tip 11 oksidira estrogene in androgene - najboljši substrat je 5a-androstan-3P,17P-diol (16). Našli so ga v steroidogenih tkivih, trebušni slinavki, ledvicah, jetrih, pljučih, nadledvični žlezi in srcu (20). 17P-HSD tip 12 selektivno katalizira pretvorbo estrona v estradiol in je visoko Slika 4: Tridimenzionalna struktura 17p-HSD tip 1 s koencimom in ekvilinom (učinkovina, ki se uprablja pri estrogenski nadomestitveni terapiji) v aktivnem mestu (pdb koda 1EQU). Prikazane so tudi aminokisline katalitične tetrade: Asn114, Ser142, Tyr155 in Lys159. Figure 4: Three-dimensional structure of 17p-HSD type 1 complexed with coenzyme and equilin (used in estrogen replacement therapy) (pdb code 1EQU). Amino acids of the catalytic tetrad are also shown: Asn114, Ser142, Tyr155 and Lys159. rctinuJ retinaldehtdrfeduktaze irtinaldchul Slika 6: Pretvorba med retinolom in retinaldehidom z retinol-dehidrogenazami in retinaldehid-reduktazami Figure 6: Interconversion between retinol and retinaldehyde by retinol dehydrogenases and retinaldehyde reductases and ros tend ion testosteron Slika 5: Pretvorba med androstendionom in testosteronom s 17p-HSD tipoma 3 in 2 Figure 5: Interconversion between androstenedione and testosterone by 17p-HSD type 3 and 2 izražen v jajčnikih in dojkah. 17P-HSD tip 12 je s svojo ketoacil-koencim A (CoA) reduktazno aktivnostjo vključen tudi v podaljševanje maščobnih kislin (21). 17P-HSD tip 13 je specifično izražen v jetrih in je z lipidnimi kapljicami povezan protein. Njegovo N-terminalno zaporedje služi kot signal za usmerjanje v endoplazmatski retikulum in lipidne kapljice (22). 17P-HSD tip 14 oksidira in s tem inaktivira steroide (estradiol) v jetrih, možganih in placenti (23). Številni encimi SDR so vključeni tudi v metabolizem retinoidov. Glede na koencimsko in substratno specifičnost jih razdelimo v dve poddružini: retinol-dehidrogenazam podobni SDR (RoDH-podobni SDR) in retinaldehid-reduktazi 1 podobni SDR (RalR1-podobni SDR). So od NAD+ in NADP+-odvisne retinoid-oksidoreduktaze, pri čemer od NAD+-odvisni encimi katalizirajo oksidacijo retinola do retinaldehida, od NADP+-odvisni encimi pa katalizirajo redukcijo retinaldehida nazaj prnstegiaiidin E2 prostagtarnJin I Slika 7: Redukcija prostaglandina E2 s CBR1 Figure 7: Reduction of prostaglandin E2 by CBR1 v retinol (slika 6). Med človeške RoDH-podobne SDR uvrščamo 11-cis-retinol-dehidrogenazo, RoDH-4 in RoDH-podobno 3a-HSD - vsi imajo 3a-hidroksisteroid-dehidrogenazno in retinol-dehidrogenazno aktivnost. Retinaldehid-reduktazo 1 (RalR1) ali retinol-dehidrogenazo 11 (RDH11) ter RDH12, RDH13 in RDH14 pa uvrščamo med RalR1-podobne SDR. Obe poddružini encimov sta izraženi v jetrih, prostati, možganih, testisih, srcu in številnih drugih tkivih (24). Karbonil-reduktaze (CBR), ki jih uvrščamo med SDR, so monomerni citosolni encimi z oksidoreduktazno aktivnostjo. Mednje uvrščamo človeške CBR1, CBR3, CBR4 in 15-hidroksi-prostaglandin-dehidrogenazo. CBR1 je zastopana v številnih tkivih (jetra, epidermis, možgani, tanko črevo, centralni živčni sistem ...) in reducira (slika 7) številne biološko in farmakološko aktivne karbonilne spojine - kinone, ketoaldehide, aromatske aldehide in biogene aldehide, ima pa tudi od NADP+-odvisno 9-keto-prostaglandin-reduktazno in 15-hidroksi-prostaglandin-dehidrogenazno aktivnost (25). O fiziološki vlogi človeških CBR3 in CBR4 ni podatkov. CBR3 je izražen v jajčnikih, trebušni slinavki in črevesju, CBR4 pa v želodcu, hipofizi in maternici (25, 26). Od NAD-odvisna 15-hidroksi-prostaglandin-dehidrogenaza inaktivira prostaglandine in je izražena v številnih organih pri sesalcih (25). 3.3 SDR identificirani kot odprti bralni okvirji (ORF) Vloga nekaterih SDR, ki so bili identificirani kot odprti bralni okvirji, ni pojasnjena, medtem ko naj bi bili drugi povezani z malignimi obolenji - hepatokarcinogenezo, folikularnim limfomom, rakom dojk, idr. (14). V teku so različne molekularne in biokemijske raziskave, ki poskušajo opredeliti vlogo SDR iz te skupine pri boleznih pri človeku. 4 SDR kot farmakološke tarče Ker imajo SDR zelo pomembno fiziološko vlogo v človeškem organizmu, so zanimivi tudi kot farmakološke tarče. Za nekatere med njimi je bilo dokazano, da so povezani z genetskimi in metaboličnimi motnjami. Raziskave in razvoj inhibitorjev številnih hidroksisteroid- Preglednica 2: Človeške SDR in bolezni s katerimi so lahko povezane (HSD - hidroksisteroid-dehidrogenaza; RDH - retinol-dehidrogenaza; CBR - karbonil-reduktaza) Table 2: Human SDR forms and associated diseases (HSD - hydroxysteroid-dehydrogenase; RDH - retinol dehydrogenase; CBR - carbonyl reductase) ENCIM BOLEZEN ENCIMI INTERMEDIARNEGA METABOLIZMA UDP-galaktoza-epimeraza galaktozemija tip Ill dihidropteridin-reduktaza fenilketonurija tip II ENCIMI METABOLIZMA HORMONOV, MEDIATORJEV IN KSENOBIOTIKOV 3P-HSD tip 1 kongenitalna adrenalna hiperplazija 11 b-HSD tip 1 odpornost na inzulin, dislipidemija, debelost, arterijska hipertenzija 17P-HSD tip 1 rak dojk, jajčnikov in endometrija, endometrioza 17P-HSD tip 2 rak dojk, endometrija, črevesja in prostate, endometrioza 17P-HSD tip 3 psevdohermafroditizem 17P-HSD tip 4 rak endometrija, endometrioza, Zellwegerjev sindrom 17P-HSD tip 7 rak endometrija, endometrioza 17P-HSD tip 8 policistične ledvice 17P-HSD tip 10 duševna zaostalost, nevrodegeneracija, Alzheimerjeva bolezen 11-c/s-RDH zakasnjena adaptacija na svetlobo, fundus albipunctatus RDH12 avtosomalna recesivna retinalna distrofija CBR1 metastaziranje rakavih celic, rast tumorjev, angiogeneza dehidrogenaz in drugih encimov iz SDR naddružine so v teku in predstavljajo zelo obetavno področje za nove farmakološke pristope. Variante alelov gena za UDP-galaktoza-epimerazo so vzrok za pomanjkanje UDP-galaktoze in s tem za galaktozemijo tipa III (preglednica 2), variante alelov dihidropteridin-reduktaznega gena pa lahko povzročijo fenilketonurijo tipa II - znano je, da je biopterin pomemben kofaktor pri hidroksilaciji tirozina (14). Pomanjkanje 3b-HSD tip 1 je vzrok za nastanek redke oblike kongenitalne adrenalne hiperplazije, ki vodi do različnih stopenj izgubljanja soli pri ljudeh obeh spolov ter nepopolnega razvoja genitalij pri novorojenčkih (15). 11 b-HSD tip 1 je povezana z nastankom metaboličnega sindroma (odpornost na inzulin, dislipidemija, debelost in arterijska hipertenzija), zato je razvoj inhibitorjev tkivno specifične aktivacije glukokortikoidov zanimiv s stališča zdravljenja metaboličnih in kardiovaskularnih bolezni (27). 11 b-HSD tip 1 je induciran ob vnetju, zato lahko pride pri motnjah v njegovem delovanju do nepopolnega protivnetnega odziva (28). Tudi 17b-HSD so zanimive tarče za razvoj novih zdravilnih učinkovin, saj so udeležene v številnih fizioloških in patofizioloških procesih. Primarna vloga 17b-HSD tip 1 in 2 je uravnavanje delovanja estrogenov v človeškem tkivu. Čeprav sta v tkivu dojk izraženi obe izoobliki, v zdravem tkivu prevladuje oksidativna aktivnost (torej tip 2), medtem ko v malignem tkivu prevladuje tip 1 - inhibitorji 17b-HSD tipa 1 so zato zanimivi s stališča zdravljenja od estrogenov odvisnih vrst raka dojke (17). Za reduktivne 17b-HSD (tip 1, 3, 7), ki aktivirajo steroidne hormone, je značilno, da so lahko vpletene v razvoj hormonsko odvisnih oblik raka (npr. rak dojke, jajčnikov in prostate) (1, 17). Zmanjšano izražanje 17b-HSD tip 2 pa lahko vodi do raka na črevesju, prostati in dojkah (29). Številni 17b-HSD izoencimi so povezani tudi z rakom endometrija in endometriozo - predvsem gre za zmanjšano izražanje tipov 2 in 4 ter povečano izražanje tipov 1 in 7 (30, 31). Mutacije gena za 17b-HSD tip 3 preprečijo pretvorbo androstendiona v testosteron, kar lahko povzroči psevdohermafroditizem pri moških (18). Neaktivnost 17b-HSD tip 4 vodi do nastanka Zellwegerjevega sindroma - oboleli običajno umrejo v prvem letu življenja (16). Nizko izražanje gena za 17b-HSD tip 8 naj bi bilo povezano z nastankom policističnih ledvic (14). Mutacije gena za 17b-HSD tip 10 povezujejo s številnimi kliničnimi stanji - od blage duševne zaostalosti do progresivne nevrodegeneracije pri otrocih. Encim je zanimiv s stališča zdravljenja Alzheimerjeve bolezni, saj ima veliko afiniteto do b-amiloidnih peptidov in bi bil lahko povezan z mitohondrijsko disfunkcijo pri Alzheimerjevi bolezni. Ugotovili so, da številne maligne epitelne celice prostate vsebujejo visoke koncentracije tega izoencima, zato bi lahko imeli njegovi inhibitorji tudi protirakavo delovanje. Zaradi vloge 17b-HSD tip 10 pri oksidaciji pozitivnih alosteričnih modulatorjev GABAa receptorja je pospešena vazava GABA na receptor, kar ima za posledico antikonvulzivni in anksiolitični učinek (19). Da imajo SDR pomembno fiziološko vlogo v metabolizmu retinoidov dokazujejo mutacije človeškega gena, ki kodira za 11-cis-RoDH, saj so le-te povezane z zakasnjeno adaptacijo na temo in fundus albipunctatusom. Mutacije gena, ki kodira za RDH12, naj bi bile povezane z resno avtosomalno recesivno retinalno distrofijo (24). Človeška CBR1 ima zaradi zniževanja koncentracije PGE2 pomembno vlogo tudi pri preprečevanju metastaziranja rakavih celic, rasti tumorjev in njihovi angiogenezi (32, 33). 5 Sklep Čeprav številni encimi SDR še niso popolnoma opisani, o njihovem pomenu v človeškem telesu priča njihova številčna zastopanost ter raznolika fiziološka vloga. Zaradi vpletenosti v različne patofiziološke procese so predvsem v zadnjem desetletju predmet številnih raziskav. Zanimivi so s stališča novih terapevtskih pristopov k zdravljenju različnih genetskih, hormonsko odvisnih, metaboličnih ter drugih bolezni. Zaradi velike strukturne sorodnosti encimov SDR in njihove zastopanosti v različnih tkivih predstavlja raziskovalcem še poseben izziv odkritje učinkovin s selektivnim in tkivno specifičnim delovanjem. 6 Literatura 1. Wu X, Lukacik P, Kavanagh KL, Oppermann U. SDR-type human hydrox-ysteroid dehydrogenases involved in steroid hormone activation. Mol Cell Endocrinol 2007, 265-266: 71-76. 2. Opperman U, Filling C, Hult M et al. Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR): the 2002 update. Chem Biol Interact 2003, 143-144: 247253. 3. Keller B, Volkmann A, Wilckens T et al. Bioinformatic identification and characterisation of new members of short-chain dehydrogenase/reductase superfamily. Mol Cell Endocrinol 2006, 248: 56-60. 4. Jörnvall H, Persson M, Jeffery J. Alcohol and polyol dehydrogenases are both divided into two protein types, and structural properties cross-relate the different enzyme activities within each type. Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78 (7): 4226-4230. 5. Jörnvall H, Persson B, Krook M et al. Short-chain dehydrogenases/reduc-taes (SDR). Am Chem Soc 1995, 34 (18): 6003-6013. 6. Rossmann MG, Liljas A, Bränden C-I, Banaszak LJ.In: Boyer PD. The Enzymes, 3rd Edition, Academic Press, New York, 1975, 11: 61-102. 7. Ghosh D, Sawicki M, Pletnev V et al. Porcine carbonyl reductase. J Biol Chem 2001, 276: 18457-18463. 8. Miura T, Nishinaka T, Terada T. Different functions between human monomeric carbonyl reductase 3 and carbonyl reductase 1. Mol Cell Biochem 2008, 315(1-2): 113-121. 9. Oppermann U, Persson B, Filling C, Jörnvall H. Structure-function relationship of SDR hydroxysteroid dehydrogenases. IN: Weiner et al. Enzymology and Molecullar Biology of Carbonyl Metabolism 6, Plenum Press, New York, 1996: 403-415. 10. Filling C, Berndt KD, Benach J et al. Critical residues for structure and catalysis in short-chain dehydrogenases/reductases. J Biol Chem 2002, 227 (28): 25677-25684. 11. Persson B, Kallberg Y, Oppermann U, Jörnvall H. Coenzyme-based functional assignments of short-chain dehydrogenases/reductases (SDRs). Chem Biol Interact 2003, 143-144: 271-278. 12. Tanaka N, Nonaka N, Nakanishi M. Crystal structure of the ternary complex of mouse lung carbonyl reductase at 1.8 A resolution: the structural origin of coenzyme specificity in the short-chain dehydrogenase/reduc-tase family. Structure 1996, 4 (1): 33-45. 13. Kallberg Y, Oppermann U, Jörnvall H, Persson B. Short-chain dehydroge-nase/reductase (SDR) relationships: A large family with eight clusters commnon to human, animal and plant genomes. Prot Sci 2002, 11: 636641. 14. Oppermann U, Filling C, Jörnvall H. Form and functions of human SDR enzymes. Chem Biol Interact 2001, 130-132: 699-705. 15. Simard J, Ricketts ML, Gingras S et al. Molecular biology of the 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase/45-44 isomerase gene family. Endocrin Rev 2005, 26 (4): 525-582. 16. Moeller G, Adamski J. Multifunctionality of human 17ß-hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cell Endocrinol 2006, 248: 47-55. 17. Vihko P, Isomaa V, Ghosh D. Structure and function of 17ß-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and type 2. Mol Cel Endocrinol 2001, 171: 71-76. 18. Luu-The V. Analysis and characteristics of multiple types of human 17ß-hydroxysteroid dehydrogenase. J Steroid Biochem Mol Biol 2001, 76: 143-151. 19. Yang SY, He XY, Schulz H. Multiple functions of type 10 17ß-hydroxys-teroid dehydrogenase. Trends Endocrinol Metab 2005, 16 (4): 167-175. 20. Chai Z, Brereton P, Suzuki T et al. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type XI localizes to human steroidogenic cells. Endocrinology 2003, 144 (5): 2084-2091. 21. Luu-The V, Tremblay P, Labrie F. Characterisation of type 12 17ß-hydrox-ysteroid dehydrogenase, an isoform of type 3 17ß-hydroxysteroid dehy-drogenase responsible for estradiole formation in women. Mol Endocrinol 2006, 20 (2): 437-443. 22. Horiguchi Y, Araki M, Motojima K. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 is a liver-specific lipid droplet-associated protein. Biochem Biophys Res Commun 2008, 370 (2): 235-238. 23. Lukacik P, Keller B, Bunkoczi G et al. Structural and biochemical characterisation of human orphan DHRS10 reveals a novel cytosolic enzyme with steroid dehydrogenase activity. Biochem J 2007, 402: 419-427. 24. Kedishvili, NY. Retinoid-active short-chain dehydrogenases/reductases. In: Weiner H, Maser E, Lindahl R, Plapp B. Enzymology and molecular biology of carbonyl metabolism - 13; Carbonyl reductases. Purdue University Press, 2007: 217-223. 25. Maser E, Hoffmann F. Multifunctional carbonyl reductases of the short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) superfamily in mammalian species. In: Weiner H, Maser E, Lindahl R, Plapp B. Enzymology and molecular biology of carbonyl metabolism - 13; Carbonyl reductases. Purdue University Press, 2007: 169-183. 26. Meier M, Haller F, Spielhaupter C, Adamski J. Characterisation of human carbonyl reductase CBR4. In: Workshop on pre-receptor steroid metabolism as target for pharmacological treatment. Abstract book, Eibsee Hotel, Germany, May 26-28, 2008. 27. Opperman U. Type 1 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase as universal drug target in metabolic disease? Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 2006, 6 (3): 259-269. 28. Chapman KE, Secki JR. 11beta-HSD1, inflammation, metabolic disease and age-related cognitive (dys)function. Neurochem Res 2008, 33 (4): 624-636. 29. Vihko P, Härkönen P, Soronen P et al. 17ß-hydroxysteroid dehydrogenas-es - their role in pathophysiology. Mol Cell Endocrinol 2004, 215: 83-88. 30. Dassen H, Punyadeera C, Kamps R et al. Estrogen metabolizing enzymes in endometrium and endometriosis. Hum Reprod 2007, 22 (12): 31483158. 31. Smuc T, Pucelj MR, Sinkovec J et al. Expression analysis of the genes involved in estradiol and progesterone action in human ovarian endometriosis. Gynecol Endocrinol 2007, 23 (2): 105-111. 32. Ismail E, Al-Mulla F, Tsuchida S et al. Carbonyl reductase: a novel metastasis-modulating function. Cancer Res. 2000, 60 (5): 1173-1176. 