Strokovni prispevek/Professional article
MOŽNOSTI ZA PRENOS ENEGA ZARODKA V POSTOPKU ZUNAJTELESNE OPLODITVE
POSSIBLILTIES FOR A SINGLE EMBRYO TRANSFER IN AN IN VITRO FERTILIZATION
PROGRAMME
Irma Virant-Klun, Tomaž Tomaževič, Branko Zorn, Lili Bačer-Kermavner, Brigita Valentinčič-Gruden, Jerneja Kmecl, Martina Ribič-Pucelj, Andrej Vogler, Eda Bokal-Vrtačnik, Sašo Drobnič, Bojana Pinter, Jožica Mivšek, Helena Meden-Vrtovec
Oddelek za reprodukcijo, Ginekološka klinika, Klinični center, Šlajmerjeva 3, 1525 Ljubljana
Prispelo 2003-05-14, sprejeto 2003-06-19; ZDRAV VESTN 2003; 72: Supl. II: 113-6
Ključne besede: zunajtelesna oploditev; blastocista; prenos; zamrzovanje; odmrzovanje; nosečnost
Izvleček - Izhodišča. Ker v postopku zunajtelesne oploditve vnašamo v maternico dva zarodka - blastocisti, je delež dvo-plodnih nosečnosti večji kot v splošni populaciji. Namen naše raziskave je bil ugotoviti klinične rezultate po elektivnem prenosu ene same blastociste.
Metode. Retrospektivno smo analizirali rezultate 696postopkov zunajtelesne oploditve. Postopke smo razdelili v dve skupini: 37postopkov, v katerih smo v maternico elektivnoprenesli eno samo blastocisto (skupina 1), in 659 postopkov, v katerih smo v maternico elektivno prenesli dve blastocisti (skupina 2). Primerjali smo stopnjo zanositve, delež dvoplodnih nosečnosti in delež spontanih splavov. Ugotavljali smo vpliv metode zunajtelesne oploditve (klasični IVF in ICSI) in starosti ženske (< 38 let in > 38 let) na klinične rezultate po prenosu ene ali dveh blastocist.
Rezultati. Po prenosu ene ali dveh blastocist se stopnji nosečnosti nista statistično pomembno razlikovali (30% vs. 46%); po prenosu ene blastociste ni bilo nobene dvoplodne nosečnosti, po prenosu dveh blastocist je bilo 18% dvoplodnih nosečnosti. Metoda zunajtelesne oploditve ni vplivala na delež dvoplodnih nosečnosti po prenosu dveh blastocist, medtem ko je bil delež dvoplodnih nosečnosti pri ženskah, mlajših od 38 let, statistično pomembno večji kot pri starejših ženskah (19% vs. 6%;p < 0,05).
Zaključki. Klinični rezultati po elektivnem prenosu ene ali dveh blastocist so zelo primerljivi. S prenosom ene blastociste se izognemo dvoplodni nosečnosti. Elektivniprenos ene same blastociste je priporočljiv predvsem pri ženskah, mlajših od 38 let.
Key words: in vitro fertilization; blastocyst; transfer; freezing; thawing; pregnancy
Abstract - Background. Since in in vitro fertilization two embryos - blastocysts are routinely transferred, the twin pregnancy rates are higher than in the general population. The aim of our study was to evaluate the clinical results after elective single-blastocyst transfer.
Methods. Retrospectively we analysed clinical results of 696 in vitro fertilization cycles. The cycles were divided into 37 cycles, in which an elective single blastocyst transfer was performed (group 1), and in 659 cycles, in which an elective double blastocyst transfer was performed (group 2). The pregnancy rates, twin pregnancy rates, and spontaneous abortion rates were compared between the two groups. Additionally we evaluated the effect of the method of in vitro fertilization (classical IVF and ICSI) and female age (< 38 years and > 38years) on the clinical results after a single or double blastocyst transfer.
Results. After an elective single or double blastocyst transfer, there was no statistically significant difference in pregnancy rates (30% vs. 46%); after a single blastocyst transfer there were no twin pregnancies, whereas after a double blastocyst transfer the pregnancy rate was 18%. After a double blastocyst transfer, the method of in vitro fertilization did not affect the twin pregnancy rate, whereas in women younger than 38years, the twin pregnancy rate was significantly higher than in women aged >38years (19% vs. 6%;p < 0,05).
