Marko Jevšek1, Tomaž Marš2
Izvor acetilholinesteraze
v • v	• v • v	, • -|	t Q
v zivcno-misicnem stiku sesalca3
Origin of Acetylcholinesterase in Mammalian Neuromuscular Junction
IZVLEČEK_
KLJUČNE BESEDE: acetilholinesteraza, živčnomišični stik, miSica skeletna - inervacija, imunohistokemija
Molekularni mehanizmi nastajanja sinaps so ena od osrednjih tem modernih nevrobiološ-kih znanosti. Acetilholinesteraza (AChE) je encim, ki katalizira hidrolizo acetilholina in tako prekine holinergičen prenos signala v živčno-mišičnem stiku (ZMS). Velika večina AChE je v tej sinapsi pričvrščena na bazalno lamino oz. membrano. Ta se nahaja med presinaptično membrano, ki je del živčnega končiča, in postsinaptično membrano, ki je del mišičnega vlakna. Ker poteka sinteza AChE tako v motoričnem nevronu kot v mišičnem vlaknu, je teoretično možno, da je izvor AChE tako v enem kot v drugem tkivu. Dosedanje raziskave močno podpirajo mišični izvor, a dopuščajo tudi možnost živčnega izvora AChE v ZMS.
V	tej nalogi smo preučevali izvor sinaptične AChE v zgodnejši fazi nastajanja sesalskega ZMS v pogojih in vitro.
V	preučevani zgodnji fazi razvoja @MS prispeva motorični nevron vsaj del AChE, ki jo najdemo v sinaptični špranji.	241
V	poskusih smo uporabili in vitro sistem, v katerem smo človeške mišične cevčice gojili v kokulturi z eksplanti, izoliranimi iz podganje hrbtenjače. V teh kokulturah se med mišičnimi cevčicami in motoričnimi nevroni, ki izrastejo iz eksplantov, razvijejo visoko diferencirani ZMS. Z uporabo vrstno specifičnih protiteles proti človeški in podganji AChE smo z imunof-luorescenčno metodo ugotavljali, ali je sinaptična AChE človeškega (mišičnega) ali podganjega (živčnega) izvora. Vrstno specifičnost protiteles smo preverili z metodo Western blot. @MS smo identificirali s kombiniranjem faznokontrastne mikroskopije mišičnih in živčnih vlaken in flou-rescenčne mikroskopije skupkov acetilholinskih receptorjev. Slednje smo opazovali, prek vezave a-bungarotoksina, označenega z rodaminom.
Po barvanju človeške AChE smo dobili močan imunofluorescenčni signal na mestu ZMS, kar kaže na visok delež mišične AChE v @MS. Signal v področju @MS smo dobili tudi po barvanju podganje AChE. To kaže, da je del AChE v opazovani fazi razvoja @MS vendarle prispeval tudi živec, vendar je ta delež, sodeč po intenziteti signala, manjši od prispevka mišice. Po kvantitativni oceni intenzitete signala je bil ta v primeru človeške AChE pozitiven v 62 %, v primeru podganje AChE pa le v 32 % od vseh opazovanih @MS.
Omenjeni rezultati potrjujejo našo hipotezo. Večina AChE v zgodnji fazi razvoja @MS je sicer mišičnega izvora, manjši delež pa prispeva tudi motorični nevron.
1	Marko Jevšek, univ. dipl. biol., študent medicine, Laboratorij za molekularno nevrobiologijo, Inštitut za patološko fiziologijo, Medicinska fakulteta, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
2	Asist. dr. Tomaž Marš, univ. dipl. biol., študent medicine, Laboratorij za molekularno nevrobiologijo, Inštitut za patološko fiziologijo, Medicinska fakulteta, Zaloška 4, 1000 Ljubljana.
3	Objavljeno delo je bilo nagrajeno s Prešernovo nagrado za študente v letu 2001.
242
ABSTRACT_
KEY WORDS: acetylcholinesterase, neuromuscular junction, muscle skeletal - innervation, immunohistochemistry
The molecular mechanisms underlying synaptic formation are one of the central themes of modern neuroscience. The best-established role of acetylcholinesterase (AChE) is the termination of signal transmission in the neuromuscular junction (NMJ) and other cholinergic synapses by catalyzing hydrolysis of acetylcholine. Most of the AChE in the NMJ is bound to the specialized basal lamina located between the presynaptic membrane contributed by the nerve ending and the postsynaptic membrane belonging to skeletal muscle fiber. Both cells can therefore be a source of synaptic AChE. Current evidence strongly supports a muscular origin for synaptic AChE; however, the possibility of neural origin has never been eliminated and is supported by another line of evidence.
The objective of this work was to study the origin of synaptic AChE at the earlier stages of the formation of mammalian NMJ under in vitro conditions.
At least part of the synaptic AChE found in the NMJ at the earlier stages of its formation is contributed by the motor neuron.
In our study, an in vitro model was employed in which human muscle was co-cultured with the explants isolated from embryonic rat spinal cord. In these co-cultures the motor neurons originate from the rat spinal cord explants and form differentiated and long-lived NMJs with human muscle fibers. By using species-specific antibodies against human and rat AChE, respectively, we were able to distinguish between AChE of muscle (human) and neural (rat) origin. Species specificity of anti-AChE antibodies was tested by Western blotting. Phase-contrast microscopy and fluorescent identification of acetylcholine receptors were used for visualization of the NMJs.
A strong signal was observed after staining with anti-human AChE antibodies, which indicated a relatively strong muscular AChE contribution in the NMJ. The signal was also observed at the NMJ after the staining of rat AChE, suggesting neural origin of a part of synaptic AChE. The lower intensity of this signal suggests that the neural contribution was smaller than the muscular one. Quantitative analysis based on the intensities of the signals revealed that 62% of the examined NMJ were human (muscle) AChE-positive and 32% of them were rat (nerve) AChE-positive.
The above results support our hypothesis. The majority of AChE at the earlier stages of NMJ formation is of muscular origin; however, a small part is also contributed by the motor neuron.
UVOD
Vloga in razporeditev acetilholinesteraze v živčno-mišičnem stiku
Vloga acetilholinesteraze
Encim acetilholinesteraza (AChE), ki prek hidrolize acetilholina (ACh) prekinja prenos signala v živčno-mišičnem stiku (ZMS) in drugih holinergičnih sinapsah, sodi - poleg ace-tilholinskih receptorjev (AChR) - med najbolj preučevane molekule živčno-mišičnega prenosa. Pomembna vprašanja o mehanizmih, ki uravnavajo ekspresijo in prostorsko razmeščanje te komponente živčno-mišičnega stika, pa obstajajo kljub temu še vedno odprta.
Izhajajoč iz ugotovitev, da se AChE nahaja tudi na mestih, kjer ni drugih komponent holinergičnega sistema, pripisujejo temu encimu tudi vrsto drugih, neholinergičnih funkcij, med drugim tudi pomembno vlogo pri razvoju motorične ploščice (1, 2).
Struktura AChE
Za encim je značilen molekularni polimorfi-zem, pojav, pri katerem se beljakovina pojavlja v različnih molekularnih oblikah. V primeru AChE imajo te oblike enake kinetične in farmakološke lastnosti, razlikujejo pa se po sestavi katalitskih in strukturnih podenot, hidrodinamskih lastnostih, hidrofobnosti in porazdelitvi v celici. Glede na strukturo delimo
različne molekularne oblike v razred hetero-mernih in homomernih oblik. Heteromerne oblike so sestavljene iz katalitskih podenot in dodatne strukturne podenote (kolagenu podoben rep ali hidrofobni strukturni peptid). Homomerne oblike pa so sestavljene samo iz katalitskih podenot, pri čemer imajo amfifilne oblike posttranslacijsko dodano še glikofosfo-lipidno sidro (slika 1). Pojavljanje različnih molekularnih oblik in njihova medsebojna razmerja se razlikujejo glede na posamezne biološke vrste, razvojne stopnje organizma in tudi glede na posamezna tkiva znotraj istega organizma. Vloga tega molekularnega polimor-fizma AChE je verjetno v usmerjanju in vgrajevanju AChE na različna mesta v celicah in tkivih glede na funkcijo, ki jo AChE na določenih mestih v določenem času lahko ima. Tako je za ZMS značilna specializirana asimetrična A12-oblika. Ta je sestavljena iz treh tetramernih oblik s štirimi katalitskimi pode-notami, ki so povezane med sabo s t. i.
kolagenskim repom, ki tej obliki omogoča zasidranje v bazalni lamini mišičnega vlakna (slika 1). V področju ZMS so prisotne tudi homomerne oblike AChE, katerih nahajališče še ni jasno (za pregled glej 1).