33. Takenaka K, Ogawa E, Oyanagi H et al. Carbonyl reductase expression and its clinical significance in non-small-cell lung cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005, 14 (8): 1972-1975. Regulatorna vloga Ca2+ ionov pri sproščanju mediatorjev vnetja iz mastocitov The regulatory role of Ca2+ ions in the secretion of inflammatory mediators from mast cells Ilonka Ferjan Povzetek: Mastociti so celice vezivnega tkiva, ki Imajo ključno vlogo pri vnetju In alergijskih reakcijah. Po Imunološki ali nelmunološkl stimulaciji sproščajo številne posrednike (mediatorje) vnetja. Sproščanje mediatorjev je v veliki meri odvisno od koncentracije prostih Ca2+ ionov v celici. Po aktivaciji mastocita se prosta koncentracija Ca2+ v celici močno zveča, kar vpliva na sproščanje vnetnih mediatorjev iz mastocitov. Spremembe proste koncentracije Ca2+ v celici so odvisne od aktivnosti nekaterih ionskih izmenjevalnih sistemov v mastocitu; Na+/Ca2+-izmen-jevalca, Na+/K+ - ATPaze ter Ca2+-ATPaze. Aktivnost teh izmenjevalcev je odvisna od koncentracije zunajceličnih in znotrajceličnih Ca2+ ionov. Številne zdravilne učinkovine in endogene spojine vplivajo na koncentracijo zunajceličnih in znotrajceličnih Ca2+ ionov ter na aktivnost ionskih izmenjevalnih mehanizmov mastocita. Kombinirano delovanje izmenjevalnih mehanizmov mastocita lahko pripomore pri spremenjenem sproščanju mediatorjev med vnetno ali alergijsko reakcijo. Ključne besede: mastociti, Ca2+ ioni, ionski izmenjevalni mehanizmi mastocitov, sproščanje mediatorjev vnetja Abstract: Mast cells play a central role in inflammatory and allergic reactions. In response to immunologic or non-immunologic stimuli they release a variety of inflammatory mediators. The secretion of the mediators is strongly dependent on the concentration of the cytosolic calcium. Immunologic or nonimmunologic stimmulation of mast cells increases intracellular concentration of free Ca2+ and thus influences on the mediators release from mast cells. The changes of intracellular free Ca2+ depend on the activity of Na+Ca2+- exanger, Na+/K+ - ATPase and Ca2+-ATPase of mast cell. Several drugs and endogenic compounds can modify the concentration of intracellular free Ca2+ ions by influencing the activity of the exchange mechanisms of mast cell. Combined actions of these exchange mechanisms serve to change mediators release from mast cells in inflammatory or allergic reactions. Key words: mast cells, Ca2+ ions, ionic exchangers of mast cells, secretion of inflammatory mediators 1 Uvod Mastociti (tkivni bazofilci) so celice vezivnega tkiva, ki Imajo ključno vlogo pri procesu vnetja in pri alergičnih reakcijah (1,2). Plazmina membrana mastocitov vsebuje specifične membranske receptorje, ki imajo visoko afiniteto za vezavo imunoglobulina IgE (3,4). Povezava dveh molekul IgE z antigenom povzroči imunološko aktivacijo celice. Na membrani mastocita so pa poleg receptorjev za vezavo IgE protiteles prisotni tudi številni drugi receptorji za vezavo endogenih in eksogenih spojin, ki lahko povzročijo neimunološko sproščanje mediatorjev vnetja (5,6,7). Med neimunološke sproščevalce sodijo bazični sproščevalci; mono-, di- in poliamini (spojina 48/80) ter peptidi, kalcijeve ionofore, lektini (concanavalin A) in citokini (interlevkini) ter rastni dejavniki (živčni rastni dejavnik - NGF). Po aktivaciji mastocitov z različnimi imunološkimi (kompleks antigena in dveh IgE protiteles) ali neimunološkimi (številne endogene ali eksogene spojine) stimulusi sproščajo mastociti številne kemijske posrednike (mediatorje) vnetja. Mediatorje vnetja delimo v dve skupini. V prvo skupino štejemo tiste spojine, ki so ves čas shranjene v zrncih celic (histamin, serotonin, eozinofilni kemotaktični faktor, nevtrofilni kemotaktični faktor, lizosomski encimi) in se iz njih sprostijo po aktivaciji celice z ustreznim stimulusom. Drugo skupino mediatorjev vnetja pa sestavljajo spojine, ki nastajajo v mastocitu med procesom vnetja in se nato tudi sproščajo iz mastocita. Mednje sodijo: arahidonska kislina, prostaglandini, prostaciklini, citokini (interlevkini), rastni dejavniki (živčni rastni dejavnik). asist. dr. Ilonka Ferjan, mag.farm., Institut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska fakulteta, Korytkova 2, 1000 ljubljana Pri procesu sproščanja mediatorjev vnetja imajo pomembno vlogo kalcijevi ioni. Sproščevalce mediatorjev vnetja lahko razdelimo na tiste, ki potrebujejo za svoje delovanje zunajcelične kalcijeve ione (3,8) in tiste, ki niso povsem odvisni od zunajceličnih kalcijevih ionov, njihovo delovanje pa zavisi od znotrajcelične koncentracije prostih kalcijevih ionov (8,9). V prvo skupino sproščevalcev prištevamo imunološke sproščevalce, lektine, ionofore, citokine (interlevkine) in rastne dejavnike (živčni rastni dejavnik). V drugo skupino sproščevalcev pa sodijo neimunološki polibazični sproščevalci - poliamini (spojina 48/80) in peptidi. 2 Mehanizem sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita Vezava sproščevalca na membrano mastocita preko aktivacije proteina G aktivira encime (fosfolipazo C, proteinsko kinazo C) v membrani mastocita, ki imajo pomembno vlogo pri mehanizmu sekrecije vnetnih mediatorjev iz mastocita (4,10). Aktivacija fosfolipaze C povzroči razgradnjo fosfatidilinizitola (8,11). Pri tem nastanejo naslednji metabolični produkti: diacilglicerol (DAG), fosfatidilna kislina in inozitol trifosfat.(IP3). IP3 sproži odprtje kalcijevih kanalov v plazemski membrani in s tem vdor Ca2+ v citoplazmo mastocita in dvig koncentracije prostih Ca2+ v citoplazmi. IP3 povzroči tudi sprostitev Ca2+ iz endoplazmatskega retikuluma (ER) v citoplazmo in tudi na ta način zveča koncentracijo prostih Ca2+ v mastocitu. DG aktivira proteinsko kinazo C, ki omogoča fosforilacijo proteinov. To ima pomemno vlogo pri delovanju mikrotubulov in mikrofilamentov in tako tudi pri premikanju granul z mediatorji vnetja k plazmini membrani, kar omogoča kasnejše zlitje membrane granul z plazmino membrano mastocita in proces eksocitoze. Osnovni stimulus za sproščanje mediatorjev vnetja iz aktiviranih mastocitov je povečana koncentracija znotrajceličnih prostih Ca2+ (12). Kratkotrajnemu zvečanju znotrajceličnih prostih Ca2+ sledi odstranitev Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (membranske zaloge za Ca2+, endoplazmatski retikulum) ali v izvencelično tekočino (13,14). Pri uravnavanju proste koncentracije Ca2+ v celici imajo pomembno vlogo specifični na membrano vezani proteini (Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem, Ca2+ - ATPaza ter Na+/K+ - ATPaza), ki skrbijo za transport Na+, K+ in Ca2+ v citoplazmo celice in iz nje (15). Omenjeni transportni proteini uravnavajo znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ pri številnih evkariotskih celicah. 3 Transportni proteini, ki skrbijo za uravnavanje koncentracije Ca2+ v celicah. Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem. Na+/Ca2+ - izmenjevalec je reverzibilni transportni protein, ki omogoča izmenjavo treh Na+ skozi celično membrano za en Ca2+ (16,17). V fizioloških razmerah Na+/Ca2+ - izmenjevalec transportira Na+ iz zunajceličnega prostora, kjer je njihova koncentracija večja v citoplazmo, kjer je koncentracija Na+ manjša. Transport Na+ v smeri nižjih koncentracij daje izmenjevalcu gonilno moč za transport Ca2+ v smeri proti koncentracijskemu gradientu, torej ven iz celice. Če se spremeni smer koncentracijskega gradienta za Na+, izmenjevalec deluje v obratni smeri in transportira Na+ iz celice in Ca2+ v celico. Smer delovanja izmenjevalnega sistema je torej odvisna od koncentracije Na+ in Ca2+ v celici in v mediju, kjer se celica nahaja. Na+/K+ - ATPaza. Na+/K+ - ATPaza je transmembranski encim, ki je odgovoren za aktivni transport Na+ iz celice in K+ v celico (18). Na ta način se vzdržuje membranski potencial celice. Transport Na+ in K+ pri tem poteka v nasprotni smeri koncentracijskega gradienta. Zato je za ta proces črpanja ionov potrebna energija, ki se tvori pri hidrolizi ATP molekul. Če se aktivnost Na+/K+ - ATPaze zmanjša, se koncentracija Na+ v celici zveča. Zvečana koncentracija znotrajceličnih Na+ aktivira Na+/Ca2+ -izmenjevalec in povzroči zamenjavo znotrajceličnih Na+ za zunajcelične Ca2+. Kot posledica tega se zveča znotrajcelična koncentracija Ca2+, kar ima lahko za posledico aktivacijo številnih celičnih encimov in različnih celičnih procesov. Ca2+ - ATPaza. Ca2+ -ATPaza je encim, ki se nahaja na plazmini membrani celice, kot tudi v celici na membrani endoplazmatskega retikuluma. Ca2+-ATPaza skrbi za aktivni transport Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (celična membrana, endoplazmatski retikulum, mitohondriji), kot tudi iz celice v zunajcelično tekočino. Pri tem potujejo Ca2+ proti koncentracijskemu gradientu za Ca2+ . Ker Ca2+-ATPaza omogoča prehod Ca2+ v smeri od nižje koncentracije k višji koncentraciji, je zato potrebna energija, ki se sprošča pri hidrolizi ATP molekul (19). Gre torej za energetsko odvisen aktivni proces. 4 Pomen Ca2+ pri procesu sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita V mastocitu je v stanju mirovanja koncentracija prostih Ca2+ zelo nizka (100 nmol/L) (21). Po aktivaciji mastocitov z imunološkim ali z neimunološkim sproščevalcem pride v mastocitu do kratkotrajnega zvečanja koncentracija prostih Ca2+ v celici (12,20), kar povzroči sproščanje številnih mediatorjev vnetja. Večja koncentracija znotrajceličnih Ca2+ vpliva na številne celične funkcije, kot so fosforilacija specifičnih proteinov, aktivacija celičnih encimov in aktivacija mikrofilamentov, ki potiskajo zrnca z mediatorji vnetja k celični membrani. Sledi proces zlitja membrane zrnc s plazmino membrano in sprostitev mediatorjev vnetja iz zrnc v zunajcelični prostor. Večina kalcija v mastocitih (>99%) je vezanega na proteine v citoplazmi celice ali shranjenega v celičnih zalogah (13,14,22). Največja zaloga Ca2+ v mastocitih je endoplazmatski retikulum (ER). Na membrani ER se nahajajo receptorji za IP3, ki nastane po aktivaciji celice s sproščevalcem vnetja. Vezava IP3 na receptorje na plazmino membrano celice ali na ER v celici sproži odprtje kalcijevih kanalov v membrani ER ter plazemski membrani in s tem dvig koncentracije prostih Ca2+ v citoplazmi, kar vodi v sproščanje vnetnih mediatorjev. 5 Vzdrževanje nizke koncentracije prostih Ca2+ pri neaktiviranih mastocitih Po vsaki aktivaciji mastocita s sproščevalcem, kateri sledi zvečanje intracelularne proste koncentracije Ca2+, se mora koncentracija prostih Ca2+ v celici hitro znižati. Pri tem je pomemben transport Ca2+ iz citoplazme celice v endoplazmatski retikulum oziroma v zunajcelično tekočino. Tako se vspostavi ponovno nizka koncentracija prostih Ca2+ v celici. Pri tem imajo podobno, kot pri številnih drugih celicah tudi pri mastocitu pomembno vlogo specifični na membrano vezani proteini (Ca2+-ATPaza, Na+/K+ - ATPaza in Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem), s pomočjo katerih se Ca2+ odstrani iz citoplazme (15). Ca2+ - ATPaza. Ca2+ -ATPaza omogoča aktivni transport Ca2+ iz citoplazme mastocita in tako znižuje koncentracijo prostih Ca2+ v celici (20). V mastocitih sta dve vrsti Ca2+ -ATPaze. Prva vrsta se nahaja na citoplazmatski membrani mastocita, druga vrsta pa na membrani endoplazmatskega retikuluma (12). Tako prehaja Ca2+ iz citoplazme v celične zaloge (celična membrana, endoplazmatski retikulum, mitohondriji), kot tudi iz celice v zunajcelično tekočino (19). Na+/K+ - ATPaza in Na+/Ca2+ - izmenjevalni sistem V stanju mirovanja mastocita ima pomembno vlogo koncentracija Na+ v mastocitu (15 mM) in v zunajcelični tekočini (134 mM) v kateri se mastocit nahaja. Na+/K+ - ATPaza omogoča aktivni transport Na+ iz celice in K+ v celico in tako vzdržuje visoko koncentracijo Na+ v izvencelični tekočini. Ca2+ iz citoplazme mastocita se zato lahko zamenjajo z Na+ iz medija s pomočjo Na+/Ca2+ - izmenjevalnim sistemom, ki se nahaja na plazmini membrani mastocita (18, 19). Na ta način se lahko koncentracija Ca2+ v citoplazmi močno zniža. 6 Mehanizmi, ki so vpleteni pri spremembi intracelularne koncentracije prostih kalcijevih ionov v mastocitu po delovanju različnih spojin. Številne endogene spojine in zdravilne učinkovine lahko vplivajo na spremembe znotrajcelične proste koncentracije Ca2+. Intracelularna koncentracija prostih Ca2+ se lahko zveča kot posledica: 1) vstopa Ca2+ iz zunajcelične tekočine v celico (23,24). Tako delujejo številni imunološki in neimunološki sproščevalci vnetnih mediatorjev (17,25). 2) sprostitve Ca2+ iz znotrajceličnih vezavnih mest (9). Številne bazične spojine (peptidi in spojina 48/80) lahko preko zanje specifičnih vezavnih mest aktivirajo encim fosfolipazo C. IP3, ki pri tem nastaja povzroči zvečanje znotrajcelične proste koncentracije Ca2+, kar sproži proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocitov. 3) inhibicije privzema Ca2+ v intracelularne zaloge (22).l Privzem Ca2+ v zaloge poteka s pomočjo transportnih proteinov Na+/Ca2+ - izmenjevalnega sistema in Ca2+-ATPaze. Lipofilne zdravilne učinkovine (antipsihotiki in antidepresivi) v večjih koncentracijah lahko inhibitorno vplivajo na omenjene transportne sisteme in na ta način zavro privzem Ca2+ v njihove zaloge. Tako se zveča koncentracija prostih Ca2+ v celici, posledica česar je lahko sproščanje vnetnih mediatorjev iz mastocitov (26,27). V eksperimentalne namene se za inhibicijo Ca2+-ATPaze uporablja tapsigargin (22). 4) inhibicije encima Na+/K+ - ATPaze. Če se aktivnost Na+/K+ - ATPaze zmanjša, to povzroči kopičenje Na+ v mastocitu (18,19). S pomočjo Na+/Ca2+ - izmenjevalnega sistema se nato Na+ iz citoplazme izmenjuje s Ca2+ iz zunajcelične tekočine ali iz celičnih zalog, kar zveča znotrajcelično koncentracijo prostih Ca2+ in to je stimulus za sproščanje vnetnih mediatorjev. Med zdravili, ki se uporabljajo kot inhibitorji Na+/K+ - ATPaze so poznani kardiotonični glikozidi. Kardiotonični glikozidi preko inhibitornega učinka na Na+/K+ - ATPazo lahko potencirajo proces sproščanja mediatorjev vnetja, ki ga povzroči tako imunološka, kot neimunološka aktivacija mastocitov (19). Po drugi strani pa nekatere zdravilne učinkovine (antipsihotiki ali antidepresivi) lahko zaradi svoje velike lipofilnosti inhibirajo sproščanje Ca2+ iz znotrajceličnih vezavnih mest. Zato se koncentracija prostih Ca2+ v citoplazmi mastocita po imunološki ali neimunološki stimulaciji ne more ustrezno zvečati, da bi prišlo do sprostitve mediatorjev vnetja iz mastocita. Na ta način lahko zgoraj omenjene spojine zavrejo proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocitov (26,27). 7 Sklep Sprememba proste koncentracije Ca2+ v mastocitu ima pomembno vlogo pri sproščanju mediatorjev vnetja. Številne endogene spojine kot tudi zdravilne učinkovine lahko na različne načine preko spremembe proste koncentracije Ca2+ v celici vplivajo na proces sproščanja mediatorjev vnetja iz mastocita in na ta način potencirajo ali inhibirajo vnetni odgovor organizma. 8 Literatura 1. Falcone FH, Haas H, Gibbs BF. The human basophil: a new appreciation of its role in immune responses. Blood 2000;96(13):4028-38. 2. Kimata M, Inagaki N, Kato T, Miura T, Serizawa I, Nagai H. Roles of mitogen- activated protein kinase pathways for mediator release from human cultured mast cells. Biochem Pharmacol 2000;60(4):589-94. 3. Tedeschi A, Lorini M, Gibelli S, Miadonna A. Effects of protein kinase C and phospholipase C inhibitors on IgE-dependent basophil histamine release. Inflammation Research 2000;49:480-5. 4. Windmiller DA, BackerJM. Distinct Phosphoinositide 3-kinases mediated mast cell degranulation in response to G-protein-coupled versus FcepsilonRI receptors. J Biol Chem 2003;«78(14):11874-8. 5. Hanson DA, Ziegler SF. Regulation of ionomycin-mediated granul release from rat basophil leukemia cells. Mol Immunol 2002;38(16-18):1329-35. 6. Shefler I, Taube Z, Medalia O, Sagi-Eisenberg R. Basic secretagogues activate protein tyrosine phosphorilation and release of arachidonic acid in mast cells via a novel protein kinase C and phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. Eur J Immunol 1998;28:3468-78. 7. Seebeck J, Westenberger K, Elgeti T, Ziegler A, Schitze S. The exocytotic signaling induced by nerve growth factor in the presence of lyso- phosphatidylserine in rat peritoneal mast cells involves a type D phospholipase. Regulatory peptides 2001;102:93-99. 8. Ferjan I, Carman-Krzan M, Erjavec F. Comparison of histamine and serotonin release from rat peritoneal mast cells induced 9. Shefler I, Sagi-Eisenberg R. Gi-mediated activation of the syk kinase by the receptor mimetic basic secretagogues of mast cells: role in mediating arachidonic acid/metabolites release. J Immunol 2001;167(1):475-81. 10. Ferjan I, Carman-Krzan M. Differential effect of interleukin-3, steam cell factor and nerve growth factor on histamine and serotonin release from rat mast cells. Inflamm Res 2000;49:S15-S16. 