Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 55 PregleDNi zNANstveNi čl ANek Inštitut za sodno medicino, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Korespondenca/ Correspondence: irena z upanič Pajnič, e: irena.zupanic.pajnic@ gmail.com Ključne besede: skeletni ostanki; nohti; lasje; feces; urin Key words: skeletal remains; nails; hair; feces; urine Prispelo: 11. 2. 2019 Sprejeto: 4. 6. 2019 @publisher.id: 2932 @primary-language: sl, en @discipline-en: Microbiology and immunology, Stomatology, Neurobiology, Oncology, Human reproduction, Cardiovascular system, Metabolic and hormonal disorders, Public health (occupational medicine), Psychiatry @discipline-sl: Mikrobiologija in imunologija, s tomatologija, Nevrobiologija, Onkologija, r eprodukcija človeka, srce in ožilje, Metabolne in hormonske motnje, Javno zdravstvo (varstvo pri delu), Psihiatrija @article-type-en: Editorial, Original scientific article, Review article, Short scientific article, Professional article @article-type-sl: Uvodnik, izvirni znanstveni članek, Pregledni znanstveni članek, klinični primer, strokovni članek @running-header: Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah @reference-sl: Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 @reference-en: Zdrav Vestn | January – February 2020 | Volume 89 Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah Mitochondrial DNA in forensic analyses Irena Zupanič Pajnič Izvleček Prispevek na pregleden način opisuje uporabo mitohondrijske DNA (mtDNA) v forenzičnih prei- skavah. Pri starih in slabo ohranjenih bioloških vzorcih tipizacija jedrne DNA pogosto ni uspešna, lahko pa preiskujemo polimorfizme mtDNA, ki je zaradi številnih kopij na celico in krožne obli- ke manj izpostavljena razgradnji in se ohrani daljši čas. Osredinili se bomo na kontrolno regijo mtDNA, ki je zaradi svoje polimorfnosti v forenzičnih preiskavah najbolj uporabna, in opozorili na heteroplazmijo, ki jo je potrebno upoštevati pri identifikaciji posameznikov in bioloških sledi. Slabo ohranjeni biološki vzorci so predvsem stari skeletni ostanki – kosti in zobje, stari nohti, feces, urin ter izpadli lasje. Pri slednjih gre za mikrosledove, ki jih kriminalisti pogosto najdejo na krajih kaznivih dejanj. Posamezen tip biološkega materiala bomo podrobneje opisali. Poleg zgradbe bomo namenili posebno pozornost vplivom okolja na ohranitev DNA v posameznem tipu biološkega materiala, optimizaciji ekstrakcijskih metod za učinkovito izolacijo in optimalno vzorčenje. Zaradi nizkih količin DNA so ti vzorci izpostavljeni kontaminaciji z DNA oseb, ki sode- lujejo pri postopkih zbiranja in genetskih preiskavah. Za preprečevanje in sledenje morebitni kontaminaciji upoštevamo različne ukrepe, ki jih bomo opisali. Uporaba mtDNA je v forenzični dejavnosti zelo široka, zato bomo prispevek zaključili s predstavitvijo preiskav mtDNA v Sloveniji in po svetu. Abstract This review article presents mitochondrial DNA (mtDNA) analyses in forensic genetics. Typing of nuclear DNA in old and poorly preserved biological samples is often unsuccessful and instead of nuclear DNA, mtDNA polymorphisms can be used for human identification. Due to its multy copy nature and circular conformation, MtDNA is less prone to degradation and is retained lon- ger. The most polymorphic control region is regularly used in forensic casework, and mtDNA heteroplasmy must be considered in the identification cases and analyses of biological traces. The poorly preserved biological samples are mainly old skeletal remains - bones and teeth, old nails, feces, urine and hair shafts. The latter are micro traces, often found by criminalists at crime scenes. We will describe each type of biological material in more detail. In addition to morpho- logical structure, we will pay special attention to the environmental impacts on the preservati- on of DNA in each type of biological material, optimization of extraction methods for effective isolation and optimal sampling. Due to low amounts of DNA, these samples are exposed to DNA contamination from personnel involved in sampling procedures and genetic testing. Different measures used to prevent and track potential contamination will be described. MtDNA analyses are often used in forensics to solve different cases, and some applications of mtDNA in Slovenia and worldwide will be discussed. 56 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) Citirajte kot/Cite as: z upanič Pajnič i. [Mitochondrial DNA in forensic analyses]. z drav vestn. 2020;89(1– 2):55–72. DOI: 10.6016/z dravvestn.2932 1 Uvod Na Inštitutu za sodno medici- no Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani od leta 1996 opravljamo mo- lekularnogenetsko identifikacijo oseb in bioloških sledi ter preverjamo bližnje sorodstvene povezave z metodo genet- skega profiliranja jedrne DNA (1), pri kateri preiskujemo dolžinske polimor- fizme mikrosatelitskih lokusov razmero- ma dobro ohranjenih bioloških vzorcev. Vendar pa z metodo genetskega profili- ranja jedrne DNA identifikacija starih in slabo ohranjenih bioloških materialov pogosto ni uspešna. Zato smo leta 2004 uvedli metodo tipizacije mtDNA (2). Problematični biološki vzorci so sta- ri skeletni ostanki (kosti in zobje), sla- bo ohranjeni ali močno poškodovani človeški posmrtni ostanki (v letalskih, železniških in prometnih nesrečah, ek- splozijah in požarih zoglenela in moč- no poškodovana trupla, žrtve naravnih nesreč, terorističnih napadov ali vojn), stari nohti, feces in urin ter mikrosle- dovi v kriminalističnih primerih (zlasti izpadli, telogeni, lasje, ki jih kriminalisti pogosto najdejo na kraju kaznivega de- janja). Našteti biološki materiali vsebu- jejo zelo malo jedrne DNA, ali pa je ta preveč razgrajena za pridobitev mikro- satelitskega genetskega profila. Zato op- ravimo preiskave sekvenčnih polimor- fizmov mtDNA, saj se ta nahaja v celici v številnih kopijah in je zaradi krožne oblike manj izpostavljena razgradnji. To ji omogoča daljšo ohranitev v starih in slabo ohranjenih bioloških materia- lih (3). Pri tipizaciji mtDNA preiskujemo polimorfizme najbolj variabilne nekodi- rajoče kontrolne regije (hipervariabilne regije HVI, HVII in HVIII), dodatno pa povečamo diskriminacijsko moč s prei- skavo enonukleotidnih polimorfizmov (angl. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) kodirajoče regije, kar nam pove- ča možnost razlikovanja oseb z identič- nimi haplotipi kontrolne regije (4). Ob metodi genetskega profiliranja jedrne DNA nam tipizacija mtDNA v rutinskih preiskavah omogoča celosten pristop k molekularnogenetskim identifikacijam biološkega materiala v sodni medicini in kriminalistiki. Kadar analiza jedrne DNA zaradi premajhne količine genet- skega materiala ali njegove razgrajenosti ni uspešna, uporabimo za identifikacijo metodo tipizacije mtDNA. Del člankov, ki so navedeni v poglav- ju Literatura, sem pregledala v doktor- ski disertaciji (5), manjši del pa jih je v magistrskem delu pregledal Marcel Obal (6) in jih v tem preglednem članku povzemamo. 2 Mitohondrijski genom Mitohondrijska DNA pri človeku predstavlja 0,3 % genomske DNA. Je dvoverižna, kovalentno zaprta krožna molekula, ki jo sestavljata zunanja težka veriga (veriga H) in notranja lahka veri- ga (veriga L). Prva vsebuje več purinskih baz, druga pa je bogata s pirimidinskimi bazami. MtDNA je dolga 16.569 bp in ima v celoti določeno nukleotidno zapo- redje (7). Sestavljena je iz prevladujoče konservativne kodirajoče regije s 37 geni in variabilne nekodirajoče kontrolne re- Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 57 PregleDNi zNANstveNi čl ANek gije. Mitohondriji se ne tvorijo na novo, ampak nastanejo z rastjo in delitvijo ob- stoječih v vsaki celični generaciji. Celoten proces podvajanja se uravnava in zagota- vlja v celici stalno količino mtDNA (8). Mutacije v mtDNA lahko povzročajo dedne bolezni, ki se dedujejo po materi in se prenesejo na vse njene potomce, ne glede na spol. Vzrok je v tem, da vsi mi- tohondriji v jajčnih celicah (pri sesalcih oociti vsebujejo približno 200.000 mo- lekul mtDNA) izvirajo iz izolirane po- pulacije molekul mtDNA. Pri raziskavah zgodnjih faz embrionalnega razvoja so namreč ugotovili, da se nahaja v ženski primordialni klični liniji le nekaj mole- kul mtDNA (8). Bendall (9) predpostav - lja, da je za človeka značilen mehanizem genetskega ozkega grla, ki vsebuje zelo nizko število segregacijskih enot, saj je opazil razlike v stopnji heteroplazmi- je že v eni generaciji (med potomci iste matere) in segregacijo heteroplazmije v homoplazmijo že v dveh generacijah. Mehanizem ozkega grla z malim števi- lom segregacijskih enot omogoča hitro fiksiranje mutacij v mtDNA (10). Človeške celice vsebujejo številne kopije mitohondrijskega genoma, kar daje, v primerjavi z le dvema kopijama jedrnega genoma, veliko večjo možnost ekstrakcije mtDNA iz starih ali slabo ohranjenih vzorcev, kot so (izpadli) te- logeni lasje, stare kosti, zobje, feces, urin in nohti (11). Vsaka celica vsebuje prib- ližno 500 mitohondrijev, vsak mitohon- drij 5 do 10 molekul mtDNA; tako