Ekspresija AChE
Omenili smo že, da se mora AChE v mišičnem vlaknu ne le sintetizirati, ampak tudi usmeriti na mesto svojega delovanja. Za pravilen potek tega procesa so najbrž pomembne vse faze biosinteze AChE, še posebej pa tiste stopnje biosinteze, kjer se le-ta uravnava. Pomembno raven te regulacije predstavlja sinteza AChE mRNA, ki je že sama asimetrično porazdeljena vzdolž skeletnomišičnega vlakna (4, 5). Na mišici latissimus dorsi odrasle prepelice in na mišici extensor digitorum lon-gus (EDL) odrasle podgane so opazili, da je le-ta prisotna v sinaptičnem predelu (6, 7). V poskusih na celičnih kulturah so ugotovili tudi, da se AChE prepisi v večjedrnem mišičnem sinci-
243
Slika 1. Molekularne oblike AChE. Prikazane so različne molekularne oblike in eksoni, ki kodirajo njihove karboksilne konce. Vstru-pu nekaterih kač (Bungarus) so v zadnjem času odkrili še dodaten ekson S, ki kodira topno monomerno obliko (povzeto po Cousin in sod, 1998(3)).
244
ciju vedno nahajajo v območju jedra, v katerem so se prepisali (8), in da tudi prevajanje ter usmerjanje zrelih AChE poteka v področju oz. vbližini izvornega jedra (9). Prepisovanju in posttranslacijskim spremembam AChE sledi prenos molekul do sarkoplazme in njihova sprostitev v živčno-mišično špranjo ter difuzija AChE do vezavnega mesta na bazalni lamini (za pregled glej 1). Prav tako se AChE sintetizira v celicah a-motoričnih nevronov (10,11), kjer so tudi visoke koncentracije AChE mRNK (12). Njena asimetrična, A12-oblika se prenese vzdolž živčnega vlakna do presinaptične membrane (11).
Izvor AChE v ŽMS
Številni raziskovalci so pokazali možnost mišičnega izvora AChE v ŽMS. V poteku skeletnomišične diferenciacije in vivo in in vitro se aktivnost AChE spreminja, prav tako pa se spreminja tudi mesto nastajanja encima znotraj mišičnega vlakna (13). Z elektronsko mikroskopijo miodermatoma zajca so že na stopnji mononuklearnih mioblastnih celic dokazali AChE v okolici jedra, v endoplaz-matskem retikulumu in v Golgijevem kompleksu (14). Ob zlitju enojedrnih mioblastov v večjedrne mišične celice in vivo in in vitro pride do povečanja aktivnosti AChE (15, 16) kot posledice zvečane ravni tudi njene mRNK (4, 17). Samo nahajanje AChE v neo-živčeni večjedrni mišični celici se v različnih razvojnih stopnjah spreminja in je verjetno tudi vrstno specifična (13). Mesto nahajanja in sinteza AChE v mišični cevčici je omejena na območje jedra, kjer se izraža AChE mRNA (9).
Glede izvora AChE, ki se nahaja na bazalni lamini v ŽMS, so mnenja danes deljena, saj obstoječi podatki dopuščajo tako možnost mišičnega kot tudi živčnega izvora. Na modelu kokulture, pripravljene iz mišičnih celic podgane in disociiranih živcev iz piščanca, so De La Portejeva in sodelavci (18) pokazali, da izvira AChE v takem modelu le iz mišične celice. Prav tako je znano, da lahko spodbujeno mišično vlakno proizvaja AChE, ki se kopiči v ŽMS (19-21). Znane so tudi mnoge podrobnosti biosinteze AChE in njihovega prenosa v skeletni mišici (22).
Nekateri avtorji nasprotno menijo, da AChE v ŽMS izvira iz živčnega vlakna. Globu-
larne (G1, G2, G4) in asimetrične oblike (A12) AChE se sintetizirajo tudi v motoričnem živcu. Couraud s sodelavci (11) je dokazal tudi njihov prenos po aksonih živcev v anterograd-ni ter retrogradni smeri. Molekularne oblike G1 in G2 potujejo po aksonu s počasnim aksonskim prenosom, obliki G4 in A12 pa s hitrim. Od vseh molekularnih oblik AChE pa v obnavljajočem živčnem vlaknu najhitreje potuje A12 AChE (11). Anglister-jeva (23) je z odstranitvijo mišice iz ŽMS žabe pokazala, da je AChE, vezana na še ohranjeno bazalno lamino v ŽMS, živčnega izvora. Dokončnega odgovora o izvoru AChE v de novo nastalem ŽMS torej še ni, zato se tega vprašanja lotevamo v tej nalogi.
Modeli za študij ŽMS v človeški mišici
Edini model, kjer je možno na relativno preprost način spremljati vse faze sinaptogeneze sesalskega ŽMS, do neke mere pa tudi interakcije med živčnimi celicami in celicami glije, je model in vitro oživčenih mišičnih celic. V tem modelu se med motoričnimi živci in skeletnomišičnimi vlakni vzpostavijo funkcionalni ŽMS, ki se po funkcionalni in po morfološki plati ne razlikujejo od ŽMS, nastalih vpogojih in vivo (24, 25). Pred kulturami disociiranih celic ima ta model vrsto prednosti, saj v večji meri ohranja kompleksnost interakcij med živčnimi in neživčnimi celicami, kakršne najdemo v pogojih in vivo.
Model omogoča spremljanje vseh faz sinaptogeneze, saj so kokulture obstojne tudi več mesecev, torej precej več, kot so in vitro sposobne preživeti organotipične kulture embrionalne hrbtenjače v odsotnosti mišičnih vlaken (26), pa tudi sesalska mišična vlakna v odsotnosti hrbtenjačnih eksplantov. Model sta prvič opisala Crain in Peterson (27), ki sta organski kulturi mišičnih vlaken dodala eksplante embrionalne mišje hrbtenjače. Iz eksplanta izraščajoči živci so tvorili funkcionalne ŽMS z obnavljajočimi mišičnimi vlakni. Po dveh do treh tednih v kokulturi so se obnavljajoča vlakna še naprej diferencirala, tvorila prečno progavost in se začela krčiti. Askanasova in sodelavci (24) so ta model spremenili. Kot vir mišičnih celic so vzeli mioblastne celice, ki se razvijejo iz satelitskih celic odrasle skeletne mišice. To so speče
(dormantne) celice, ki se aktivirajo ob poškodbah mišic in imajo ključno vlogo pri obnovi tkiva (25-29). V omenjenem modelu človeški mioblasti, pridobljeni iz biopsijskega mišičnega tkiva, vstopajo v proces fuzije in tvorijo mišične cevčice, te pa nato tvorijo ZMS z živci, ki izraščajo iz eksplantov embrional-ne podganje hrbtenjače. Ta model omogoča opazovanje nastanka @MS, ki se tvorijo v bližini eksplanta kot del dobro diferenciranih in funkcionalnih motoričnih enot (4, 30). V teh kokulturah se nikotinski AChR in AChE kopičijo na mestih na novo nastalih ZMS. Kokulture kažejo očiten prehod iz multifokal-nega oživčenja v mlajših do unifokalnega oživčenja v starejših kokulturah, kar je značilno tudi za oživčenje in vivo (31). Krčenje mišičnih cevčic je možno reverzibilno prekiniti z 1 mM koncentracijo d-tubukurarina, kar dokazuje, da se ne prožijo spontano, ampak prek izločanja ACh in njegove vezave na AChR (24). Oživčene mišične cevčice so v primerjavi z neoživčenimi veliko bolj diferencirane (32) in imajo jasno izraženo prečno progavost in vzpostavljen mirovni membranski potencial (33). Potek oživčenja je podoben poteku v razmerah in vivo: po dveh do treh dneh kokulture je opaziti intenzivno izrašča-nje aksonov iz eksplanta. Po 7 do 10 dneh se pojavijo že prve kontrahirajoče mišične cevčice. Po 14 do 16 dneh število kontrahirajočih vlaken naraste in se pojavi prečna progavost. Po treh tednih so krčitve neprekinjene, kon-trahirajoča vlakna pa so morfološko bistveno drugačna od nekontrahirajočih, ki začnejo propadati in odmirati (24).