11. Deane JA, Fruman DA. Phosphoinositide 3-kinase: diverse roles in immune cellactivation. Annu Rev Immunol 2004;22:563-98. 12. Dorval V, Dufour M, Leclerc P. Role of protein tyrosine phosphorilation in the thapsigargin-induced intracellular Ca2+ store deplation during human sperm acrosome reaction. Molecular Human Reproduction 2003;9:125-31. 13. Alfonso A, Botana MA, Vieytes MR, LouzaoMC, Botana LM. Effect of signal transduction pathways on the action of thapsigargin on rat mast cells. Biochemical Pharmacology 1994;47:1813-20. 14. Inesi G, Wade R, Rogers T. The sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump: Inhibition by thapsigargin and enhancement by adenovirus-mediated gene transfer. Annals of the New York Academy of Sciences 1998;853:195-206. 15. Rumpel E, Pilatus U, Mayer A, Pecht I. Na+and Ca2+ gradients across the membrane modulate the secretory response of mast cells. Int Arch Allergy Immunol 1995;107:351-3. 16. Alfonso A, Lago J, Botana MA, Vietes MR, Botana LM. Characterization of Na+Ca2+exchanger on rat mast cells. Cellular Physiol Biochem1999;9:53-71. 17. Praetorius HA, Friis UG, Praetorius J, Johansen T Evidence for a Na+Ca2+ exchange mechanism in rat peritoneal mast cells. Pflugers Arch 1998;437:86-93. 18. Lago J, Alfonso A, Vieytes MR, Botana LM. Ouabain induced enhancement of rat mast cells response . Modulation by protein phosphorilation and intracellular pH. Cellular Signaling 2001;13:515-24. 19. Knudsen T. The Na+K+-pump in rat peritoneal mast cells: some aspects of regulation of activity and cellular function. Danish Medical Bulletin 1995;42:441-53. 20. Alfonso A, Cabado AG, Vietes MR, Botana LM.Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol 2000;130:1809-16. 21. Inesi G, Wade R, Rogers T. The sarcoplasmic reticulum Ca2+ pump: Inhibition by thapsigargin and enhancement by adenovirus-mediated gene transfer. Annals of the New York Academy of Sciences 1998;853:195-206. 22. Huber M, Huges MR, Krystal G. Thapsigargin-induced degranulation of mast cells is dependent on transient activation of phosphatidylinositol-3 kinase. J Immunol 2000;165:124-33. 23. Micera A,Puxeddu I, Aloe I, Levi-Schaffer F. New insights on the involvement of Nerve Growth Factor in allergic inflammation and fibrosis. Cytokine Growth Factor Rev 2003;14:369-74. 24. Stempelj M, Carman-Krzan M , Ferjan I. Regulatory role of extracellular Na+ and Ca2+ ions in nerve growth factor induced histamine secretion from rat mast cells. Inflamm Res 2003;52:74-8. 25. Stempelj M and Ferjan I. Signaling pathway in nerve growth factor induced histamine release from rat mast cells. Inflamm Res 2005;54:344-349 26. Ferjan I and Erjavec F. Effect of Ca2+ ions on the inhibition of histamine and serotonin secretion caused by phenothiazines. Fundamental and clinical pharmacology 1999;13 (Suppl 1):145. 27. Ferjan I, Erjavec F. Changes in histamine and serotonin secretion from rat mast cells caused by antidepressants. Inflamm Res 1996;45:141-4. Sodobni pristopi k izdelavi trdnih disperzij z izboljšano biološko uporabnostjo učinkovin Contemporary approaches to solid dispersions production with improved drug bioavailability Odon Planinšek Povzetek: Velik delež novih zdravilnih učinkovin je težko vodotopnih, kar omejuje njihovo absorpcijo. Povečevanje biološke uporabnosti teh spojin je eden izmed največjih izzivov razvoja sodobnih farmacevtskih oblik. Z razvojem trdnih disperzij lahko pogosto presežemo omejitve drugih metod povečevanja hitrosti raztapljanja, kot so: tvorba soli, solubilizacija z uporabo sotopil ali zmanjševanje velikosti delcev in dosežemo želeno sproščanje učinkovine. Po stiku trdne disperzije z vodnim medijem pride do hitre raztopitve pomožne snovi, težko topna učinkovina pa se sprosti v obliki koloidnih delcev z veliko specifično površino, s čimer se povečata njena hitrost raztapljanja in biološka uporabnost. Prispevek obravnava omejitve, ki so v preteklosti preprečevale industrijsko proizvodnjo trdnih disperzij, kamor spadajo predvsem zapleteni postopki izdelave, slaba ponovljivost fizikalno-kemijskih lastnosti, omejitve povezane z razvojem ustrezne farmacevtske oblike in fizikalna nestabilnost. Prav tako so opisane tudi tehnologije, ki danes omogočajo industrijsko proizvodnjo trdnih disperzij, kot so: oblaganje sladkornih jeder v zvrtinčenih plasteh, iztiskanje talin, neposredno polnjenje želatinskih kapsul s talinami, uporaba površinsko aktivnih snovi in tehnologija s superkritičnimi fluidi. Ključne besede: trdne disperzije, biološka uporabnost, hitrost raztapljanja Abstract: Large percentage of new drug compounds are poorly water soluble. Bioavailability increase of these compounds represents one of the major chalenge in the development of drug formulations. To achieve desired drug release, the development of solid dispersions can overcome the limitations of approaches such as salt formation, solubilization by cosolvent or particle size reduction. After the solid dispersion is exposed to aqueous media, the carrier dissolves and the drug is released as fine colloidal particles with large surface area that increases dissolution rate and bioavailability. Article discusses limitations that dissabled industrial production of solid dispersions in the past which include laborious methods of preparation, low reproducibility of physicochemical characteristics, difficult dosage form development and low physical stability. Technologies which today enable industrial production of solid dispersion such as spraying on sugar beads using fluidized bed coating system, hot-melt extrusion, direct capsule filling, use of surface active carriers and supercritical fluid technology are also described. Key words: solid dispersions, bioavailability, dissolution rate 1 Uvod Raztapljanje učinkovine v bioloških medijih je poleg njene permeabilnosti najpomembnejši parameter, ki vpliva na biološko uporabnost. Povečamo jo lahko z izdelavo soli, ki pa ni mogoča pri uporabi nevtralnih učinkovin. Tudi pri uporabi šibkih kislin ali baz je lahko ta metoda nepraktična, kadar izboljšanje raztapljanja prepreči pretvorba soli v prvotno obliko kisline oziroma baze. Solubilizacija učinkovin v organskih topilih ali v vodnem mediju z uporabo površinsko aktivnih snovi v kombinaciji s sotopili vodi v izdelavo tekočih formulacij, ki so s stališča komercializacije izdelka manj zaželene od trdnih farmacevtskih oblik (1). Analiza modificirane Noyes-Whitneyeve enačbe omogoča pregled nekaterih možnosti za izboljšanje hitrosti raztapljanja (dC/dt) v vodi težko topnih učinkovin (Enačba 1) (2). dC AD(C-C) S — (1) dt h A je površina, ki je na razpolago za raztapljanje, D difuzijski koeficient spojine, CS topnost spojine v mediju za raztapljanje, C koncentracija spojine ob času t in h debelina difuzijske plasti v stiku s površino delca, ki se raztaplja. izr. prof. dr. Odon Planinšek, mag. farm., Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana Prva možnost za povečanje hitrosti raztapljanja je povečanje površine, ki je na voljo za raztapljanje. To lahko dosežemo z zmanjševanjem velikosti delcev ali z izboljšanjem močenja snovi, ki se raztaplja. Uporaba različnih mlinov ali nadzorovane kristalizacije ima omejitve glede minimalne velikosti delcev, ki jih lahko izdelamo. Poleg tega je rokovanje s finimi delci v proizvodnji zelo zahtevno. Teoretično lahko stanjšamo tudi debelino difuzijske plasti, česar pa praktično, glede na definirane hidrodinamične pogoje v telesu, ne moremo doseči. Bolj smiselno je zagotavljanje „sink" pogojev, ki pa so odvisni predvsem od permeabilnosti mukoze, sestave in volumna tekočin v prebavni cevi. Permeabilnost mukoze lahko povečamo z dodatkom ustreznih pomožnih snovi, ki pa v preteklosti niso dale najboljših rezultatov. Aplikacija učinkovine takoj po zaužitju hrane omogoča izboljšanje raztapljanja in podaljšanje časa, ki je na voljo za raztapljanje. Vpliv hrane na raztapljanje lahko napovedujemo s testiranjem raztapljanja v biorelevantnih medijih (3). Uporaba različnih formulacijskih pristopov predstavlja verjetno najbolj zanimivo skupino možnosti za izboljšanje hitrosti raztapljanja težko topnih učinkovin. Poleg obarjanja različnih kristalnih oblik, tvorbe amorfov ali psevdopolimorfov, lahko za ta namen izdelujemo tudi trdne disperzije. 2 Definicija trdne disperzije Trdna disperzija je disperzija ene ali več aktivnih komponent v inertnem nosilcu, oziroma ogrodju, ki je v trdnem agregatnem stanju. Pripravimo jo lahko s taljenjem, raztapljanjem ali kombinacijo obeh metod. Pri tem lahko pride do že omenjene pospešitve ali do upočasnitve sproščanja. Med pomožno snovjo (nosilcem) in učinkovino lahko pride do različnih interakcij. Nastanejo lahko različne strukture, kot so: enostavna evtektična zmes, trdna raztopina, amorfna raztopina in amorfna suspenzija, amorfni precipitat v/na kristalnem nosilcu, kompleksna spojina ali kombinacije naštetih struktur (4). Trdne disperzije sta prva predstavila Sekiguchi in Obi (5). Evtektična zmes v vodi težko topne zdravilne učinkovine sulfatiazola in fiziološko inertnega, vodotopnega nosilca sečnine, se po peroralni aplikaciji hitreje absorbira in izloči iz telesa, kot sam sulfatiazol. Strukture in mehanizmi, ki vplivajo na raztapljanje so bili v Farmacevtskem vestniku predstavljeni v sklopu metod za povečevanje topnosti in hitrosti raztapljanja učinkovin opisane leta 2002 (6). 3 Prednosti izdelave trdnih disperzij Zaradi povečanja hitrosti raztapljanja pride do povečanja hitrosti in obsega absorpcije zdravilne učinkovine. Odmerek zdravilne učinkovine lahko zato tudi zmanjšamo. Posledica povečane absorpcije je lahko tudi zmanjšanje predsistemskega metabolizma. Tako je povečana hitrost raztapljanja 17--estradiola v črevesju vzrok za nasičenje encimskih sistemov, ki so odgovorni za predsistemski metabolizem (4). 4 Omejitve izdelave trdnih disperzij Uporaba različnih preslabo definiranih metod izdelave, slaba ponovljivost izdelave, težave pri izdelavi ustrezne farmacevtske oblike, omejitve glede povečevanja proizvodne serije ter fizikalna in kemijska nestabilnost so v preteklosti preprečevale komercializacijo trdnih disperzij. 4.1 Omejitve povezane z metodo izdelave Temperature, ki so jih mnogi raziskovalci uporabljali pri izdelavi trdnih disperzij s taljenjem, so bile v začetku razvoja zelo visoke (nad 100°C pri uporabi kombinacije acetaminofen-urea, ali nad 200°C v primeru uporabe sladkorjev) (7, 8). Nižjo temperaturo so uporabili za taljenje nifedipina in PEG 6000 (85°C) (9). Ohlajanje talin so izvajali z uporabo ledene kopeli, pri čemer so nekateri uporabili mešanje, drugi ohlajen zrak ali pa so talino nadzorovano počasi ohlajali. Disperzije je bilo treba do več dni shranjevati pri nizki temperaturi, da je prišlo do strjevanja, ki je omogočilo naknadno drobljenje. Glavna omejitev uporabe metode raztapljanja za izdelavo trdne disperzije je neustrezna topnost učinkovine in pomožne snovi v istem topilu. Zaradi nizke topnosti ene od komponent je za izdelavo trdne disperzije potrebno uporabiti velik volumen topila. Tako sta npr. Chiou in Riegelman (10) 0,5g grizeofulvina in 4,5g PEG 6000 raztapljala v 500 ml etanola. Nekateri avtorji so težavo reševali tako, da so uporabili sotopila, drugi pa tako, da so le učinkovino raztopili v organskem topilu in jo v obliki raztopine dodali staljeni pomožni snovi (11). 4.2 Omejitve zaradi neponovljivosti fizikalno-kemijskih lastnosti Poleg različnih možnosti, ki so na voljo npr. za ohlajanje taline ali metod sušenja raztopine pri izdelavi trdnih disperzij, tudi mnogi drugi parametri vplivajo na lastnosti produkta. Sem prištevamo hitrost segrevanja, maksimalno temperaturo segrevanja, čas vzdrževanja maksimalne temperature, metodo in hitrost ohlajanja, metodo mletja in končno velikost delcev. Kristaliničnost komponente v trdni disperziji je pogosto odvisna od segrevanja do tiste temperature kjer nastane bistra raztopina učinkovine in pomožne snovi (11). Nepopolno raztapljanje komponent v talini, podobno kot njuno razmerje ali velikost delcev zdrobljene disperzije, vodi v spremembe v raztapljanju (11,12). Tudi pri izdelavi trdne disperzije z metodo raztapljanja mnogokrat nastane amorfna oblika učinkovine. Delež kristaliničnosti oziroma amorfnosti je odvisen od razmerja učinkovina-pomožna snov ter od mnogih drugih parametrov kot so: narava topila, razmerje učinkovina-topilo ali pomožna snov-topilo, način ter hitrost sušenja. 4.3 Omejitve povezane z razvojem farmacevtske oblike Za ustrezno klinično uporabo in komercializacijo zdravila je potrebno trdno disperzijo vgraditi v kapsulo ali tableto. Pri tem se lahko pojavijo težave glede možnosti drobljenja delcev, ki so premehki. Druge težave so lepljivost, slabe pretočne lastnosti, nestisljivost, nekompatibilnost učinkovine s pomožnimi snovmi in nestabilnost trdnih disperzij. V literaturi najdemo nekaj opisov relativno neuspešnih razvojev farmacevtskih oblik, ki vsebujejo trdne disperzije. Ford in Rubinstein sta staljeno disperzijo indometacina in PEG (tališče disperzije je 100 °C) dodajala zmesi natrijevega škrobnega glikolata in kalcijevega hidrogehkarbonata v mešalniku pri 70°C ter tako izdelala granule (13). Te sta nato strjevala en dan pri 25°C, dodala Mg stearat in izdelala tablete. Končne tablete z maso 600 mg so vsebovale le 25 mg indometacina. Kljub temu, da je bil delež pomožnih snovi zelo visok, izdelane tablete niso razpadle. Težave povezane s slabo razpadnostjo tablet so posledica lastnosti pomožnih snovi, kot je npr. PEG, ki pri tabletiranju delujejo kot dobra veziva. Tako se med stiskanjem lahko zmehčajo ali stalijo, napolnijo pore med delci ter s tem med raztapljanjem preprečijo razpad tablete. Poleg tega mehanizma lahko med stiskanjem pomožna snov prekrije delce razgrajevala. Povečevanje serije pri metodi izdelave trdne disperzije z raztapljanjem bi zahtevalo velike količine uporabe in odparevanja organskih topil. Za znižanje stroškov proizvodnje bi bilo na ta način izdelano trdno disperzijo smiselno označiti kot aktivno farmacevtsko substanco in proizvodnjo delcev prenesti v tovarno, kjer poteka sinteza in izolacija učinkovin (1). Seveda, bi bilo pri tem treba ugotoviti, ali predpisi omogočajo takšno proizvodnjo zdravil. 4.4 Fizikalno-kemijska nestabilnost trdnih disperzij V literaturi je najpogosteje obravnavana fizikalna nestabilnost trdnih disperzij kristalizacija učinkovine in/ali pomožnih snovi. Trdne disperzije, izdelane z metodo taljenja, večinoma vsebujejo del učinkovine, ki je molekulsko dispergiran, kar je odvisno od topnosti. Drugi del se nahaja v amorfnem ali kristalnem stanju, kar je odvisno od pogojev izdelave te disperzije. Če je učinkovina v obliki molekulske disperzije prenasičena, ali se nahaja v amorfni obliki, lahko s staranjem kristalizira. Podobno se lahko dogaja s pomožnimi snovmi. Chiou je ugotovil, da grizeofulvin kristalizira v disperziji s PEG 6000, kadar je njegova koncentracija nad 5 % medtem, ko pri nižji koncentraciji ostane raztopljen in se s časom ne spreminja (14). Istemu pojavu sta Ford in Rubinstein pripisala znižanje hitrosti raztapljanja indometacina iz disperzije s PEG 6000 (15). Poleg tega sta ugotovila večje znižanje hitrosti raztapljanja pri višje koncentriranih disperzijah. Splošno lahko rečemo, da lahko na stabilnost disperzije, ki vsebujejo amorfne spojine, vplivajo pogoji shranjevanja (predvsem temperatura in vlaga) in razmerje komponent v trdni disperziji. Tako predvsem povišana relativna vlaga (npr. med 60 in 75 %) povzroči popolno kristalizacijo učinkovine v trdni disperziji v relativno kratkem času (npr. nekaj tednov) (16). Pretvorba amorfne v kristalno obliko je najpomembnejše vprašanje stabilnosti tudi pri disperzijah, izdelanih z metodo raztapljanja. Tudi tu vlaga bistveno vpliva na kristalizacijo učinkovine v trdni disperziji. Ugotovljeno je, da lahko pri nižji relativni vlagi PVP zadrži kristalizacijo učinkovin. Stabilizacija amorfne učinkovine v disperziji s PVP naj bi bila posledica tvorbe vodikovih vezi (17). Poleg izbire ustrezne pomožne snovi je za stabilizacijo trdne disperzije bistveno tudi njeno razmerje glede na učinkovino. 