se v metabolno aktivnih celicah nahaja 1000 do 10.000 molekul mtDNA. Veliko mi- tohondrijev vsebujejo srčno tkivo (polo- vico prostornine citoplazme tvorijo mi- tohondriji) ter jetrno in mišično tkivo. Največ molekul mtDNA vsebujejo ooci- ti, najmanj pa spermijske celice (le nekaj 100) (8). Pri identifikaciji starih in slabo ohranjenih bioloških materialov je pred- nost uporabe mtDNA pred jedrno DNA tudi v tem, da se ohrani daljši čas, saj jo pred razgradnjo z eksonukleazami ščitita krožna oblika in mitohondrijska ovojni- ca (12). Zaradi naštetih lastnosti mtDNA lahko biološke vzorce, katerih tipizacija jedrne DNA ni uspešna, identificiramo s polimorfizmi mtDNA, vendar zaradi odsotnosti rekombinacije identificiramo maternalno linijo, ki ji biološki vzorec ali sled pripada, in ne posameznika. Mitohondriji se nahajajo v citoplaz- mi, zato se mtDNA deduje neodvisno od jedrnega genoma. Pri človeku se mtDNA deduje po materi. Zaradi maternalnega dedovanja in odsotnosti rekombinaci- je obravnavamo nukleotidno zaporedje mtDNA kot enolokusno ali haplotip- sko (13). MtDNA se v nespremenjeni obliki prenese na vse materine potomce ne glede na spol, zato uporabljamo njena nukleotidna zaporedja kot označevalce za maternalne rodovnike, kar je potreb- no upoštevati pri izbiri referenčnega ozi- roma primerjalnega vzorca v identifika- cijskih testih. Osebe z enakimi zaporedji nukleotidov mtDNA imajo skupnega ženskega prednika (3), kar je osnova za prepoznavanje bioloških vzorcev s tipi- zacijo mtDNA. 3 Kontrolna regija mtDNA Najbolj variabilni del mtDNA je 1122 bp dolga nekodirajoča kontrolna regija. Natančneje lahko omejimo sekvenčni polimorfizem predvsem na dva, 300 do 400 bp dolga, hipervariabilna segmenta, ki se nahajata znotraj zanke D (14). Prvi segment, ki ga najdemo na mestu 16.024– 16.365, imenujemo hipervariabilna regija 1 (HVI), drugega, na mestu 73–340, pa hipervariabilna regija 2 (HVII). Obe re- giji sta med osebami, nesorodnimi po materini liniji, zelo polimorfni (3). HVI ima večje število sekvenčno variabilnih mest in nižjo frekvenco posameznih polimorfizmov, HVII pa manjše število 58 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) sekvenčnih polimorfizmov, ki imajo višjo frekvenco (15). Poleg regij HVI in HVII je v kontrolni regiji mtDNA tudi regija HVIII (na mestu 438–574), katere varia- bilnost je veliko manjša kot variabilnost regij HVI in HVII (16). Kontrolna regija mtDNA ima vsaj 5-krat višjo mutacij- sko stopnjo kot preostala mtDNA (17). Zaradi svoje polimorfnosti je najbolj raziskano področje molekule mtDNA, zato je izredno uporabna za identifika- cijo (18). Evropejci kavkazijske rase se med seboj razlikujemo na regijah HVI in HVII povprečno na 8 nukleotidnih mestih, kar je približno 1,5-odstotna nu- kleotidna raznolikost (19). Raznolikost mtDNA je 5- do 10-krat višja med rasa- mi kot znotraj posameznih ras, ki so med seboj precej podobne (20). Raznolikost znotraj črnske rase je veliko večja kot znotraj azijske, belske ali hispanske rase, po variabilnosti pa črnski rasi sledi azij- ska rasa (17). Zaradi velike variabilnosti mtDNA znotraj in med populacijami lahko s polimorfizmi mtDNA ugotavlja- mo genetsko strukturo populacij, filoge- netske odnose med njimi ter migracije in moderno poselitev sveta. Nukleotidno zaporedje lahke veri- ge mtDNA, ki nam v forenzičnih pre- iskavah služi kot referenčni standard pri določanju nomenklature haplotipov mtDNA, je prvi opisal Anderson (7) in ga zato imenujemo Andersonova sekven- ca ali Cambridge Reference Sequence (CRS) (13). Nomenklatura haplotipov mtDNA temelji na priporočilih komisije ISFG (International Society for Forensic Genetics) in skupine EDNAP (European DNA profiling group) (13). Kadar opazi- mo razliko med preiskovanim haploti- pom mtDNA in Andersonovo sekvenco, označimo le nukleotidna mesta, na ka- terih smo razliko opazili, pri čemer na- vajamo sekvenčne razlike v lahki verigi mtDNA (21). Pri uporabi mtDNA v forenzične namene moramo biti pozorni na mo- žen pojav heteroplazmije (heterogenost molekul mtDNA znotraj posameznika). V preteklosti je veljalo mnenje, da je mtDNA posameznika homoplazmična, danes pa vemo, da je heteroplazmija do določene mere prisotna pri vseh ljudeh, vendar z nizko stopnjo (pri 5–10 % lju- di) (22). Heteroplazmija je prisotnost dveh ali več tipov molekul mtDNA v citoplazmi; od tod ime heteroplazmija. Bolj splošno pa heteroplazmijo opre- delimo kot mešanico multiplih (običaj- no dveh glavnih) populacij mtDNA pri posamezniku. Heteroplazmija lahko nastopa na ravni celic (posamezna celi- ca je homoplazmična, različne celice pa so med seboj heteroplazmične), na ravni mitohondrijev (posamezen mitohondrij je homoplazmičen, različni mitohondri- ji so med seboj heteroplazmični, zato je posamezna celica heteroplazmična) in na ravni molekul mtDNA (posamezen mitohondrij je heteroplazmičen) (23). Pri regijah HVI in HVII sta bili opaženi dve vrsti heteroplazmije, in sicer točkov- na in dolžinska. Dolžinska je v populaciji veliko pogostejša in se kaže kot variacija v številu citozinskih baz v homopolimer- nem odseku (19). Točkovna heteroplaz - mija se v populaciji redkeje pojavlja od dolžinske (24). Heteroplazmija se pode- duje ali je posledica somatskih mutacij, do katerih pride v času življenja posame- znika (22). Kadar je stopnja heteroplaz- mije visoka in je prisotna v vseh tkivih, je najverjetneje podedovana od matere; če nastopa le v posameznih tkivih, je pos- ledica somatskih mutacij. Stopnja hete- roplazmije se med različnimi tkivi razli- kuje in narašča s starostjo posameznika, najvišja pa je pri laseh (25). V forenzič- nih preiskavah je bila prvič opisana he- teroplazmija v kontrolni regiji mtDNA pri identifikaciji ruskega carja Nikolaja II (26,27). Heteroplazmično mesto Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 59 PregleDNi zNANstveNi čl ANek 16169 so potrdili tudi pri carjevem bratu Georgiju Romanovu, medtem ko je pri 4 generacije oddaljenih še živečih soro- dnikih zaradi segregacije heteroplazmije prišlo na tem mestu do homoplazmije. Identičnost haplotipov carja in njegove- ga brata je dokončno potrdila pozitivno identifikacijo skeletnih ostankov carja Nikolaja II (27). Tudi Parsons (28) ugo - tavlja, da je za človeka značilna zelo hitra segregacija sekvenčnih variant med ge- neracijami, saj je opazil segregacijo he- teroplazmije v homoplazmijo že v dveh generacijah. Mitohondrijski genom ima 5- do- 10-krat višjo mutacijsko stopnjo od jedr - nega, kar je verjetno posledica pogostih napak pri podvajanju in nižje učin- kovitosti popravljalnih mehanizmov. Metabolno aktivnejša tkiva z višjimi energetskimi potrebami zaradi oksida- tivnih poškodb hitreje kopičijo mutaci- je (25). Zaradi visokih mutacijskih sto- penj mtDNA lahko opazimo razlike med haplotipi že med bližnjimi sorodniki po materini liniji (na primer med materjo in otrokom), razlike med haplotipi pa lahko opazimo tudi v somatskih tkivih, zlasti kot posledico segregacije obstoje- če heteroplazmije pri posamezniku. To pomeni, da lahko pride do razlik med haplotipi mtDNA med različnimi lasmi in/ali tkivi znotraj posameznika (24). Poznavanje mutacijske stopnje kontro- lne regije mtDNA je pomembno tako za evolucijske študije kot za forenzične identifikacijske teste. Povprečno se mu- tacijska stopnja kontrolne regije mtDNA ocenjuje na 10 –5 do 10 –6 mutacij na nuk- leotid na generacijo (29). Parsons (28) je določil mutacijsko stopnjo na 0,03 mu- tacij na generacijo. Če je skupna dolži- na regij HVI in HVII mtDNA 608 bp in predpostavimo, da traja ena genera- cija 20 let, lahko ocenimo to mutacijsko stopnjo na 2,5 mutacij/nukleotid/milijon let. Problematične, slabo ohranjene bio- loške vzorce, ki jih v forenzičnih raziska- vah najpogosteje preiskujemo s tipiza- cijo mtDNA, predstavljajo stari skeletni ostanki – kosti in zobje, stari nohti, mi- krosledovi v kriminalističnih primerih – zlasti izpadli, telogeni, lasje ter feces in urin. 4 Kosti Kosti glede na obliko delimo na dol- ge, kratke, ploščate, nepravilnih oblik in sezamoidne. Makroskopsko delimo ko- stninino na kompaktno in spongiozno. Prva je gosta in neporozna, razmerje med površino in prostornino je majhno, druga pa je močno porozna in ima ve- liko razmerje med površino in prostor- nino. Kompaktna sestavlja zunanji del koncev dolgih kosti (epifiza) in ploščatih kosti ter srednji del dolgih kosti (diafi- za). Spongiozno najdemo v notranjosti ploščatih kosti in v koncih dolgih kosti. Srednji deli dolgih kosti so znotraj votli – prostor imenujemo medularni kanal, zapolnjuje ga rumeni kostni mozeg (30). Kompaktno kostnino sestavljajo ponav- ljajoče se strukturne enote, imenovane osteoni. Skozi središče vsakega od njih vzdolž kosti poteka centralni (Harvesov) kanal, v katerem so krvne in limfne žile ter živci, prečno pa Harvesove kanale med seboj povezujejo Volkmannovi ka- nali. V vsakem osteonu Harvesov kanal obdajajo koncentrične lamele, med nji- mi pa so področja, imenovana lakune, v katerih se nahajajo zrele kostne celice osteociti. Lakune so med seboj poveza- ne s kanalikuli, majhnimi