Mnoga opažanja kažejo, da se razvoj človeških mišic bistveno razlikuje od razvoja glodalskih mišic. Medtem ko imajo vlakna glo-dalskih mišic tudi v kulturi brez prisotnosti živca dobro razvito bazalno lamino, prečno progavost in se spontano krčijo, človeške mišične celice v kulturah brez oživčenja ne dosežejo stopnje zrelosti, ki je potrebna za krčenje in imajo slabo razvito bazalno lamino ter prečno progavost (24, 34, 35). Očitne razlike med mišico človeka, ki za normalno diferenciacijo in razvoj nujno potrebujejo oživčenje (36), in mišicami ostalih živalskih vrst opozarjajo, da je za študij mišične ontoge-neze pri človeku treba uporabiti poskusne
modele s človeško mišico. Zgoraj opisani model je do sedaj edini, ki izpolnjuje to zahtevo.
NAMEN IN HIPOTEZA
Sporočanje prek sinaps je osnova delovanja živčevja. Molekularni mehanizmi, ki uravnavajo to sporočanje, in mehanizmi moduliranja tega sporočanja so zato ena od osrednjih tem današnjih nevrobioloških znanosti. Eden od načinov spoznavanja teh mehanizmov je tudi opazovanje dogodkov med nastajanjem sinaps. Zaradi eksperimentalne dostopnosti je predmet takih študij najpogosteje ZMS. V tej nalogi nameravamo ugotavljati izvor encima AChE v ZMS sesalca. Preverjali bomo naslednjo hipotezo: V zgodnji fazi razvoja ZMS prispeva motorični nevron vsaj del AChE, ki jo najdemo v sinaptični špranji.
OBRAZLOŽITEV
Danes še nimamo dokončnega odgovora na vprašanje, od kod izvira AChE, ki se nahaja v sinaptični špranji ZMS. Mnoge študije so pokazale, da vsaj del le-te vsekakor prispeva 245 skeletno mišično vlakno. Ze leta 1971 so Tennyson in sodelavci (14) dokazali AChE v okolici jedra, v endoplazmatskem retiku-lumu in v Golgijevem aparatu mioblastnih celic. Od takrat naprej so številni raziskovalci (13, 15, 16, 22) potrdili prisotnost AChE v mišični celici. Na modelu kokulture, pripravljene iz mišičnih celic podgane in disociiranih živcev iz piščanca, so De La Portejeva in sod-delavci (18) pokazali, da izvira AChE v takem modelu le iz mišične celice.
Po drugi strani pa obstajajo podatki, ki govorijo v prid hipotezi, da del AChE v ZMS prispeva motorični nevron. Tako vemo, da potekata sinteza asimetričnih A12-oblik AChE tudi v motoričnih nevronih in da se A12-ob-like AChE prenašajo po aksonih motoričnih nevronov (11). Edini za zdaj znani namen sinteze take »repate« asimetrične oblike AChE naj bi bil ravno v tem, da se z repom pričvrsti v bazalno lamino ZMS. Poleg tega je Anglister-jeva (23) ugotovila, da se tudi po odstranitvi mišičnega dela ZMS žabe in po inhibiciji prej prisotne AChE ta encim ponovno pokaže v bazalni lamini ZMS.
246
Z uporabo in vitro sistema, v katerem je človeška mišica oživčena s podganjim motoričnim nevronom (4, 24, 37), bomo poizkusili določiti izvor AChE. Z uporabo vrstno specifičnih protiteles proti človeški in podganji AChE bomo z imunofluorescenčno metodo ugotavljali, ali je sinaptična AChE človeškega (mišičnega) ali podganjega (živčnega) izvora.
METODE
TTetiranje živali in delo s človeškim tkivom
Studijo izvora AChE smo opravili v Laboratoriju za mišične kulture na Inštitutu za patološko fiziologijo MF v Ljubljani. Uporabili smo človeške mišične kulture, oživčene in vitro (38). Za vse poskuse, ki smo jih izvedli, so bila pridobljena mnenja ustreznih etičnih komisij (Komisija za medicinsko etiko pri Ministrstvu za zdravstvo Republike Slovenije, št. 63/01/99).
Podganje embrionalno tkivo smo izolirali iz embrijev brejih samic soja Wistar. Pri delu so bili upoštevani ustrezni predpisi, ki jih pri takem delu zahteva ustrezna zakonodaja v Sloveniji (Navodila o pogojih za izdajo dovoljenja za poskuse na živalih v znanstvenoraziskovalne namene, UL. RS št. 322-03/85-74). Posebna pozornost je bila namenjena zmanjšanju trpljenja živali. Le-te smo žrtvovali v komorah z dovajanjem CO2. Pri delu s človeškim tkivom smo upoštevali vse varnostne ukrepe, ki preprečujejo okužbe in njihovo širjenje. V opisanih poskusih smo uporabili delce človeške mišice, ki se po doktrini odstranjujejo pri nekaterih operacijah na Ortopedski kliniki KC v Ljubljani.
Priprava kultur človeških mišic in njihovo oživčenje s podganjim živcem
Kot model za študij sinaptogeneze smo uporabili modificiran model človeške mišice, oživčene in vitro (29, 36). Kulturo človeških mioblastov smo pripravili iz mišičnega tkiva bolnikov, za katere je bilo ugotovljeno, da so brez mišičnih in živčno-mišičnih degenerativnih bolezni. V naši študiji smo kot vir
satelitskih celic uporabili koščke mišice abductor hallucis, ki se po doktrini odstranijo pri operacijah ekvinovarusa. Tkivo smo pred obdelavo shranili v 15 ml rastnega medija z minimalno sestavo (MEM) (Gibco, Maryland, ZDA) z dodanim 15 % govejim serumom (FBS) (Gibco, Maryland, ZDA) (T = 4°C). Tkivo smo pred pripravo celičnih kultur očistili vezivnega in drugega tkiva in razrezali na 0,5 do 1 mm velike koščke. Koščke tkiva smo nato tripsinizirali (T = 37°C), čas tega postopka pa je bil odvisen od količine tkiva. Tripsinizirane mišične satelitske celice smo nato gojili do klonalne gostote v petrijevkah (d = 100 mm), in to v MEM z dodanim 15 % FBS in drugimi substancami, nakar smo jih prenesli v inkubator z nasičeno vlago (T = 37°C) in mešanico zraka in 5 % CO2. Po dveh do treh tednih rasti brez menjave medija in pred fuzi-jo mioblastov v mišične cevčice, smo ločili mioblastne kolonije od fibroblastnih kolonij in jih nadalje gojili v posodah za celične kulture (75 cm2). Ko je rast dosegla konfluentnost in pred zlitjem mioblastov, smo celice tripsi-nizirali in prenesli v posode (d = 35 mm) z vstavljenim krovnim stekelcem. Krovna stekelca smo pred tem prevlekli z mešanico želatine (Sigma, Missouri, ZDA) in krvne plazme v razmerju 1: 2. Mioblasti so naprej rasli v mediju F-14 (Gibco, Maryland, ZDA) z dodanim 10 % FBS, fibroblastnim rastnim dejavnikom (50ng/ml medija), epidermalnim rastnim dejavnikom (10 ng/ml medija) (oba rastna dejavnika sta bila proizvod Collaborative Research, Ohio, ZDA) in insulinom (10 |lg/ml medija) (Sigma, Missouri, ZDA). Po zlitju mioblastov v mišične cevčice smo na kulturo položili 0,5-1 mm debele segmente podganje hrbtenjače, izolirane iz embrijev (stopnja E13 do E14), z nepoškodovanimi meningami in dorzalnimi gangliji. Na vsako krovno stekelce smo prenesli 4 do 5 segmentov embrionalne hrbtenjače. Nadaljnjo diferenciacijo mioblastov smo vzpodbudili z gojenjem v mediju F-14 z dodanim 5% FBS, insulinom (10 |g/ml medija) in brez rastnih dejavnikov. Medij smo menjavali vsake 2 do 3 dni in v tem času kulture redno opazovali pod invertnim mikroskopom (Zeiss, Jena, Nemčija).
Imunocitokemi~no barvanje v kulturah ~love{kih mi{ic, oživčenih in vitro
Izbira protiteles
Uporabili smo primarna poliklonalna protitelesa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, ZDA) in monoklonalna protitelesa (Calbioc-hem, Cambridge, ZDA) proti podganji ter primarna poliklonalna protitelesa (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz ZDA) in monoklonalna protitelesa proti človeški AChE (Chemicon, Temecula, ZDA). Kot kontrolo smo uporabili poliklonalna protitelesa proti aktinu (Santa Cruz Biotechnology, ZDA). Sekundarna protitelesa (Jackson ImmunoRe-search Laboratories, West Grove, ZDA) so bila označena s fluorescein izotiocianatom (FITC) ali tetrametil rodamin izotiocianatom (TRITC).