5 Izboljšave, ki omogočajo industrijsko proizvodnjo trdnih disperzij 5.1 Polnjenje kapsul s talinami Trdne disperzije lahko izdelamo tako, da talino polnimo neposredno v trdne želatinske kapsule in jo ohladimo na sobno temperaturo. V ta namen lahko uporabimo obstoječo opremo za kapsuliranje. V kapsuli nastane čep, iz katerega se po stiku s topilom v prebavni cevi sproščajo sestavine disperzije. Temperatura polnjenja ne sme preseči 70°C, ker višja temperatura vpliva na lastnosti kapsule. Tehnologija se najprej ni izkazala, saj so ugotovili, da se učinkovina iz disperzije, kljub zagotovitvi „sink" pogojev, ne raztaplja bistveno hitreje, kot v čisti obliki. Razlog za takšno obnašanje učinkovine je hitro raztapljanje pomožne snovi, ki povzroči nastanek plasti učinkovine na površini ogrodja trdne disperzije in prepreči njeno nadaljnje sproščanje. Te težave so uspešno reševali tako, da so k PEG dodajali površinsko aktivne snovi kot so polisorbat 80, ali fosfatidilholin (18,19). Kljub temu, da sproščena učinkovina ostane neraztopljena v mediju za raztapljanje, ko njena koncentacija preseže topnost, drobne kapljice nastale emulzije ali disperzije delcev, omogočajo izboljšanje absorpcije. 5.2 Sodobne površinsko aktivne snovi za izdelavo trdnih disperzij Dve pomembni površinsko aktivni snovi, ki ju uporabljamo za izdelavo trdnih disperzij sta Gelucire 44/14 in vitamin E R-alfa-tokoferil polietilen glikol 1000 sukcinat (TPGS). Gelucire 44/14 je zmes gliceril in PEG 1500 estrov z dolgimi maščobnimi kislinami in je oficinalna spojina v evropski farmakopeji. Vrednost 44 označuje temperaturo tališča, vrednost 14 pa hidrofilno-lipofilno ravnotežje (HLB). Vitamin E TPGS ima HLB vrednost 13 ter tališče 38°C. Za uporabo v trdnih disperzijah ga mešamo s pomožnimi snovmi, ki zvišajo njegovo temperaturo tališča (1). Raziskave biološke uporabnosti trdnih disperzij s tovrstnimi spojinami so dale mnoge vzpodbudne rezultate. Aungst in sodelavci so poročali, da se biološka uporabnost inhibitorja HIV proteaze z oznako DMP323 ob zvišanju odmerka s 85 mg na 350 mg zniža z 49,6% na 5,2%, kadar so uporabili PEG kot pomožno snov v trdnih disperzijah. Pri uporabi disperzij, ki so vsebovale Gelucire 44/14, je bil padec biološke uporabnosti pri istem povečanju odmerka mnogo manjši (z 68,9% na 49,5%) (19). Biološka uporabnost v vodi težko topne učinkovine z oznako RP69698 pri psih je bila 4,5 krat večja (27,6% v primerjavi s 6%), ko so uporabili trdno disperzijo PEG 3350-Labrasol-polisorbat 80 kot takrat, ko so uporabili vodno suspenzijo, ki je vsebovala 0,5% metilceluloze (19). Uporaba površinsko aktivnih snovi v trdnih disperzijah je omejena, kadar je učinkovina v pomožni snovi preslabo topna, saj je volumen taline disperzije prevelik, da bi ga lahko napolnili v kapsulo. V takšnem primeru lahko delce učinkovine dispergiramo v talini pomožne snovi, vendar je vprašanje ali se bo na ta način biološka uporabnost dovolj povečala (21). Pri temperaturi shranjevanja trdne disperzije učinkovina v pomožni snovi ne sme kristalizirati. Kadar je topnost učinkovine v staljeni pomožni snovi mnogo višja od koncentracije, ki jo nameravamo uporabiti v disperziji, lahko pričakujemo, da do obarjanja pri nižji temperaturi ne bo prišlo. Kristalizacija učinkovine iz disperzije z Gelucire 50/13, polisorbatom 80 in polioksil 35 ricinovim oljem je bila razlog za umik zdravila Norvir® s tržišča leta 1998 (22). 5.3 Oblaganje jeder v zvrtinčenih plasteh Raztopino učinkovine in pomožne snovi lahko razpršujemo na površino nevtralnih granul, oziroma sladkorna jedra, ki jih nato tabletiramo ali pa obložimo pelete, ki jih polnimo v kapsule. Zdravilo z itrakonazolom industrijsko proizvajajo tako, da raztopino učinkovine in hidroksipropilmetilceluloze (HPMC) v diklorometanu in etanolu razpršujejo na sladkorna jedra (23). V Wursterjevi komori nastanejo s trdno raztopino obložena jedra, ki v fizioloških pogojih omogočajo nastanek prenasičene raztopine učinkovine in njeno hitro absorpcijo iz prebavne cevi. HPMC pri tem deluje predvsem kot inhibitor kristalizacije učinkovine. Namesto razprševanja z organskimi raztopinami lahko za oblaganje uporabljamo talino disperzije učinkovine in pomožne snovi (24). 5.4 Iztiskanje taline Najpomembnejša aplikacija iztiskanja v farmaciji je izdelava granul ali pelet enakih velikosti, oblik in gostote. Proces je sestavljen iz mešanja zmesi praškov (učinkovine in pomožnih snovi), ki ji dodamo tekočino, nadaljnjega mešanja in potiskanja skozi matrico oziroma perforirano ploščo, da nastane cilindrični ekstrudat. Druga možnost je iztiskanje talin, ki je bila v farmaciji prvič uporabljena že leta 1971 (25). Prednost uporabe taline za izdelavo trdne disperzije je predvsem v tehnologiji, ki ne zahteva uporabe topil zaradi česar ni onesnaževanja okolja, ni potrebno dokazovati rezidualnih topil v proizvodnji in uporabljati eksplozivno varne opreme. Naprava za iztiskanje (angl. screw extruder - vijačni ekstrudor) vsebuje vijačni mešalnik, z enim ali dvema vijakoma, s tako oblikovano povšino, ki omogoča mešanje in transport snovi vzdolž cevi-ohišja imenovanim polž (Slika 1). V področju zbiralnega lijaka izvajamo polnjenje ekstrudorja, ki mu sledi mešanje, taljenje in iztiskanje homogene zmesi skozi matrico ter obdelava ekstrudata. Na lastnosti ekstrudata vplivajo predvsem tok praškov, strižne sile, čas zadrževanja zmesi v aparatu, tlak in hitrost ohlajanja. Večina toplote za taljenje zmesi nastane med trenjem zmesi, ostalo pa dodamo z električnim ali tekočinskim segrevanjem plašča cevi. Značilnost vijačnega ekstrudorja je tudi kratek čas potovanja zmesi od polnjenja do iztiskanja, ki znaša do dve minuti. Temperaturo lahko natančno nadziramo med 30 in 250 °C. Zaprt sistem, ki preprečuje dostop vlage in kisika omejuje razgradnjo učinkovine. Sistem, ki poleg učinkovine in pomožnih snovi vsebuje še tekočino, ima pomanjkljivosti glede homogenosti, medtem ko lahko talina učinkovine in pomožne snovi obstaja kot enofazen sistem v širokem temperaturnem območju (26). Na stabilnost trdnih disperzij vplivajo predvsem medmolekulske interakcije med učinkovino in nosilcem ter viskoznost pomožne snovi (27). Medtem ko je trdna raztopina stabilna, na stabilnost prenasičene zbiralni lijak rezanje drobljenje mešanje mešanje in iztiskanje taljenje Slika 1: Shema dvovljačnega ekstrudorja. Figure 1: Scheme of a twin screw extrudor. disperzije vpliva temperatura steklastega prehoda. V amorfnl disperziji se molekule do neke mere gibljejo, kar vodi v kristalizacijo učinkovine oziroma pomožne snovi (27). Zato so medmolekulske interakcije med učinkovino in pomožno snovjo zelo pomemben mehanizem fizikalnokemijske stabilizacije disperzije. Rosemberg in sodelavci so z ekstruzijo taline razvili sistem učinkovine s pomožnimi snovmi, ki med raztapljanjem tvori delce velikosti 1-3 mm, s čimer se bistveno poveča hitrost raztapljanja (28). Kot pomožne snovi so uporabili PVP, vinilpirolidonvinilacetat v kombinaciji z različnimi površinsko aktivnimi snovmi. Tridesetkratno povečanje hitrosti raztapljanja 17-estradiola so dosegli Hùlsmann in sodelavci z uporabo PVP in Gelucire 44/14 v disperzijah (29). Izboljšanje raztapljanja se je ohranilo tudi po izdelavi tablet. Pozitivni učinki izdelave trdnih disperzij so se pokazali tudi pri raziskavah na ljudeh. Testiranja na prostovoljcih so pokazala 2,3 kratno povečanje biološke uporabnosti itrakonazola iz trdne disperzije izdelane z ekstruzijo taline v primerjavi z registriranim zdravilom v obliki kapsul (30). Z isto tehnologijo so uspeli izdelati bioekvivaletno zdravilo z ibuprofenom glede na registrirane tablete, ki vsebujejo ibuprofenom lizinat (31). 5.5 Tehnologija s superkritičnimi fluidi Superkritični fluid se nad kritično temperaturo in tlakom nahaja v obliki ene faze. Njegove lastnosti so primerne za izdelavo različnih produktov saj ima gostoto podobno tekočinam, stisljivost podobno plinom in večjo difuzivnost od tekočin. Poleg tega se lastnosti kot so viskoznost, difuzivnost, dielektrična konstanta in polarnost odvisno od tlaka in temperature spreminjajo, kar omogoča izbiro ustreznih pogojev za posamezno aplikacijo. Tehnologijo uporabljamo za frakcioniranje polimerov, čiščenje površinsko aktivnih spojin in drugih farmacevtskih surovin, za izvajanje polimerizacij in drugih kemijskih reakcij ter kristalizacije in obarjanja (32). Najpogosteje v teh procesih uporabljamo ogljikov dioksid, ki ima relativno nizek kritični tlak in temperaturo (31,1°C, 73,8 bar). Poleg tega, da je netoksičen, negorljiv in poceni, ga lahko uporabljamo za obdelavo termolabilnih učinkovin. Tehnologija s superkritičnimi fluidi omogoča izdelavo majhnih delcev z veliko specifično površino, ki imajo dobre pretočne lastnosti in majhno vsebnost rezidualnih topil (33). Prva izmed možnosti za izdelavo trdnih disperzij je metoda hitre ekspanzije iz superkritične raztopine (RESS -angl. rapid expansion of supercritical solution). Učinkovino in pomožno snov raztopimo v CO2 ter skozi šobo razpršimo v ekspanzijsko posodo z nižjim tlakom, da nastanejo delci disperzije. Omejitev te metode za izdelavo trdnih disperzij za farmacevtsko uporabo je predvsem nizka topnost učinkovin in polimerov v superkritičnem CO2 (<0,01 %), zaradi česar bi bila industrijska proizvodnja večjih količin produkta nepraktična (1). Pri večini ostalih metod, ki jih uporabljamo pri izdelavi trdnih disperzij s superkritičnimi fluidi pride do obarjanja delcev. To pomeni, da v postopku njihove izdelave uporabljamo organska topila. Superkritični fluid pri tehniki GAS uporabimo kot netopilo (angl. gas antisolvent -plin kot netopilo). Učinkovino, pomožno snov ali obe komponenti hkrati raztopimo v organskem topilu. Raztopini v avtoklavu naknadno dodajamo superkritični fluid, ki povzroči obarjanje (Slika 2) (34). Prednost te metode je prevsem v možnosti uporabe različnih topil. Pri izdelavi disperzij karbamazepina v kombinaciji s PEG, Gelucire 44/14 oziroma vitamin E TPGS s to metodo, so bili rezultati raztapljanja oborjeni delci topilo + CO; Slika 2: Shematski prikaz metode uporabe plina kot netopila. Figure 2: Scheme of gas anti-solvent method. predvsem zaradi polimorfne transformacije učinkovine boljši, kot pri izdelavi trdnih disperzij z metodo odparevanja topila (35). Pri metodi PGSS (angl. precipitation from gas saturated solutions -obarjanje iz raztopin, nasičenih s plinom) učinkovino in pomožno snov stalimo ter talino nasitimo s superkritičnim CO2. Po ekspanziji se topnost zniža in izginjajoči plin povzroči, da se staljena zmes razgradi v drobne kapljice. Adiabatična ekspanzija povzoči tudi ohlajanje (Joule-Thomsonov pojav) in oborijo se delci trdne disperzije. Delci, ki nastanejo so majhni z enakomerno porazdelitvijo velikosti tako, da naknadno mletje ni potrebno. Prednost tehnike je tudi odsotnost organskih topil. PGSS proces so uspešno uporabili pri izdelavi disperzij nifedipina, felodipina in fenofibrata v kombinaciji s PEG 8000. Raztapljanje učinkovine iz disperzij je bilo v vseh primerih boljše kot v primeru raztapljanja mikronizirane učinkovine (36,37). Tehnika SEDS (angl. solution enhanced dispersion by supercritical fluids - sprememba raztopine v disperzijo s superkritičnimi fluidi) je podobna GAS tehniki. Omogoča obarjanje delcev z uporabo koaksialne šobe, skozi katero hkrati razpršujemo raztopino učinkovine in pomožnih snovi ter superkritični fluid. Slednji začne pronicati v kapljice raztopine, raztapljati organsko topilo, v katerem se prenasitita učinkovina in pomožna snov kar povzroči kristalizacijo in nastanek delcev. Z uporabo te tehnike je med modelno učinkovino in Eudragit-om E100 nastala trdna raztopina (38). Prav tako so trdne raztopine nastale pri uporabi več modelnih učinkovin ter hidroksipropilceluloze, etilceluloze in polivinilpirolidona (39). Še ena metoda za izdelavo trdnih disperzij obsega impregnacijo polimernega ogrodja z učinkovino, raztopljeno v superktitičnem fluidu. Učinkovina mora biti dobro topna v superkritičnem fluidu. S to raztopino nato impregniramo polimer, ki nabrekne in absorbira učinkovino (40). Nastane lahko trdna raztopina ali amorfna trdna disperzija. Z opisano metodo so izdelali amorfno trdno disperzijo ibuprofena in PVP (41). 5.6 Ostale novejše tehnike Granuliranje s talinami je ena izmed enostavnejših metod za reševanje težav povezanih z veliko kohezivnostjo mikroniziranih delcev učinkovine, ki onemogočajo njihovo enakomerno dispergiranje v zmesi za direktno tabletiranje. Mikronizirane delce učinkovine lahko dispergiramo v talini veziva in jo po kapljicah dodajamo ostalim pomožnim snovem v hitrovrtečem mešalniku, v katerem vzdržujemo povišano temperaturo, dokler ne nastanejo granule. Po ohladitvi izdelane granule omogočajo izboljšano raztapljanje učinkovine zaradi povečane specifične površine. Podobne rezultate lahko dosežemo s taljenjem veziva v zmesi z ostalimi komponentami (z učinkovino in polnilom), ki tvorijo granule v hitrovrtečem mešalniku. Seo in sodelavci so na opisane načine izboljšali raztapljanje diazepama iz granul, ki so kot veziva vsebovale PEG 3000 ali Gelucire 50/13 (42). Vzpodbudne rezultate raztapljanja so dobili tudi Perissutti in sodelavci z izdelavo granul ibuprofena z vezivom poloksamer 188 (43) ter Passerini s sodelavci z izdelavo granul prazikvantela s PEG 4000 oziroma s poloksamerom 188 (44). Pomemben korak izdelave delcev trdne disperzije s taljenjem je hitra ohladitev taline, ki jo lahko dosežemo z uporabo tehnike razprševanja s strjevanjem. V aparatu, ki ga najpogosteje uporabljamo za sušenje z razprševanjem vodnih in organskih disperzij, razpršujemo talino učinkovine in pomožnih snovi skozi šobo, kjer nastanejo kapljice. Te Slika 3: Shema aparata Izdelavo delcev z razprševanjem s strjevanjem. Figure 3: Scheme of an apparatus for particles formation with spray congealing. Slika 4: Mikrodelci trdne disperzije učinkovine in Gelucire 44/14 izdelane z metodo razprševanja s strjevanjem na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani. Figure 4: Solid dispersion microparicles prepared with a drug and Gelucire 44/14 using spray congealing at the Faculty of pharmacy in Ljubljana. se med letom srečajo z ohlajenim zrakom in strdijo, padejo na dno posode, ali pa s tokom zraka potujejo v ciklon, kjer se ločijo od zraka in zberejo v posodi (Slika 3). Nastanejo sferični delci trdne disperzije učinkovine in pomožnih snovi (Slika 4). Passerini in sodelavci so z uporabo te metode izdelali trdne disperzije prazikvantela oziroma karbamazepina in Gelucire 51/13 (44, 45) z izboljšanim raztapljanjem učinkovine glede na fizikalne zmesi istih komponent. Ili in sodelavci so ugotovili, da je raztapljanje glimepirida hitrejše ob uporabi Gelucire 50/13, kot ob uporabi PEG 6000 in poloxamera 188. V vseh primerih je bilo raztapljanje učinkovine iz takšnih sistemov bistveno hitrejše kot raztapljanje same učinkovine (46). Evaporacijsko obarjanje v vodno raztopino (EPAS-angl. Evaporative Precipitation into Aqueous Solution) je nova metoda izdelave trdnih disperzij. Pri postopku pride do hitre fazne separacije, pri čemer nastanejo nanodelci in mikrodelci v vodi težko topne učinkovine. Učinkovino najprej raztopimo v organskem topilu z nizkim vreliščem, jo nato vodimo skozi šobo pri temperaturi višji od vrelišča topila in razpršujemo v segreto vodno raztopino. Hitro odparevanje drobnih kapljic povzroči prenasičenje in hitro nukleacijo, zaradi česar je velika verjetnost, da bodo namesto kristalnih nastali amorfni delci. V organsko topilo, vodo ali obe dodamo površinsko aktivno snov, ki omogoča optimiranje tvorbe delcev in njihovo stabilizacijo. Pri izdelavi delcev je šoba potopljena v vodno raztopino kar zagotavlja hiter stik delcev učinkovine s hidrofilno površinsko aktivno snovjo, ki prepreči kristalizacijo in rast delcev ter vpliva na izboljšanje raztapljanja posušenih delcev. Stabilno vodno suspenzijo delcev lako posušimo z razprševanjem pri povišani temperaturi ali z liofilizacijo. Na ta način so izdelali nano in mikrodelce ciklosporina, ki so ga raztopili v kloroformu in obarjali v vodni raztopini različnih površinsko aktivnih snovi (fosfatidilholin, Tween, Mryj in Brij) oziroma polimerov (PEG, PVP) (47). Pri opisani metodi pride do oblaganja delcev učinkovine s stabilizatorjem, ki se porazdeljuje na medfazi učinkovina-voda tako, da se hidrofilni del molekule orientira proti vodi. Po osušitvi je površina delcev hidrofilna, kar bistveno pripomore k izboljšanju raztapljanja. Delež pomožnih snovi je v tem primeru mnogo manjši kot pri večini ostalih metod za izdelavo trdnih disperzij, zaradi česar so