Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2, 69–83. Agris category codes: / COBISS Code 1.02 GENETSKI NADZOR INBRIDIRANIH LINIJ Martina PERŠE a) , Simon HORVAT b) in Damjana ROZMAN c) a) Univ. v Ljubljani, Medicinska fak., Inštitut za patologijo, Medicinski eksperimentalni center, Zaloška 4, SI-1000 Ljubljana, Slovenija, e-pošta:martina.perse@mf.uni-lj.si. b) Univ. v Ljubljani, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, prof.dr., e-pošta: simon.horvat@bfro.uni-lj.si. c) Univ. v Ljubljani, Medicinska fak., Inštitut za biokemijo, Center za funkcijsko genomiko, Zaloška 4, SI-1000 Ljubljana, Slovenija, prof.dr., e-pošta: damjana.rozman@mf.uni-lj.si. Delo je prispelo 02. februarja 2007, sprejeto 26. oktobra 2007. Received February 02, 2007, accepted October 26, 2007. IZVLE ČEK Z razvojem molekularne genetike so postale inbridirane linije u činkovito in nepogrešljivo orodje v biomedicinskih raziskavah. Njihova uporabnost sega od raziskovanja osnovnih mehanizmov delovanja genov in genskega uravnavanja do razvoja modelov za človeške bolezni, ki so nepogrešljivi pri raziskovanju patofizioloških, biokemi čnih in molekularnih mehanizmov nastanka in razvoja bolezni kot tudi pri razvijanju novih terapevtskih sredstev. Zato je povsem razumljivo, da so zahteve po uniformnih in avtenti čnih živalih znotraj genetsko standardiziranih linij upravi čene in s stališ ča verodostojnosti rezultatov nujne. Namen prispevka je opozoriti na potencialne vire genetskega razhajanja med linijami in predstaviti metode, ki se lahko uporabljajo pri genetskem nadzoru glodalcev (predvsem laboratorijskih miši in podgan) tako v vzrejnih kot poskusnih enotah. Klju čne besede: molekularna genetika / biomedicinske raziskave / inbridirane linije / genetska razhajanja / genetska variabilnost / genetski nadzor / genetski ozna čevalci / genetski polimorfizmi / laboratorijske miši / laboratorijske podgane GENETIC MONITORING OF INBRED STRAINS ABSTRACT With the advent of molecular genetics, inbred strains became one of the most powerful tools in biomedical research. Their applications are numerous and range from investigating basic mechanisms of genes and gene regulation to the generation of models of human diseases, which can be used for pathophysiological, biochemical, molecular and therapeutic studies. Therefore, the need for uniform and authentic animals within the genetically standardized strains is understandable and from the perspective of validity of results also necessary. The purpose of this article is to outline the potential sources of genetic variation of rodent (mainly mouse and rat) colonies and to describe the methods used to monitor or control this variation. These methodologies may be applied in both breeding centres and individual research laboratories. Key words: molecular genetics / biomedical research / inbred strains / genetic drift / genetic variability /genetic monitoring / genetic markers / genetic polymorphisms / laboratory mice / laboratory rats UVOD V osemdesetih letih prejšnjega stoletja je veliko raziskovalcev poro čalo o genetskem razhajanju (angl. genetic variability; genetic drift) znotraj inbridiranih linij oziroma podlinij http://aas.bf.uni-lj.si Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 70 podgan in miši med razli čnimi komercialnimi rejami ali celo znotraj posamezne reje. Eden takih primerov je bila WKY inbridirana linija podgan, ki so jo raziskovalci uporabljali pri študijah povišanega krvnega tlaka in se pri tem soo čali z nasprotujo čimi si rezultati (Kurtz in sod., 1989). Genetske razlike so odkrili tudi pri podlinijah, ki izvirajo iz linije 129/SvJ, ki je služila kot vir pluripotentnih embrionalnih mati čnih celic za razvoj miši s ciljno mutacijo (Threadgill in sod., 1997). Prav tako je prišlo do genetskega razhajanja pri kongenih linijah na C57BL/6 in DBA ozadju (Lovell in sod., 1984). Protislovne rezultate so dobili tudi raziskovalci zaradi neupoštevanja genetskih razlik med podlinijami C57BL/6 linije (Wotjak, 2003; Specht in Shoepfer, 2001). Predvideva pa se, da obstaja še veliko ve č primerov, kjer je genetsko razhajanje znotraj genetsko standardiziranih linij povzro čilo protislovne rezultate in so zato le-ti ostali neobjavljeni. Opisani primeri po eni strani pri čajo, da znotraj izogenih linij prihaja do genetskih razhajanj, kar ima lahko negativne u činke pri vrednotenju raziskovalnih podatkov. Uporaba linij oziroma podlinij, ki niso genetsko definirane lahko vodi do nezanesljivih, celo neuporabnih rezultatov, in je pogosto vzrok za neponovljivost poskusov znotraj ali med institucijami. Po drugi strani pa ti isti primeri povdarjajo pomembnost uspešne genetske kontrole pri zagotavljanju uniformnosti in avtenti čnosti genetsko standardiziranih linij. V prispevku smo se osredoto čili na genetski nadzor inbridiranih linij, ki so med genetsko standardiziranimi linijami pri znanstvenoraziskovalnem delu zastopane že od samega za četka genetskih raziskav na sesalcih. Zato ne presene ča dejstvo, da so se metode dokazovanja genetske istovetnosti razvijale v odvisnosti od zahtev uporabe inbridiranih linij (Silver, 1995). Danes so inbridirane linije med najpogosteje uporabljenimi linijami