Imunocitokemi~no barvanje AchE
Kokulture smo najprej sprali v fosfatnem pufru (PBS), segretem na 37°C, nato smo jih fiksirali s 4% paraformaldehidom (Sigma, Missouri, ZDA) v fosfatnem pufru (15 min), nakar smo jih 2-krat spirali z istim pufrom. Po spiranju smo tkivo inkubirali v fosfatnem pufru z dodanimi primarnimi protitelesi pri sobni temperaturi (razredčitev in čas inkuba-cije sta bila odvisna od vrste protitelesa in sta se gibala od 1:100 do 1:1000). Sledilo je spiranje primarnih protiteles (petkrat v fosfatnem pufru) in inkubacija z ustreznim sekundarnim protitelesom (30min). Po inkubaciji s sekundarnimi protitelesi in spiranju smo material vklopili v glicin in robove krovnega stekelca premazali z lakom.
Histokemi~no barvanje AChE
AChE v kokulturah smo prikazali s histoke-mičnim barvanjem pri sobni temperaturi s prilagojeno (39) tioholinsko metodo po Koelleju. Kokulture smo najprej fiksirali s 4 % paraformaldehidom v fosfatnem pufru (15 min), nakar smo jih 2-krat spirali z enakim pufrom. Sledila je 15-minutna predinkubaci-ja v raztopini po Koelleju brez substrata (50 nM CuSO4, 20 mM glicin, 4,8 mM KCN, pH = 7,0 (vse kemikalije Sigma, Missouri, ZDA)) in nato inkubacija, časovno odvisna od poteka barvanja, ki smo ga spremljali pod
mikroskopom, v enaki raztopini, ki smo ji dodali acetiltioholin (1 mg/ml) (Sigma, Missouri, ZDA). Barvanje smo končali z 2-kratnim spiranjem v fosfatnem pufru.
Barvanje AChR
Skupke AChR smo barvali z a-bungarotoksi-nom, označenim s flourescentnim barvilom rodamin (Molecular Probes, Oregon, ZDA). Rastnemu mediju smo dodali a-bungarotok-sin v končni koncentraciji 10-6 M in v takšnem mediju inkubirali kokulture 60 min pri 37°C. Sledilo je 3-kratno spiranje kokultur z istim medijem in 15-minutna fiksacija s 4 % paraformaldehidom (Sigma, Missouri, ZDA) v fosfatnem pufru pri 37°C.
Mikroskopiranje
Preparate, obdelane po postopkih, opisanih v prejšnjih točkah, smo fotografirali na Zeis-sovem mikroskopu Axioskop z ustreznimi filtri za UV-svetlobo. Uporabili smo povečave 200-1000-krat.
Določitev specifičnosti primarnih protiteles
Priprava vzorcev za elektroforezo
Za določitev specifičnosti primarnih protiteles smo uporabili vzorec človeškega tkiva (mišice) in vzorec podganjega tkiva (embrionalna hrbtenjača podgane, soj Wistar). Odvzeto tkivo smo očistili in s pomočjo tehtnice določili težo vzorcu, ki je bila 200 mg. Temu smo dodali 0,5 ml homogenizacijskega pufra (20 mM TRIS pH = 7,4), ki je vseboval 10% saharozo, 1 mM EDTA z dodatkom 1 % Tri-ton-X, 0,1 mM PMSF in 1,5nM Pepstatin A. Vzorec smo homogenizirali na ledu, dokler tkivo ni razpadlo v amorfen homogenat. Le-tega smo nato centrifugirali 10 minut pri 4°C in 10.000 obr./min in supernatant prenesli v novo mikrocentrifugirko. Sedimentu smo dodali 0,5 ml svežega homogenizacijskega pufra in nato vzorec ponovno homogenizira-li na ledu ter centrifugirali 10 minut pri 4°C in 10.000 obr./min. Supernatant smo prenesli k prejšnjemu. Zbranemu homogenizatu smo določili koncentracijo beljakovin (glej naslednje poglavje). Vzorec za nanos na gel
247
248
smo pripravili iz supernatanta z dodatkom denaturacijskega pufra (0,071 M TRIS pH = 6,8, 5,71% SDS, 29% glicerol, 0,14% P-merkaptoetanol), v katerega smo dodali nekaj kristalov bromfenol modrega (vse kemikalije Sigma, Missouri, ZDA) in vode. Vsak vzorec je vseboval 33 vol. % denaturacijskega pufra in 600 |g beljakovin. Vzorce smo 5 min segrevali na 100°C, nato pa shranili do uporabe na -70°C.
Določitev koncentracije beljakovin
Koncentracijo beljakovin smo določili po Lowryjevi metodi s kompletom za določevanje beljakovin (Sigma, Missouri, ZDA). Absorbcijo smo izmerili pri valovni dolžini 750 nm. Najprej smo naredili umeritveno krivuljo z vzorci znane koncentracije, nato smo izmerili absorbcijo pri našem vzorcu. Koncentracijo beljakovin v supernatantih smo določili iz umeritvene krivulje.
Elektroforetična ločitev beljakovin
Za ločitev beljakovin smo pripravili 7,5% SDS-PAGE gel, debeline 1 mm in velikosti 14 x 24 cm. Gel smo sestavili iz zbirnega in ločitvenega gela. Zbirni gel je zavzemal zgornje 4 cm, ki je enaka dvakratni dolžini višine vzorca v žepku. Preostali gel je ločitveni gel.
Priprava zbirnega in ločitvenega gela
Ločitveni gel (60 ml) smo pripravili iz 17,6 ml vode, 30 ml 0,75 M TRIS pH = 8,8, 0,3 ml 20 % SDS in 11,5 ml 40 % akrilamida (vse kemikalije Sigma, Missouri, ZDA). Kot katalizator polimerizacije smo dodali 3 | l TEMED (Sigma, Missouri, ZDA) in 0,9 ml 10 % amonijevega persulfata. Ločitveni gel smo vlili med dve čisti stekli, površino gela smo izravnali z izobuta-nolom (Sigma, Missouri, ZDA) in pustili polimerizirati eno uro pri sobni temperaturi.
Medtem smo pripravili 10 ml zbirnega gela iz 4,8 ml vode, 5 ml 0,25 M TRIS pH = 6,8, 0,05 ml 20 % SDS in 1,25 ml 40 % akrilamida. Kot katalizator polimerizacije smo tu dodali 10 |l TEMED in 0,1 ml 10% amonijevega persulfata. S sveže pripravljenim gelom smo sprali zgornji rob ločitvenega gela, nato pa natočili zbirni gel na ločitveni gel in vstavili glavnik z desetimi žepi. Po eni uri polimeri-
zacije smo glavnik previdno odstranili in žepke sprali s pufrom za elektroforezo.
Elektroforeza
Elektroforeza je potekala v pufru s sestavo: 0,025M TRIS (Sigma, Missouri, ZDA), 0,19M glicin (Sigma, Missouri, ZDA) in 0,1 % SDS. V žepke v gelu smo nanesli 100 |l vzorca, ki je vseboval 600 | g beljakovin. Ločevanje je potekalo prek noči (14 ur) pri konstantnem toku 16 mA.
Prenos beljakovin na membrano
Prenos beljakovin iz gela na PDVF membrano je potekal čez noč pri konstantni napetosti 12 V v pufru za prenos (8 mM TRIS, 64 mM glicin, 6,7% metanol, 0,1 % SDS).
Po končani elektroforezi smo gel odstranili iz steklenih plošč in ga 30 minut inkubirali v pufru za prenos. Membrano smo aktivirali s 5-minutno inkubacijo v 100 % metanolu, nato pa pustili 30 minut v pufru za prenos. Po inkubaciji membrane in gela v pufru za prenos smo sestavili sendvič in ga prenesli v posodo za prenos, ki je potekal prek noči (13 ur). Po končanem prenosu smo sendvič razstavili, membrano sprali v 1X PBS-su in posušili pri sobni temperaturi.
Detekcija AChE na membrani
Membrano smo razrezali tako, da sta bila dva pasova s humanimi in podganjimi beljakovinami skupaj. Po 60-minutni inkubaciji v blocking pufru smo membrano nadalje inkubirali 60 minut s primarnimi protitelesi proti AChE, razredčeni 1: 250 v blocking pufru.
300 ml blocking pufra smo pripravili tako, da smo zmešali 30 ml 10 x PBS, 270 ml vode in 0,9 mg I-Block (Tropix, Massachusetts, ZDA). Mešanico smo postavili vmikrovalov-no pečico za 2 minuti, nato pa segrevali in mešali na magnetnem mešalniku do popolne raztopitve I-Block. Ko se je ves I-Block raztopil, smo raztopino ohladili na sobno temperaturo in dodali 0,9 ml Tween-20.