kanali, ki so- delujejo pri prenosu hranilnih snovi iz Harvesovega kanala do osteocita in pri odvajanju odpadnih snovi iz osteocita. Spongiozna kostnina ne vsebuje oste- onov, temveč jo sestavljajo trabekule, premrežene kostne ploščice, ki prav tako vsebujejo lamele, lakune, osteocite in ka- 60 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) nalikule, ter rdeč kostni mozeg, ki vsebu- je krvne žile, ki prehranjujejo osteocite. Zaradi krhkosti spongiozne kostnine le-ta potrebuje zunanjo zaščitno plast kompaktne kostnine (31). Mikroskopsko kost sestavljajo celice in medceličnina. Medceličnina sesto- ji iz organskega in anorganskega dela. Organski del v največji meri predstavlja kolagen tipa I in nekateri drugi protei- ni in glikoproteini (glikozaminoglikani, osteokalcin, osteonektin, osteopontin, si- aloprotein), anorganski del pa hidroksia- patit, sestavljen iz kalcijevih in fosfatnih ionov. Celice, ki sestavljajo kosti, so oste- oblasti, osteociti in osteoklasti ter sode- lujejo v gradnji, resorpciji in mineraliza- ciji kosti. Aktivni osteoblasti so nezrele kostne celice in sodelujejo pri izgradnji medceličnine; izločajo hormone (pros- taglandine) in encim (alkalna fosfata- za), ki sodelujejo pri mineralizaciji, prav tako pa izločajo organski del kostnega matriksa, ki se imenuje osteoid. Sestavlja ga mešanica proteinov, izmed katerih večinski delež predstavlja kolagen tipa I. Osteoid z vezavo s hidroksiapatitom povzroči mineralizacijo kosti in ji da trdnost in togost. Skozi proces osteo- geneze se osteoblasti ujamejo v osteoid in se po mineralizaciji preoblikujejo v osteocite. Osteoklasti so celice, ki sode- lujejo v resorpciji kosti, nahajajo se na kostni površini v prostorih, imenovanih Howshipove lakune (30). V kostnem tkivu (prav tako v zobeh) je DNA veliko bolj stabilna kot v osta- lih tkivih. Kemp in Smith (32) sta zago- vornika hipoteze, ki pravi, da omogoča stabilnost DNA in njeno ohranitev v starih skeletnih ostankih vezava DNA na hidroksiapatit, pri čemer se nega- tivno nabite fosfatne skupine molekule DNA vežejo na hidroksilna mesta na hidroksiapatitu, ki je glavna kostna masa. To hipotezo potrjuje dejstvo, da se ob povečani degradaciji hidroksiapa- tita ohrani v kosti manj DNA. S časom je zaradi dejavnikov okolja kost ved- no bolj porozna, kar zmanjša možnost pridobitve DNA (30). Prve uspešno iz- vedene preiskave DNA, pridobljene iz kosti, so opravili Hochmeister (33) in Hagelbergova (34), ki je pri molekular - noantropoloških preiskavah kosti, starih od 300 do 5.500 let, ugotovila, da je ohra- njenost DNA v kosteh odvisna predvsem od pogojev, v katerih so se skeletni os- tanki nahajali, manj pa od same starosti skeletnih ostankov. Za preiskavo DNA iz skeletnih ostankov se najpogosteje uporabljajo stegnenice, golenice, zobje ter skalnice senčnic (35-37), nekatere no - vejše raziskave pa kažejo velik potencial majhnih spongioznih kosti dlani in sto- pal ter pogačic (38,39). Metoda ekstrak- cije DNA iz kosti je ena najzahtevnejših in najdaljših ekstrakcijskih metod v fo- renzičnih genetskih preiskavah. Svežih kosti za pridobitev genomske DNA ni potrebno prej dekalcificirati, pri starih kosteh pa nam dekalcifikacija omogoča pridobitev večje količine DNA (33). 5 Zobje Za genetsko identifikacijo skeletizira- nih, močno poškodovanih ali razpadlih človeških posmrtnih ostankov so zobje zelo dober, če ne celo najboljši vir DNA, saj so skriti v čeljustnih kosteh, dodatno pa jih ščitijo še jezik, lična sluznica in sklenina. V primerjavi s kostmi je DNA v zobeh bolj zaščitena, saj predstavlja- jo trda zobna tkiva, ki obdajajo pulpno votlino, fizično zaščito zobne pulpe. Trda zobna tkiva se ohranijo v številnih skraj- nih okoliščinah, saj niso podvržena hitri razgradnji po zakopu in raztapljanju v vodi. Alvarez Garcia (40) je preučeval vpliv okolja na razgradnjo DNA v zobeh in ugotovil, da pride najhitreje do razgra- dnje DNA v vodi, nato v zemlji in nato na zraku. V starih zobeh je DNA izred- Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 61 PregleDNi zNANstveNi čl ANek no stabilna, saj je, podobno kot v starih kosteh, vezana na hidroksiapatit. Rubio s sodelavci (41) ugotavlja, da največ DNA v zobnih tkivih propade v prvih dveh le- tih po smrti. Anatomsko lahko zob razdelimo na tri dele: krona, ki predstavlja zgornji del, in korenina, ki predstavlja spodnji z alveolno kostjo obdan del, ter vrat, ki predstavlja stičišče krone in korenine. Zunanjo plast krone prekriva sklenina, ki je najtrše tkivo v človeškem telesu. Skoraj v celoti je mineralnega izvora in ne vsebuje celic. Korenina zoba je prek- rita s cementom, ki je mineralizirano tkivo, sestavljeno iz hidroksiapatita, kolagena in drugih nekolagenskih pro- teinov. Delimo ga v dve vrsti glede na prisotnost ali odsotnost celic (cemento- citov) (42). Cement brez celic se nahaja v vratnem delu zobne korenine in pove- zuje zob z obzobnimi tkivi. Cement, ki vsebuje v medceličnino ujete celice, se nahaja v apikalnem delu zobne koreni- ne in v furkacijskem področju zoba, tj. tam, kjer se razhajajo korenine večkore- ninskih zob (43). Lahko ga primerjamo s kostnim tkivom, kjer so v lakunah ujeti osteociti, saj prav tako služi kot dober vir DNA, a je po svoji funkciji in strukturi drugačen; ni ožiljen, oživčen, ne vsebuje kostnega mozga, ni podvržen nenehne- mu remodeliranju, v življenju posame- znika pa se nenehno debeli (42,43). Na meji med krono in korenino – v podro- čju, imenovanem zobni vrat – se stika- ta sklenina in cement, pod njima pa se nahaja zobovina (dentin), ki ščiti zobno pulpo. Zobovina in pulpa predstavljata glavnino zoba in sta v nasprotju s skle- nino bogata s celicami, večinoma gre za odontoblaste in fibroblaste. Zobovino sestavljajo hidroksiapatit, kolagen tipa I in voda (42). Najbogatejši vir DNA v zo- beh je zobna pulpa. Ta je v pulpni votlini dobro zaščitena, vse dokler je zob trdno zasidran v alveolni kosti. Če je zob shra- njen v suhem okolju, pride do dehidri- ranja zobne pulpe in mumifikacije, kar zaustavi nekrotične in gnilobne procese in omogoča dobro ohranjenost DNA. Če je mikrookolje vlažno, pulpa hitro zgnije. Suho okolje in nižja temperatu- ra v kombinaciji s kratkim posmrtnim intervalom so za ohranitev DNA v pul- pi najugodnejši, v nasprotnem primeru pa se DNA ohrani v trdnih zobnih tki- vih (42).V primerih, ko je posmrtni in- terval dolg in je verjetnost razgradnje zobne pulpe velika, lahko opravimo tipi- zacijo mtDNA, katere glavni vir je den- tin – ostanki podaljškov odontoblastov v dentinskih kanalih pa tudi cementociti v cementu (44). Zunanje tkivo – sklenina ščiti tkiva, ki so v notranjosti zoba, pred zunanjimi dejavniki, kot so denimo UV sevanje, mikroorganizmi in višje tem- perature. Sklenina ima pore in je nepre- pustna za molekule, ki so večje od vode, ter tako ščiti zob tudi po smrti organiz- ma. Pore v zobovini so manjše od por v kostnem tkivu, kar prispeva k boljši oh- ranjenosti zob v primerjavi s kostmi. Na količino in kakovost DNA v zobu vplivajo tudi bolezni zob, hkrati pa sled- nje zvišajo možnosti kontaminacije. Pri kariesu mikroorganizmi lokalno razgra- dijo mineralizirano zobno tkivo, kar omogoči vdor bakterij v pulpo. V kombi- naciji z napredovalo parodontozo lahko karies uniči zobni cement, saj je le-ta v tem primeru izpostavljen ustni votlini in tako dostopen mikroorganizmom (42). Higgins in sodelavci (45) s preučeva - njem zobovine in zobnega cementa, kot dveh morebitnih najugodnejših virov DNA v zobeh, prihajajo do zaključkov, da obstaja razlika v količini DNA med zobmi iste osebe in med različnimi tki- vi istega zoba. Pri vzorčenju priporočajo uporabo zdravih, endodontsko nezdrav- ljenih zob, če takih ni na voljo, pa je DNA bolj smiselno pridobiti iz zobnega ce- menta v predelu korenine in ne iz celega 62 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) zoba (43). Za genetsko preiskavo si zobje po primernosti sledijo v naslednjem vr- stnem redu: endodontsko nezdravlje- ni kočnik, ličnik, podočnik in sekalec. Pridobitev DNA iz zoba je mogoča bo- disi z resekcijo zoba ter ekstrakcijo zob- ne pulpe, bodisi z zmletjem celega zoba ali pa z zmletjem le koreninskega dela, če ima zob karies (43). 