Conclusions. Clinical results obtained after an elective single and double blastocyst transfer are comparable. By the transfer of one blastocyst twin pregnancies are avoided. Elective single blastocyst transfer is recommended in women, younger than 38 years.
Uvod
Razvoj novih, zaporednih gojišč je v postopku zunajtelesne oploditve omogočil gojenje zarodkov do razvojne stopnje blastociste (1). Na naši kliniki gojimo zarodke vseh bolnic v postopku zunajtelesne oploditve do razvojne stopnje blastoci-
ste. Zarodki na razvojni stopnji blastociste imajo približno 100 celic in so že diferencirani v embrioblast in trofoblast, vmesni prostor pa zapolnjuje kavitacijska votlina - blastocel (sl. 1). Do razvojne stopnje blastociste se razvije približno 60% zarodkov. Na 5. dan po ultrazvočnem aspiriranju foliklov vne-
semo v maternico največ dva zarodka - blastocisti. Poleg tega smo razvili klinično uspešni metodi za zamrzovanje in od-mrzovanje nadštevilnih humanih blastocist (2), ki v postopku zunajtelesne oploditve preostanejo po vnosu svežih blasto-cist v maternico. Postopek zamrzovanja in odmrzovanja preživi približno 85% blastocist, vnos odmrznjenih blastocist v maternico pa daje dobre klinične rezultate (3). Ker z razvojem zarodkov do razvojne stopnje blastociste izberemo najkakovostnejše zarodke za vnos v maternico in nad-številne blastociste uspešno zamrznemo, nam to daje možnosti za prenos ene same blastociste v maternico, ne da bi s tem zmanjšali klinično uspešnost postopka. Na ta način bi se izognili dvoplodnim nosečnostim, ki se v postopku zunajtelesne oploditve pojavljajo v višjem odstotku kot v splošni populaciji (4).
Namen naše raziskave je bil ugotoviti klinične rezultate po prenosu ene same blastociste v maternico v postopku zunaj-telesne oploditve in se s tem približati naravnemu stanju -enoplodni nosečnosti.
zanositve po vnosu zamrznjenih in odmrznjenih blastocist iz istih postopkov), deležu dvoplodnih nosečnosti in deležu spontanih splavov. Razlike so bile statistično pomembne pri p < 0,05.
Rezultati
Elektivni prenos ene same ali dveh blastocist smo izvedli v 696 od 2123 (33%) postopkov zunajtelesne oploditve v obdobju od januarja 2001 do decembra 2002. Obe skupini, skupina z elektivnim prenosom ene same blastociste in skupina z elektivnim prenosom dveh blastocist, se nista razlikovali v povprečni starosti ženske, povprečnem številu zarodkov na postopek in po deležu postopkov neposrednega vnosa semenčice v citoplazmo jajčne celice (ICSI) za zdravljenje moške neplodnosti (razpr. 1), zato sta bili primerljivi. V obeh skupinah smo dosegli skupno 314 nosečnosti, kar pomeni 45-od-stotno stopnjo nosečnosti na prenos zarodka.
Razpr. 1. Klinični rezultati po elektivnemprenosu ene ali dveh blastocist v postopku zunajtelesne oploditve.
Table 1. Clinical results after elective single and double blastocyst transfer in an in vitro fertilization programme.
Zunajtelesna oploditev In vitro fertilization
Sl. 1. Humana blastocista v postopku zunajtelesne oploditve (400-kratna povečava; Laboratorij IVF, Ginekološka klinika, Klinični center Ljubljana).
Figure 1. Human blastocyst in an in vitro fertilization programme (y 400; IVF Laboratory, Department of Obstetrics and Gynecology, University Medical Centre Ljubljana).