primerni tudi za parenteralno aplikacijo. Pri elektrostatski metodi z vrtenjem (angl. Electrostatic Spinning Method) kombiniramo metode za izdelavo trdne raztopine/disperzije in nanotehnologijo. Raztopino učinkovine in polimera črpamo skozi cev, v kateri jo izpostavimo električni napetosti med 5 in 30 kV. Ko električne sile presežejo medfazno napetost med raztopino učinkovine, pomožne snovi in zrakom, nastanejo vlakna s premerom v nanometrskem ali mikrometrskem območju. Njihov premer je odvisen od medfazne napetosti, dielektrične konstante, hitrosti pretoka raztopine in velikosti električne napetosti (48). Po odparitvi topila vlakna zberemo na situ. Proces je omejen z nizkim številom uporabnih pomožnih snovi, ki so sposobne tvoriti nitke. Na farmacevtskem področju so ga preverili s pretvorbo itrakonazola in HPMC v nanovlakna, ki so vsebovala amorfno nanodisperzijo učinkovine v polimernem ogrodju (49). Učinkovina se je iz vlaken hitro popolnoma sprostila, medtem ko je bilo sproščanje učinkovine iz fizikalnih zmesi z isto sestavo minimalno (1-3 %). Elegantna metoda izdelave trdnih disperzij je segrevanje fizikalne zmesi učinkovine in pomožne snovi z uporabo mikrovalov, ki jih snovi absorbirajo in pretvorijo v toplotno energijo. Z izdelavo trdnih disperzij karvedilola in b-ciklodekstrina so na ta način izdelali kompleks s stehiometrijskim razmerjem 1:2 in izboljšano navidezno vodotopnostjo glede na čisto učinkovino (50). Moneghini in sodelavci so izdelali trdne disperzije ibuprofena z b-ciklodekstrinom oziroma PVP/VA (kopolimer polivinilpirolidona in vinilacetata) (51). V obeh primerih je prišlo do znižanja kristaliničnosti učinkovine oziroma do njene skoraj popolne amorfizacije, hitrost raztapljanja pa se je glede na raztapljanje učinkovine iz fizikalnih zmesi bistveno izboljšala. Trdne disperzije lahko z metodo odparevanja topila izdelamo tudi tako, da ostane pomožna snov neraztopljena, učinkovina pa se obori v porah oziroma adsorbira na površini delcev. Takeuchi in sodelavci so izdelali disperzije z raztapljanjem tolbutamida in suspedniranjem SiO2 v etanolu (52). Vzorce so sušili z razprševanjem ali z odparevanjem topila pri znižanem tlaku. Učinkovina se je v disperzijah oborila v pretežno amorfni obliki. Raztapljanje tolbutamida je bilo pri uporabi hidrofilnega SiO2 (neporozni Aerosil 200 in porozna Sylisia 350) glede na čisto učinkovino bistveno izboljšano. Izboljšanje raztapljanja so pripisali boljšemu močenju, večji disperzibilnosti delcev v mediju za raztapljanje, zmanjšanju velikosti delcev in znižanju kristaliničnosti učinkovine. Tako izdelane disperzije imajo dobre pretočne lastnosti in stisljivost, tako da je izdelava tablet mnogo enostavnejša kot pri trdnih disperzijah, ki so izdelane s taljenjem. Uporabimo lahko relativno majhen delež polnila in razgrajevala in izdelamo tablete, iz katerih se učinkovina zelo hitro popolnoma sprosti (53). 6 Zaključek Trdne disperzije lahko oblikujemo v farmacevtsko obliko s hitrim ali upočasnjenim sproščanjem že v zgodnji fazi razvoja zdravila z uporabo relativno majhnih količin učinkovine, kar je velika prednost pred ostalimi metodami, s katerimi želimo zagotoviti čim višjo biološko uporabnost. Kljub intenzivnim raziskavam, ki trajajo že desetletja, je razvoj pomožnih snovi in tehnologij za izdelavo trdnih disperzij šele v zadnjem obdobju omogočil prihod tovrstnih zdravil na tržišče. Nekatera med njimi kot sta Norvir® in Rezulin® je bilo treba zaradi nestabilnosti in pojava neželenih stranskih učinkov umaknti s tržišča, druga pa se danes zaradi nove dodane vrednosti, uspešno prodajajo. Uspešno razvita zdravila izdelana z ekstruzijo talin za peroralno aplikacijo, ki jih danes najdemo na trgu, vsebujejo disperzijo grizeofulvina in polietilenglikola, nabilona in PVP, troglitazona in PVP. Obstajajo tudi registrirane oblike, izdelane z ekstruzijo taline za subkutano aplikacijo in nadzorovano sproščanje, ki vsebujejo goserelin ali buserelin v kombinaciji z PLGA (poli(laktid-ko-glikolid)). Dve kontracepcijski zdravili vsebujeta polietilen vinilacetat kopolimer za nadzorovano sproščanje progestina in estrogena iz rezervoarja (ogrodja), ki ga apliciramo subkutano oziroma vaginalno. Z izdelavo trdnih disperzij želimo najpogosteje povečati hitrost raztapljanja in doseči prenasičeno koncentracijo raztopljene učinovine na mestu absorpcije. Njihov razvoj je intenziven, ker lahko izdelamo farmacevtske oblike za različne aplikacije, vklučujoč najbolj zaželene, tablete. Pričakujemo lahko, da se bo število registriranih zdravil, ki vsebujejo trdne disperzije, v prihodnosti hitro povečevalo. 7 Literatura 1 Serajudin ATM. Solid dispersion of poorly water-soluble drugs: Early promises, subsequent problems, and recent breakthroughs. J Pharm Sci 1999; 88: 1058-1066. 2. Noyes AA, Whitney WR. The rate of solution of solid substances in their own solutions. J Am Chem Soc 1897; 19: 930-934. 3. Galia E, Nicholaides E, Hörter D, et al. Evaluation of various dissolution media for predicting in vivo performance of class I and II drugs. Pharm Res 1998; 15: 698-705. 4. Ford JL. The current status of solid dispersions. Pharm Acta Helv 1986; 3: 69-88. 5. Sekiguchi K, Obi N. Studies on absorption of eutectic mixture I. A comparison of the behaviour of eutectic mixture of sulfatiazole and that of ordinary sulfatiazole in man. J Chem Pharm Bull 1961; 9: 866-872. 6. Planinšek O. Nekatere metode za povečevanje topnosti in hitrosti raztapljanja v vodi težko topnih učinkovin-2. del. Farm Vestn 2002;53: 117-127. 7. Goldberg AH, Gibaldi M, Kanig JL. Increasing dissolution rates and gastrointestinal absorption of drugs via solid solutions and eutectic mixtures II. Experimental evaluation of eutectic mixture: urea-acetaminofen system. J Pharm Sci 1966; 55: 482-487. 8. Allen LV, Yanchick VA, Maness DD. Dissolution rates of corticosteroids utilizing sugar dispersions. J Pharm Sci 1977; 66 494-497. 9. Lin CW, Cham TM. Effect of particle size on the available surface area of nifedipine from nifedipine-poly(ethylene glycol) 6000 solid dispersions. Int J Pharm 1996; 127: 261-272. 10. Reed-Hill RE. Physical Metallurgy Principles, Van-Nostrand, Princetown, NJ, 1964. Chiu WL, Riegelman S. Preparation and dissolution characteristics of several fast release solid dispersions of griseofulvin. J Pharm Sci 1969; 58: 1505-1509. 11. Vera N ,Veiga MD, Cadorniga R. Solid dispersions of oxodipine-PEG 6000 characterization and dissolution study. STP Pharma Sci 1991; 1: 125-129. 12. Gines JM, Arias MJ, Moyano JR, et al. Thermal investigation of crystallization of poly(ethylene glycol)s in solid dispersions containing oxazepam. Int J Pharm 1996; 143: 247-253. 13. Ford JL, Rubinstein MH. Formulation and aging of tablets prepared from indomethacin-poly(ethylene glycol) 6000 solid dispersions. Pharm Acta Helv 1980; 55: 1-7. 14. Chiou WL. Pharmaceutical applications of solid dispersion systems: X-say diffraction and aqueous solubility studies on griseofulvin-poly(ethylene glycol) 6000 systems. J Pharm Sci 1977; 66: 989-991 15. Ford JL, Rubinstein MH. Aging of indomethacin-poly(ethylene glycol) 6000 solid dispersion. Pharm Acta Helv 1979; 54: 353-358. 16. Suzuki H, Sunada H. Some factors influencing the dissolution of solid dispersions with nicotinamide and hydroxypropylmethylcellulose as combined carriers. Chem Pharm Bull 1988; 46: 1015-1020. 17. Taylor LS, Zografi G. Spectoscopic characterization of interactions between PVP and indomethacin in amorphous molecular dispersions. Pharm Res 1997; 14: 1691.1698. 18. Serajuddin ATM, Sheen PC, Mufson D et al. Effect of vehicle amphiphilicity on the dissolution and bioavailability of a poorly water-soluble drug from solid dispersion. J Pharm. Sci. 1988; 77: 325-329. 19. Aungst BJ, Ngguyen NH, Rogers N et al. Amphiphilic vehicles improve the oral bioavailability of a poorly soluble HIV protease inhibitor at high doses. Int J Pharm 1997; 156: 79-88. 20. Serajuddin ATM, Sheen PC, Augustine MA. Improved dissolution of a poorly water-soluble drug from solid dispersions in poly(ethylene glycol):polysorbate 80 mixtures. J Pharm Sci 1990; 79: 463-464. 21. Dordunoo SK, Ford JL, Rubinstein MH. Preformulation studies on solid dispersions containing triamterene of temazepam in polyethylene glycols or Gelucire 44/14 for liquid filling of hard gelatine capsules. Drug Dev Ind. Pharm 1991; 17: 1685-1713 22. Rosoff M, Serajuddin ATM. Solubilization of diazepam in bile salts and in sodium cholate-lecithin-water phases. Int J Pharm 1980; 6: 137-148. 23. Gilis PA, De Conde V, Vandecruys R. Janssen Pharmaceutica NV. Beads having a core coated with an antifungal and a polymer. US patent 5 633 015. 1997. 24. Kennedy JP, Niebergall PJ. Development and optimization of a solid dispersion hot melt fluid bed coating metod Pharm Dev Technol 1996; 1: 51-62. 25. el-Egakey MA, Soliva M, Speise P. Hot extruded dosage forms. Pharm Acta Helv. 1971; 46 : 31-52. 26. Karanth H, Subbraya Shenoy V, Ramachandra Murthy R. Industrially feasible alternative approaches in the manufacture of solid dispersions: A technical report. AAPS PharmSciTech 2006; 7(4): E1-E7. 27. Breitenbach J, Two concepts, one technology: controlled release and solid dispersion with Meltrex, in: I. Ghebre-Selassie (Ed.), Modided Release Drug Delivery Technology, Marcel Dekker, New York, NY, 2003. 28. Rosenberg J, Degenhardt M, Breitenbach J et al. Amorphous Embedding of a Lipophilic Drug Substance by Meltrex-technology. Abstract book 7th European Symposium on Controlled Drug Delivery, Noordwijk aan Zee, Netherlands, 2002: 184-188. 29. Hülsmann S, Backensfeld T, Keitel S, Bodmeier R. Melt extrusion-an alternative method for enhancing the dissolution rate of 17-estradiol hemihydrate, Eur. J. Pharm Biopharm 2000; 49: 237-242. 30. Baert L, Elvire C, Verreck G, Thone D. Antifungal compositions with improved bioavailability, Eur. Patent 0,904,060, 1996. 31. Zeidler J, Neumann J, Liepold B et al. A fast-acting analgesic comprises as analgesic substance ibuprofen in an adjuvant matrix with a porous structure and a density of greater than 1 and up to 2.5 g/cm3. US Patent 6,322,816, 1997. 32. Phillips EM, Stella VJ. Rapid expansion from supercritical solutions: application to pharmaceutical processes. Int J Pharm 1993; 94: 1-10. 33. Beach S, Latham D, Sidgwick C et al. Control of the physical form of salmeterol xinofoate. Org Proc Res Dev 1999; 3: 370-376. 34. Lack E, Weidner E, Knez Z et al. Particle Generation with Supercritical CO2. 1st Vienna International Conference: Micro- and Nano-Technology, March 9 - 11, 2005, The Austrian Tribology Society, Vienna, Austria. 35. Sethia S, Squillante E. Physicochemical characterization of solid dispersions of carbamazepine formulated by supercritical carbon dioxide and conventional solvent evaporation method. J Pharm Sci 2002;91:1948-1957. 36. Sencar-Bozic P, Srcic S, Knez Z, Kerö J. Improvement of nifedipine dissolution characteristics using supercritical CO2. Int J Pharm. 1997;148:123-130. 37. Kerc J, Srcic S, Knez Z, Sencar-Bozic P. Micronization of drugs using supercritical carbon dioxide. Int J Pharm. 1999; 182: 33-39. 38. Juppo AM, Boiddier C, Khoo C. Evaluation of solid dispersion particles prepared with SEDS. Int J Pharm 2003; 250: 385-401. 39. York P, Wilkins SA, Storey RA, Walker SE, Harland RS, inventors. Bradford Particle Design PLC, Bristol-Myers Squibb. Coformulation methods and their products. World patent 0 115 664. 2001. 40. Berens AR, Huvard GS, Korsmeyer RW, Kunig RW. Application of compressed carbon dioxide in the incorporation of additives into polymers. J Appl Polym Sci 1992; 46: 231-242. 41. Kazarian SG, Martirosyan GG. Spectroscopy of polymer/drug formulations processed with supercritical fluids: in situ ATR-IR and Raman study of impregnation of ibuprofen into PVP. Int J Pharm. 2002; 232: 81-90. 42. Seo A., Holm P., Kristensen G., Schaefer T. The preparation of agglomerates containing solid dispersions of diazepam by melt agglomeration in a high shear mixer. Int. J Pharm. 2003; 259,161-171. 43. Perissutti B, Rubessa F., Moneghini M., Voinovich D. Formulation design of carbamazepine fast-release tablets prepared by melt granulation technique. Int J Pharm 2003; 256: 53-63. 44. Passerini N, Albertini B, Perissutti, Rodriguez L. Evaluation of melt granulation and ultrasonic spray congealing as techniques to enhance the dissolution of praziquantel. Int J Pharm 2006; 318: 91-102. 45. Passerini N, Perissutti B, Moneghini M et al. Characterization of carbamazepine-Gelucire 50/13 microparticles prepared by a spray congealing process using ultrasounds. J Pharm Sci 2002; 91: 3 699-707. 46. Ilic I, Dreu R, Burjak M et al. Microparticle size control and glimepiride microencapsulation using spray congealing technology. Int J Pharm 2009: v tisku. 47. Chen X, Young TJ, Sarkari M et al. Preparation of cyclosporine A nanoparticles by evaporative precipitation into aqueous solution. Int J Pharm 2002; 242: 3-14. 48. Deitzel JM, Kleinmeyer J, Harris D, Beck Tan NC. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibres and textiles. Polym. 2001; 42: 261-272. 49. Verreck G, Cun I, Peeters J et al. Preparation and characterization of nano fibres containing amorphous drug dispersions generated by electrostatic spinning. Pharm Res 2003; 20: 810-817. 50. Xianhong W, Fei T, Zhijun J, Ziuyang L. Preparation and study the 1:2 inclusion complex of carvedilol with b-cyclodextrin. J Pharm Biom Anal 2004; 34: 517-523. 51. Moneghini M, Bellich B, Baxa P, Princivalle F. Microwave generated solid dispersion containing ibuprofen. Int J Pharm 2008; 125-130. 52. Takeuchi H, Naira S, Yamamoto H, Kawashima Y. Solid dispersion particles of tolbutamide prepared with fine silica particles by spray-drying method. Powder Tech 2004; 141: 187-195. 53. Takeuchi H, Nagira S, Tanimura S et al.Tabletting of solid dispersion particles consisting of indomethacin and porous silica particles. Cem Pharm Bull 2005; 53(5): 487-491. Farmakoterapija parodontalnih bolezni Pharmacotherapy of periodontal diseases Saša Obermajer Povzetek: Za odstranjevanje zobnih oblog in zdravljenje gingivitisa so bolnikom na voljo številni izdelki. Njihov cilj je zmanjšanje vnetja dlesni in s tem preprečiti razvoj destruktivne parodontalne bolezni. Proizvodi so primarno v obliki zobnih past ali ustnih vod, ki vsebujejo aktivne učinkovine klorheksidin, triklosan, kositrov fluorid, kombinacijo eteričnih olj, antimikrobnih učinkovin in antibakterijskih peptidov. Primerna sestava zobnih past in ustnih vod je izrednega pomena za ohranitev biološke razpoložljivosti učinkovin in v nekaterih primerih za izboljšanje njihovih trajnosti. Novi lokalni dostavni sistemi, kot tudi genska terapija, nudijo možnosti izboljšanja terapije in hkrati preventive parodontalne bolezni. Sledeči sistematični pregled farmakoterapevtskih učinkovin predlaga za optimalno zdravje dlesni uporabo pripravkov za odstranjevanje plaka in zdravljenje gingivitisa kot dodatek bolnikovim oralnim higienskim navadam . Ključne besede: periodontitis, gingivitis, klorheksidin, triklosan, antimikrobne učinkovine, kovinski ioni, antibakterijski peptidi Abstract: Multiple antigingivitis and antiplaque products are available for patients. The goal of antiplaque, antigingivitis agents is to decrease gingival inflammation so that destructive periodontal disease will not develop. These products are primarily in the form of a dentifrice or a mouthrinse, and the active agents involved include chlorhexidine, triclosan, stannous fluoride, a combination of essential oils, antimicrobial agents and antibacterial peptides. The proper formulation of these active agents into dentifrices and/or mouthrinses is extremely important to maintain the bioavailability of the agents and, in some cases, to improve their substantivity. New local delivery systems as well as gene therapy will improve therapy as well as prevention of this prevalent disease. This systematic review suggests that for optimum gingival health, adults should add an antiplaque, antigingivitis agent to their oral hygiene regimen. Keywords: periodontitis, gingivitis, chlorhexidine, triclosan, antimicrobials, metal ions, antibacterial peptides 1 Uvod Bolezni obzobnih tkiv, tako gingivitis kot parodontitis, so resne infekcijske bolezni, ki, kadar ostanejo nezdravljene, vodijo v izgubo zob. Parodontalne bolezni se pojavljajo tako pri odraslih kot tudi pri otrocih in najstnikih. Gingivitis prizadane več kot 70 % otrok starejših od 7 let (1) in več kot 75 % odraslih ter se pri nekaterih odraslih populacijah približuje celo 100 % (2). Resni generaliziran parodontitis prizadene od 5 do 15 % populacije, medtem ko zmerne oblike parodontitisa prizadanejo večino prebivalstva (3). Pomembna je preventiva, zgodnje diagnosticiranje in zgodnje zdravljenje parodontalnih bolezni. Namen članka je aktualen sistematičen pregled farmakoterapije pri zdravljenju parodontalnih bolezni. 