tako v imunoloških, onkoloških kot tudi v genetskih raziskavah, kjer služijo kot izvorne linije za razvoj drugih genetsko standardiziranih linij kot so koizogene, rekombinantne, kongene ter mutirane. Zato se opisane metode lahko smiselno uporabljajo pri genetskem nadzoru vseh naštetih linij. INBRIDIRANE LINIJE IN PODLINIJE Izraz inbridirana linija opredeljuje homozigotne osebke, ki so parjeni v ožjem sorodstvu in so zaradi tega genetsko identi čni z izjemo razlik med spoloma (Lo čniškar, 1999). Inbridirana linija nastane po vsaj 20 zaporednih generacijah inbridinga (brat x sestra; izjemoma starši x potomci) iz enega izvornega para (International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice and Rat Genome and Nomenclature Committee, 2005). Izogenost, homozigotnost in dolgoro čna genetska stabilnost omogo čata vzrejo in uporabo inbridiranih linij širom po svetu, neodvisno od kraja in časa. Znotraj inbridiranih linij naj bi bila genetska variabilnost minimalna, zaradi česar je tudi fenotipska variabilnost za ve čino lastnosti bistveno manjša kot pri genetsko variabilnih osebkih, še posebno za lastnosti, ki so zna čilne za posamezno linijo (Festing, 1999). Zato lahko govorimo o za linijo zna čilnem fenotipu (poznana življenjska doba ter glavne patološke, imunološke, fiziološke, vedenjske in biokemi čne značilnosti posamezne linije). Posamezna linija je ozna čena s kodo, ki omogoča njeno razpoznavnost širom po svetu (za podrobnejšo razlago glej (Perše in Rozman, 2006)). Kljub vsem naštetim lastnostim prihaja med osebki znotraj inbridirane linije do genetskega razhajanja, ki ima lahko za posledico nastanek novih linij oziroma podlinij. Zato so nastala jasna pravila, ki dolo čajo, kdaj lahko govorimo o linijah oziroma podlinijah (Festing in sod., 1999a). Če namre č lo čeno vzrejamo živali iste linije med F 20 in F 40 oziroma katerokoli standardno inbridirano linijo za ve č kot 20 generacij govorimo o podliniji. V prvem primeru je v genomu inbridiranih linij še dovolj heterozigotnih lokusov, da lahko z nadaljnim inbridingom botrujejo nastanku genetsko razli čnih osebkov, v drugem primeru pa je zelo verjetno, da bo prišlo do genetske raznolikosti zaradi novih spontanih mutacij, ki se bodo fiksirale. Ne glede na prejšnji Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 71 dve pravili, pa govorimo o nastanku podlinije vedno, kadar se odkrije genetske razlike med živalmi znotraj linije (International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice and Rat Genome and Nomenclature Committee, 2005). GENETSKA RAZHAJANJA ZNOTRAJ INBRIDIRANIH LINIJ Dejavniki, ki lahko vodijo do genetskih razhajanj so rezidualna heterozigotnost, kopi čenje in fiksacija spontanih mutacij ter genetska kontaminacija (Sharp in sod., 2002; Zimmermann in sod., 2000; Hardy, 2004). Rezidualna heterozigotnost Izra čunali so, da so živali po 20 zaporednih generacijah inbridinga v povpre čju homozigotne na 98,6 % lokusih, medtem ko je preostali del genoma še vedno heterozigoten. Ta ostanek genetske variabilnosti imenujemo rezidualna heterozigotnost (Beck in sod., 2000; Festing, 2003; Sharp in sod., 2002; Zimmermann in sod., 2000). Čeprav se rezidualna heterozigotnost z nadaljnjim inbridingom zmanjšuje, je le-ta še vedno lahko vzrok genetskemu razhajanju. Najbolj očitno je to sicer takrat, ko pride do lo čene vzreje živali znotraj linije že kmalu po njenem nastanku, kar ima za posledico nastanek novih linij. Najbolj poznani primeri nastalih linij, ki izvirajo iz iste linije, sta liniji DBA/1 in DBA/2, ki se danes genetsko razlikujeta na ve čjem številu lokusov zaradi relativno velike rezidualne heterozigotnosti ob času njune lo čitve (Mouse Genome Database, 2006). Rezidualna heterozigotnost je tudi vzrok raznolikosti med živalmi iste linije ali podlinije, ki se vzrejajo v lo čenih rejah, saj se z nenehnim inbridingom lahko na heterozigotnih lokusih pri potomcih fiksirajo alternativni aleli, ki tako vodijo v nova razhajanja znotraj linije ali podlinije. (Zimmermann in sod., 2000). Mutacije Do razhajanj lahko pride tudi zaradi spontanih mutacij. Nekateri avtorji poro čajo, da je verjetnost fiksacije mutacije na kateremkoli delu genoma pri inbridiranih linijah zaradi homozigotnosti in izogenosti majhna in še manjša na kodirajo čih ali regulatornih podro čjih (Festing, 2003; Sharp in sod., 2002). Drugi ocenjujejo, da pride v genomu inbridiranih linij miši do fiksacije mutacije v vsaki tretji generaciji, pri podganah pa celo pri vsaki generaciji (Zimmermann in sod., 2000). V preteklosti je opisanih kar nekaj primerov nastanka povsem novih linij zaradi spontanih mutacij. Med njimi sta danes najbolj poznani liniji debelih (mutacija »obese«, Pennisi, 2000) in golih miši (mutacija »nude«, Flanagan, 1966). In ne le to, v vodilnem laboratoriju genetskih raziskav na miših (The Jackson Laboratory) osebje pri redni oskrbi dveh milijonov miši vsako leto identificira okoli 75–80 miši, ki se fenotipsko razlikujejo od sovrstnic (spremenjen zunanji videz, rast, razvojne anomalije, spremenjeno obnašanje ipd.). Miši, na katerih odkrijejo potencialno mutacijo, nato ustrezno parijo, da ugotovijo, če je mutacija dedna (lahko je tudi somatska) in kakšen je na čin dedovanja (monogeno, recesivno, dominantno ipd.). Ugotovili so, da je spremenjen fenotip pri takih pregledih kar v 75 % primerov posledica spontanih mutacij v genomu (Silver, 1995). Če torej nastane mutacija na podro čju genoma, ki ima za posledico na zunaj opazno spremembo fenotipa, se lahko žival takoj izlo či iz reje ali poskusa. V primeru, da mutacija navzven ni o čitno opazna, lahko ostane prikrita dalj časa (Festing, 2003). Slednje se je zgodilo pri C57BL/6JOlaHsd podliniji (C57BL/6J linija, ki jo vzrejajo v Harlanu v Veliki Britaniji), pri kateri so mutacijo, delecijo α-synuclein lokusa, odkrili šele raziskovalci povsem nepri čakovano, ko se je ta že prenesla na ve čino svojih potomcev (Specht in Schoepfer, 2001). Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 72 Genetska kontaminacija Genetska kontaminacija predstavlja najpomembnejši in najpogostejši vzrok genetskih razhajanj in se ji je, za razliko od prvih dveh, mo č izogniti. Do genetske kontaminacije lahko pride zaradi nena črtnih parjenj živali razli čnih linij med seboj, nepoznavanja zna čilnosti izogenih linij in genetske nomenklature. Nenamerna parjenja so najpogosteje posledica človeške napake pri ozna čevanju oziroma identifikaciji kletk ali živali (npr. napake pri aplikaciji ali od čitavanju ušesnih številk-zarez, kovinskih zna čk ali tetoviranja, napa čno vstavljeni podkožni identifikacijski mikro čipi). Kadar gre za živali s podobnimi oznakami kot so C57BL/6 in C57BL/10 ali DBA/1 in DBA/2 ali CBA/J in CBA/Ca itd., ki so si tudi fenotipsko zelo podobne, je nevarnost napake zelo velika. Napake pri ozna čevanju se lahko odkrijejo le, če imajo živali v kletkah druga čno barvo dlake kot bi jo morale imeti glede na ozna čbo kletk. Če pa so si živali fenotipsko podobne, ostane napaka prikrita (Sharp in sod., 2002). Tovrstne človeške napake naredijo pri izogenih linijah veliko ve č škode kot jo narede neizogibne spremembe, ki so posledica rezidualne heterozigotnosti ali mutacije. Zato je povsem razumljivo, zakaj je poznavanje pravil poimenovanja linij tako zelo pomembno, še posebno danes, v času naraš čajo čega števila genetskih raziskav. Uporaba standardiziranih pravil poimenovanja linij in podlinij je namre č nujna, saj je na ta na čin omogo čena razpoznavnost med njimi že iz same oznake. Zgovoren primer, ki to potrjuje, je odkritje genetske kontaminacije pri 129/SvJ podliniji (Threadgill in sod., 1997), kateri je z namenom boljšega razlo čevanja podlinij in njihove raznolikosti sledila sprememba nomenklature za vse 129 podlinije (Festing in sod., 1999b). GENETSKI NADZOR Kadar vzrejamo ali parimo ve č razli čnih linij v istem laboratoriju ali celo v istem prostoru (še posebej, če imamo v reji živali z enako barvo dlake), je nevarnost genetske kontaminacije velika. Pri prepre čevanju genetske kontaminacije si lahko pomagamo z natan čnim vodenjem rodovniških evidenc, uporabo barvnih karton čkov z natisnjenimi oznakami linije oziroma podlinije, takojšnjim izlo čanjem pobeglih živali. Genetsko kontaminacijo lahko bistveno zmanjšamo tudi z izbiro sistema vzreje. V ta namen je zelo u činkovit tako imenovani piramidalni sistem vzreje. V tem sistemu imamo tri fizi čno lo čene vzreje za dolo čeno inbridirano linijo s čimer lahko zagotovimo veliko število genetsko uniformnih živali z najmanjšim možnim številom generacij (za podrobnejšo razlago glej Hardy, 2004). Tudi izobraževanje osebja, ki oskrbuje laboratorijske živali, v smislu poznavanja osnovnih fizioloških zna čilnosti linij s katerimi dela, lahko prispeva k zmanjševanju človeških napak (Sharp in sod., 2002). Toda v primeru, da pride do nenamernega križanja dveh linij z enakim fenotipom, kontaminacija ostane prikrita (Van Zutphen in sod., 2005). Tudi ve čletne izkušnje rejcev laboratorijskih glodalcev kažejo, da zgolj skrbno gospodarjenje in dosledno upoštevanje vzrejnih metod, ne morejo v celoti prepre čiti človeških napak. Slednje potrjuje nedavno odkriti primer genetske kontaminacije C57BL/6N podlinije pri komercialnem rejcu (Nitzki, 2007). Inbridirane linije se med seboj razlikujejo, razlike pa se lahko izražajo kot navzven vidne fenotipske razlike (morfološki ozna čevalci), variante proteinov (biokemi čni in imunološki ozna čevalci) ali razlike v zaporedju DNA (molekularni ozna čevalci). Vse razlike, ki se jih da na katerikoli na čin dolo čati (morfološko, biokemi čno, imunološko, molekularno) so t.i. genetski ozna čevalci, ki so sestavni elementi genetskega kartiranja in se hkrati izkoriš čajo tudi za kontrolo genetske uniformnosti oziroma avtenti čnosti izogenih linij (Mouse Genome Database, 2006). V nadaljevanju so opisane metode, ki se uporabljajo pri genetskem nadzoru inbridiranih linij. Najprej so na kratko predstavljene metode, ki temeljijo na fenotipsko izraženih razlikah med Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 73 inbridiranimi linijami, nato pa metode, ki temeljijo na odkrivanju razlik med linijami na ravni DNA. Morfološki ozna čevalci Vsako odstopanje od morfoloških znakov linije je lahko znak genetske kontaminacije ali mutacije (Sharp in sod., 2002). To lahko zelo usposobljeno in izurjeno osebje ugotovi že pri rokovanju in opazovanju živali (Balk, 1992), kot je to praksa v The Jackson Laboratory. Vidna odstopanja znotraj inbiridiranih linij so (Mouse Genome Database, 2006): − sprememba barve dlake živali, njene velikosti, oblike ali teže; − spremembe obnašanja živali znotraj linije; − spremembe v fizioloških parametrih; − spremembe reproduktivnih lastnostih zna čilnih za linijo – reproduktivne lastnosti so sicer pod velikim vplivom okolja (imajo nizko heritabiliteto) zato niso tako zanesljiv parameter za ugotavljanje možnih genetskih sprememb znotraj linij. Po razmahu genomskih projektov v prejšnjem desetletju so v zadnjem času vse bolj v ospredju tako imenovani fenomski (angl. phenome) projekti. Namen teh projektov je razviti standardizirano metodologijo dolo čanja fenotipskih podatkov (anatomske, fiziološke in vedenjske zna čilnosti), da bi povečali uporabnost teh podatkov med razli čnimi vzrejnimi centri oziroma laboratoriji in dosegli spletne vire, ki bi vse te podatke zbrali na enem mestu. Tako so pri miših (The mouse Phenotype Database Integration Consortium, 2007; Svenson in sod., 2007; Bogue in Grubb., 2004) in pri podganah (Mashimo in sod., 2005) fenomski projekti proizvedli ogromno koristnih meritev, ki lahko raziskovalcem omogo čijo primerjanje fenotipov med linijami in podlinijami, identificiranje modelov za nove lastnosti ali bolezni in poiskati pravi model za njihovo študijo. Toda pri vsem naštetem se je treba zavedati, da zgolj z opazovanjem morfoloških znakov in merjenjem fenotipskih podatkov genetske kontaminacije v ve čini primerov ni mogo če odkriti, zato se je za uspešen nadzor potrebno poslužiti drugih razpoložljivih metod (Sharp in sod., 2002). Imunološki ozna čevalci Klasi čna metoda za dokaz genetske uniformnosti je transplantacija kože med živalmi znotraj linije in ugotavljanje sprejetja oziroma zavrnitve presadka. Živali znotraj inbridirane linije so homozigotne in izogene (tudi za poglavitni histokompatibilnostni kompleks) in imajo tkiva antigensko enaka oziroma histokompatibilna (tkivno skladna), zato ne pride do sprožitve imunskega odziva oziroma zavra čanja presadka (Vozelj, 2000). Tako lahko s pomo čjo te metode ugotavljamo spremembe na histokompatibilnostnem lokusu, ki nastanejo kot posledica genetske kontaminacije, rezidualne heterozigotnosti ali fiksacije nove spontane mutacije (Sharp in sod., 2002). Čeprav je metoda ob čutljiva, enostavna in ne zahteva veliko opreme, je njena najve čja pomanjkljivost dolgotrajnost (Balk, 1992; Sharp in sod., 2002). Presadke je treba opazovati vsaj 100 dni, predno lahko naredimo oceno o histokompatibilnosti (Balk, 1992; Sharp in sod., 2002). Slabost je tudi ta, da lahko pride do zavrnitve tkiva zaradi slabega celjenja (Balk, 1992) ali medsebojnega poškodovanja presadka. Za prepre čevanje slednjega, je za izvedbo te metode potrebno živali nekaterih linij (C57BL/10) nastaniti individualno (Sharp in sod., 2002). Metoda ne omogo ča razlikovanja med sorodnimi linijami (Balk, 1992) oziroma F1 hibridi in njihovimi starši. Kadar namre č parimo miši dveh razli čnih inbridiranih linij, dedujejo vsi potomci F1 en haplotip od vsakega starša. Posledi čno potomstvo F1 sprejme presadke od obeh staršev, kar oteži odkrivanje kontaminacije (Vozelj, 2000). S to metodo tudi ni mogo če preveriti avtenti čnosti (Van Zutphen in sod., 2005) oziroma vira kontaminacije (Balk, 1992). Zato se je Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 74 poleg presajanja kože potrebno poslužiti še drugih metod, ki so opisane v nadaljevanju (Balk, 1992). Imunološke ozna čevalce lahko ugotavljamo s pomo čjo mikrocitotoksi čnega testa (limfocitni antigeni), hemaglutinacijskega testa (H2 haplotip in drugi eritrocitni antigeni) ter mešane limfocitne reakcije (dolo čevanje poglavitnih in šibkejših histokompatibilnostih antigenskih razlik pri glodalcih) (Balk, 1992; Sharp in sod., 2002). Biokemi čni ozna čevalci Med biokemi čne ozna čevalce spadajo alelne variante encimov (izoencimi) ali proteinov, ki se med seboj razlikujejo po fizikalnih ali funkcijskih zna čilnostih, kot je elektroforetska mobilnost ali encimatska aktivnost. Pri genetskem nadzoru so uporabni tisti, ki so med linijami polimorfni in diskriminatorni in so razporejeni po vseh kromosomih genoma (Balk, 1992). Alelne variante encimov ali proteinov so ozna čene z malimi črkami npr. a,b,c, itd. Za homozigotne linije je zna čilno, da imajo le en tip variante vsakega ozna čevalca, zaradi česar lahko za vsako posamezno linijo dolo čimo za linijo specifi čen vzorec alelnih variant (Sharp in sod., 2002). Za lo čevanje linij, ki se danes v raziskavah najpogosteje uporabljajo, obi čajno zadoš ča poleg barve dlake le 4–5 razli čnih biokemi čnih ozna čevalcev, medtem ko 10 razli čnih biokemi čnih ozna čevalcev že omogo ča ustvariti za linijo zna čilni vzorec ozna čevalcev in tako nudi dovolj informacij za ugotovitev genetske kontaminacije in pogosto tudi njenega izvora (Sharp in sod., 2002). Podrobni protokoli za 17 pogosto uporabljenih mišjih biokemi čnih ozna čevalcev so dostopni na spletu (http://eanimal.snu.ac.kr/collaboration/gmonitoring/- gmonitoring.htm). Prednosti metode identifikacije izoencimov so hitra in tehni čno enostavna izvedba. Mnogi izoencimi so