6 Nohti Nohti so se razvili le pri primatih in predstavljajo roženo tvorbo epidermisa kože. Epidermis v glavnem tvorijo ke- ratinociti, ki izdelujejo vlaknasti protein keratin. V višje ležečih plasteh epidermi- sa se keratinociti spreminjajo v roževi- naste luske. Poroženevanje ali keratini- zacija je proces, v katerem se keratinociti postopno v različnih plasteh epidermisa izdiferencirajo v korneocite, izpolnjene s keratinom in drugimi beljakovinami. Keratinizacija se konča po kemičnih spremembah, katerih rezultat so disul- fidne povezave keratinskih filamentov. Keratin kože imenujemo mehki keratin, keratin las in nohtov pa trdi keratin, ki za razliko od mehkega vsebuje veliko di- sulfidnih skupin. Mehki keratin se lušči, trdega pa je potrebno rezati (46). V pri - meru identifikacije močno razpadlega ali ekshumiranega trupla pridobimo ge- netski material, če je le možno, iz nohtov. Ti se, podobno kot lasje, ohranijo dolgo po smrti in so v naravnem okolju manj izpostavljeni mikrobni razgradnji, saj obstaja le nekaj specializiranih mikro- organizmov, ki lahko uporabljajo keratin kot hranilo (47). Najprimernejši so nohti na palcih nog, saj so najdebelejši (48). Za razliko od zob in kosti je postopek izo- lacije genomske DNA iz nohtov bistve- no krajši in manj zahteven. Cline (49) je uspešno sekveniral do 270 bp dolge fra- gmente mtDNA iz nohtov, ekshumira- nih 36 let po pokopu. Splošno velja, da je iz razmeroma svežih nohtov moč prido- biti jedrne profile, pri starih nohtih pa je večinoma uspešna analiza mtDNA. Če je noht nalakiran z lakom, je potrebno lak odstraniti, saj zavira reakcijo PCR (49). Večina standardnih metod za pridobitev DNA iz keratiniziranih tkiv (nohti in las- je) zahteva zaradi prisotnosti disulfidnih vezi med keratinskimi proteini večdnev- no inkubacijo v ekstrakcijskem pufru, ki poleg proteinaze K vsebuje tudi DTT (ta cepi disulfidne vezi med polipeptidi). Za polno aktivnost proteinaze K je potreb- na prisotnost ionov Ca 2+ . Hellmann (50) je v TN Ca -pufru EDTA zamenjal z ioni Ca 2+ in dosegel popolno razgradnjo ke- ratiniziranega nohta (ali lasnega stebla) že v 2–5 urah, zaradi česar je čas, potre- ben za pridobitev DNA iz nohtov (ali las), bistveno krajši kot iz kosti ali zob. 7 Lasje Las je rožena, elastična tvorba epider- misa. V kožo je vložen v tulcu ali foliklu. Med nosečnostjo se pri embriju razvijejo vsi lasni folikli, iz katerih nato v življenju ciklično izraščajo in izpadajo lasje (22). V lasnem steblu sta dve populaciji mi- tohondrijev - ena iz matriksnih celic in druga iz melanocit. Posledica dveh po- pulacij mitohondrijev je mešanje različ- nih genskih skladov molekul mtDNA, ki imajo lahko različne haplotipe in so torej potencialno heteroplazmični. Eno samo lasno steblo lahko ima vzdolž različnih delov stebla različna razmerja heterop- lazmičnih variant oziroma so lahko raz- lična razmerja heteroplazmičnih variant prisotna med lasmi, ki izvirajo iz istega folikla (22,51). Lasje imajo tri faze rasti. Prva faza je anagena ali aktivna faza, v kateri so lasje 2 do 8 let. Sledi ji katagena ali razgraje- valna faza, ki traja 2 do 4 tedne (52). V tej prehodni fazi se zaključi mitotska aktiv- nost matriksnih celic lasnega folikla. Po Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 63 PregleDNi zNANstveNi čl ANek katageni fazi se lasje nahajajo 2 do 4 me- sece v telogeni ali počivajoči fazi, dokler ne izpadejo iz lasišča. Začetek zadnje, telogene faze naznanja skrčitev lasne ko- renine in njeno potiskanje proti površini lasišča. Po delovanju proteinaz nastane v koži iz vidne čebulice lasne korenine nevidna paličasta korenina, bogata s ke- ratini, povezanimi z disulfidnimi vezmi. Telogena korenina dosega le še 1/3 dol- žine korenine v anageni fazi. V telogeni fazi pride do programirane celične smrti – apoptoze, katere rezultat je keratiniza- cija celičnih proteinov, razgradnja jedra in izguba oziroma razgradnja jedrne DNA. Pod telogeno korenino se začne tvoriti nov anageni las, telogeni pa izpa- de iz lasišča. Populacija matriksnih celic in dermalna papila za nov anageni las torej izvirata iz starega telogenega lasu, nov las pa se tvori na istem mestu, kot je stari izpadel. Telogeni folikel postane zo- pet anageni (22). Ko las izpade iz lasnega folikla, pride do dehidracije celic, zato popolnoma keratiniziran las vsebuje manj kot 10 % vode. Vsak dan nam iz- pade 50 do 100 telogenih las. Na lasišču imamo 100.000 do 150.000 las, od tega je 80 do 90 % anagenih in približno 10 % telogenih. Katagenih las je malo, saj tra- ja katagena faza le 2 do 4 tedne (52). Pri anagenih in katagenih laseh se jedrna DNA nahaja v čebulici lasne korenine in celicah lasnega tulca, ki obkrožajo lasno korenino. Večino jedrne DNA vsebu- je lasna korenina, lasni tulec je vsebuje zelo malo. Pred ekstrakcijo DNA iz las je nujno potrebno opraviti mikroskop- sko analizo, saj je prisotnost jedrne DNA odvisna od morfologije lasu. Korenine anagenih in katagenih las so odlični kan- didati za analizo jedrne DNA. Telogeni lasje imajo le nevidno paličasto, kerati- nizirano korenino in popolnoma kera- tinizirano lasno steblo (22). Zato je pri izpadlih – telogenih laseh, ki jih na kraju kaznivega dejanja kriminalisti najpogo- steje najdejo, večinoma uspešna le anali- za mtDNA (53). V lasnem steblu so pigmentna zrn- ca melanina, ki določajo barvo las. Eumelanin je v rjavih in črnih laseh, feomelanin v rdečih in svetlih laseh. S standardnimi ekstrakcijskimi postopki melanina ne moremo ločiti od DNA in inhibira reakcijo PCR (54). Nekateri fo- renzični strokovnjaki (54) domnevajo, da pogosto šamponiranje in barvanje las negativno vplivata na količino izolirane DNA, vendar McNevin (55) negativne - ga učinka kozmetičnih sredstev ni opa- zil. Različni avtorji (50,54) poudarjajo pri preiskavah lasnih stebel potrebo po odstranjevanju površinske kontaminaci- je. Malo je znanega o posmrtnih spre- membah mtDNA v laseh. Če so poškod- be DNA podobne kot v drugih tkivih, lahko pričakujemo oksidativno in hidro- litično depurinacijo, hidrolitično deami- nacijo in fragmentacijo, ki so posledica izpostavljenosti ionizirajočemu sevanju in UV – svetlobi (47). Graffy (53) v pri - merih identifikacije pogrešanih oseb, še posebno, če je bilo truplo najdeno nekaj mesecev ali let po smrti, priporoča izola- cijo DNA iz kosti, tudi če so lasje ohra- njeni, saj so analize starih las problema- tične, pogosto tudi neuspešne. 8 Feces Človeško blato ali madeži človeškega blata na toaletnem papirju ali obleki so v redkih primerih edini dokazni material, najden na kraju kaznivega dejanja. Pri spolnih zlorabah je možno najti majhne količine blata na penisu posiljevalca. S tipizacijo DNA lahko ugotovimo izvor človeškega blata in osumljenca oziroma žrtev povežemo (ali ne) s kaznivim de- janjem. Feces je končni produkt prebave, ki poteka v prebavilih. Ta je obložen z epi- 64 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) telom, ki se regenerira na dva do šest dni. Pri človeku se tako iz prebavil dnevno odlušči 17 milijard celic (56). Glede na to, da dnevno izločimo 100–200 gra- mov blata in da celica vsebuje približno 6 pg genomske DNA, lahko ocenimo, da miligram blata teoretično vsebuje 300– 600 ng DNA. Vendar praktično iz fecesa pridobimo veliko manj DNA, saj večino odluščenih celic in njihove DNA v pro- cesu prebave prebavni encimi in bakteri- je razgradijo. Intestinalno oblogo tvorijo stebričaste absorptivne celice in čašaste celice. V fecesu poleg teh dveh tipov epi- telnih celic najdemo tudi luskaste celice iz epitela analnega kanala, ki se odlušči- jo ob iztiskanju blata. Levkocitov, ki so sicer prisotni v intestinalni oblogi, v fe- cesu običajno ne najdemo. Z mikroskop- sko analizo blata so dokazali prisotnost nukleiranih odluščenih epitelnih celic, ki so v fecesu glavni vir DNA in nakazujejo možnost pridobitve jedrne DNA. V endar vsebuje feces zelo veliko bakterij (v de- belem črevesu in danki je 10 11 bakterij- skih celic na gram črevesne vsebine), ki degradirajo DNA, in ogromno snovi, ki inhibirajo reakcijo PCR (57). Vsebnost DNA v fecesu ljudi moč- no variira in je individualno specifična, kar sta dokazala tako Jahnson (56) kot Vandenberg (58). Na koncentracijo iz fe- cesa izolirane DNA vplivajo količina bla- ta in interval gibanja peristaltike, razgra- dnja odluščenih epitelnih celic in DNA v blatu, izpostavljenost blata zunanjim dejavnikom ter učinkovitost ekstrakcij- ske procedure. Tako je možno pridobi- ti največ genomske DNA iz svežega in zamrznjenega blata, z daljšanjem izpo- stavljenosti zunanjim dejavnikom pa se stopnjuje bakterijska razgradnja DNA in razgradnja zaradi razgrajevalnih snovi, ki se v človeškem blatu nahajajo (npr. žolčne kisline). Odluščene epitelne celice v fecesu niso enakomerno razporejene. Gibanje peristaltike povzroča mešanje črevesne vsebine, zato so vsi deli fecesa občasno izpostavljeni epitelni površi- ni črevesa. Mešanje je manj intenzivno v rektumu in analnem kanalu, kjer pri- de ob iztiskanju do dodatnega luščenja epitelnih celic, zato so najverjetneje na površini blata večje količine epitelnih celic. Vandenberg (58) zato priporočata ekstrakcijo DNA iz blata, odvzetega iz površine. 