2 Razdelitev parodontalnih bolezni Gingivitis in parodontitis sta dve glavni obliki infekcijskih bolezni, ki prizadaneta parodoncij. Gingivitis je najmilejša oblika parodontalne bolezni. Gre za vnetje gingive (dlesni), ki se klinično kaže z znaki kot so rdečica gingive, edem, krvavenje in povečan tok tekočine v gingivalnih žepih (4). Nezdravljen gingivitis lahko napreduje v parodontitis. Parodontitis je poleg vnetja gingive tudi vnetje vezivnega tkiva, parodontalnega ligamenta in kosti. Histopatologija lezije pri parodontitisu je sicer v mnogih pogledih podobna nastanku lezije pri gingivitisu, vendar sčasoma prevlada izguba parodontalnega tkiva z izgubo kosti ter nastanek parodontalnih žepkov (4,5). Parodontitis se tako klinično razlikuje od gingivitisa, pride namreč do izgube podpornih tkiv zoba, zaradi česar postane zob majav in v končni fazi izpade (4). Obe bolezni se klasificira glede na etiologijo, klinično sliko ali spremljajoče dejavnike, ki bolezen poslabšajo (5). Med parodontalnimi in sistemskimi boleznimi obstaja povezava (1). Sprejeta klasifikacija parodontalnih bolezni: 1. gingivalne bolezni zaradi zobnih oblog (sem spadajo različni gingivitisi), 2. kronični parodontitis, 3. agresivni parodontitis, 4. parodontitis kot manifestacija sistemskih bolezni in nekrotizirajoče parodontalne bolezni (4). Saša Obermajer, dr. dent. med., Stomatoestetika Kulis, Korenčanova 34, 1000 Ljubljana Slika 1: Prikaz videza zdravega zoba in obzobnega tkiva. Figure 1: Shematic representation of healthy tooth and periodontal tissue. 3 Vzroki za nastanek parodontalnih bolezni Gingivitis je pogosto posledica neprimerne ustne higiene. Razvoj gingivitisa potrebuje prisotnost zobnih oblog in bakterij, ki direktno in indirektno izzovejo patološke spremembe v tkivu. Skoraj vse parodontalne bolezni so povezane z mikroorganizmi oziroma so le ti njihovi povzročitelji (4). Prekomerna rast biofilma, ponavadi zaradi nerednega čiščenja, je povezana z razvojem parodontalnih bolezni. (6). Pomembno pa je poudariti, da imajo na parodontalno bolezen močan vpliv naslednji dejavniki: • kajenje, • genetika (do 30% populacije je gensko dovzetnih za razvoj parodontalne bolezni, kar pomeni, da navkljub dobri ustni higieni z večjo verjetnostjo razvijejo parodontalno bolezen), • nosečnost, puberteta, menopavza (kot posledica hormonskih sprememb so dlesni bolj občutljive na prisotnost zobnih oblog, hkrati pa obstaja tudi obratna povezava parodontalne bolezni na nosečnost; noseče ženske s parodontalno boleznijo so bolj dovzetne za prezgodnji porod in nedonošenost novorojenčkov), • stres oz. imunski status organizma, • zdravila. Med zdravili je potrebno posebej poudariti učinkovine fenitoin, natrijev valproat, ciklosporin A in blokatorje kalcijevih kanalov (npr. nifedipin), ki povzročajo hiperplazijo dlesni bodisi neodvisno ali v odgovor na prisotnost zobnih oblog. Tipični znaki so sprememba oblike in velikosti papile, lahko pa se poveča tudi preostala obzobna ter prirasla dlesen. Na stanje povečane občutljivosti parodontalnih tkiv v odgovor na zobne obloge vplivajo tudi peroralni kontraceptivi in antidepresivi. V širšem smislu pa na zdravje dlesni vplivajo tudi azatioprin, protirakave učinkovine in metotrexat, ki posredno povzročajo atrofijo, eritrem ter ulceracije (7). • stiskanje in škrtanje z zobmi (bruksizem) ter okluzijska travma, • sladkorna bolezen (pri sladkorni bolezni je prav tako opazna navzkrižna povezava, in sicer je pri bolnikih s parodontalno boleznijo sama sladkorna bolezen težje obvladljiva zaradi vpliva parodontalne infekcije na zmožnost proizvodnje ter porabe inzulina), • neustrezna prehrana, • druge sistemske bolezni. 4 Zdravljenje parodontalnih bolezni Gingivitis je reverzibilna bolezen. Osnovna terapija pri ljudeh s kroničnim gingivitisom je zmanjšanje števila ustnih bakterij in z njimi povezanih kalcificiranih in nekalcificiranih sedimentov. Terapevtski cilj odstranjevanja zobnega kamna in zobnih oblog ter luščenja in glajenja korenine zoba je zmanjšanje števila supra- in subgingivalnih bakterij pod nivo, ki je sposoben povzročiti klinično vnetje dlesni. Parodontitis je pogojno reverzibilna bolezen. Terapevtsko zdravljenje razdelimo v tri glavne skupine: anti-infekcijsko zdravljenje oz. nekirurško terapijo, resektivno kirurško zdravljenje in regenerativno kirurško zdravljenje. Anti-infekcijsko zdravljenje odstrani etiološke dejavnike z odstranjevanjem zobnih oblog in zobnega kamna, supra-in subgingivalno z luščenjem in glajenjem korenine. Med najpogosteje izvajanimi resektivnimi kirurškimi parodontalnimi terapijami so gingivektomije, reženjske operacije (zmanjševanje globine parodontalnih žepov) z ali brez postopkov za podaljšanje klinične krone ter mehkotkivni presadki. Regenerativna terapija zajema regeneracijo ali rekonstrukcijo izgubljenega parodontalnega tkiva (5). i migracija neutroFilccv I v koronami predel 1 i'|>!i'l:|>kiv! pripoja PRISTNA DLESEN kolonizacija z mikrobi mouociti, Tukr,'I n' liintbcili in ne u I rofi I c i nil Ii racij j v vezivno Ikivo ->íc'.;:it::i.c:. I Em ločili, ' mont« ¡r^itiAkiufaiii povedana infijtracija prol k\':].:.i:] in dilatacija /i . povedana izguba kolagena. izredno malo plazmalk KLINIČNO ¿DRAVA OLESEN ZÛQDNJI GINGIVITIS povedana emigracija neutrafiicev in prolitcracija cclic hI pripoja ntpfDO poveiana I " ciniß^lj^ neulrul: Icev npikalna mii cpiurlijskeya pripoja J moOnopovcíana liukocilna inñltmcija* pluzmalkiani (10.30%) i m • ■ ; ■ - » pliujriaikt > 50% izguba konti USTALJENI GINGIVITIS PARODONTITIS Slika 2: Shematični prikaz razvoja parodontalne bolezni. Figure 2: Shematic representation of periodontal disease development. 4.1 Farmakoterapija parodontalnih bolezni Proces nastanka zobnih oblog se lahko spremeni oz. zavre na več ravneh še predno masa in kompleksnost zobnih oblog dosežeta nivo, ki preprečuje zdravje dlesni. Farmakoterapija lahko tako učinkuje na kvaliteto in kvantiteto plaka, odvisno od napredovalosti bolezni. Pomembno je poudariti, da so bakterije v biofilmih bolj rezistentne na delovanje protimikrobnih agensov kot prostoživeče. Tako morajo biti farmakoterapevtiki učinkoviti predvsem proti zobnim oblogam, ne samo proti samim bakterijam sline. Glede na mehanizem delovanja ločimo antiadhezivne dejavnike, ki učinkujejo na začetno adhezijo primarnih bakterij, ki ustvarjajo zobne obloge (delmopinol), antimikrobne dejavnike, ki imajo bakteriostatični ali baktericidni učinek, in dejavnike, ki zmanjšujejo količino nastalih oblog (hipoklorit, proteaze, dekstranaze, mutanaze). Glede na farmacevtsko-kemijsko klasifikacijo so to antibiotiki, encimi, bisbigvanidni antiseptiki (klorheksidin, aleksidin, oktenidin), kvartarne amonijeve spojine (benzalkonijev klorid, cetilpiridinijev klorid), fenoli (triklosan) in oljne esence, naravni proizvodi (zelišča in rastline), fluoridi, kovinske soli, oksidanti (peroksiborat), detergenti (natrijev-lavril-sulfat), aminoalkoholi (oktopenol, delmopinol), natrijev klorid ter drugi antiseptiki (povidon jod, heksetidin). Da je lahko farmakoterapevtska učinkovina pri zdravljenju parodontalne bolezni učinkovita, mora zadostovati petim pogojem: inhibira ali zatre ustreznega patogena, doseči mora ustrezno mesto delovanja, imeti mora ustrezno koncentracijo, delovati mora dovolj dolgo in ne sme povzročati poškodb. Farmakoterapija pri zdravljenju parodontitisa je lahko sistemska ali lokalna. Lokalno učinkovine apliciramo v obliki zobne paste, ustne vode, sprejev, izpiralcev, premazov ali žvečilnih gum. 4.1.1 Antiseptiki Antiseptiki obsegajo široko področje kemijskih kategorij, od alkoholov (etil alcohol, isopropyl alcohol), amidinov in gvanidov (klorheksidin), halogenov (triklosan), živosrebrovih spojin (nitromersol), fenolov (eugenol, triklosan, timol), kvaternarnih amonijevih spojin (citilpiridinijev klorid), kovin (cinkov citrate), barvil do drugih (heksetidin, ocetna kislina). Različni mehanizmi delovanja antiseptikov potekajo preko inaktivacije encimov, spremembe normalne permeabilnosti bakterijske celične membrane, denaturacije proteinov, helacije in interkalacije v DNA. Idealni antiseptik mora imeti določene fizikalne, estetske (brez vonja, ne povzroča zabarvanja, bolečin...) in učinkovitostne (visoka germicidna aktivnost, širok spekter aktivnosti, dolgotrajna učinkovitost) lastnosti. Hkrati pa je potrebno poudariti, da idealnega antiseptika še niso odkrili. Minimalna inhibitorna koncentracija antiseptika mora doseči bakterije na vseh izpostavljenih ustnih predelih. Dve področji, gingivalni žep in interproksimalno področje med zobmi, pomembna pri patogenezi parodontalne bolezni, pa s spiranjem z ustnimi vodami ne moremo doseči. Tovrstne težave lahko presežemo z uporabo lokalnih dostavnih sistemov (8) ter hkratnim mehanskim čiščenjem. Čeprav so preučili že stotine učinkovin in preparatov, še vedno ni idealnega antiseptika (9). Za klorheksidin bi lahko rekli, da je nekakšen referenčni standard (9), saj se z njim primerjajo in ocenjujejo številni antiseptiki. 4.1.1.1 Klorheksidin (1,1 '-Heksametilen bis(5-(p-klorofenil)bisgvanid) Klorheksidin je antiseptik, član skupine bisgvanidov, in je še vedno referenčni standard (zlati standard), s katerim se ocenjuje in primerja številne druge oralne antiseptike; namreč klorheksidin še vedno velja za najučinkovitejše protimikrobno sredstvo pri peroralni uporabi. Slika 3: Kemijska struktura klorheksidina. Figure 3: Chemical structure of clorhexidine. Klorheksidin ima baktericidni in bakteriostatični učinek na Gram (+) in Gram (-) bakterije (vpliva na membransko prepustnost bakterij, pri višjih koncentracijah pa povzroča tudi koagulacijo citoplazme). Najdemo ga v več kot 100 različnih proizvodih kot edino aktivno učinkovino ali v kombinaciji z drugimi učinkovinami. V Evropi se običajno uporablja koncentracija 0,2 %, v Združenih državah Amerike pa 0,12 % (9). Uporablja se v obliki ustne vode, gelov, sprejev in premazov v koncentracijah 0,03-2%. Klorheksidin se v zobnih pastah redkeje uporablja zaradi anionske narave detergentov zobnih past, ki ga deaktivirajo. Indikacije za uporabo so: perioperativna uporaba (pred ali po operativnim posegom), v sklopu parodontalne terapije (gingivitis, parodontitis, nekrotizirajoči ulcerativni gingivitis/parodontitis), preventiva kariesa, ustni zadah, suha usta, kot dodatek ustni higieni in profesionalni profilaksi ter pri hendikepiranih osebah. Uporaba klorheksidin ustne vode (0,1 do 0,2 %) dva- do trikrat dnevno je učinkovita pri zmanjšanju oblog in gingivitisu. Učinkovitost je večja kot pri ostalih ustnih vodah (10,11,12). Klorheksidinske ustne vode naj bi se glede na izsledke posameznih študij uporabljale najprej 30 minut po zobnem ščetkanju oz. po uporabi zobnih past, saj le te vsebujejo snovi, ki lahko inaktivirajo klorheksidin (13,14,15). Ob oralni uporabi ima številne stranske učinke: rjavo zabarvanje zob, zobnih materialov in jezika, motnje okusa, erozije ustne sluznice ter otekanje parotidne žleze. Rjavo zabarvanje zob naj bi pravzaprav povzročali prehodni elementi in žveplo, in sicer naj bi klorheksidin povečal akumuliranje žveplo-vsebujočih komponent zobnih oblog, ki nadalje interagirajo z železom ter tako povzročijo zabarvanje oblog (zabarvanje je tisti stranski učinek, ki prepreči dolgoročno uporabo klorheksidina v preventivne namene). Omenimo lahko še sinergistično delovanje klorheksidina in bakra, ki omogoča 10- do 100 krat večje zmanjšanje števila živih celic kot pa ga daje sam klorheksidin. Ena od oblik oralne aplikacije klorheksidina je klorheksidinski čip. Klorheksidinski čip je majhen biorazgradljiv film hidrolizirane želatine, v kateri je vgrajeno 2,5 mg klorheksidinijevega glukonata. Čip ima obliko nohta (5 x 4 mm) in je debel 0,35 mm. Prednosti uporabe sta biološka razgradljivost in enostavna aplikacija. Čip je samoretencijski ter dostavlja učinkovino v koncentraciji 125 g/ml vsaj 7 dni (16). Pri tej koncentraciji klorheksidin uniči 99% subgingivalne mikroflore (17). Študije z uporabo klorheksidinskega čipa so pokazale, da zadržano sproščanje klorheksidina iz etil-celuloznih počasi-sproščujočih dostavnih sistemov učinkovito zmanjšuje število bakterij v žepih vsaj 17 tednov (18,19). Klorheksidinski čip, uporabljen kot adjunktivna terapija luščenju in glajenju korenin, poveča učinek mehanske terapije ter znatno zmanjša globino sondiranja gingivalnih žepov, krvavitev dlesni. in izboljša nivo gingivalnega prirastišča (20,21). Tekom zdravljenja naj bi se bolnik izogibal ščetkanju zdravljenih zob. Priporočljiva pa je uporaba klorheksidinske ustne vode dvakrat dnevno, dva tedna. Za najbolj učinkovito uporabo čipa se je izkazala terapija žepov 5mm ali več vsake 3 mesece (zmanjšanje globine sondiranja in števila žepov dlesni nad 5mm ali več). 4.1.1.2 Triklosan (5-kloro-2-(2,4-diklorofenoksi) fenol) Triklosan, kloriran bisfenol, je najbolj pogosto uporabljena protimikrobna učinkovina v peroralnih proizvodih. Učinkovit je proti glivicam, Gram (+) in večini Gram (-) bakterij ter ima omejeno učinkovitost proti Pseudomonas spp. Triklosan ni tako učinkovit antiseptik kot klorheksidin, vendar pa kaže tako protimikrobno kot protivnetno delovanje (inhibira številne pomembne mediatorje vnetja dlesni) (22,23). Njegovo delovanje se izboljša z izboljšanjem same oralne retencije triklosana, z uporabo kopolimerov ali v kombinaciji z drugimi komplementarnimi protimikrobnimi učinkovinami. V kombinaciji s kopolimerom PVM/MA (polivinilmetileter maleinske kisline) je antimikrobna učinkovitost triklosana povečana, saj naj bi bil povečan privzem triklosana na sklenino in epitelijske celice (24). Triklosan v kombinaciji s PVM/MA značilno zmanjša zobne obloge in gingivitis v primerjavi s placebom (25,26,27). V kombinaciji s silikonskim oljem triklosan značilno zmanjša krvavenje ob sondiranju v primerjavi s samim triklosanom, saj se silikonsko olje adsorbira na trdne površine zob zaradi nizke površinske napetosti (28). Triklosan in ionski detergent natrijev laurilsulfat v ustni vodi značilno zmanjšata nastanek zobnih oblog (29). Sicer tudi ustna voda z 1,5% natrijevim laurilsulfatom zmanjša nastanek zobnih oblog, vendar je prednostno dodajanje triklosana, saj varuje pred tkivnimi poškodbami, ki jih povzroča natrijev laurilsulfat (30). Kombinacija triklosana in cinkovega citrata zmanjšuje nastanek plaka in tako pripomore pri ohranjanju zdravja dlesni (31). Triklosan in cinkov citrat imata skupaj komplementarni in aditivni protibakterijski učinek ter zavirata tvorbo zobnih oblog (zmanjšujeta rast bakterij, inhibirata metabolizem in prevzem glukoze pri bakterijah ter zmanjšujeta ekspresijo virulenčnih dejavnikov bakterij - proteaze) (32). Kombinacija triklosana in cinkovega citrata daje boljše lastnosti v primerjavi s triklosan-kopolimerom v smislu dostave in retencije triklosana na oralnih površinah in na zobnih oblogah (33). V primerjalni študiji so ugotovili, da je triklosan slabše učinkovit v primerjavi s klorheksidinom ali s cetilpiridinijevim kloridom. Triklosan pri 0,1% daje omejeno inhibicijo plaka in je manj učinkovit kot 0,01% klorheksidin. Vse testirane spojine so bile sicer učinkovitejše od kontrole, vendar pri triklosanu ta razlika ni bila vedno statistično značilna (34). Pozitivna lastnost uporabe triklosana je varnost ter malo neželjenih stranskih učinkov, med katerimi je napogostejši kontaktni dermatitis. Prav tako ne povzroča zabarvanja zob. 4.1.1.3 Kovinske soli Kovinske soli so baktericidne napram ustnim bakterijam, inhibirajo bakterijske encime in so učinkovite proti nastanku zobnih oblog (35). Kovinski ioni imajo protimikrobno delovanje v naslednjem vrstnem redu Ag+ > Cu2+ > Sn2+ > Zn2+ > Al3+. Kositer se uporablja najpogosteje, navadno v obliki kositrovega fluorida. Kositrove soli v obliki ustnih vod, gelov ali past so učinkovite pri zmanjšanju oblog in gingivitisa. Neželjena učinka uporabe sta zabarvanje zob in motnje okušanja (36). Cinkove soli se tudi pogosto dodajajo v zobne paste ali ustne vode (37). Cink ima prednost pred ostalimi kovinskimi ioni, saj ne povzroča zabarvanosti zob in nima škodljivih sistemskih učinkov ali učinkov na mehka tkiva kot ostali kovinski ioni (38). Zadržuje se v ustni votlini, hkrati pa njegova večkratna aplikacija povečuje koncentracijo cinkovih ionov v zobnih oblogah. Cink ima protimikrobno delovanje in inhibira nastanek zobnih oblog preko številnih inhibitornih mehanizmov (39,40). Inhibira tripsinu podobne proteaze bakterije Porphyromonas gingivalis, inhibira glikolizo in nastanek kislin bakterije Streptococcus mutans (31). 