izraženi v številnih tkivih, zato lahko za dolo čitev nekaterih izoencimov zadoš ča le odvzem krvi. Ker pa vedno ni mogo če izvesti testiranja biokemi čnih ozna čevalcev brez evtanazije živali, se testi obi čajno izvajajo na senilnih razplodnih živalih (angl. retired breeders). Kar so časno predstavlja časovno oviro pri ugotavljanju genetske kontaminacije. Pomanjkljivost je tudi ta, da testi niso uporabni za razlo čevanje nekaterih sorodnih podlinij (Sharp in sod., 2002). Zaradi zgoraj naštetih pomanjkljivosti in razvoja u činkovitejših molekularnih ozna čevalcev (spodaj) se biokemi čni ozna čevalci danes vse redkeje uporabljajo za potrebe rednega genetskega nadzora. Molekularni ozna čevalci Razvoj molekularnega kloniranja in pomnoževanja kratkih DNA odsekov z verižno reakcijo polimeraze (PCR) je omogo čil razvoj novih pristopov za nadzor uniformnosti in avtenti čnosti inbridiranih linij s pomo čjo genetskih označevalcev, kot so polimorfizmi dolžin restrikcijskih fragmentov-PCR ozna čevalci, mikrosateliti in polimorfizmi enega baznega para. Polimorfizmi dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP) Minisateliti: Z odkritjem restrikcijskih encimov je bilo omogo čeno iskanje ozna čevalcev na ravni DNA (Silver, 1995). Restrikcijski encimi prepoznajo zanje zna čilno zaporedje DNA in ga cepijo, kar povzro či razkosanje DNA na razli čno dolge fragmente. Pri tej vrsti ozna čevalca uporabljamo restrikcijske encime, ki ne režejo znotraj minisatelitne ponovitve S pomo čjo elektroforeze, ki omogo či razslojevanje DNA fragmentov po dolžini, in prenosom fragmentov na membrano (prenos po Southernu) ter hibridizacijo membrane z ozna čeno multilokusno sondo, ki je obi čajno zaporedje osnovnega motiva minisatelita, dobimo za posamezno inbridirano linijo zna čilen vzorec dolžin restrikcijskih fragmentov ali DNA prstni odtis. Razlike med prstnimi Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 75 odtisi DNA osebkov so znotraj genetsko heterogene populacije velike, medtem ko se raznolikost med sorodnimi linijami zmanjšuje (Silver, 1995). Razli čno dolgi fragmenti DNA so namre č lahko posledica prisotnosti ali odsotnosti restrikcijskih mest v zaporedju DNA, zamenjave ene baze, ki povzro či nastanek novega ali uni čenje obstoje čega restrikcijskega mesta ter delecij ali insercij med dvema restrikcijskima mestoma (Balk, 1992). Ve činoma pa so polimorfizmi pri teh ozna čevalcih posledica razli čnega števila ponovitev minisatelitnega zaporedja (Aker in Huang, 1996), kar ima za posledico razli čne dolžine fragmentov tudi v primeru, ko polimorfizmov na restrikcijskih mestih ni. Pogostnost polimorfizmov minisatelitov, ki so posledica ve čjega ali manjšega števila ponovitev osnovnega minisatelitnega elementa (10 –3 na lokus na gameto) je precej višja od pogostnosti klasi čnih to čkovnih mutacij (10 –5 –10 –6 na lokus na gameto pri človeku; Jeffreys in sod., 1988) oziroma ocenjene povpre čne pogostnosti mutacij pri miših (1.8 X 10 –10 mutacij na nukleotid na generacijo; Drake in sod., 1998). To pomeni, da lahko s temi ozna čevalci lažje najdemo genetske razlike tudi med sorodnimi linijami in podlinijami. Predvideva se, da je ve čja pogostnost mutacij pri minisatelitih kot tudi pri mikrosatelitih posledica neenakega prekrižanja (angl. unequal crossingover) nesestrskih kromatid med mejozo, ki botruje nastanku novih alelov, ki se razlikujejo med seboj le po številu ponovitev motiva osnovnega zaporedja. Ker imajo živali znotraj izogene linije enak genotip (z izjemo razlik med spoloma v spolnih kromosomih), lahko s so časno detekcijo 10–40 nevezanih in visoko polimorfnih lokusov dobimo za posamezno linijo zna čilen vzorec dolžin restrikcijskih fragmentov ali DNA prstni odtis. To je prednost te metode, saj lahko tako z enim testom dolo čimo polimorfizme na multiplih lokusih in razlikujemo linije od podlinij ter tudi podlinije med seboj (Mannen in sod., 1994). V kolikor pride pri testirani živali do spremenjenega za linijo zna čilnega DNA prstnega odtisa, žival ne pripada testirani liniji. S primerjanjem razli čnih vzorcev lahko ugotovimo njen izvor (Balk, 1992). Za izvedbo testa živali ni potrebno evtanazirati, saj obi čajno za pripravo DNA zadoš ča koš ček repa, ušesa ali prsta (Charles River Laboratories, 2002). Slaba stran te metode za rutinski genetski nadzor je dejstvo, da je postopek časovno zahteven, da potrebujemo relativno visoko kvalitetno DNA, da navadno uporabljamo radioizotope za ozna čevanje DNA sond. Prav slednje lastnosti so razlog, da danes RFLP-minisatelitno metodo za rutinski nadzor inbridiranih linij izpodrivajo novejše in u činkovitejše metode kot so mikrosateliti in SNP ozna čevalci. Enolokusni RFLP z metodo po Southernu: Ta ozna čevalec prav tako temelji na razlikah v dolžini restrikcijskih fragmentov, ki nastanejo zaradi polimorfizmov na mestih restrikcijskih encimov. Genomska DNA osebkov inbridiranih linij se razreže z izbranimi restrikcijskimi encimi, razsloji na agarozni elektroforezi, prenese na membrano s prenosom po Southernu, hibridizira z ozna čeno DNA sondo za dolo čen lokus ter v primeru ozna čevanja DNA sond z radioizotopi, podvrže vizualizaciji rezultatov z autoradiografijo. Ta metoda je bila