9 Urin V forenzični dejavnosti je urin za- nimiv zlasti v primerih, ko je potrebno ugotoviti identiteto urina, prej odvzetega za forenzične toksikološke ali alkoholi- metrične preiskave ter kontrole dopin- ga (59). V teh primerih se namreč lahko pojavi sum, da urin ne pripada preisko- vancu (ali so ga preiskovanci zamenjali že v ambulanti pri samem odvzemu vzorca, ali pa je prišlo do zamenjave vzorcev ob analizi v laboratoriju). Preverjanje izvo- ra urinskega vzorca ni preprosto, saj ima urin v primerjavi z ostalimi telesnimi tekočinami zelo malo celic. V zdravem človeškem urinu najdemo le do 500 nu- kleiranih celic na mililiter urina. Največ je levkocitov (300–500 celic/ml urina), v majhnem številu pa so prisotne tudi epi- telne celice (60). Urin žensk vsebuje več - je število nukleiranih celic (zlasti epitel- ne celice iz nožničnega trakta) kot urin moških, zato običajno pridobimo pet- krat več DNA iz urina žensk (61). Proces hidrolize celic v urinu in kontaminacije z mikroorganizmi (bakterije, glive) nas- topi praktično takoj po uriniranju, zato je dobro svežemu urinu pred shranje- vanjem dodati snovi, ki preprečijo rast mikroorganizmov, zmanjšajo aktivnost encimov in stabilizirajo DNA. Različni avtorji predlagajo uporabo različnih prezervativov in shranjevanje vzorcev pri različnih temperaturah (62). Količina genomske DNA, ki jo je moč pridobiti iz Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 65 PregleDNi zNANstveNi čl ANek vzorca urina, je odvisna od spola, od po- gojev, v katerih so urin shranili, od časa shranjevanja, od obsežnosti mikrobne kontaminacije, od sproščanja nukle- az iz hidroliziranih celic in od metode izolacije, ki jo uporabimo za pridobitev DNA (62). Če tipizacija jedrne DNA ni uspešna, tipiziramo mtDNA. 10 Ukrepi za preprečevanje kontaminacije DNA Kemijski dejavniki okolja (čas, sončna svetloba, temperatura, vlažnost…) in bi- ološki dejavniki okolja (prisotnost mi- kroorganizmov), kateremu so človeški posmrtni ostanki ali človeški izločki podvrženi, povzročajo razgradnjo ge- netskega materiala in kontaminacijo z DNA bakterij in gliv. Najslabše vpliva na človeški dedni material izpostavljenost visokim temperaturam, visoki vlažnosti in neposredni sončni svetlobi ter mikro- organizmom, ki s svojimi encimi cepijo molekulo DNA (na mikrobno razgradnjo v največji meri vpliva vlaga). Tovrstne kontaminacije, ki v največji meri vpli- va na uspešnost tipizacije mtDNA, ne moremo preprečiti. Preprečimo pa lah- ko najnevarnejši tip kontaminacije, to je kontaminacija s človeškim biološkim materialom oziroma sodobno človeš- ko DNA. Zaradi nizke vsebnosti DNA in njene razgrajenosti v starih ali slabo ohranjenih bioloških materialih so to- vrstni forenzični vzorci zelo dovzetni za kontaminacijo s sodobno DNA (32), do katere lahko pride pri zbiranju in shra- njevanju dokaznega materiala ali med samo tipizacijo v laboratoriju. Pri starih kosteh, zobeh in telogenih laseh je najpo- gostejša površinska kontaminacija zara- di neprimernega rokovanja z dokaznim materialom. Površinsko kontaminacijo odstranjujemo z različnimi metodami. Med njimi so najpogostejše spiranje v vodi, detergentu, kislini, etanolu ali be- lilu, obsevanje z UV-svetlobo, pri kos- teh fizično odstranjevanje površine in kot zadnja možnost pridobitev DNA iz materiala, odvzetega iz notranjosti kos- ti ali zoba. Za učinkovito odstranevanje površinske kontaminacije se običajno uporablja različna kombinacija naštetih tehnik. Uporabo belila (natrijev hipoklorit) kot sredstva za odstranjevanje kontami- nacije iz površine starih kosti ali zob je preučeval Kemp (32) in ugotovil, da be - lilo uniči kontaminacijsko DNA na po- vršini kosti ali zob, saj jo z oksidativnim delovanjem razcepi na kratke fragmente, endogena DNA pa ostane nepoškodo- vana. Vzrok za to je izredna stabilnost DNA, ki se v starih kosteh in zobeh veže na hidroksiapatit, ki jo ščiti pred kemij- sko razgradnjo. Belilo je potrebno nato odstraniti s spiranjem z vodo in etano- lom. Pri zobeh je zobna pulpa, ki je glav- ni vir DNA, zaprta v pulpni votlini in obdana s trdimi tkivi (sklenina, dentin in cement), zato je manj izpostavljena kontaminaciji (63). Večina raziskoval- cev (54) uporablja za dekontaminacijo površine zob podobno kot pri kosteh zaporedno spiranje v detergentu, vodi in etanolu ter obsevanje z UV-svetlobo. Če je zob poškodovan (zlomljen ali pri- zadet z zobno gnilobo) njegovo površi- no dekontaminiramo le s spiranjem v vodi in obsevanjem z UV-svetlobo (54). Površina lasnega stebla je zaradi hidro- fobne narave keratinskih proteinov vo- doodporna in zato na nek način zaščite- na pred kontaminacijo, če pa že pride do nje, se jo da sprati z zaporednim večkra- tnim spiranjem v detergentu, etanolu in vodi (53,54). Cline (49) opozarja, da lahko uporaba previsokih koncentracij belila (10-odstotno belilo), kislin (1N HCl) in ekstrakcijskih pufrov (z doda- no proteinazo K in SDS) kot sredstev za odstranjevanje površinske kontaminaci- 66 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) je iz nohtov poškoduje endogeno DNA nohta. Poleg površinske kontaminacije s sodobno DNA je možna še kontami- nacija s predhodnimi produkti reakcije PCR ali kontaminacija reagentov, pla- stike in druge laboratorijske opreme. V Laboratoriju za molekularno genetiko Inštituta za sodno medicino v Ljubljani zato v izogib kontaminaciji vedno sledi- mo priporočilom za njeno preprečeva- nje (13,19,32,64,65). Uporabljamo dvojne sterilne laboratorijske rokavice, ki jih za vsak vzorec menjamo, kirurške maske za obraz, zaščitne kape, zaščitne prevleke za čevlje in zaščitno haljo za enkratno uporabo. Vse delovne površine pred in po delu očistimo z belilom, vodo in eta- nolom. Če je možno, jih čez noč izposta- vimo tudi UV-sevanju. Orodja in pri- pomočke za čiščenje, brušenje in mletje kosti in zob po uporabi očistimo na enak način kot delovne površine, jih sterilizi- ramo in čez noč ter pred začetkom dela izpostavimo UV-sevanju. Na enak način po sterilizaciji čez noč in pred začet- kom dela UV-sevanju izpostavimo vse pripomočke, orodja, reagente in labora- torijsko plastiko. Za vsak vzorec upora- bimo nova, čista orodja in pripomočke. Izdelano imamo eliminacijsko podat- kovno zbirko DNA, v kateri so shranjeni profili mtDNA laboratorijskega osebja in oseb, ki so v kateri koli fazi zbiranja in shranjevanja forenzičnih vzorcev – zlasti skeletnih ostankov, prišle v stik z njimi. Vzorce eliminacijske zbirke analiziramo ločeno od forenzičnih vzorcev in loče- no od referenčnih vzorcev (sorodniki ali osebni predmeti pogrešane osebe pri identifikacijskih postopkih). Prostorsko med seboj ločimo različne dele analize, da preprečimo morebitno kontaminaci- jo s produkti PCR. Pomnoženih produk- tov PCR nikoli ne vnašamo v prostore za pripravo vzorcev in reagentov, izolacijo DNA in pripravo reakcij PCR; slednji so med seboj prav tako ločeni. Čiščenje in mletje kosti in zob poteka v popolnoma ločenem prostoru, kjer mehansko čisti- mo vzorce kosti v zaprti citostatični ko- mori, da preprečimo navzkrižno konta- minacijo vzorcev s kostnim prahom. Ta prostor uporabljamo zgolj za pripravo tovrstnih vzorcev (kosti, zobje, telogeni lasje, stari nohti), ne pa tudi za pripra- vo vzorcev, ki vsebujejo večje količine DNA, kot denimo vzorci krvi in sline. V pomnoževanje produktov z reakcijo PCR vedno vključimo negativno kontro- lo, da zaznamo kakršno koli kontamina- cijo z DNA ali s produkti PCR. Prav tako vedno vključimo negativno kontrolo v postopek ekstrakcije DNA, da preverimo čistost ekstrakcijskih reagentov, labora- torijske plastike in morebitno navzkriž- no kontaminacijo vzorcev. Dobljena nu- kleotidna zaporedja forenzičnih vzorcev primerjamo z eliminacijsko podatkovno zbirko profilov mtDNA. MtDNA ved- no sekveniramo v obe smeri, s čimer zagotovimo pravilnost določitve nukle- otidnega zaporedja. Preiskave forenzič- nih vzorcev, ki vsebujejo nizke količine mtDNA, ponovimo vsaj dvakrat – tako preverimo, ali dobljeni rezultati med se- boj sovpadajo (66). 11 Primeri preiskav mtDNA Mitohondrijski genom je zelo upo- raben za določanje identitete starih po- smrtnih ostankov ter preučevanje gene- aloških odnosov, saj lahko kot referenčni vzorec uporabimo tudi nekaj generacij oddaljene sorodnike po materini lini- ji (3). Tako so s tipizacijo mtDNA iden- tificirali francoskega prestolonaslednika Ludvika XVII, katerega srce je po usmr- titvi izrezal zdravnik in se je ohranilo vse do danes. Iz preko 200 let starega srca pridobljeni haplotip mtDNA so pri- merjali s haplotipom mtDNA las Marije Antoinette in njenih še živečih potom- Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 67 PregleDNi zNANstveNi čl ANek cev po materini liniji. Z identičnostjo haplotipov so dokazali, da je bil dese- tletni deček, ki je leta 1795 umrl v ječi Temple, res sin Ludvika XVI. in Marije Antoinette (67). S pomočjo polimorfiz- mov mtDNA in primerjavo s še živeči- mi sorodniki po materini liniji so iden- tificirali tudi skeletne ostanke Martina Bormanna, enega najbolj radikalnih Hitlerjevih sodelavcev (68). S tipizacijo jedrne in mtDNA so identificirali brata Reinholda Messnerja (69) ter leta 1960 pokopane člane gverilske organizacije Che Guevara v Boliviji (70). Velikokrat se uporablja kombinacija jedrnih in mtDNA polimorfizmov za identifici- ranje žrtev množičnih nesreč, kot so letalske nesreče, potresi in požari (71). Ena najbolj odmevnih molekularnoge- netskih identifikacij skeletnih ostankov je bila identifikacija ruske vladarske družine Romanov (26,27), pri kateri je bilo potrebno za pozitivno identifikaci- jo analizirati tako jedrno kot mitohon- drijsko DNA. S pomočjo jedrne DNA so lahko preverili maternalno in pater- nalno povezanost družinskih članov v grobišču, niso pa mogli odgovoriti na vprašanje, ali gre dejansko za posmrtne ostanke družine Romanov. Jedrna DNA namreč omogoča le preverjanje bližnjih sorodstvenih