Po 60-minutni inkubaciji s primarnimi protitelesi smo membrano spirali 3-krat po 5 minut v blocking pufru. Sledila je 60-minut-na inkubacija s sekundarnimi protitelesi, redčenimi 1: 2500 v blocking pufru, in nato spiranje (3-krat po 5 minut) v blocking pufru. Po tem spiranju smo membrano spirali še
2-krat po 5 minut v 1 x assay pufru (Tropix, Massachusetts, ZDA).
Za prepoznavo elektroforetskih pasov smo na membrano nanesli tanek sloj raztopine CDP-Star (Tropix, Massachusetts, ZDA). Po 5-minutni inkubaciji smo membrano dali v prozorno vrečko in izpostavili rentgenskemu filmu (Kodak, X-OMAT) za 20 sekund. Rentgenski film smo razvijali 3 minute v Ilford PQ Univerzal (Ilford, Mobberley, Anglija) razvijalcu, razredčenem 1:10 v vodi, za tem smo film spirali 5 minut v vodi in ga fiksirali 4 minute v Ilford Hypam (Ilford, Mobberley, Anglija) fiksativu, razredčenem 1:4 v vodi. Po končani fiksaciji smo film sprali v vodi in posušili.
REZULTATI
Nastajanje @MS med ~love{kim mišičnim vlaknom in podganjim motori~nim nevronom v pogojih in vitro
Ze en dan po vzpostavitvi kokulture eksplan-tov hrbtenjače in človeških mišičnih cevčic so pričeli iz eksplantov izraščati živci. Število teh izrastkov je naraščalo vse do 8. dne kokultu-re. Distalno od mesta izraščanja iz eksplanta
so se živci močno razvejili in ustvarili gosto mrežo. Po treh dneh kokulture so živci pripotovali v bližino diferenciraj očih mišičnih cevčic. S svojimi rastnimi stožci (angl.-franc. boutons) so vzpostavili prve stike z mišičnimi cevčicami (slika 2). Po 7 dneh v kokulturi so se pojavile prve kontrahirajoče skupine mišičnih cevčic. Število eksplantov s kontrahirajočimi mišičnimi cevčicami je naraščalo do 10. dne, medtem ko je število kontrahirajočih enot v področju teh eksplantov naraščalo vse do 17. dne in se nato ustalilo. Kokulture kontrahirajočih mišic smo ob redni menjavi medija lahko vzdrževali tri do šest mesecev. Da so krčitve res posledica živčno-mišičnega prenosa, smo dokazali z blokado vseh krčitev po enour-ni inkubaciji z 10-7 M a-bungarotoksinom.
Nastajanje in zorenje ZMS smo spremljali tudi s histokemičnim barvanjem na AChE in imunofluorescenčnim barvanjem na AChR.
Histokemično barvanje AChE s tioholin-sko metodo (glej metode) nam prikaže mesta katalitske aktivnosti AChE v tkivu in ne ločuje AChE-molekul po njihovi vrstni specifičnosti. Po 10 dneh v kokulturi je bila večina histo-kemičnega produkta AChE razporejena v difuznih lisah, razpotegnjenih po večji površini mišične cevčice, kar je značilno za zgodnje
249
Slika 2. Faznokontrastna slika 7 dni stare kokulture Človeških mišičnih cevčic, oživčenih in vitro z eksplanti podganje embrionalne hrbtenjače. Izrastkinevronov (črnepuščce) tvorijo prve stike zraz-vijajočimi se večedrnimi mišičnimi cevčicami (glave puščic). Bela puščica prikazuje mesto eksplanta in smer, od koder izraš-čajo živci. Merilo: 30p.m.
Slika 3. Svetlobnomikroskopska slika I0dni stare kokulture po barvanju na AChE shistokemično metodo po Koelleju. Vmanj zrelih cevčicah so lise AChE razpotegnjene in veče (puščce), medtem ko so lise AChE vpodroču tvorbe zrelejših stikov že ostro omejene in manjše (glave puščic). Merilo: I00p.m.

X
v

Slika 4. Svetlobnomikroskopska slika 21 dni stare kokulture. A: Po barvanju na AChE s tioholinsko metodo vidimo, da je AChE v tej fazi že skoncentrirana v ostro omejene skupke na mestih @MS (glave puščic). Ko primerjamo sliko A s sliko B, kjer so v istem mikroskopskem polju prikazani skupki AChR (glave puščic), barvanih z a-bungarotoksinom, označenim z rodaminom, ugotovimo sovpadanje obojih skupkov po njihovi lokaciji. Merilo: 100pm.
250
faze miogeneze in sinaptogeneze @MS. Na nekaterih mestih pa smo tudi v tem obdobju že našli ostro omejene skupke AChE z visoko koncentracijo encima (slika 3). Po 21 dneh je bila večina AChE aktivnosti locirana v ostro omejenih skupkih (slika 4 A), ki so značilni za zrele @MS. Skupki AChE so sovpadali s skupki AChR, ki smo jih označevali z a-bun-garotoksinom (primerjaj sliki 4 A in B).
Preverjanje vrstne specifičnosti protiteles
Po elektroforetičnem ločevanju beljakovin v vzorcih glede na njihovo molekulsko maso smo z ustreznimi protitelesi preverjali njihovo vrstno specifičnost glede vezave na AChE (slika 5).
Slika 5. Specifičnost primarnih protiteles. Po elektroforezi smo ločene beljakovine prenesli na PDVF-membrano in le-to nato barvali s primarnimi protitelesi proti humani oz. podganji AChE. Pred tem smo membrano razrezali na dva dela, tako da smo na vsakem delu imeli po en vzorec s človeškimi in po en vzorec s podganjimi beljakovinami. Levi del membrane smo barvali s protitelesi proti humani, desni del pa s protitelesi proti podganji AChE. Kot človeško tkivo smo uporabili koščke človeške mišice, kot podganje tkivo pa hrbtenjačo podgane. Molekulska teža 71 kDa ustreza molekulski teži katalitske podenote AChE. Pasove smo prikazali s CDP-Star reagentom.
Slika 6. Specifičnost primarnih protiteles-kontrola. Postopek je bil tak, kot smo ga opisali pri sliki 5, le da membrane nismo rezali. Uporabili smo protitelesa proti različnim izooblikam aktina.
Na delu membrane, ki smo jo izpostavili protitelesom proti človeški AChE, smo dobili signal izključno v koloni, v kateri je bil nanesen beljakovinski vzorec, pripravljen iz vzorcev človeške skeletne mišice (slika 5, levi del). Molekulsko maso beljakovin v pasu smo, glede na ustrezen označevalec, ocenili na 71 kDa, kar ustreza katalitski podenoti AChE. V koloni, v kateri je bil nanesen beljakovinski vzorec, pripravljen iz podganje hrbtenjače, po barvanju s temi protitelesi nismo dobili nobenega signala, ki bi kazal na vezavo protiteles, kar pomeni, da je bila vezava protiteles proti človeški AChE vrstno specifična.
Na delu membrane, ki smo jo barvali s protitelesi proti podganji AChE (slika 5, desni del), smo dobili dobro viden signal le v koloni, kjer je bil nanesen vzorec beljakovin, pripravljen iz podganje hrbtenjače, kar dokazuje, da so bila tudi protitelesa proti podganji AChE vrstno specifična. Tudi v tem primeru je molekulska masa (okoli 71 kDa) ustrezala katalitski podenoti AChE.
V kontrolnem poskusu, v katerem smo preverjali postopek glede prenosa beljakovin na membrano in ustreznost zaznavanja prenesenih beljakovin, smo uporabili protitelesa proti izooblikam aktina, ki niso vrstno specifična. Velikost aktinske molekule je približno 43 kDa. Ugotovili smo, da so bili vsi postopki: izolacija beljakovin, prenos na membrano in zaznava uspešni, saj smo dobili pozitiven
pas velikosti 43 kDa tako pri vzorcu s človeškimi kot tudi pri vzorcu s podganjimi beljakovinami (slika 6).
Nespecifično vezavo sekundarnih protiteles smo testirali z barvanjem kokultur samo s sekundarnimi protitelesi. S flourescenčno mikroskopijo smo nato pregledali takšne kokulture in ugotovili, da je bilo nespecifične vezave sorazmerno malo.