zelo razširjena za genetsko kartiranje laboratorijskih živali (predvsem miši in podgan) ter izvajanje genetskega nadzora v 80 in 90-tih letih prejšnjega stoletja. Danes se jo zaradi relativne neu činkovitosti (naenkrat pregledujemo le en lokus) in dragega postopka redkeje uporablja za rutinski genetski nadzor, je pa še vedno v rabi pri genetskem nadzoru specifi čnih lokusov ali induciranih mutacij (transgenski modeli ipd.). Glede u činkovitosti dolo čanja genetskih razlik med linijami in podlinijami sodi ta metoda med povpre čne, kar sta nazorno pokazala Knight in Dyson (1990), ki sta med linijami NOD in C57BL/10 testirala 22 razli čnih restrikcijskih encimov in našla 30 % polimorfnih lokusov. Nekoliko ve čji je odstotek polimorfizmov teh ozna čevalcev med linijami ki izvirajo iz M. musculus in M. spretus oziroma M.m.castaneus – tako je Avner in sod. (1988) ugotovil, da lahko, če primerjamo inbridirane linije, ki izvirajo iz M. musculus ali iz M. spretus, s tipi čno DNA sondo, pri čakujemo polimorfen RFLP lokus z ve č kot 90 % verjetnosti. Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 76 RFLP-PCR: Osnova te metode je enaka kot je opisano zgoraj, le da postopek bistveno poenostavi vklju čitev metode PCR. Z metodo PCR pomnožimo del odseka genoma, kjer testiramo prisotnost RFLP ozna čevalca in PCR produkt obdelamo z restrikcijskimi encimi. Sledi razslojevanje produktov na agaroznem ali poliakrilamidnem gelu in barvanje DNA z etidijevim bromidom. Ta metoda je bistveno hitrejša in cenejša od RFLP metode po Southernu, ker temelji na u činkoviti reakciji PCR. Poleg tega ni potrebno imeti na razpolago velikih koli čin visoko kvalitetne DNA kot je to potrebno za RFLP metodo po Southernu. Za genetski nadzor celega genoma v primerjavi s spodaj naštetimi metodami tudi RFLP-PCR metoda še vedno ni dovolj učinkovita. Zato se danes v glavnem uporablja za genetski nadzor specifi čnih lokusov oziroma mutacij (Horvat in Bunger, 1999) ter prisotnosti oziroma odsotnosti transgenskih vklju čkov (Liu in sod., 2006). Mikrosatelitni polimorfizmi (angl. Simple Sequence Length Polymorphism; SSLP) Mikrosateliti so kratka ponavljajo ča se zaporedja DNA, ki se dedujejo kodominantno in so visoko polimorfni glede na število ponovitev osnovnega motiva mikrosatelita. Podobno kot pri zgoraj opisanih minisatelitih, je višja pogostnost mutacij na teh lokusih rezultat neenakega prekrižanja kromatid v mejozi, lahko pa so tudi posledica zdrsa polimeraze med podvojevanjem DNA, ko polimeraza »presko či« dolo čeno ponovitev mikrosatelita in tako nastane alel s krajšo dolžino. Genomske lokacije nukleotidnih zaporedij mikrosatelitov so znotraj vrst ohranjene, medtem ko je število ponovitev teh zaporedij razli čno in zna čilno za posamezno linijo oziroma podlinijo (primer za miši v preglednici 1). Vsak mikrosatelit je obi čajno obdan z edinstvenimi, neponavljajo čimi se zaporedji v genomu (enolokusna sekvenca). Na teh podro čjih dolo čimo PCR za četne oligonukleotide, ki so obi čajno 20bp dolga zaporedja komplementarna edinstveni DNA na bo čnih področjih mikrosatelita. Dolo čanje dolžine mikrosatelitnih zaporedij je u činkovito orodje genetskega nadzora inbridiranih linij, saj so ti ozna čevalci visoko polimorfni tudi med sorodnimi podlinijami. Klju čni dejavnik pri rutinskem testiranju inbridiranih linij je izbor ustreznih mikrosatelitnih ozna čevalcev. Pomembno je, da pri genetskem nadzorovanju izberemo tiste mikrosatelitne ozna čevalce (pregl. 1), ki so med linijami oziroma podlinijami v reji diskriminatorni (Festing, 2003). Preglednica 1. Dolžina mikrosatelitov na posameznih lokusih med razli čnimi mišjimi linijami. Odebeljene številke ozna čujejo alelne razlike. Simbol ozna čevalca DNMitN pomeni: D – nepoimenovan DNA ozna čevalec; N – številka kromosoma; Mit – laboratorijska koda; N – številka lokusa. Tako D1Mit308 ozna čuje 308 MIT mikrosatelitni ozna čevalec, ki se nahaja na kromosomu 1 (povzeto po www.harlan.com). Table 1. The length of microsatellite loci between different mouse strains. The bolded numbers indicate alelic differences. These markers are denoted by symbols DNMitN, where the D indicates an anonymous DNA marker; N – the number of the chromosome; Mit – the Laboratory Registration Code; N – the number of the locus. For example, D1Mit308 is the 308 MIT microsatellite marker assigned to chromosome 1. Mišja linija D1Mit 308 D5Mit 79 D6Mit 102 D9Mit 18 D11Mit 236 C57BL/6NHsd 150 bp 106 bp 146 bp 180 bp 106 bp CBA/JCrHsd 160 bp 106 bp 126 bp 210 bp 106 bp A/JOlaHsd 160 bp 106 bp 140 bp 210 bp 106 bp BALB/cAnNHsd 160 bp 136 bp 140 bp 213 bp 118 bp Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 77 Tehnika vklju čuje odvzem vzorca tkiva (koš ček repa, ušesa), pripravo DNA in pomnoževanje enega ali ve č mikrosatelitov z uporabo enolokusnih PCR za četnih oligonukleotidov. Lo čevanje velikosti mikrosatelitov omogo ča elektroforeza na agaroznem gelu ali poliakriamidnem gelu skupaj z vzorci živali z znanim genotipom. Razli čno dolgi aleli prepotujejo razli čne dolžine. Če proge niso v enaki vrsti pomeni, da genotipa nista identi čna (Sharp in sod., 2002). Pri miših je prva objava izolacije in kartiranja seta mikrosatelitov (Dietrich