Metode
Retrospektivno smo analizirali klinične rezultate 696 postopkov zunajtelesne oploditve s prenosom zarodka, opravljenih na Ginekološki kliniki v Ljubljani v obdobju od januarja 2001 do decembra 2002. Postopke smo razdelili v dve skupini: 37 postopkov, v katerih smo pri neplodnih parih pridobili več kot en zarodek, vendar smo v maternico prenesli eno samo blastocisto - elektivni prenos ene same blastociste (skupina 1) in 659 postopkov, v katerih smo pridobili več kot dva zarodka, vendar smo v maternico prenesli samo dve blastoci-sti - elektivni prenos dveh blastocist (skupina 2). V skupini 1 smo elektivno prenesli eno samo blastocisto zaradi želje bolnice, nevarnosti hiperstimulacije, dvoplodne nosečnosti ali zaradi ponavljajočih se spontanih splavov v anamnezi. V skupini 2 smo rutinsko prenesli v maternico dve blastocisti, saj v postopku zunajtelesne oploditve prenesemo največ 2 zarodka. V obeh skupinah smo upoštevali tudi zamrzovanje in odmrzovanje blastocist ter klinične rezultate z odmrznjeni-mi blastocistami iz istih postopkov zunajtelesne oploditve. S testom Mann Whitney U (program SPSS, Illinois Inc., USA) smo ugotavljali statistično razliko med obema skupinama po stopnji zanositve, kumulativni stopnji zanositve (vključujoč
	Elektivni prenos 1 blastociste	Elektivni prenos 2 blastocist
	v maternico (skupina 1) Elective single blastocyst transfer (group 1)	v maternico (skupina 2) Elective double blastocyst transfer (group 2)
Prenosi zarodkov v maternico (ET) Embryo transfers (ET)	37	659
Število žensk No. of women	37	615
Povprečna starost ženske (min-max) Mean female age (min-max)	32,9 ± 2,3 (29-36) 33,5 ± 4,5 (20-43)	
Število zarodkov/postopek (min-max) No. of embryos per cycle (min-max)	2,8 ± 0,8 (2-4)	5,3 ± 2,4 (3-19)
Postopki neposrednega vnosa semenčice v citoplazmo jajčne celice ICSI (%) Cycles of intracytoplasmic sperm injection ICSI (%)	12 (32)	227 (34)
Klinične nosečnosti Clinical pregnancies	11	303
Klinične nosečnosti/ET Clinical pregnancies/ET	30%	46%
Dvoplodne nosečnosti (%) Twin pregnancies (%)	0 (0)*a	51 (17)*b
Spontani splavi (%) Spontaneous abortions (%)	2 (18)	33 (11)
Postopki z zamrzovanjem blastocist (%) 21 (57) Cycles with blastocyst freezing (%)		367 (56)
Klinične nosečnosti z odmrznjenimi blastocistami Clinical pregnancies with thawed blastocysts	2	32
Kumulativna stopnja nosečnosti/ET Cummulative pregnancy rate/ET	13/37 (35%)*c	335/659 (51%)*d
* a,b / c, d - statistično pomembna razlika (p < 0,05).
- statistically significant difference (p < 0,05).
Stopnja nosečnosti na prenos ene blastociste (30%) se ni statistično pomembno razlikovala od stopnje nosečnosti na prenos dveh blastocist (46%). Po prenosu ene blastociste ni bilo
nobene dvoplodne nosečnosti, po prenosu dveh blastocsit pa je bilo 51 (18%) dvoplodnih nosečnosti (p < 0,05). Nadštevilne blastociste smo zamrznili v 388 (56%) postopkih s prenosom zarodka. Odmrznili smo blastociste iz 187 (48%) postopkov z zamrzovanjem blastocist. Pri tem smo dosegli 34 nosečnosti. Ob upoštevanju prenosa svežih in odmrznjenih blastocist iz istih postopkov smo v obeh skupinah ugotovili 50-odstotno kumulativno stopnjo nosečnosti; po elektivnem prenosu dveh blastocist smo dosegli statistično pomembno višjo kumulativno stopnjo nosečnosti (51%) kot po elektivnem prenosu ene blastociste (35%), vendar številke niso dokončne, saj so blastociste iz 52% postopkov z zamrzovanjem blastocist še vedno zamrznjene.
Vpliv metode zunajtelesne oploditve na klinične rezultate po elektivnem prenosu ene same ali dveh blastocist
Elektivno smo eno blastocisto prenesli po 25 postopkih klasične zunajtelesne oploditve (IVF) in 12 postopkih neposrednega vnosa semenčice v citoplazmo jajčne celice (ICSI). Po IVF smo dosegli 8 nosečnosti (32-odstotna stopnja nosečnosti na prenos zarodka), po ICSI pa 3 nosečnosti (25-odstotna stopnja nosečnosti na prenos zarodka). Razlika v stopnji nosečnosti na prenos zarodka ni bila statistično pomembna. Elektivni prenos 2 blastocist smo opravili po 432 postopkih IVF in 227 postopkih ICSI. Po postopkih IVF smo dosegli 200 nosečnosti, po postopkih ICSI pa 103 nosečnosti. Po postopkih IVF in ICSI se stopnja nosečnosti na prenos zarodka ni razlikovala (46% proti 45%). Po IVF je bilo 37 (19%) dvoplodnih nosečnosti in po ICSI 14 (14%). Delež dvoplodnih nosečnosti po IVF in ICSI se ni statistično pomembno razlikoval.