odnosov, preverjanje so- rodnosti med daljnimi sorodniki, ki so med seboj ločeni z nekaj generacija- mi pa zaradi rekombinacije ni mogoče. Preverjanje daljnih sorodstvenih pove- zav je možno z analizo linearnih genet- skih označevalcev, kot sta kromosom Y in mtDNA, saj se dedujeta v nespre- menjeni obliki. Pri družini Romanov so preverili identičnost skeletnih ostan- kov tako, da so nukleotidna zaporedja mtDNA primerjali z nekaj generacij od- daljenimi, a še živečimi potomci po ma- terini liniji. Molekularnogenetske anali- ze 5.000 let starega tirolskega ledenega človeka – Öetzija (72), neandertalca (73) in mnoge druge genetske analize staro- davne DNA so pokazale, da je možno pridobiti mtDNA iz zelo starih človeških ostankov, ne le skeletov, ampak tudi mu- mificiranih mehkih tkiv različnih mu- zejskih in arheoloških zbirk (3). S pomočjo mtDNA poteka identi- fikacija skeletnih ostankov ameriških vojakov, padlih v vojnah v Vietnamu, Kambodži, Laosu in na Kitajskem (2300 žrtev), v korejski vojni (8.000 žrtev) in v drugi svetovni vojni (78.000 voja- kov) (11) ter identifikacija žrtev množič- nih pobojev na ozemlju bivše Jugoslavije (100.000 žrtev) (74,75). MtDNA je izred- no uporabna pri identifikaciji žrtev dru- ge svetovne vojne v Sloveniji, kjer imamo preko 600 evidetiranih prikritih grobišč s približno 100.000 žrtvami. Največje prikrito masovno grobišče, ki smo ga v Sloveniji genetsko identificirali, je gro- bišče Konfin I v bližini Grčaric (76). Seznam žrtev , najden v arhivih, je zajemal 88 žrtev, antropološka študija izkopanih skeletov je to število potrdila. Še živeče sorodnike (brate, sestre, sinove, hčerke, nečakinje, nečake, bratrance) smo uspeli najti za 44 žrtev. Izkop v anatomski legi ni bil mogoč, zato smo genetsko prei- skali vse desne stegnenice (84 kosti) ter pridobili jedrno DNA za uspešno tipiza- cijo mikrosatelitov iz 82 kosti, pri čemer smo s primerjavo genetskih profilov av- tosomskih mikrosatelitov ter haplotipov kromosoma Y in mtDNA s sorodniki us- peli identificirati tretjino žrtev, statistič- ne analize pa so pokazale visoko stopnjo identifikacije za 32 žrtev (76). Haplotipi mtDNA so nam služili za identificira- nje s pomočjo sorodnikov po materini liniji. Kosti smo vrnili sorodnikom, ki so svojce pokopali v družinske grobove. Identifikacija žrtev druge svetovne vojne je zelo kompleksen proces, saj vključu- je sodelovanje strokovnjakov različnih področij, genetska tipizacija je težavna zaradi slabo ohranjene DNA v starih 68 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) kosteh, problematično pa je tudi iska- nje sorodnikov, saj je od vojnih pobojev minilo več kot 70 let. Dokazali smo, da lahko s kombinacijo različnih genetskih označevalcev (avtosomske DNA, kro- mosoma Y in mtDNA) in tipizacijo bli- žnjih in daljnih sorodnikov ter izredno uspešno metodo ekstrakcije DNA iz ske- letnih ostankov, ki smo jo razvili v na- šem laboratoriju (66), uspešno identifi - ciramo tudi žrtve druge svetovne vojne. Identifikacija žrtev masovnega grobišča Konfin I je postavila osnovo za nadalj- nje molekularnogenetske preiskave po- vojnih množičnih grobišč, ki smo jih v zadnjih desetih letih izvedli v Sloveniji v našem laboratoriju. Poleg storžiških žrtev (77) smo genetsko preiskali tudi žrtve Bodoveljske Grape (5), lobanjo iz Bohinja (78), žrtve grobišča Mačkovec (prispevek v postopku recenzije), Mače (prispevek v pripravi), Babna Gora (pri- spevek v postopku recenzije), Mozelj, Kržeti, Zaplana, Krimska jama in Konfin II. 12 Zaključek Preiskave mtDNA v forenzični dejav- nosti so izredno pomembne za reševanje primerov, pri katerih preiskava jedrne DNA ni uspešna, ter primerov identi- fikacij, pri katerih imamo za primerja- vo kot referenčni vzorec na razpolago le sorodnike po materini liniji. Le malo evropskih laboratorijev je v preteklo- sti uporabljalo preiskave mtDNA, saj je postopek Sangerjevega sekveniranja in ločevanja sekvenčnih produktov na ka- pilarni elektroforezi zamuden, mtDNA pa je zaradi številnih kopij močno iz- postavljena kontaminaciji, kar je pot- rebno upoštevati pri organizaciji in opremi forenzičnega genetskega labo- ratorija, postopki pa v nasprotju s pre- iskavami jedrnih mikrosatelitov niso standardizirani. Z razvojem tehnologije sekveniranja naslednje generacije (angl. Next Generation Sequencing, NGS) po- staja tipizacija mtDNA v forenziki hitrej- ša, enostavnejša, uporabniku prijaznejša, zaradi zaprtih sistemov manj podvržena kontaminaciji in standardizirana. Tako lahko danes s tehnologijo NGS na eno- staven način sekveniramo ne le kontro- lno regijo mtDNA, ampak tudi celoten mitohondrijski genom (51,79,80). 13 Zahvala Zahvaljujem se Komisiji Vlade Republike Slovenije za reševanje vpra- šanj prikritih grobišč za opravljene izko- pe žrtev druge svetovne vojne. Del študij, opisanih v preglednem članku je sofinancirala Javna agenci- ja za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS) iz državnega prora- čuna (projekt Določitev najprimernej- ših skeletnih elementov za molekularno genetsko identifikacijo starih človeških posmrtnih ostankov, št. J3–8214). Literatura 1. z upanič Pajnič i, Šterlinko H, Bala ic J, komel r. Parentage testing with 14 str loci and population data for 5 strs in the slovenian population. int J l egal Med. 2001;114(3):178-80. https://doi.org/10.1007/ s004140000179 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11296891 2. z upanič Pajnič i, Balažic J, komel r. sequence polymorphism of the mitochondrial DNA control region in the slovenian population. int J l egal Med. 2004;118(1):1-4. https://doi.org/10.1007/s00414-003-0394-3 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14534795 3. Fisher dL, Holland MM, Mitchell L, Sledzik PS, Wilcox aW, Wadhams M, et al. Extraction, evaluation, and amplification of dNa from decalcified and undecalcified United States Civil War bone. J Forensic Sci. 1993;38(1):60-8. https://doi.org/10.1520/JFs13376J https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8426158 Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 69 PregleDNi zNANstveNi čl ANek 4. Coble MD, vallone PM, Just rs, Diegoli tM, smith BC, Parsons tJ. effective strategies for forensic analysis in the mitochondrial DNA coding region. int J l egal Med. 2006;120(1):27-32. https://doi.org/10.1007/s00414- 005-0044-z https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16261373 5. z upanič Pajnič i. identifikacija oseb iz starih in slabo ohranjenih bioloških materialov s polimorfizmi mito- hondrijske DNA. [PhD thesis]. ljubljana: i. z upanič Pajnič; 2007. 6. Obal M. Uporaba različnih skeletnih elementov za genetsko identifikacijo žrtev druge svetovne vojne. [Master's thesis]. ljubljana: M. Obal; 2018. 7. Anderson s, Bankier A t , Barrell Bg, de Bruijn MH, Coulson Ar, Drouin J, et al. sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature. 1981;290(5806):457-65. https://doi.org/10.1038/290457a0 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7219534 8. vogel F, Motulsky Ag. Human genetics - problems and approaches. Berlin: springer-verlag; 2018. 1997. pp. 83-7, 114-27, 145-93, 495-583, 593-54, 610-21, 705-11. 9. Bendall ke, Macaulay vA, sykes BC. variable levels of a heteroplasmic point mutation in individual hair roots. Am J Hum genet. 1997;61(6):1303-8. https://doi.org/10.1086/301636 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/9399894 10. Howell N, kubacka i, Mackey DA. How rapidly does the human mitochondrial genome evolve? Am J Hum genet. 1996;59(3):501-9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8751850 11. Holland MM, Fisher Dl, Mitchell lg, r odriquez WC, Canik JJ, Merril Cr, et al. Mitochondrial DNA sequen- ce analysis of human skeletal remains: identification of remains from the Vietnam War. J Forensic Sci. 1993;38(3):542-53. https://doi.org/10.1520/JFs13439J https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8515208 12. Hopwood AJ, Mannucci A, sullivan kM. DNA typing from human faeces. int J l egal Med. 1996;108(5):237-43. https://doi.org/10.1007/BF01369817 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8721422 13. t ully g, Bär W, Brinkmann B, Carracedo A, gill P , Morling N, et al. Considerations by the european DNA profiling (eDNAP) group on the working practices, nomenclature and interpretation of mitochondrial DNA profiles. Forensic sci int. 2001;124(1):83-91. https://doi.org/10.1016/s0379-0738(01)00573-4 https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/11741765 14. sullivan kM, Hopgood r, gill P . identification of human remains by amplification and automated sequen- cing of mitochondrial DNA. int J l egal Med. 1992;105(2):83-6. https://doi.org/10.1007/BF02340829 https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1520642 15. Piercy r, sullivan kM, Benson N, gill P . the application of mitochondrial DNA typing to the study of white Caucasian genetic identification. int J l egal Med. 1993;106(2):85-90. https://doi.org/10.1007/BF01225046 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8217870 16. l utz s, Wittig H, Weisser HJ, Heizmann J, Junge A, Dimo- simonin N, et al. is it possible to differentiate mtDNA by means of Hviii in samples that cannot be distinguished by sequencing the Hvi and Hvii regions? Forensic sci int. 2000;113(1-3):97-101. https://doi.org/10.1016/s0379-0738(00)00222-X https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/10978608 17. Cann rl, stoneking M, Wilson AC. Mitochondrial DNA and human evolution. Nature. 