in sod., 1992) pomenila prelomnico v genomskih raziskavah in nudila možnost prehoda rutinskega genetskega nadzora od relativno neu činkovitih RFLP tehnik na nadzorovanje z mikrosateliti. Izolirali so set 317 mikrosatelitnih lokusov med seboj oddaljenih v popre čju 4,3 cM in ugotovili, da je pri čakovana stopnja polimorfnosti med najpogosteje uporabljenimi linijami miši 50 %. Čeprav baze podatkov na spletu (npr. MGI: http://www.informatics.jax.org/menus/strain_menu.shtml) danes vsebujejo precej ve čje število mikrosatelitnih lokusov in omogo čajo iskanje polimorfnih ozna čevalcev med željenimi linijami in podlinijami miši, je za potrebe genetskega nadzora koristneje uporabiti preverjene sete mikrosatelitov iz originalne literature. Mikrosatelitni ozna čevalci so namre č lahko s prakti čnega vidika dolo čanja v laboratoriju bolj ali manj robustni in u činkoviti, zato nam lahko preverjeni rezultati v originalni literaturi pri izbiri seta mikrosatelitov za naše potrebe prihranijo veliko časa. V objavi Dietricha in sod. (1992) je bila detekcija mikrosatelitov z radioaktivnimi ozna čenimi oligonukleotidnimi za četniki še vedno sorazmerno neu činkovita in tehni čno zahtevna. Zato so raziskovalci za čeli iskati u činkovitejše in uporabniku bolj prijazne pristope, kot je uporaba fluorescence v danes že standardnih laserskih DNA analizatorjih za detekcijo mikrosatelitov (Rhodes in sod., 1997). Nadgradnja tega sistema je delo Witmerja in sod. (2003), ki so razvili set 314-ih visoko polimorfnih mikrosatelitnih ozna čevalcev in jih optimizirali s tako imenovano multipleks PCR, ki omogo ča hkratno dolo čanje ve čjega števila mikrosatelitov v isti reakciji z uporabo štirih razli čnih fluorescen čnih barvil. V zadnjem času se pojavljajo tudi protokoli optimizirani za dolo čen tip celic kot je na primer sperma (Katoh in sod., 2005), kar je zelo uporabno pri genetskem nadzoru kriopreserviranih spolnih celic. Tudi pri podganah so se mikrosateliti izkazali za zelo u činkovite molekularne ozna čevalce pri rutinskem genetskem nadzoru. Prva objava s 134 podganjimi mikrosateliti (Serikawa in sod., 1992) je sprožila pravo revolucijo pri kartiranju podganjega genoma in omogo čila u činkovit genetski nadzor standardnih linij podgan po celotnem genomu. Nedavno je bil objavljen članek (Mashimo in sod., 2006), kjer so razvili visoko polimorfen set mikrosatelitov primeren tudi za uporabo v rutinskem genetskem nadzoru podganjih linij. Polimorfizmi enega baznega para (angl. Single Nucleotide Polymorphism; SNP) Polimorfizmi enega baznega para ali SNP predstavljajo vrsto polimorfizmov, ki so najbolj gosto in enakomerno razporejeni po genomu in omogo čajo odkrivanje genetske osnove za lastnosti, ki so se fiksirale v dolo čeni liniji kot posledica selekcijskega parjenja ali mutacije (Petkov in sod., 2004). Med inbridiranimi linijami miši je bilo že v eni od prvih objav (Wiltshire in sod., 2003) opisanih preko 70.000 SNP. V povpre čju so takrat izra čunali 14 SNP na 10 kb, vendar pa je porazdelitev SNP polimorfizmov v genomu neenakomerna. Obstajajo odseki z visoko stopnjo (40 SNP na 10 kb) in odseki z nizko stopnjo SNP polimorfizma (0,5 SNP na 10kb). Pri primerjanju genomov razli čnih inbridiranih linij (129, C3H, BALB z B6) se je izkazalo, da predstavljajo odseki z nizko stopnjo SNP kar 2/3 genoma. Enako distribucijo kaže tudi stopnja SSLP polimorfizma, vendar pa so SSLP polimorfni tudi na podro čjih z nizko stopnjo SNP polimorfizma, kar se sklada z njihovo visoko mutacijsko naravo (Wade in sod., 2002). SNP, ki se dedujejo vezano, predstavljajo haplotip. Kar 30–60 % vseh haplotipov v genomu imajo linije Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 78 med seboj enake. Ti predstavljajo regije genoma iz katerih lahko sklepamo na skupno poreklo posameznih linij (Wiltshire in sod., 2003). V The Jackson Laboratory so vpeljali sistem nadzora genetskega ozadja inbridiranih linij miši, ki temelji na analizi visoko polimorfnih SNP. Metoda naj bi bila zanesljiva, enostavna, obsežna in ekonomi čna tudi za manjše ustanove (Petkov in sod., 2004a, 2004b). Na osnovi predhodno opravljenih testov pri 48-ih linijah, so dolo čili distribucijo 235 srednje do visoko polimorfnih ozna čevalcev (kjer se redkejši alel pojavlja med linijami s frekvenco 0,1 ali ve č), ki so bili vsaj 2 cM narazen (od 3.8 do 13.5 cM). Na ta na čin so hoteli izbrati le tiste SNP, ki ne pripadajo istemu haplotipu. Prednost pri izboru so imeli tisti SNP, ki so bili opaženi pri ve č kot petih linijah in katerih najmanj pogosti tip alelov je bil dolo čen pri vsaj dveh linijah. Ti kriteriji pa so bili bolj ohlapni za podro čja z nizko stopnjo SNP polimorfizma (Petkov in sod., 2004). Za dolo čitev minimalnega števila ozna čevalcev so se poslužili statisti čnih analiz. Da bi lahko z 99 % gotovostjo dobili vsaj tri razlike med dvema linijama, so morali testirati živali z vsaj 26 ozna čevalci. Za kontrolo genetskega ozadja so izbrali set 28 visoko informativnih SNP, razporejenih po vseh kromosomih. Nekaj izmed njih tudi specifi čnih za lo čevanje med sorodnimi linijami. Z izborom so dosegli vzorec, kjer se 98 % testiranih linij med seboj razlikuje v treh ali ve č ozna čevalcih (Petkov in