Vpliv starosti ženske na klinične rezultate po elektivnem prenosu ene same ali dveh blastocist
Eno samo blastocisto smo prenesli v 17 postopkih pri 17 ženskah, mlajših od 38 let, in v dveh postopkih pri dveh ženskah, starejših od 38 let. Pri mlajših ženskah smo dosegli 10 nosečnosti, pri starejših ženskah pa 1 nosečnost. Stopnja nosečnosti na prenos zarodka pri mlajših in starejših ženskah se ni razlikovala (59% vs. 50%).
Dve blastocisti smo prenesli po 522 postopkih zunajtelesne oploditve pri ženskah, mlajših od 38 let, in po 137 postopkih pri ženskah, starih 38 let ali več. Pri mlajših ženskah smo dosegli 253 nosečnosti (48-odstotna stopnja nosečnosti na prenos zarodka) in pri starejših ženskah 50 nosečnosti (36-odstotna stopnja nosečnosti na prenos zarodka). Pri mlajših ženskah je bilo 48 (19%) dvoplodnih nosečnosti, medtem ko so bile pri starejših ženskah le 3 (6%) mnogoplodne nosečnosti. Pri ženskah, mlajših od 38 let, je bil delež mnogoplodnih nosečnosti statistično pomembno manjši kot pri starejših ženskah (p < 0,05).
Razpravljanje
Po elektivnem prenosu ene same blastociste v maternico je bila stopnja nosečnosti dobra in primerljiva stopnji nosečnosti po prenosu dveh blastocist v maternico. Po vnosu ene same blastociste v maternico ni bilo nobene dvoplodne nosečnosti, medtem ko je bilo po vnosu dveh blastocist 18% dvo-plodnih nosečnosti.
Po elektivnem prenosu ene same blastociste v maternico smo dosegli 30-odstotno stopnjo nosečnosti na prenos zarodka, kar je dober klinični rezultat. V preteklosti smo zarodke gojili le 2 dni do razvojne stopnje manjceličnika z 2 do 4 celicami. Stopnje nosečnosti, ki smo jih dosegali s prenosom dveh, treh ali celo štirih manjceličnikov, so bile nižje (5, 6). To potrjuje, da razvoj zarodkov do razvojne stopnje blastociste omogoča izbor najbolj kakovostnih zarodkov za prenos v maternico, in
da z elektivnim prenosom ene blastociste v maternico ne zmanjšamo možnosti za zanositev. Zarodki z nekaterimi večjimi genetskimi in presnovnimi nepravilnostmi se namreč ne razvijejo do razvojne stopnje blastociste. Po elektivnem prenosu ene blastociste v maternico ni bilo dvo-plodne nosečnosti. Nekateri avtorji so poročali o povečani možnosti za pojav monozigotnih dvojčkov po prenosu bla-stocist po postopku zunajtelesne oploditve (7), vendar v naši študiji po vnosu ene blastociste tako po IVF kot po ICSI nismo ugotovili nobene monozigotne dvoplodne nosečnosti. Dejstvo, da po prenosu ene same blastociste v maternico ni dvoplodnih nosečnosti, je izredno pomembno, saj je dvoplo-dna nosečnost povezana z več zapleti med nosečnostjo in porodom, predvsem pa s prezgodnjim porodom in razvojnimi nepravilnostmi pri novorojenčkih (4, 8). Po elektivnem prenosu dveh blastocist smo dosegli 46-odstot-no stopnjo nosečnosti na prenos zarodka, ki se ni statistično pomembno razlikovala od stopnje nosečnosti po prenosu ene blastociste. Po prenosu dveh blastocist smo ugotovili 18% dvo-plodnih nosečnosti. To je več kot v splošni populaciji, kjer se pojavlja približno 3 do 40 dvoplodnih nosečnosti na 1000 nosečnosti (4).
Metoda zunajtelesne oploditve ne vpliva na delež dvoplodnih nosečnosti po prenosu dveh blastocist. Čeprav se po metodi ICSI do blastociste razvije manjši delež zarodkov kot po klasičnem IVF (9, 10), je kakovost blastocist po metodi ICSI povsem enakovredna kakovosti blastocist po klasičnem IVF. Zato je bil tudi delež dvoplodnih nosečnosti enak. To kaže na to, da je elektivni prenos ene blastociste smiseln tako po IVF kot po ICSI.