1987;325(6099):31-6. https://doi.org/10.1038/325031a0 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/3025745 18. l orente JA, entrala C, Alvarez JC, l orente M, Arce B, Heinrich B, et al. social benefits of non-criminal genetic databases: missing persons and human remains identification. int J l egal Med. 2002;116(3):187-90. https:// doi.org/10.1007/s004140100255 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12111326 19. Bär W, Brinkmann B, Budowle B, Carracedo A, gill P , Holland M, et al. DNA commission of the international society for forensic genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing. int J l egal Med. 2000;113(4):193-6. https://doi.org/10.1007/s004140000149 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10929233 20. Allen M, engström As, Meyers s, Handt O, saldeen t , von Haeseler A, et al. Mitochondrial DNA sequencing of shed hairs and saliva on robbery caps: sensitivity and matching probabilities. J Forensic sci. 1998;43(3):453- 64. https://doi.org/10.1520/JFs16169J https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9608683 21. Parson W, Brandstätter A, Alonso A, Brandt N, Brinkmann B, Carracedo A, et al. the eDNAP mitochondri- al dNa population database (EMPOP) collaborative exercises: organisation, results and perspectives. Fo - rensic sci int. 2004;139(2-3):215-26. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2003.11.008 https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/15040920 22. Linch Ca, Whiting da, Holland MM. Human hair histogenesis for the mitochondrial dNa forensic scien- tist. J Forensic sci. 2001;46(4):844-53. https://doi.org/10.1520/JFs15056J https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/11451065 23. Wilson Mr, Polanskey D, r eplogle J, Dizinno JA, Budowle B. A family exhibiting heteroplasmy in the human mitochondrial dNa control region reveals both somatic mosaicism and pronounced segregation of mi- totypes. Hum genet. 1997;100(2):167-71. https://doi.org/10.1007/s004390050485 https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/9254844 24. t ully g, Barritt sM, Bender k, Brignon e, Capelli C, Dimo-simonin N, et al. r esults of a collaborative study of the eDNAP group regarding mitochondrial DNA heteroplasmy and segregation in hair shafts. Forensic sci int. 2004;140(1):1-11. https://doi.org/10.1016/s0379-0738(03)00181-6 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/15013160 25. Calloway CD, r eynolds rl, Herrin gl, Anderson WW. the frequency of heteroplasmy in the Hvii region of mtDNA differs across tissue types and increases with age. Am J Hum genet. 2000;66(4):1384-97. https://doi. org/10.1086/302844 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10739761 70 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) 26. gill P , ivanov Pl, kimpton C, Piercy r, Benson N, t ully g, et al. identification of the remains of the r omanov family by DNA analysis. Nat genet. 1994;6(2):130-5. https://doi.org/10.1038/ng0294-130 https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/8162066 27. ivanov Pl, Wadhams MJ, r oby rk, Holland MM, Weedn vW, Parsons t J. Mitochondrial DNA sequence hete- roplasmy in the Grand duke of russia Georgij r omanov establishes the authenticity of the remains of t sar Nicholas ii. Nat genet. 1996;12(4):417-20. https://doi.org/10.1038/ng0496-417 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/8630496 28. Parsons tJ, Muniec Ds, sullivan k, Woodyatt N, Alliston-greiner r, Wilson Mr, et al. A high observed substi- tution rate in the human mitochondrial DNA control region. Nat genet. 1997;15(4):363-8. https://doi. org/10.1038/ng0497-363 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9090380 29. Bendall ke, Macaulay vA, Baker Jr, sykes BC. Heteroplasmic point mutations in the human mtDNA control region. Am J Hum genet. 1996;59(6):1276-87. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8940273 30. Campos PF, Craig Oe, t urner-Walker g, Peacock e, Willerslev e, gilbert Mt . DNA in ancient bone - where is it located and how should we extract it? Ann Anat. 2012;194(1):7-16. https://doi.org/10.1016/j.aanat.2011.07.003 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21855309 31. Allen C, Harper v. laboratory Manual for Anatomy and Physiology. 4th ed. Hoboken (NJ): Wiley; 2011. pp. 96-8. 32. kemp BM, smith Dg. Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth. Forensic sci int. 2005;154(1):53-61. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2004.11.017 https://pubmed.ncbi.nlm. nih.gov/16182949 33. Hochmeister MN, Budowle B, Borer Uv, eggmann U, Comey Ct , Dirnhofer r. t yping of deoxyribonucleic acid (DNA) extracted from compact bone from human remains. J Forensic sci. 1991;36(6):1649-61. https:// doi.org/10.1520/JFs13189J https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1685164 34. Hagelberg e, sykes B, Hedges r. Ancient bone DNA amplified. Nature. 1989;342(6249):485. https://doi. org/10.1038/342485a0 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2586623 35. Miloš A, selmanović A, smajlović l, Huel rl, katzmarzyk C, rizvić A, et al. success rates of nuclear short tandem repeat typing from different skeletal elements. Croat Med J. 2007;48(4):486-93. https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/17696303 36. Hansen HB, Damgaard PB, Margaryan A, stenderup J, l ynnerup N, Willerslev e, et al. Comparing Anci- ent DNA Preservation in Petrous Bone and t ooth Cementum. Pl os One. 2017;12(1):e0170940. https://doi. org/10.1371/journal.pone.0170940 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28129388 37. siriboonpiputtana t , rinthachai t , shotivaranon J, Peonim v, r erkamnuaychoke B. Forensic genetic analysis of bone remain samples. Forensic sci int. 2018;284:167-75. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2017.12.045 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29408726 38. Mundorff A, Davoren JM. examination of DNA yield rates for different skeletal elements at increasing post mortem intervals. Forensic sci int genet. 2014;8(1):55-63. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2013.08.001 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24315589 39. Andronowski JM, Mundorff Az, Pratt iv, Davoren JM, Cooper DM. evaluating differential nuclear DNA yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-Ct approa- ch. Forensic sci int genet. 2017;28:211-8. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2017.03.002 https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/28315820 40. Alvarez garcía A, Muñoz i, Pestoni C, lareu Mv , r odríguez-Calvo Ms, Carracedo A. effect of environmental factors on PCr -DNA analysis from dental pulp. int J l egal Med. 1996;109(3):125-9. https://doi.org/10.1007/ BF01369671 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8956985 41. rubio l, Martinez lJ, Martinez e, Martin de las Heras s. study of short- and long-term storage of teeth and its influence on DNA. J Forensic sci. 2009;54(6):1411-3. https://doi.org/10.1111/j.1556-4029.2009.01159.x https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19804532 42. Higgins D, Austin JJ. t eeth as a source of DNA for forensic identification of human remains: a review. sci Justice. 2013;53(4):433-41. https://doi.org/10.1016/j.scijus.2013.06.001 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/24188345 43. Mansour H, krebs O, sperhake JP , Augustin C, koehne t , Amling M, et al. Cementum as a source of DNA in challenging forensic cases. J Forensic l eg Med. 2018;54:76-81. https://doi.org/10.1016/j.jflm.2017.12.015 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29328966 44. smith BC, Fisher Dl, Weedn vW, Warnock gr, Holland MM. A systematic approach to the sampling of dental DNA. J Forensic sci. 1993;38(5):1194-209. https://doi.org/10.1520/JFs13524J https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/8228888 45. Higgins D, kaidonis J, Austin J, t ownsend g, James H, Hughes t . Dentine and cementum as sources of nuclear DNA for use in human identification. Aust J Forensic sci. 2011;43(4):287-95. https://doi.org/10.1080 /00450618.2011.583278 46. Petrovič D, z orc M. Histologija. ljubljana: Univerza v ljubljani, Medicinska fakulteta, inštitut za histologijo in embriologijo; 2005. pp. 35-42, 115-24, 166-68. 