Izvor sinapticne AChE v ŽMS
Imunofluorescenčno barvanje človeške in podganje AChE smo v začetnih poskusih izvajali na mlajših kokulturah, starih od 10 do 14 dni, in nato še v starejših kokulturah, starih 4 tedne ali več. Ker je bilo v večini primerov barvanje na AChE v mlajših kokulturah šibko in razpršeno, smo v nadaljnjih poskusih uporabili le starejše, vsaj 4 tedne stare kokulture s kontrahirajočimi mišičnimi cevčicami. V teh kokulturah so bili @MS bolj diferencirani (slika 4 A), zato je bilo pričakovati tudi višje koncentracije AChE v njihovih področjih. Zrele in dobro diferencirane kokulture so nam omogočile tudi boljše morfološko razpoznavanje poteka izrastkov nevronov in mesta stikov le-teh z mišičnimi cevčicami (slika 7 C). Na ta način smo laže določili mesta ZMS, po krčitvah pa smo lahko ugotavljali, ali so stiki v teh področjih že dosegli stopnjo funkcionalne zrelosti. @MS smo označili z a-bungarotok-sinom, označenim z rodaminom.
Po imunofluorescentnem barvanju 4 tedne starih kokultur na človeško AChE smo ugotovili mešano populacijo opazovanih ZMS. Na velikem številu stikov med izrašča-jočimi nevroni in mišičnimi cevčicami je bilo barvanje na AChR še šibko in difuzno, kar je kazalo na sorazmerno nezrelost ZMS na teh mestih. V takih stikih ponavadi nismo zasledili pozitivnega barvanja na človeško AChE.
Del stikov med izrastki nevronov in mišičnimi vlakni je bil bolje diferenciran. Na teh mestih smo po barvanju na AChR že našli ostro omejene lise obarvanja (slika 7 B), značilne za zrelejše ZMS. V takih primerih smo na istih mestih ugotovili tudi dokaj intenzivno barvanje s protitelesi proti človeški AChE (slika 7 A). Glede na tkivno specifičnost teh protiteles, preizkušeno z metodo Western blot, smo lahko sklepali, da je ta del ploščič-ne AChE mišičnega izvora.
251
A

252
C

a
Slika 7. Imunocitokemija @MS sprotitelesiproti človeški AChE-1. A: Barvanje AChE s protitelesi proti človeški AChE. B: Barvanje AChR za-bungarotoksinom, označenim zrodaminom. C: Fazno-kontrastna slika istega mikroskopskega polja: puščica prikazuje mišično cevčico, črtkana puščica pa živec. Mesto @MS je označeno s puščično glavo. Merilo je 100 pm.
Da bi ugotovili, ali del ploščične AChE vendarle prispeva tudi motorični nevron, smo skupino kokultur iz iste serije poskusov barvali tudi s protitelesi proti podganji AChE, in sicer po enakem postopku. Tudi tu smo na prej opisani način določili mesta ZMS in nato ugotavljali kolokalizacijo med temi mesti in skupki AChR, barvanimi z a-bungarotok-sinom (slika 6 B in C). S podganjimi protitelesi proti AChE smo na teh mestih v nekaterih primerih prav tako ugotovili lokalizacijo AChE, vendar je bilo to barvanje za razliko od barvanja s človeškimi protitelesi proti AChE slabše omejeno in šibkejše (slika 6 A).
Kvantitativno določevanje kolokalizacije AChR in AChE smo izvedli v šestih 4 tedne starih različnih kokulturah. Vse kokulture smo obarvali z a-bungarotoksinom. V treh kokul-turah smo barvali s protitelesi proti človeški
AChE, v treh pa s protitelesi proti podganji AChE. V vsaki od treh kokultur, barvanih s protitelesi proti človeški AChE smo izbrali 20 mest, ki so po merilih faznokontrastne mikroskopije in glede na barvanje z a-bunga-rotoksinom ustrezala ZMS. Od 20 takšnih mest je bilo 12,3 ± 2,1 (n = 3) ali 62 % pozitivnih na barvanje s protitelesi proti človeški in torej mišični AChE. Enako smo naredili s kokulturami, barvanimi s protitelesi proti podganji AChE, kjer smo ugotovili pozitivno obarvanost na podganjo, torej živčno AChE v 6,3 ±1,5 (n = 3) @MS oz. 32 % primerov.
RAZPRAVLJANJE
Naši rezultati kažejo, da vsaj v zgodnji fazi razvoja ZMS del sinaptične AChE prispeva tudi živec. Ta ugotovitev bi lahko pojasnila poro-
Slika 8. Imunocitokemija @MS sprotitelesi proti podganji AChE-2. A: barvanje AChE s protitelesi proti podganji AChE. B: Barvanje
AChR z a-bungarotoksinom, označenim z rodaminom. C: Fazno- _
kontrastna slika istega predela: puščični glavi prikazujeta mesto 253 @MS, puščica pa mišično vlakno, ki je na tej sliki nekoliko izven fokalne ravnine. Črtkani puščici prikazujeta živec. Merilo je 100pm.
čila drugih avtorjev, ki so ugotovili, da se v motoričnih nevronih sintetizira AChE (40) in da se nato prenašajo po aksonih asimetrične, repate oblike A12 AChE (11). Po sedaj veljavnih razlagah naj bi bil namreč namen posttranslacijske vezave katalitskih podenot AChE na strukturno podenoto (rep) v tem, da omogoči vezavo AChE na specializirano bazalno lamino vpodročju ZMS (41). Avtorji, ki zagovarjajo mišični izvor AChE v bazalni lamini @MS, poudarjajo sintezo A12-oblik AChE v mišičnih vlaknih in kopičenje teh oblik na mestih, kjer živec sploh ni prisoten, ne ponujajo pa ustrezne razlage za potovanje A12-oblik po aksonih motoričnih nevronov (za pregled glej 1). Pri tem je treba posebej omeniti, da je sinteza A12-oblike AChE pravzaprav posebnost motoričnih nevronov, saj v ostalih predelih osrednjega živčevja prevladuje globularna G4-oblika, ki je s posebnim lipidnim repom pričvrščena v celično membrano nevronov (za pregled glej 42).
Delež AChE v ZMS, ki ga prispeva motorični nevron, je najverjetneje vezan na bazalno lamino v ZMS, kjer se nahaja večina AChE v tej sinapsi. Glede na uporabljen pristop pa ne moremo izključiti možnosti, da je del te AChE v obliki G4 vezan na presinaptično membrano. Tudi v tem primeru pa bi bila to AChE, ki bi po svoji lokaciji lahko sodelovala pri signaliziranju prek ZMS na enak način kot AChE, vezana na bazalno lamino. Malo verjetna pa je možnost, da smo v naših poskusih ugotavljali AChE znotraj živčnega končiča, saj protitelesa v naših pogojih ne prestopajo celičnih membran.
Med sicer redke zagovornike razlage, da vsaj del AChE v bazalni lamini ZMS izvira iz živčnega končiča, sodi Anglisterjeva. V svojih študijah izvora AChE v @MS je Anglisterjeva (23) uporabila model in vivo. V odrasli žabi je s prerezanjem in radioaktivnim obsevanjem uničila mišična vlakna, tako da sta po operaciji
254
v področju ŽMS ostala nepoškodovana bazalna lamina in končič motoričnega nevrona. Prej prisotno AChE v ŽMS je zavrla z organo-fosfatnim inhibitorjem. Ugotovila je, da je po enem mesecu v bazalni lamini s pripadajočim motoričnim nevronom prišlo do ponovne histokemično ugotovljive aktivnosti AChE na mestih prvotnih ŽMS. Te ugotovitve je strnila v sklep, da vsaj del AChE izvira iz motoričnega nevrona. Kritiki njenih rezultatov so poudarjali možnost spontane reaktivacije z organofosfatnim inhibitorjem zavrte AChE in možnost, da je AChE nastala drugje v organizmu in nato pripotovala do bazalne lamine in se vanjo »ujela«. Prav tako ni jasno, do kakšne mere je bazalna lamina po opisanem posegu še morfološko in funkcionalno podobna nepoškodovani bazalni lamini ŽMS.
Zaradi podobnosti v eksperimentalnem pristopu je treba posebej omeniti, da se naši rezultati ne ujemajo s poročili De La Porteje-ve in sodelavcev (18). Ti avtorji so na podlagi podobno zasnovanih poskusov kot v naši študiji ugotovili, da je AChE, vezana v bazalno membrano sinaptične špranje ŽMS, izključno mišičnega izvora. Razlago za to neujemanje vidimo v neustreznosti poizkusnega modela, ki so ga l. 1986 uporabili De LaPortejeva in sodelavci (18) v svojih študijah.