Pri ženskah, mlajših od 38 let, je bil delež dvoplodnih nosečnosti po prenosu dveh blastocist manjši kot pri ženskah, starih 38 let ali več. To je razumljivo, saj je vgnezditvena sposobnost zarodkov pri starejših ženskah manjša; glavni vzrok temu je predvsem slabša kakovost jajčnih celic. Genetska preiskava primarnega in sekundarnega polarnega telesca z metodo fluorescenčne hibridizacije in situ (FISH; kromosomi 13, 16, 18, 21, 22) je na 8382 jajčnih celicah starejših žensk (s povprečno starostjo 38,5 leta) v postopku zunajtelesne oploditve pokazala, da se pri več ko polovici jajčnih celic pojavlja nepravilno število kromosomov - anevploidije (11). Pri ženskah, starejših od 38 let, imajo celice granuloze v večji meri nepravilno mitohondrijsko DNK (predvsem delecije) kot pri ženskah, starih 34 let ali manj (12). S starostjo ženske se slabša kakovost zarodkov - predvsem se veča pojavnost anevplo-idij (13), kar ima za posledico manjšo vgnezditveno sposobnost zarodkov. Zato je elektivni prenos ene same blastociste priporočljiv predvsem pri ženskah, mlajših od 38 let. Pri starejših ženskah bi s prenosom ene same blastociste v maternico preveč zmanjšali možnosti za zanositev. Zato bo pri odločanju za elektivni prenos ene blastociste pri teh bolnicah odločilnega pomena predvsem raven FSH (14). Elektivni prenos ene same blastociste v maternico je zelo perspektiven, predvsem pri mlajših ženskah. Omogoča dobre klinične rezultate brez dvoplodnih nosečnosti. Prenos ene same blastociste v maternico omogoča uspešen program zamrzo-vanja in odmrzovanja humanih blastocist (2, 3). Nadštevilne blastociste lahko uspešno zamrznemo in odmrznemo. Stopnja zanositve po elektivnem prenosu ene same blastoci-ste v maternico se bo v prihodnosti še povečala, saj znanje o humanih blastocistah hitro napreduje. Spoznanja kažejo, da se predvsem povsem razvite blastociste in blastociste z dobro morfologijo (15) bolje vgnezdijo v maternici kot manj razvite blastociste in blastociste s slabšo morfologijo. Prenos ene same blastociste v maternico bo primeren predvsem za ženske s povsem razvitimi blastocistami in blastocistami z dobro morfologijo. Na kakovost in vgnezditveno sposobnost blastociste pa lahko sklepamo tudi iz morfologije primarnega telesca jajčne celice (16), morfologije pronukleusov v zigoti (17) in iz
kakovosti zarodka na dan 2 (18). Kot zelo perspektivno pa se kaže tudi ugotavljanje metabolizma blastocist: porabe glukoze iz gojišča, v katerem se razvija blastocista (19), ali porabe in sproščanja amino kislin v gojišče (20). Za prenos v maternico bomo lahko izbrali najbolj vitalno (metabolno aktivno) blastocisto, preostale blastociste pa zamrznili.
Zaključki
Elektivni prenos ene blastociste v maternico daje dobre klinične rezultate, zelo primerljive elektivnemu prenosu dveh blastocist. S prenosom ene blastociste se izognemo dvoplo-dni nosečnosti. Elektivni prenos ene blastociste je priporočljiv ne glede na metodo zunajtelesne oploditve (IVF ali ICSI), predvsem pa pri ženskah, mlajših od 38 let. Stopnja zanositve po elektivnem prenosu ene same blastociste v maternico se bo v prihodnosti še povečala. Znanje o humanih blastocistah hitro napreduje, tako da bomo lahko za prenos v maternico izbrali blastocisto najboljše kakovosti, preostale pa zamrznili.
Zahvala
Zahvaljujemo se gospe Mojci Pirc, vodji Enote za raziskovalno delo, za pregled in oblikovanje besedila. Prav tako se zahvaljujemo medicinskim sestram: Ani Kisel-Vovko, Zvonki Gorše, Janji Tekavec, Jožici Ši-monka, Majdi Štucin, Andreji Peterlin, Blanki Gradišek, Zdenki Mra-mor in Gini Milič za vso skrb in pomoč pri postopkih zunajtelesne oploditve.