4.1.1.4 Fluorid Fluorid je običajno prisoten v zobnih pastah (1.000-1.500 ppm v obliki natrijevega fluorida ali natrijevega monofluorofosfata). Ima predvsem protikariozni učinek, vendar pa ima le majhen učinek na zobne obloge ter komaj opazen protimikrobni učinek. Protikariozni mehanizem poteka preko inhibicije številnih bakterijskih encimov bodisi neposredno ali posredno, s čimer zmanjša hitrost nastajanja kislin v zobnih oblogah po zaužitju ogljikovih hidratov (42). Hkrati vpliva na remineralizacijo in demineralizacijo sklenine. Sub-ppm raven fluorida v slini poveča remineralizacijo sklenine, saj se poveča obarjanje kalcijevih fosfatov in tvorba fluorohidroksiapatita v zobnih tkivih (43). V obliki kositrovega fluorida ali amin fluorida pa ima zaradi nefluoridne komponente molekule znatne antibakterijske lastnosti. Amin naj bi imel površinsko aktivne lastnosti (44) in zavira adhezijo bakterij kot tudi samo rast bakterij. Kositrov fluorid pa deluje antibakterijsko, v večji meri zaradi kositrovega iona, ki je klinično učinkovit (45). 4.1.1.5 Eterična olja Na tržišču je že več let prisoten proizvod, ki vsebuje mešanico eteričnih olj s timolom, evkaliptolom, metil salicilatom in mentolom. Je zelo učinkovit v preprečevanju nastanka supragingivalnih oblog in gingivitisa (46). 4.1.1.6 Ostali antiseptiki Ustne vode z aminom in kositrovim fluoridom kažejo enako učinkovitost kot ustne vode z eteričnim oljem pri zmanjšanju nastanka zobnih oblog in pri ohranjanju zdravja dlesni, vendar imajo močnejši antibakterijski učinek (47). V primerjavi s klorheksidinom pa ustne vode z aminom in kositrovim fluoridom slabše odstranjujejo zobne obloge, vendar povzročijo tudi značilno manjše zabarvanje zob. Sinergistično delovanje kažeta tudi klorheksidin in baker (inhibicija rasti izbranih oralnih bakterij), in sicer zmanjšata število živih celic za 10-do 100 krat bolj kot ob uporabi samega klorheksidina. Prihodnja leta bodo prinesla izboljšave pripravkov z antiseptiki. Nove generacije bi lahko vključevale kombinacije že znanih učinkovin, ki delujejo komplementarno in aditivno. S tem bi povečali učinkovitost ter selektivnost antimikrobnih učinkovin. 4.1.2 Protimikrobne učinkovine Parodontalna bolezen je infekcijskega izvora, povzročena z zobnimi oblogami kompleksne sestave. Nastane z omejenim številom bakterijskih vrst, zato stalno in maksimalno zaviranje nastanka zobnih oblog ni edina rešitev za zdravljenje parodontalne bolezni. Pri posameznikih, ki imajo specifično patogeno infekcijo, je potrebna terapija z učinkovinami, usmerjenimi proti specifičnim patogenom (specifična hipoteza plaka) (48). Poleg specifičnosti pa je pomembno poudariti, da so lahko nekateri patogeni za mehanske posege nedosegljivi zaradi sposobnosti invazije v tkivo (49) ali pa se nahajajo na mestih, ki so parodontalnim instrumentom nedosegljiva (koreninska razcepišča). Poleg tega pa lahko perzisitirajoči patogeni rekolonizirajo zobne površine tudi iz nezobnih področij (hrbtišče jezika, tonzile). Z ustreznimi učinkovinami lahko terapijo parodontalne bolezni usmerimo le proti posameznim patogenom (zdravilo mora pokazati delovanje in vitro proti patogenemu mikroorganizmu) in na področja, ki mehanskim tehnikam niso dostopna (dokazati je potrebno, da se učinkovita koncentracija zdravila, potrebna za uničenje mikroorganizma, lahko doseže v subgingivalnem okolju brez večjih lokalnih in sistemskih stranskih učinkov za zadosten čas, da signifikantno prizadane patogene). V ta namen se pri farmakoterapiji parodontalne bolezni uporabljajo ozkospektralni antibiotiki, lahko lokalno ali sistemsko. Ker pa je subgingivalna flora ponavadi mešana (aerobna in anaerobna), je potrebna kombinirana antibiotična terapija. 4.1.2.1 Sistemska protimikrobna terapija V parodontalni terpaiji se v namen sistemskega protimikrobnega zdravljenja uporabljajo učinkovine: tetraciklin, penicilin, klindamicin, metronidazol ter kombinacija metronidazola, amoksicilina in klavulanske kisline. Indikacije za uporabo sistemske antibiotične terapije so refraktarni parodontitis in agresivni lokalizirani parodontitis ter akutne infekcije (absces dlesni), v nekaterih primerih pa tudi kronični in agresivni parodontitis pri odraslem. Uporaba sistemske antibiotične terapije je priporočljiva tudi pri pacientih teden ali dva po regenerativnih posegih ali po vstavitivi vsadkov, saj je v teh primerih ključnega pomena, da ne pride do infekcij v zgodnjih fazah obnove tkiva. Tudi v nekaterih napredovalih primerih parodontalne bolezni lahko zelo specifične škodljive bakterije odstranimo s kratkotrajno terapijo s sistemskimi antibiotiki. Sistemska protimikrobna terapija je običajna tudi za zdravljenje akutnih infekcij (absces dlesni) ter pred terapijo bolnikov, ki imajo določena komprimitivna bolezenska stanja (umetna srčna zaklopka, prolaps mitralne zaklopke z regurgitacijo...). Praviloma pri večini parodontalnih bolezenskih stanj sistemska antibiotična terapija ni potrebna in učinkovita. Potrebno je poudariti, da je učinek antibiotikov kratkotrajen. 4.1.2.2 Nizkodozna sistemska antibiotična terapija Zanimiv učinek nekaterih antibiotikov je, poleg uničevanja bakterij, ki povzročajo parodontalne bolezni, zmanjšanje telesne produkcije kolagenaze. Kolagenaza je encim, ki je med drugim potreben pri odstranjevanju starih tkiv in nadomestitvi z novimi tkivi. Njeno prekomerno nastajanje, ki je prisotno pri parodontalnih boleznih, pa uničuje tkivo dlesni. Antibiotik doksiciklin pri nizkih odmerkih, ki ne delujejo antibiotično, zavira učinke kolagenaze. Hkrati pa sta prednosti majhnih doz antibiotikov manjša možnost razvoja rezistence in manj stranskih učinkov. 4.1.2.3 Lokalna antimikrobna terapija Lokalna dostava antimikrobnih učinkovin je rezultat več kot 20-letnega pionirskega raziskovalnega dela Goodsona iz raziskovalne ustanove Forsyth Dental Research Center. Cilj je dostava visokih koncentracij antibiotikov ali antimikrobnih učinkovin neposredno na mesto parodontalne okužbe. Dosežene koncentracije so znatno večje kot pri sistemski terapiji, pri čemer je sistemska dostava minimalna. V uporabi so tetraciklinsko vlakno, klorheksidinski čip, doksiciklinski polimer, metronidazolski gel, minociklinsko mazilo. a. Tetraciklinsko vlakno Tetraciklinsko vlakno gradi polimer polietilen vinil acetata, ki je 25% nasičen s tetraciklinom. Vlakno je dolgo 23 cm in ima premera 0,5 mm ter vsebuje 12,7 mg tetraciklina. Vlakno je fleksibilno in ga zlahka vstavimo v parodontalni žep, ki ga skoraj povsem zapolni ter enakomerno sprošča učinkovino 14 dni. V primerjavi s sistemsko dostavo tetraciklina, je pri vlaknu koncentracija tetraciklina v tekočini dlesni 1590 g/ml napram 4 do 8 g/ml pri sistemski dostavi, medtem ko je serumska koncentracija 0,4 g/ml in manj napram 2 do 4 g/ml pri sistemski dostavi. Celokupni odmerek po desetih dnevih zdravljenja je 12, 7 mg napram 10.000 g pri sistemski dostavi. Tekom zdravljenja naj bi se bolnik izogibal ščetkanju zdravljenih zob. Priporočljiva pa je uporaba klorheksidinske ustne vode dvakrat dnevno do enega tedna po odstranitvi vlaken ( vlakna pustimo deloveti 7-14 dni). Terapija s tetraciklinskim vlaknom se je izkazala za učinkovitejšo glede globine sondiranja žepov dlesni, nivoja kliničnega prirastišča dlesni in krvavitve dlesni v primerjavi z luščenjem in glajenjem korenin (50). Optimalna mesta za uporabo tetraciklinskih vlaken so parodontalni žepi z globino sondiranja 5mm ali več, ki krvavijo ob sondiranju in se niso odzvala na mehansko terapijo. b. Doksiciklinski polimer Tekoč biorazgradljiv dostavni sistem (10% doksiciklin hiklat) otrdi v parodontalnem žepu in omogoča kontrolirano sproščanje vgrajenega doksiciklina. Doksiciklin se tik pred aplikacijo zmeša s tekočim polimerom ter injicira v žep, ki se nato zapre s cianoakrilatom. Tekom zdravljenja naj bi se bolnik izogibal ščetkanju zdravljenih zob. Priporočljiva pa je uporaba klorheksidinske ustne vode. Doksiciklin je bil izbran zaradi mehanizma delovanja, t.j. učinkovitosti proti številnim parodontalnim patogenom, zaradi česar je učinkovit pri zdravljenju parodontitisa (51,52,53). Doksiciklin znatno zmanjšuje globino sondiranja in krvavitev ob sondiranju. V primerjavi z luščenjem in glajenjem korenin dosega 100% rezultate luščenja in glajenja glede nivoja kliničnega prirastišča dlesni ter globine sondiranja (54). c. Metronidazolski gel Metronidazolski gel vsebuje 25% metronidazola. V žepe dlesni se nanese z injekcijo in topo kanilo. Sistem je biorazgradljiv, vendar pa zahteva večkratne aplikacije. Učinkovitost zdravljenja se je v številnih študijah izkazala za primerljivo luščenju korenin (55,56). e. Minociklinsko mazilo Minociklinsko mazilo vsebuje 2% minociklinskega hidroklorida. V žepe dlesni se nanese z injekcijo in topo kanilo. Zaradi biorazgradljivosti so potrebne večkratne aplikacije učinkovine. Minociklin je učinkovit pri uničevanju bakterij, ki naj bi povzročale parodontalne bolezni. Učinkovito zmanjšuje globino sondiranja, krvavitev ob sondiranju in izboljšuje nivo kliničnega prirastišča. Minociklinsko mazilo, kot adjunktivna terapija po luščenju in glajenju korenin, je bolj učinkovito kot pa izpiranje ust po luščenju in glajenju korenin (57). Potrebno je poudariti, da uporaba lokalnih antimikrobnih učinkovin ne bo nadomestila terapevtske potrebe po temeljitem luščenju in glajenju korenin, ki ostaja najpomembnejša modalnost v parodontiki. Tetraciklinsko vlakno se priporoča za uporabo pri ponovnem pregledu, 4-6 tednov po luščenju in glajenju korenin, kadar so žepi še vedno večji kot 5 mm in krvavijo pri sondiranju. Doksiciklinski polimer in metronidazolski gel pa bi se lahko uporabljala kot nadomestilo luščenju in glajenju korenin. Vsi primeri vnetnega parodontitisa niso primerni za lokalno zdravljenje. Kadar konvencionalna mehanska terapija ni povsem učinkovita, je potrebno dodatno in bolj agresivno zdravljenje. V primeru, ko po luščenju in glajenju korenin ostanejo lokalizirana mesta, ki se niso odzvala, je primerna uporaba kontroliranih lokalnih dostavnih sistemov. V primeru, da ostane prizadetih več zaporednih zob, pa je najverjetneje parodontalna operacija najučinkovitejša metoda. Ustrezna alternativa pri atipičnem parodontitisu (številna prizadeta mesta v vseh kvadrantih, ki ne odgovarjajo na mehansko terapijo) je tudi sistemsko zdravljenje z ustreznim antibiotikom, po laboratorijskem testiranju za prisotnost mikrobov. Periimplantitis in parodontalni abscess sta tudi primerni indikaciji za uporabo lokalne antibiotične terapije. Nerazgradljivo tetraciklinsko vlakno omogoča ustrezno drenažo abscesa, hkrati pa dostavlja visoke koncentracije tetraciklina v sam absces. Za izbor ustreznega dostavnega sistema je potrebno upoštevati učinkovitost učinkovin, njihovo dostopnost, težavnost rokovanja z njimi in stroške. 4.1.3 Antibakterijski peptidi Možna alternativa antibiotikom so antibakterijski peptidi. Nekateri derivati antibakterijskih peptidov so že prešli faze razvoja, vključno humane klinične študije faze I-III. Uporaba humanih antibakterijskih peptidov kot zdravil doslej še ni zaživela, in sicer zaradi do sedaj še neznanih bioloških funkcij teh molekul in velikih stroškov masovne proizvodnje (58). Antibakterijski peptidi so raznolike skupine molekul z majhno molekulsko maso (59), dolge od 6 do 50 aminokislin (60,61), s širokim spektrom baktericidnega in fungicidnega delovanja, zato jih imenujemo tudi naravni antibiotiki (62). Kljub širokemu spektru delovanja je njihova citotoksičnost do normalnih sesalskih celic zelo nizka. Vloga antibakterijskih peptidov pa ni samo antimikrobno delovanje, ampak tudi povezovanje mehanizmov prirojene in pridobljene obrambe organizma (59). Nevretenčarji imajo le prirojeno imunost, pri vretenčarjih pa je obrambni mehanizem odvisen tako od prirojene kot od pridobljene imunosti (63). Antimikrobni peptidi so del prirojene imunosti pri nevretenčarjih, pri vretenčarjih pa dopolnjujejo pridobljeno imunost, saj so prva obramba pri vdoru patogenov (64). Hkrati so tudi del mehanizmov prirojene imunosti kot biosinteza antimikrobnih peptidov. Odvisno od organizma so prisotni konstitutivno znotraj sekretornih celic ali pa nastanejo inducibilno pri infekciji (63). Antimikrobni peptidi sodelujejo pri nekaterih aktivnostih imunskega sistema kot so pospeševanje akutnega vnetnega odziv (59). Majhne koncentracije peptidov bi se lahko vezale na tkiva ter preprečile vezavo bakterij. Ta koncept so testirali v primerjalni študiji antibakterijskega peptida nisina in klorheksidina, ki je pokazala, da je nisin učinkovit pri odstranjevanju zobnih oblog in ne povzroča zabarvanja zob (65). 4.1.4 Genska terapija Genska terapija v parodontiki še ni bila sprejeta z uspehom, primarno zaradi nepopolne tehnologije genske terapije, sekundarno pa ker je parodontalna bolezen posledica večih dejavnikov; mikrobne infekcije in gostiteljevega imunskega odgovora, modificirano z genskimi in okoliškimi dejavniki. Hkrati gre pri genetiki za probleme z genskimi variacijami pri različnih populacijah (multipli geni, interakcije med geni in okoljem, odsotnost določenega gena kot univerzalno priznani vzročni dejavnik). Trenutno je genska terapija na nivoju kliničnih raziskav na živalskih modelih in poteka v smeri spreminjanja gostiteljevega imunskega odgovora ter specifičnih parodontalnih patogenov. Genska terapija poteka z vstavljanjem terapevtskega gena v pacientovo tarčno celico preko nosilne molekule oziroma vektorja. Najpogosteje uporabljen vektor je virus, ki je gensko spremenjen in nosi normalno človeško DNA. Klinična aplikacija genskega prenosa poteka lahko in vivo ali ex vivo. Omejitve genske terapije pa so kratkotrajnost same terapije, imunski odgovor pacienta, problemi z virusnimi vektorji, stroški in etični razlogi. Rekonstruktivna kirurgija (autogeni ali alograftni vsadki) je za bolnika s signifikantno alveolarno izgubo kosti prednostna pred izgubo zoba, vendar je izzid nepredvidljiv. Genska terapija poskuša uporabiti telesu lasten mehanizem tvorbe kosti z vnašanjem terapevtskega proteina v regenerativno mesto. Študije izvedene na živalih so obetavne, vendar bo pred razvojem genske terapije potrebno rešiti številne probleme povezane s prenosom genov. a. Tkivno inženirstvo Strategija tkivnega inženirstva je vstaviti terapevtski rastni faktor v regenerativno mesto. Vnos lahko poteka z ex vivo genskim prenosom v tkivnih kulturah in nadaljnjim priraščanjem celic, ki izražajo terapevtski gen. Številne celice, kot so ne-osteogeni fibroblasti (iz dlesni in zobne pulpe), keratinociti, mioblasti, osteoblasti, po adenovirusnem vnosu izražajo BMP-7 in BMP-9 gen (BMP, bone morphogenic protein so multifunkcionalni rastni dejavniki) in so sposobne diferencirati v osteocite pri vstavitvi v kostno okvaro in vivo. Adenovirusni vnos gena in vivo v okvarjeno kostno tkivo omogoča popravke kostnih okvar v razmeroma kratkem času. Mezenhimske izvorne celice so pluripotentne izvorne celice in po genskem inženirstvu ter vnosu v kostni defekt z ekspresijo BMP-2 inducirajo novo kost v kostni okvari in vivo. PDGF (ang. platelet derived growth factor) ima močan učinek na regeneracijo trdih in mehkih tkiv. Indukcija proliferacije je dosežena pri podaljšani izpostavljenosti (> 7 ur) PDGF, ki pa nam jo omogoča adenovirusni sistem vnosa gena. Tudi in vivo vnos gena za kostni sialoprotein v kostni defekt omogoča uspešno regeneracijo parodontalne alveolne kosti. Nov način vnosa genov predstavlja vgradnja intaktne DNA v polimere, ki se lahko uporabijo kot obloge na vstavljivih pripravah kot so parodontalni implantati (položajno specifična genska terapija). Tovrstna genska sredstva bi lahko izboljšala biokompatibilnost parodontalnih implantatov. Kostno remodeliranje učinkovito izboljša tudi in vivo vnos genov za številne proteine, ki sodelujejo pri remodeliranju z metodo elektroporacije. b. Cepiva Injiciranje plazmida z genom za fimbrialni protein bakterije Porphyromonas gingivalis v tkivo žleze slinavke sproži nastanek IgG in IgA protiteles, ki lahko neutralizirajo P. gingivalis ter omejijo njeno pritrjevanje in nastanek zobnih oblog. Znanstveniki so tudi dokazali učinkovitost cepljenja z gensko spremenjenim vektorjem Streptococci gordoni, ki izraža fimbrilarni antigen P. gingivalis. Cepljenje z rekombinantnim hemaglutininom B, pomembnim virulentnim dejavnikom P. gingivalis, sproži produkcijo IgG protiteles ter IL-2, IL-10 in IL-4, kar zagotovi zaščito pred izgubo kosti. Druge strategije prihodnosti genske terapije parodontalne bolezni so še genski pristop do antibiotične rezistence biofilma, antimikrobna genska terapija, vpliv genske terapije na adherenco bakterij, genska terapija v smeri laboratorijske rasti novih zob, razvoj genskih zdravil itd. Lahko predvidevamo, da bo v prihodnosti genski pristop predstavljal vedno večji delež pri terapiji kot tudi preventivi parodontalnih bolezni. Za zdravnike dentalne medicine kot tudi farmacevte je pomembno, da sledijo napredku znanosti tako na področju biotehnologije in genskega inženirstva kot tudi dostavnih sistemov za lokalno zdravljenje parodontalnih bolezni, ki lahko bistveno pripomorejo k sami preventivi ter izboljšanju učinkovitosti kirurškega zdravljenja. 