Omenjeni avtorji so uporabili kokulturo disociiranih nevronov iz piščančje hrbtenjače in podganjih mišičnih vlaken. Z uporabo vrstno specifičnih protiteles proti piščančji in podganji AChE so na tem modelu ugotovili, da je edini vir AChE skeletnomišično vlakno. Vrsta razlogov narekuje previdnost pri interpretaciji takih rezultatov, še posebej zaradi uporabe disociiranih nevronov za oživčenje mišičnih vlaken. V taki obliki so motorični nevroni kratkoživi in slabo diferencirani, zato so taki tudi ŽMS, ki jih ti motorični nevroni tvorijo. V kokulturah disociiranih nevronov piščančje (43) ali mišje (44) hrbtenjače in mišičnega vlakna podgane sicer pride do nastanka stikov med nevroni in mišičnimi cevčicami, vendar se ti stiki ne razvijejo do morfološko in funkcionalno zrelih ŽMS (44, 45). Disociirani mišji motorični nevroni v kokultu-ri z mišičnimi vlakni sicer preživijo dlje, kot če so v kulturah sami, vendar pričnejo kazati znake degeneracije že po tednu dni in propadejo po 14 dneh kokulture (44), ta čas pa je
prekratek za razvoj ŽMS do tiste stopnje, v kateri po naših izkušnjah pride do visoke koncentracije AChE v področju ŽMS (44, 46). V sinaptogenezi in v odraslem ŽMS so za tvorbo in organizacijo ter vzdrževanje strukture zrelega ŽMS potrebne interakcije ne le med motoričnimi nevroni in mišičnimi vlakni, ampak tudi drugimi celicami, kot so celice gliae (47). Vseh teh celic v poskusnem modelu, ki so ga uporabili De La Portejeva in sodelavci (18), ni bilo, kar je ob pomanjkanju descendentnih in večine aferentnih signalov verjetno glavni razlog za kratkoživost kokul-tur z disociiranimi nevroni.
V naših poskusih je bil uporabljen model kokultur podganjega eksplanta hrbtenjače s človeškimi mišičnimi celicami, ki ima vsaj dve bistveni prednosti pred zgoraj omenjenim modelom, ki so ga uporabili De la Portejeva in sodelavci (18). V kokulturah podganjega eksplanta embrionalne hrbtenjače s humanimi mišičnimi celicami se po oživčenju razvijejo mišične cevčice, ki so morfološko in funkcionalno visoko diferencirane in podobne mišičnim vlaknom in vivo, njihova doba preživetja pa je lahko tudi do 6 mesecev (24, 31). Elektronska mikroskopija je pokazala, da so takšne mišične cevčice prečnoprogaste, da imajo dobro razvito bazalno lamino in trans-verzne (T)-tubule (24). ŽMS je v takšnih pogojih po razvitosti in stopnji zrelosti zelo podoben ŽMS in vivo (24). Poudariti je treba, da so v teh kulturah prisotne tudi glialne celice, med katerimi naj bi pri uravnavanju AChE v ŽMS bile še posebno pomembne Schwan-nove celice. Časovni potek diferenciacije in kodiferenciacije živčnih in glialnih celic je vteh kokulturah podoben kot v razmerah in vivo (37), kar močno podpira razlago, da so za visoko stopnjo diferenciranosti v naših kokulturah zaslužne medcelične interakcije, ki jih v kokulturah z disociiranimi nevroni ni. K prednosti našega modela pred modelom, ki so ga uporabili omenjeni avtorji, bi lahko prišteli tudi visoko vrstno specifičnost protiteles, ki smo jo lahko ugotovili z metodo Western blot.
Ker je bil v naših kvantitativnih analizah fluorescenčni signal za AChE, ki izvira iz mišičnih vlaken, pogosteje prisoten kot signal AChE, ki izvira iz končiča motoričnega nevrona, sklepamo, da je prispevek mišičnega vlakna pri sinaptični AChE v ŽMS večji od
prispevka motoričnega nevrona. Odsotnost imunocitokemičnega barvanja na AChE v večjem številu ZMS si razlagamo s prenizko koncentracijo AChE v tej fazi razvoja ZMS oz. premajhno občutljivostjo naše imunocito-kemične metode, da bi te majhne količine AChE zaznala. Biološki pomen dvojnega izvora AChE v sinaptični špranji bi lahko bil zaščita ZMS pred pomanjkanjem tega pomembnega encima in njegove vloge pri prenosu signala. Količina funkcionalne AChE v ZMS je v tem primeru pogojena s sintezo in prenosom v obeh celicah, kar v primeru okvare sintet-skega mehanizma v eni celici zagotavlja normalen prenos signala s pomočjo AChE druge celice. Prav tako ne gre zanemariti novejših raziskav, ki ugotavljajo vpliv AChE na razvoj ZMS. AChE lahko igra vlogo enega izmed organizatorjev zapletene zgradbe @MS (48).
Na koncu je treba tudi poudariti, da so naše študije zajele le določeno časovno obdobje nastajanja ZMS in da se prispevki mišice in živca skozi posamezna obdobja lahko spreminjajo. Za celovitejši odgovor o izvoru AChE v ZMS bi bile tako potrebne dodatne študije.
ZAKLJUČKI
1. V zgodnji fazi razvoja @MS, ki v pogojih in vitro nastanejo v ko kulturi človeških mišičnih vlaken in eksplantov podganje embrionalne hrbtenjače, večji delež AChE prispeva mišično vlakno, manjši delež pa prispeva motorični nevron.
2.	Delež AChE, ki ga v ZMS prispeva motorični nevron, je najverjetneje vezan na specializirano bazalno lamino te sinapse, kjer se nahaja večina sinaptične AChE. Glede na uporabljeni eksperimentalni pristop pa ne moremo izključiti možnosti, da je del te AChE v kaki drugi obliki, najverjetneje G4, vezan na presinaptično membrano. Malo verjetna pa je možnost, da smo v naših poskusih ugotavljali AChE znotraj živčnega končiča, saj protitelesa v naših pogojih ne prestopajo celičnih membran.
3.	Kokulture človeških mišičnih vlaken in eks-plantov podganje embrionalne hrbtenjače so primeren model za študij molekularnih mehanizmov nastajanja sesalskega ZMS, v primeru človeške mišice pa je to tudi edini možen model za študij nastajanja ZMS.
ZAHVALA
Mentorju prof. dr. Zoranu Grubiču se iskreno zahvaljujeva za ves trud, ideje in strokovno vodenje.
Da so bile ure v laboratoriju krajše, delo bolj zanimivo in predvsem uspešno, gre zahvala Zvonki in Katarini.
255
LITERATURA
1.	Massoulie J, Pezzementi L, Bon S, Krejci E, Vallette F-M. Molecular and cellular biology of cholinesterase. Prog Neurobiol 1993; 41: 31-91.
2.	Ben Aziz-Aloya R, Seidman S, Timberg, R, Sternfeld M, Zakut H, Soreq H. Expression of a human acetylcholinesterase promoter-reporter construct in developing neuromuscular junctions of Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 2471-75.
3.	Cousin X, Bon S, Massoulie J, Bon C. Identification of a novel type of altenatively spliced exon from acetylcho-linestrase gene of Bungarus fasciatus. Molecular forms of acetylcholinesterase in the snake liver and muscle. J Biol Chem 1998; 273: 9812-20.
4.	Grubic Z, Komel R, Walker WF, Miranda AF. Myoblast fusion and innervation with rat motor nerve alter distribution of acetylcholinesterase and its mRNA in culture of human muscle. Neuron 1995; 14: 317-27.
5.	Moscoso LM, Chu GC, Gautam M, Noakes PG, Merlie JP, Sanes JR. Synapse-associated expression of an acetylcholine receptor-inducing protein, ARIA/heregulin, and its putative receptors, ErbB2 and ErbB3, in developing mammalian muscle. Dev Biol 1995; 172: 158-69.
6.	Jasmin BJ, Lee RK, Rotundo RL. Compartimentization of acetylcholinesterase mRNA and enzyme at the vertebrate neuromuscular junction. Neuron 1993; 11: 467-77.
7.	Michel RN, Vu CQ, Tetzlaff W, Jasmin BJ. Neural regulation of acetylcholinesterase mRNA at mammalian neuromuscular synapses. J Cell Biol 1994; 127: 1061-69.
256
8.	Tsim KWK, Greenberg I, Rimer M in Randall WR. Transcripts for the acetylcholine receptor and acetylcholinesterase show distribution differences in cultured chick muscle cells. J Cell Biol 1992; 118: 1201-12.