Literatura
1.	Gardner DK, Lane M, Schoolcraft WB. Culture and transfer of viable blastocysts: a feasible proposition for human IVF. Hum Reprod 2000; 15: Suppl 6: 9-23.
2.	Virant-Klun I, Tomaževič T, Bačer-Kermavner L, Valentinčič-Gruden B, Mivšek J, Meden-Vrtovec H. Successful freezing and thawing of blastocysts cultured in sequential media. Fertil Steril 2003; 6, v tisku.
3 . Virant-Klun I, Veble A, Valentinčič B et al. Zamrzovanje in odmrzovanje zarodkov v programu zunajtelesne oploditve. Zdrav Vestn 1998; 67: 4959.
4.	Petterson B, Blair E, Watson L, Stanley F. Adverse outcome after multiple pregnancy. Baillieres Clin Obstet Gynaecol 1998; 12: 1-17.
5.	Tomaževič T, Meden-Vrtovec H, Ribič-Pucelj M et al. Po desetih letih IVF-ET na Ginekološki kliniki v Ljubljani. Zdrav Vestn 1994; 63: 579-83.
6.	Meden-Vrtovec H, Virant-Klun I, Tomaževič T et al. Program zunajtelesne oploditve na Ginekološki kliniki v Ljubljani. Zdrav Vestn 2001; 70: 89-95.
7.	Mikli AA, Jun SH, Hinckley MD, Behr B, Giudice LC, Westphal LM. Incidence of monozygotic twinning with blastocyst transfer compared to cleavage-stage transfer. Fertil Steril 2003; 79: 503-6.
8.	Chuileannain FN, Brennecke S. Prediction of preterm labour in multiple pregnancies. Baillieres Clin Obstet Gynaecol 1998; 12: 53-66.
9.	Shoukir Y, Didier C, Campana A, Sakkas D. Blastocyst development from supernumerary embryos after intracytoplasmic sperm injection: a paternal influence? Hum Reprod 1998; 13: 1632-7.
10. Griffiths TA, Murdoch AP, Herbert M. Embryonic development in vitro is compromised by the ICSI procedure. Hum Reprod 2000; 15: 1592-6.
1 1 . Kuliev A, Cieslak J, Ilkevitch Y, Verlinsky Y. Chromosomal abnormalities in a series of 6733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod Biomed Online 2003; 6: 54-9.
1 2. Seifer DB, DeJesus V, Hubbard K. Mitochondrial deletions in luteinized granulosa cells as a function of age in women undergoing in vitro fertilization. Fertil Steril 2002; 78: 1046-8.
13.	Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti AP, Tabanelli C, Trobetta C, Boudjema E. The role of preimplantation diagnosis for aneuploidies. Reprod Biomed Online 2002; 4: Suppl 3: 31-6.
14.	Van Rooij IA, Bancsi LF, Broekmans FJ, Looman CW, Habbema JD, te Velde ER. Women older than 40 years of age and those with elevated follicle-stimulating hormone levels differ in poor response rate and embryo quality in in vitro fertilization. Fertil Steril 2003; 79: 489-90.
15.	Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schlenker T, Schoolcfaft WB. Blastocyst score affects implantation and pregnancy outcome: towards a single blastocyst transfer. Fertil Steril 2000; 73: 1155-8.
1 6. Ebner T, Moser M, Sommergruber M, Yaman C, Pfleger U, Tews G. First polar body morphology and blastocyst formation rate in ICSI patients. Hum Reprod 2002; 17: 2415-8.
17. Balaban B, Urman B, Isiklar A et al. The effect of pronuclear morphology on embryo quality parameters and blastocyst transfer outcome. Hum Reprod 2001; 16: 2357-61.
1 8. Hardarson T, Caisander G, Sjogren A, Hanson C, Hamberger L, Lundin K. A morphological and chromosomal study of blastocysts developing from morphologically suboptimal human pre-embryos compared with control blastocysts. Hum Reprod 2003; 18: 399-407.
1 9. Gardner DK, Lane M, Stevens J, Schoolcraft WB. Noninvasive assessment of human embryo nutrient consumption as a measure of developmental potential. Fertil Steril 2001; 76: 1175-80.
20. Houghton FD, Hawkhead JA, Humpherson PG et al. Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Hum Reprod 2002; 17: 999-1005.