47. gilbert Mt , Janaway rC, t obin DJ, Cooper A, Wilson As. Histological correlates of post mortem mitochon- drial DNA damage in degraded hair. Forensic sci int. 2006;156(2-3):201-7. https://doi.org/10.1016/j.forsci- int.2005.02.019 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15922527 Uporaba mitohondrijske DNA v forenzičnih preiskavah 71 PregleDNi zNANstveNi čl ANek 48. schlenker A, grimble k, Azim A, Owen r, Hartman D. t oenails as an alternative source material for the extra- ction of DNA from decomposed human remains. Forensic sci int. 2016;258:1-10. https://doi.org/10.1016/j. forsciint.2015.10.025 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26610200 49. Cline rE, Laurent NM, Foran dr. the fingernails of Mary Sullivan: developing reliable methods for selecti- vely isolating endogenous and exogenous DNA from evidence. J Forensic sci. 2003;48(2):328-33. https:// doi.org/10.1520/JFs2002107 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12664990 50. Hellmann A, r ohleder U, schmitter H, Wittig M. str typing of human telogen hairs—a new approach. int J l egal Med. 2001;114(4-5):269-73. https://doi.org/10.1007/s004140000175 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/11355409 51. gallimore JM, Mcelhoe JA, Holland MM. Assessing heteroplasmic variant drift in the mtDNA control region of human hairs using an MPs approach. Forensic sci int genet. 2018;32:7-17. https://doi.org/10.1016/j.fsi- gen.2017.09.013 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29024924 52. linch CA, smith sl, Prahlow JA. evaluation of the human hair root for DNA typing subsequent to micros- copic comparison. J Forensic sci. 1998;43(2):305-14. https://doi.org/10.1520/JFs16137J https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/9544538 53. graffy eA, Foran Dr. A simplified method for mitochondrial DNA extraction from head hair shafts. J Forensic sci. 2005;50(5):1119-22. https://doi.org/10.1520/JF s2005126 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16225218 54. Baker le, McCormick WF, Matteson kJ. A silica-based mitochondrial DNA extraction method applied to forensic hair shafts and teeth. J Forensic sci. 2001;46(1):126-30. https://doi.org/10.1520/JFs14923J https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11210897 55. McNevin D, Wilson-Wilde l, r obertson J, kyd J, l ennard C. short tandem repeat (str) genotyping of kerati- nised hair. Part 2. An optimised genomic DNA extraction procedure reveals donor dependence of str pro - files. Forensic sci int. 2005;153(2-3):247-59. https://doi.org/10.1016/j.forsciint.2005.05.005 https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/15998572 56. Johnson DJ, Martin lr, r oberts kA. str -typing of human DNA from human fecal matter using the QiA geN QiAamp stool mini kit. J Forensic sci. 2005;50(4):802-8. https://doi.org/10.1520/JF s2004428 https://pub - med.ncbi.nlm.nih.gov/16078481 57. roy r. analysis of human fecal material for autosomal and Y chromosome Strs. J Forensic Sci. 2003;48(5):1035-40. https://doi.org/10.1520/JFs2002348 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14535665 58. vandenberg N, van Oorschot rA. extraction of human nuclear DNA from feces samples using the QiAamp DNA stool Mini kit. J Forensic sci. 2002;47(5):993-5. https://doi.org/10.1520/JFs15502J https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/12353586 59. sípoli Marques MA, Pinto Damasceno lM, gualberto Pereira HM, Caldeira CM, Pereira Dias BF, de giacomo vargens D, et al. DNA typing: an accessory evidence in doping control. J Forensic sci. 2005;50(3):587-92. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15932091 60. t songalis gJ, Anamani De, Wu AH. identification of urine specimen donors by the PM+DQA1 amplification and typing kit. J Forensic sci. 1996;41(6):1031-4. https://doi.org/10.1520/JF s14043J https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/8914292 61. linfert Dr, Wu AH, t songalis gJ. the effect of pathologic substances and adulterants on the DNA typing of urine. J Forensic sci. 1998;43(5):1041-5. https://doi.org/10.1520/JF s14354J https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/9729822 62. Milde A, Haas-r ochholz H, kaatsch HJ. improved DNA typing of human urine by adding eDt A. int J l egal Med. 1999;112(3):209-10. https://doi.org/10.1007/s004140050237 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10335891 63. t suchimochi t , iwasa M, Maeno Y, koyama H, inoue H, isobe i, et al. Chelating resin-based extraction of DNA from dental pulp and sex determination from incinerated teeth with Y-chromosomal alphoid repeat and short tandem repeats. Am J Forensic Med Pathol. 2002;23(3):268-71. https://doi.org/10.1097/00000433- 200209000-00013 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12198355 64. r ohland N, Hofreiter M. Ancient DNA extraction from bones and teeth. Nat Protoc. 2007;2(7):1756-62. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.247 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17641642 65. Parson W, gusmão l, Hares Dr, irwin JA, Mayr Wr, Morling N, et al. DNA Commission ofthe internatio - nal Society for Forensic Genetics: revised and extended guidelines for mtdNatyping. Forensic Sci Int Ge- net. 2014;13:134-42. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2014.07.010 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25117402 66. z upanič Pajnič i. extraction of DNA from Human skeletal Material. in: goodwin W. Forensic DNA t yping Protocols. New York: Humana Press; 2016. pp. 89-108. 67. Jehaes e, Decorte r, Peneau A, Petrie JH, Boiry PA, gilissen A, et al. Mitochondrial DNA analysis on remains of a putative son of l ouis Xvi, king of France and Marie-Antoinette. eur J Hum genet. 1998;6(4):383-95. https://doi.org/10.1038/sj.ejhg.5200227 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9781047 68. Anslinger k, Weichhold g, keil W, Bayer B, eisenmenger W. identification of the skeletal remains of Mar- tin Bormann by mtDNA analysis. int J l egal Med. 2001;114(3):194-6. https://doi.org/10.1007/s004140000176 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11296895 69. Parson W, Brandstätter A, Niederstätter H, grubwieser P, scheithauer r. Unravelling the mystery of Nanga Parbat. int J l egal Med. 2007;121(4):309-10. https://doi.org/10.1007/s00414-006-0098-6 https://pubmed. ncbi.nlm.nih.gov/16673142 70. lleonart r, riego e, saínz de la Peña Mv , Bacallao k, Amaro F, santiesteban M, et al. Forensic identificati- on of skeletal remains from members of ernesto Che guevara’s guerrillas in Bolivia based on DNA typing. 72 Zdrav Vestn | januar – februar 2020 | Letnik 89 JaVNO Zdra VStVO (V ar StVO PrI dELU) int J l egal Med. 2000;113(2):98-101. https://doi.org/10.1007/Pl00007716 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/10741484 71. Mukaida M, kimura H, t akada Y, Masuda t , Nakata Y. the personal identification of many samples recove - red from under the sea. Forensic sci int. 2000;113(1-3):79-85. https://doi.org/10.1016/s0379-0738(00)00219-X https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10978605 72. Handt O, richards M, t rommsdorff M, kilger C, simanainen J, georgiev O, et al. Molecular genetic analyses of the t yrolean ice Man. science. 1994;264(5166):1775-8. https://doi.org/10.1126/science.8209259 https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/8209259 73. krings M, s tone A, schmitz r W, krainitzki H, s toneking M, Pääbo s. Neandertal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell. 1997;90(1):19-30. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)80310-4 https:// pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9230299 74. Andelinović s, sutlović D, erceg ivkosić i, Škaro v, ivkosić A, Paić F, et al. t welve-year experience in identifi- cation of skeletal remains from mass graves. Croat Med J. 2005;46(4):530-9. https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/16100755 75. Parsons tJ, Huel rM, Bajunović z, rizvić A. large scale DNA identification: the iCMP experience. Forensic sci int genet. 2019;38:236-44. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2018.11.008 https://pubmed.ncbi.nlm.nih. gov/30469017 76. z upanič Pajnič i, gornjak Pogorelc B, Balažic J. Molecular genetic identification of skeletal remains from the second World War konfin i mass grave in slovenia. int J l egal Med. 2010;124(4):307-17. https://doi. org/10.1007/s00414-010-0431-y https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20217112 77. z upanič Pajnič i. Molecular genetic identification of the slovene home guard victims. z drav vestn. 2008;77:745-50. 78. z upanič Pajnič i, Petaros A, Balažic J, geršak k. searching for the mother missed since the second World War. J Forensic l eg Med. 2016;44:138-42. https://doi.org/10.1016/j.jflm.2016.10.015 https://pubmed.ncbi. nlm.nih.gov/27810583 79. strobl C, eduardoff M, Bus MM, Allen M, Parson W. evaluation of the precision iD whole MtDNA genome panel for forensic analyses. Forensic sci int genet. 2018;35:21-5. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2018.03.013 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29626805 80. sturk-Andreaggi k, Peck MA, Boysen C, Dekker P, McMahon tP, Marshall Ck. AQMe: A forensic mitochondrial DNA analysis tool for next-generation sequencing data. Forensic sci int genet. 2017;31:189-97. https://doi. org/10.1016/j.fsigen.2017.09.010 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29080494