9.	Rossi SG in Rotundo RL. Cell surface acetylcholinesterase molecules on multinucleated myotubes are clustered over the nucleus of origin. J Cell Biol 1992; 119: 1657-67.
10.	Silver A. The biology of cholinesterasese. V: Neuberger A in Tatum ET. urd. Frontiers of biology, Oxford: North-Holland Publishing Company; 1974. p. 36.
11.	Couraud JY, Di Giamberardino L, Hassig R, Mira JC. Axonal transport of the molecular forms of acetylcholinesterase in developing and regenerating peripheral nerve. Exp Neurol 1983; 80: 94-110.
12.	Miš K. Izražanje acetilholinesteraze v hrbtenjači podgane. [Magistrsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 2001.
13.	Grubic Z, Miranda MF. Developmental expression of acetylcholinesterase in skeletal muscle. V: Quinn DM, urd. Enzymes of the Cholinesterase family. New York: Plenum Press; 1995. pp. 37-43.
14.	Tennyson VM, Brzin M, Slotwiner P. The appearance of acetylcholinesterase in the myotome of the embryonic rabbit. An electron microscope cytochemical and biochemical study. J Cell Biol 1971; 51: 703-21.
15.	Tennyson VM, Brzin M, Kremzner LT. Acetylcholinesterase activity in the myotube and muscle satellite cell of the fetal rabbit. An electron microscopic-cytochemical and biochemical study. JHistochem Cytochem. 1973;21: 634-52.
16.	Rieger F, Koenig J, Vigny M. Spontaneous contractile activity and the presence of the 16 S form of acetylcholinesterase in rat muscle cells in culture: reversible suppressive action of tetrodotoxin. DevBiol 1980; 76: 358-65.
17.	Fuentes ME, Taylor P. Control of acetylcholinesterase gene expression during myogenesis. Neuron 1993; 10: 679-87.
18.	De La Porte S, Vallette FM, Grassi J, Vigny M, Koenig J. Presynaptic or postsynaptic origin of acetylcholinesterase at neuromuscular junctions? An immunological study in heterologous nerve-muscle cultures. Dev Biol 1986; 116: 69-77.
19.	Guth L, Zalewski A. Disposition of cholinesterase following implantations of nerve into innervated and dener-vated muscle. Exp Neurol 1963; 7: 316-26.
20.	Weinberg CB, Hall ZW. Junctional form of acetylcholinesterase restored at nerve-free endplates. Dev Biol 1979; 68: 631-35.
21.	Lomo T, Massoulie J, Vigny M. Stimulation of denervated rat soleus muscle with fast and slow activity patterns induces different expression of acetylcholinesterase molecular forms. J Neurosci 1985; 5: 1180-87.
22.	Rotundo RL, Rossi SG, Peng HB. Targeting acetylcholinesterase molecules to the neuromuscular synapse. J Physiol Paris. 1998; 92: 195-98.
23.	Anglister L. Acetylcholinesterase from the motor nerve terminal accumulates on the synaptic basal lamina of the myofiber. J Cell Biol 1991; 115: 755-64.
24.	Askanas V, Kwan H, Alvarez R, Engel King W, Kobayashi T, Martinuzzi A, Hawkins E. De novo neuromuscular junction formation on human muscle fibres cultured in monolayer and innervated by foetal rat spinal cord: ultrastructural and ultrastructural-cytochemical studies. JNeurocytol 1987; 16: 523-37.
25.	Miranda AF. Disease muscle in tissue culture. V: Engel AG, Franzini-Armstrong C. urd. Myology. 2. izd. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 1046-71.
26.	Martin Schmidt-Achert K, Askanas V, Engel WK. Thyrotropin-releasing hormone enhances choline acetyltrans-ferase and creatine kinase in cultured spinal cord ventral horn neurons. JNeurochem 1984; 43: 586-89.
27.	Crain SM, Alfei L, Peterson ER. Neuromuscular transmission in culture of adult human and rodent skeletal muscle after innervation in vitro by fetal rodent spinal cord. JNeurobiol 1970; 1: 471-89.
28.	Miranda AF, Mongini T, DiMauro S. Human myopathies in muscle culture: morphological, cytochemical and biochemical studies. Adv Cell Culture 1985; 4: 1-39.
29.	Bischoff R. The satellite cell and muscle regeneration. V: Engel AG, Franzini-Armstrong C. urd. Myology. 2. izd. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 97-118.
30.	Tanji K, Sancho S, Miranda AF. Innervation of MyoD-converted human amniocytes and fibroblast by fetal rodent spinal cord neurons. Neuromuscul Disord 1994; 4: 317-24.
31.	Kobayashi T, Askanas V. Acetylcholine receptors and acetylcholinesterase accumulate at the nerve-muscle contacts of the de novo grown human monolayer muscle co-culture with fetal rat spinal cord. Exp Neurol 1985; 88: 327-35.
32.	Vita G, Askanas V, Martinuzzi A, Engel WK. Histoenzymatic profile of human muscle cultured in monolayer and innervated de novo by foetal rat spinal cord. Muscle Nerve 1988; 11: 1-9.
33.	Saito K, Kobayashi T, Askanas V, Engel WK, Ishikawa K. Electrical parameters of human muscle cultured in monolayer aneurally and innervated by rat spinal cord. Muscle Nerve 1986; Suppl. 5: 162.
34.	Miranda AF, Babiss LE, Fisher PB. Measurement of the effect of interferons on cellular differentiation in human muscle cell. Methods Enzymol 1986; 119: 619-26.
35.	Miranda AF, Peterson ER, Musorovsky EB. Differential expression of creatine kinase and phosphoglycerate muta-se during development in aneural and innervated human muscle culture. Tissue Cell 1988; 20: 179-91.
36.	Grinnell AD. Trophic interaction between nerve and muscle. V: Engel AG, Franzini-Armstrong C., eds. Myology. 2nd ed. New York: McGraw Hill; 1994. pp. 359-91.
37.	Marš T, YU K, Tang X, Miranda AF, Grubič Z, Cambi F, King MP. Differentiation of glial cells and motor neurons during the formation of neuromuscular junctions in cocultures of rat spinal cord explant and human muscle. J Comp Neuro 2001; 438: 239-51.
38.	Marš T. Človeška mišica oživčena in vitro - model za študij sinaptogeneze živčno-mišičnega stika. [Magistrsko delo]. Ljubljana: Univerza v Ljubljani; 1999.
39.	Brzin M, Pucihar S. Iodide, thiocyanate and cyanide ions as capturing reagents in one-step copper-thiocholine method for cytochemical localization of cholinesterase activity. Histochemistry 1978; 56: 213-20.
40.	Andres C, Beeri R, Friedman A, Lev-Lehman E, Henis S, Timberg R, Shani M, Soreq H. Acetylcholinesterase-transgenic mice display embryonic modulations in spinal cord choline acetyltransferase and neurexin Iß gene expression followed by late-onset neuromotor deterioration. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 8173-78.
41.	Rotundo RL, Rossi SG, Anglister L. Transplantation of quail collagen-tailed acetylcholinesterase molecules onto the frog neuromuscular synapse. J Cell Biol 1997; 136: 367-74.
42.	Fernandez HL, Moreno RD, Inestrosa NC. Tetrameric (G4) acetylcholinesterase: structure, localization, and physiological regulation. JNeurochem 1996; 66: 1335-46.
43.	Berg DK, Fischbach GD. Enrichment of spinal cord cell cultures with motoneurons. J Cell Biol 1978; 77: 83-98.
44.	Lupa MT, Gordon H, Hall ZW. A specific effect of muscle cells on the distribution of presynaptic proteins in neurites and its absence in a C2 muscle cell variant. Dev Biol (Orlando) 1990; 142: 31-43.
45.	Fischbach GD, Berg DK, Cohen SA, Frank E. Enrichment of nerve-muscle synapses in spinal cord-muscle cultures and identification of relative peaks of ACh sensitivity at sites of transmitter release. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1976; 40: 347-57.
46.	O'Brien RJ, Fischbach GD. Isolation of embryonic chick motoneurons and their survival in vitro. J Neurosci 1986; 6: 3265-74.
47.	Chapron J, De La Porte S, Delepine L, Koenig J. () Schwann cells modify expression of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase at rat neuromuscular junctions. Eur J Neurosci 1997; 9: 260-70.
48.	Sternfeld M, Ming G, Song H, Sela K, Timberg R, Poo M, Soreq H. Acetylcholinesterase enhances neurite growth and synapse development through alternative contributions of its hydrolytic capacity, core protein, and variable C termini. J Neurosci 1998; 18: 1240-49.
Prispelo 31. 7. 2002
257