5 Literatura 1. Oh TJ, Eber R, Wang HL. Periodontal diseases in the child and adolescent. J Clin Periodontol 2002, 29: 400-410. 2. Witt J, Ramji N, Gibb R, Dunavent J, Flood J, Barnes J. Antibacterial and Antiplaque Effects of a Novel, Alcohol-Free Oral Rinse with Cetylpyridinium Chloride. J Cotemp Dent Pract, 2005; 6: 1-10. 3. Research, Science and Therapy Committee of the American Academy of Periodontology: Academy Report. Epidemiology of Periodontal Diseases J Periodontol 2005, 76:1406-1419. 4. Research, Science, and Therapy Committee of The American Academy of Periodontology. The Pathogenesis of Periodontal Disease. J Periodontal 1999, 70: 457-470. 5. American Academy of Periodontology-Research, Science and Therapy Committee. Threatment of Plaque-induced Gingivitis, Chronic Peridontitis, and Other Clinical Conditions. Endorsed by the American Academy of Pediatric Density 2004, 169-178. 6. Frias J, Olle E, Alsina M. Periodontal Pathogens produce Quorum Sensing Signal Malecules. IAI 2001, 3432-3434. 7. Kinane DF, Marshall GJ. Periodontal menifestation of sistemmc disease. Aust Den J, 2001, 46:2-12. 8. Tamaki Y, Nomura Y, Takeuchi H, Ida H, Arakawa H, Tsurumoto A, Kumagai T, Hanada N. Study of the clinical usefullness of a dental drug system for selective reductions of mutans streptococci using a case series. J Oral Sci 2006, 48:111-116. 9. Bouwsma OJ. The status, future, and problems of oral antiseptics. Curr Opin Periodontol 1996, 3:78-84. 10. Flotra L. A 4-month study on the effect of clorhexidine mouth washes on 50 soldiers. Scand J Dent Res 1972,80:10-17. 11. de la Rosa M. The use of clorhexidine in the management of gingivitis in children. J Periodontol 1988,59:387-389. 12. Brecx M. Efficacy of Listerine, Meridol and clorhexidine mouthrinses on plaque, gingivitis and plaque bacteria vitality. J Clin Periodontol 1990, 17:292-297. 13. Barkvall P, Rolla G, Svendsen AK. Interaction between clorhexidine digluconat and sodium lauryl sulfate in vivo. J Clin Periodontol 1989, 16:593-595. 14. Addy M, jenkins S, Newcombe R. Studies on the effects of toothpaste rinses on plaque regrowth: 1. Influence of surfactants of clorhexidine efficacy. J Clin Periodontol 1989, 16:380-384. 15. Jenkins S, Addy M, Newcombe R. The effects of 0,5% clorhexidine and 0,2% triclosan containing toothpastes on salivary bacterial counts. J Clin Periodontol 1990, 17:85-89. 16. Killoy WJ, Polson AM. Controlled local delivery of antimicrobials in the treatment of periodontitis. Advan in Perodont 1998, 42: 263-283. 17. Wilson M, Stanley A, Bansal G. Effect of the Phenoxyethanol, clorhexidine and their combination on subgingival plaque bacteria. J Antimicrob Chemother 1990, 25:921. 18. Soskolne A, Golomb G, Friedman M. New sustained release dosage form of clorhexidine for dental use: II. Use in periodontal therapy. J Periodont Res 1983, 18:330. 19. Stabholz A, Sela MN, Friedman M. Clinical and microbiological effects of sustained release clorhexidine in periodontal pockets. J Clin Periodontol 1986, 13: 783. 20. Soskolne WA, Heasman PA, Stabholz A. Sustained local delivery of clorhexidine in the treatment of periodontitis: A multi-center study. J Periodontol 1997, 68:32. 21. Jeffcoat M, Palcanis K, Offenbacher S. Multicenter evaluation of a biodegradable clorhexidine /gelatin chip for the treatment of adult periodontitis. J Dent Res 1997, 76:152. 22. Gaffar A; Afflitto J, Nabi N. Chemical agents for the control of plaque and gingivitis: an overview. Eur J Oral Sci 1997, 105: 502-507. 23. Gaffar A, Scherl D, Afflitto J et al. The effect of Triclosan on mediators of gingival inflammation. J Clin Periodontol 1995, 22:480-484. 24. Nabi N. In vitro and in vivo studies on triclosan/PVM/MA copolymer NaF combination as an antiplque agent. Am J Dent 1989, 2: 197-206. 25. Palomo F. Plaque/gingivitis effict of triclosan dentifricies, J Dent Res 1993, 72: 334. 26. Triratana T. Plaque/gingivitis effect of a triclosan/copolymer dentifrice. J Dent Res 1993, 72: 334. 27. Linde J. The effect of a triclosan-contining dentifrice on establishement plaque and gingivitis. J Clin Periodontol 1993, 20: 327-334. 28. Roll G, Gaare D, Ellingsen JE. Experiments with a toothpaste containing polymethylsiloxan/triclosan. Scand J Dent Res 1993, 101:130-132. 29. Waaler SM. Effects of oral rinsing with triclosan and sodium lauryl sulfate on dental plaque formation: a pilot study. Scand J Dent Res 1993, 101: 192-195. 30. van der Ouderaa FJ, Cummins D, Hull DMC. Use of Triclosan for the Manufacture of a medicament for the treatmnt of Periodontitis. 1993. European patent application number 92202287.6. 31. Marsh PD. Dentifrices containing new agents for the control of plaque and gingivitis: microbiological aspect. J Clin Periodontol 1991, 18: 462-467. 32. CumminsD. Zinc citrate/Triclosan: a new antiplaque system for the control of plaque and the prevention of gingivitis:short term clinical and mode of actions studies. J Clin Periodontol 1991, 18_ 455-461. 33. Creeth JE, Abraham PJ, Barlow JA et al. Oral delivery and clearance of antiplaque agents from Triclosan-containing dentifrices. Int Dent J 1993, 43_ 387-397. 34. Jenkins S, Addy M, Nowcombe RG. A comparison of a cetylpiridinum chloride, triclosan and clorhexidine mouthrinse formulations for effects on plaque growth. J Clin Periodontol 1994, 21:441-444. 35. Marsh PD. Dentrifices containing new agents for the control of plaque and gingivitis: microbiological aspect. J Clin Periodontol 1991, 18: 462-467. 36. Jackson RJ. Metal salts, essential oils and phenols-old or new? Periodontol 2000, 1997 15, 63-73. 37. Stadtler P, Holler H. Toothpastes. Int J Clin Pharm&Therapeutics 1992. 30: 167-172. 38. Mandel ID. Chemoterapeutic agents for controlling plaque and gingivitis. J Clin Periodontol 1988, 15: 488-498. 39. Gjermo P, Saxton CA. Antibacterial dentifrices. Clinical data and relevance with emphasis on zinc/Triclosan J Clin Periodontol 1991, 18: 468-472. 40. Phan TN, Buckner T, Sheng J, et al. Physiological actions of zinc related to inhibition of acid and alkali production by oral streptococci in suspensions and biofilms. Infect Immun 41. Watson GK, Cummins D, van der Ouderaa FJG. Inhibition of acid production by Streptococcis mutans NCTC-10449 by zinc and effect of metal speciation. Caries Res 1991 25: 431-437. 42. Marsh PD. Dentrifices containing new agents for the control of plaque and gingivitis: microbiological aspect. J Clin Periodontol 1991, 18: 462-467. 43. ten Cate JM. Current concepts on the theories of the mechanism of action of fluoride. Acta Odontol Scand 1999, 57: 325-239. 44. Scheie AA. Modes of action of currently known chemical anti-plaque agents other than chlorhexidine. J Dent Res 1989, 68: 1609-1616. 45. Gaffar A, Afflitto J, Nabi N. Chemical agents for the control of plaque and gingivitis: an overview. Eur J Oral Sci 1997, 105: 502-507. 46. Ross NM, Charles CH. Long term therapy of Listerine antiseptic on dental plaque and gingivitis. J Clin Dent 1989, 1: 92-95. 47. Zimmerman A. Gingivitis, plaque accumulation and plaque composition under long-term use of Meridol. J Clin Periodontol 1993, 20:346-351. 48. Loesche WJ. Clinical and microbiological aspects of chemoterapeutical agents used according to the specific plaque hypothesis. J Dent Res 1979, 58:2404-12. 49. Amano A. Disruption of epithelial barrier and impairment of cellular function by Porphyromonas gingivalis. Front Biosci 2007, 12:3965-74. 50. Goodson JM, Cugini MA, Kent RL. Multi-center evaluation of tetracycline fiber therapy: I. Experimental design, methods, and baseline data. J Periodont Res 1997, 26:361. 51. Baker PJ, Evans RT,Coburn RA. Tetracycline and its derivatives strongly bind to and are released from the tooth surface in active form. J Periodontol 1983, 54:580. 52. Golub LM, Ramamurthy N, McNamara TF. Tetracyclines inhibit tissue collagenase activity: A new mechanism in the treatment of periodontal disease. J Periodont Res 1984, 19:651. 53. Gordon JM, Walker CB. Current status of systemic antibiotic usage in destructive periodontal disease.J Periodontol 1993, 64:760. 54. Garrett S, Adams D, Bandt C. Two multicenter clinical trials of subgingival doxycycline in the treatment of periodontitis. J Dent Res 1997, 76:153. 55. Klinge B, Attstrom & Karring T. 3 regimens of topical metronidazole compared wilh subgutgival scaling on periodontal pathology in adults. J Clin Periodontol 1992, 19:708. 56. Pedrazzoli V, Killian M, Karring T . Comparative clinical and microbiological effects of topical subgingival application of metrbnidazole 25% dental gel and scaling in the treatment of adult periodontitis. J Clin periodontol 1992, 19:751. 57. Nakagawa T,Yamada S, OosukaY. Clinical and microbiological study of local mlnocycline delivery (Periocline) following scaling and root planing in recurrent penodontal pockets. Bull Tokyo Dent Coll 1991, 32:63. 58. Lemaitre B, Reichhart JM, Hoffmann JA. Drosophila host defense: Differential induction of antimicrobial peptide genes after infection by various classes of microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 14614-14619. 59. Devine DA, Hancock REW: Cationic Peptides: Distribution and Mechanisms of Resistance. Curr Pharm Des. 2002, 8: 703-714. 60. Hwang PM, Vogel HJ. Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem. Cell Biol. 1998, 76: 235-246. 61. Brogden KA. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria ? www.nature.com/reviews/micro, 2005, 3: 238-250. 62. Marshall SH, Arenas G. Antimicrobial peptides: A natural alternative to chemical antibiotics and a potential for applied biotechnology. 63. Bulet P, St cklin R, Menin L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. Imunol. Rev. 2004, 198: 169-184. 64. Metz-Boutigue MH, Kieffer AE, Goumon Y, Lugardon K, Aunis D. Study of new antimicrobial peptides in cromaffin granules from bovine adrenal medulla: new aspects of innate immunity. Cell Biology of the Cromaffin Cell 2004, 129-1. 65. Howel TH, et al. The effect of a mouthrinse based on nisin, a bacteriocin, on developing plaque and gingivitis in beagledogs. J Clin Periodontol 1993, 20:335-339. 34. skupščina SFD Jelka Dolinar 25 let je Slovensko farmacevtsko društvo organiziralo simpozije ob rednih letnih skupščinah v Avditoriju v Portorožu. Prvega na temo »Alergija in zdravila« leta 1983. V tem obdobju je lokacijo zamenjalo samo tri krat. Preselitev simpozija iz Avditorija v portoroški Bernardin je vodila želja po spremembi, ki bo hkrati omogočila ustrezno kakovost konferenčnih prostorov in storitev. Organizatorji, pa tudi udeleženci simpozija in razstavljalci, so bili s kongresnim centrom Bernardin zadovoljni. V treh dneh srečanja so se zvrstile tri teme. Interaktivno vključevanje udeležencev v obravnavo praktičnih kliničnih primerov na temo AKUTNE BOLEČINE, se je tudi tokrat izkazalo kot učinkovit način za spodbujanje razprave. Satelitski simpozij je pripravil in vodil prof. dr. Aleš Mrhar. Glavna tema ZDRAVILA V ONKOLOGIJI IN PREHRANA ONKOLOŠKIH BOLNIKOV, ki jo je povezoval prof. dr. Borut Štrukelj je potekala v petek, 8. maja. Zadnji dan srečanja je bil na programu satelitski simpozij VLOGA IN UGLED LEKARNIŠKE SLUŽBE, kjer smo, kljub spodbudam moderatorja simpozija doc. dr. Aleša Mlinariča, zaman pričakovali živahno razpravo. Natrpan program prvih dveh dni je vplival na slabši odziv. Srečanje smo zaključili z redno letno skupščino, na kateri so prisotni potrdili poročila o delu in poslovanju ter poročilo nadzornega odbora, dali razrešnico dosedanjim organom SFD ter sprejeli predlog manjših sprememb in dopolnitev temeljnega akta SFD. V razpravi so delegati pozvali k intenzivnejši vlogi društva pri obravnavi sprememb in dopolnitev Zakona o zdravstveni dejavnosti, ki lahko bistveno vpliva na položaj stroke in poklica v zdravstvenem sistemu. Sprejet je bil sklep o sodelovanju predstavnikov Društva s Fakulteto za farmacijo in Lekarniško zbornico Slovenije pri pripravi pripomb na omenjeni zakon. Razprava na skupščini je ponovno iznesla problematiko Farmakona. Neredno izhajanje ni le posledica težav z usklajevanjem vsebin znotraj uredniškega odbora, pač pa tudi premajhnega interesa strokovnjakov za pisanje prispevkov iz klinične prakse. Skupščina je podprla idejo o publiciranju druge oblike informativnega biltena v povezavi s FIC-em. Za predsednika društva v mandatnem obdobju 2009-2011 je bil ponovno izvoljen dr. Gašper Marc. V naslednjem dveletnem obdobju si bo še naprej prizadeval za večjo prepoznavnost stroke v javnosti in za povezovanje vseh struktur v farmaciji. Skupščina se potrdila tudi članarino za leto 2010, ki bo znašala za zaposlene farmacevte 32 €, za tehnike 25 €, za študente in seniorje pa 15 €. Organi društva mandat 2009 - 2011 izvoljeni na 34. skupščini SFD Predsednik SFD Gašper Marc IZVRŠNI ODBOR (člani so bili potrjeni na občnih zborih Podružnice Celjska podružnica Marina Urbanc Mokotar Dolenjska podružnica Marjan Balkovec Gorenjska podružnica Tina Bukovec Kosmač Ljubljanska podružnica Tatjana Kogovšek Vidmar Mariborska podružnica Matjaž Tuš Pomurska podružnica Damir Domjan Posavska podružnica Alenka Koritnik Primorska podružnica Karolina Žvanut Zasavska podružnica Sabina Drobnič Sekcije Homeopatska sekcija Maruša Hribar - predsednica Tanja Šegula - članica IO Sekcija bolnišničnih farmacevtov Tajda Gala Miharija Sekcija farmacevtskih tehnologov Jernej Zadnik Sekcija farmacevtskih tehnikov Zdenko Taušič Sekcija farmacevtskih znanosti Aleš Obreza Sekcija kliničnih farmacevtov Nataša Faganeli Sekcija farmacevtov javnih lekarn Nina Pisk Sekcija seniorjev Lovro Dermota Sekcija študentov Petra Soršak Sekcija za farmacevtsko kemijo Lucija Peterlin Mašič Regulatorna sekcija Simona Cencelj Nadzorni odbor Janez Kerč, Dionizij Petrič, Jasna Majdič Disciplinsko sodišče Aleš Krbavčič, Ivan Remškar, Darja Frankič Odbor za podeljevanje društvenih priznanj Aleš Mrhar, Franc Vrečer, Zofija Vitkovič, Martina Klanjšček, Breda Kosirnik, Slavko Rataj, Lovro Dermota Izdajateljski svet Mirjana Gašperlin, Anamarija Zega, Katja Razinger, Mojca Prah Klemenčič, Tanja Šegula, Mira Abazovič, Sonja Rupret Društvena priznanja za leto 2009 Aleš Mrhar, predsednik Odbora za podeljevanje društvenih priznanj Na 34. skupščini so društvena priznanja prejeli Minafikovo odličje prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm. i %s.L,o Dlll il^t iE KC1J* fAKMAC SVi DV IAV.-JIH LEt*SN J i k -V ! l!i>K M [- SI I J\ l | r Hitro odpravi bolečino e°tfČ/Nfl ((< KL i f c tf www.nalgesiasi Hitra rešitev Tc^nohv^con www.krka.sl IJ» KRKk Naša hiovoiivnnst hi znanje za učinkovite in varne izdelke vrhunske kako vosu. Pred uporabo natančno preberite navodilo! O tveganju in neželenih učinkih se posvetujte z zdravnikom ali s farmacevtom.