sod., 2004). V posodobljenih bazah podatkov danes zasledimo že ve č kot milijon SNP ozna čevalcev (glej SNP baze podatkov pri miših), kjer je najkoristnejša baza na spletni strani The Jackson Laboratory (http://www.jax.org/phenome/snp.html), ki združuje SNP ozna čevalce iz razli čnih virov in ponuja orodja za navzkrižno primerjanje. Čeprav je ve čina teh primerjav ponujena za 16 danes najpogosteje uporabljenih linij miši, ima baza dostop do SNP podatkov za ve č kot 125 razli čnih linij. Pri podganah je število SNPjev in genotipiziranih linij podgan precej manjše kot pri miših, vendar se tudi pri podganah pojavljajo objave (Zimdahl s sod., 2004, Smits in sod., 2005) ter baze podatkov za SNP genotipe (SNP baze podatkov pri podganah), ki bodo podobno kot pri miših kmalu postale najbolj koristne za izbiro in uporabo ozna čevalcev za genetski nadzor tudi pri tej vrsti laboratorijskih živali. PREPRE ČEVANJE GENETSKIH RAZHAJANJ ZNOTRAJ LINIJ Če torej želimo preveriti uniformnost in avtenti čnost živali posamezne linije, se lahko poslužimo zgoraj opisanih metod. Toda so časno se moramo zavedati, da so metode genetskega nadzora usmerjene predvsem v prepre čevanje genetskih kontaminacij linij oziroma podlinij in ne odkrivanju mutacij ali razlik zaradi rezidualne heterogenosti. Če se ho čemo izogniti vsem dejavnikom genetskega razhajanja znotraj linij, se moramo poslužiti metode shranjevanja embrijev (Van Zutphen in sod., 2005). Danes je mogo če sesalske embrije shranjevati z uporabo posebnih tehnik, ki vklju čujejo zamrzovanje in shranjevanje preimplantacijskih embrijev v teko čem dušiku. Ta proces shranjevanja embrijev na zelo nizki temperaturi imenujemo kriopreservacija. Tehnika je vsestransko uporabna. Poslužujejo se jo v smislu prepre čevanja izumrtja dragocenih inbridiranih linij, do katerega bi lahko prišlo zaradi fatalne bolezni (vnos patogenov) ali nesre če (požar) v reji. Omogo ča zagotavljati nenehno dostopnost sicer redko uporabljenih linij brez potrebe po vzdrževanju živali v vzrejnih centrih. Kar se je pokazalo zelo dobrodošlo tudi pri genetsko spremenjenih živalih, katerih število linij mo čno naraš ča. Prav tako se jo lahko poslužimo za za četek vzreje gnotobioti čnih živali ali živali prostih specifi čnih patogenov. In nenazadnje, služi tudi kot sredstvo prepre čevanja genetskega razhajanja znotraj linij, saj s kriopreservacijo embrijev vplivamo na zmanjšanje števila generacij in s tem posledi čno zmanjšujemo verjetnost pojava dejavnikov, ki so vzrok genetskemu razhajanju znotraj linij (Van Zutphen in sod., 2005). Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 79 GENETSKI NADZOR V PRAKSI Ker so inbridirane linije homozigotne za celoten genom je relativno enostavno poiskati lokuse, ki se razlikujejo med razli čnimi inbridiranimi linijami. Za ugotavljanje avtenti čnosti inbridiranih linij (pregl. 2) je ponavadi dovolj, da dolo čimo 5–6 polimorfnih genetskih ozna čevalcev, ki so nevezani (ležijo na razli čnih kromosomih). Na ta na čin lahko z veliko verjetnostjo odkrijemo možno genetsko kontaminacijo. Preglednica 2. Princip izbire števila genetskih ozna čevalcev za izvajanje genetskega nadzora: primer spodaj prikazuje, da s 6 polimorfnimi nevezanimi genetskimi ozna čevalci lahko z 98,5 % verjetnostjo ugotovimo, če sta pregledani inbridirani liniji genetsko kontaminirani Table 2 Principle for selecting the number of markers for genetic monitoring: example below demonstrate that with 6 polymorphic non-linked markers one can detect genetic contamination in two inbred lines with 98.5% probability Genetski ozna čevalec 1 Alel Inbridirane Linije št. 1 Alel Inbridirane Linije št. 2 Kumulativna verjetnost, da lahko odkrijemo genetsko kontaminacijo A A1 A2 (1–(0,5) 1 ) 50 % B B2 B1 (1–(0,5) 2 ) 75 % C C1 C2 (1–(0,5) 3 ) 87 % D D1 D2 (1–(0,5) 4 ) 93 % E E2 E1 (1–(0,5) 5 ) 97 % F F2 F1 (1–(0,5) 6 ) 98,5 % 1 genetski ozna čevalci so ne-vezani (ležijo na razli čnih kromosomih) Izbrane sete šestih (ali ve č) genetskih ozna čevalcev (pregl. 2) je potrebno menjati vsako generacijo. Priporo ča se, da na vsake 3–4 generacije pregledamo vsaj 2 genetska ozna čevalca na vsak kromosom. S tovrstnim genetskim nadzorom, beleženjem fenotipskih podatkov (telesne mase, reprodukcija, barva dlake) imamo veliko možnost dolo čanja kontaminacij in izbire takih staršev, ki po genotipu in fenotipu ustrezajo zna čilnostim dolo čene inbridirane linije oziroma podlinije laboratorijskih živali. Od vseh v tem prispevku naštetih metod genetskega nadzora, so danes uporabljene v glavnem metode dolo čanja SNP genotipov, mikrosatelitov ter PCR-RFLP. Prvi dve sta v rabi predvsem za pregled genetske variabilnosti po celotnem genomu, tretja metoda je uporabna, ko opravljamo genetsko kontrolo samo za majhno število lokusov, specifi čnih mutacij ali transgenih vklju čkov. V Sloveniji imamo v glavnem manjše vzrejne in poskusne centre. Čeprav pravila nomenklature navajajo, da lo čena vzreja dolo čene linije lahko vodi v razvoj podlinije po 20 generacijah, pa ve čji vzrejni centri kot so The Jackson Laboratory in Charles Rivers Laboratories opozarjajo, da lahko pride do razvoja podlinij že po 10 generacijah inbridinga ali že samo po treh generacijah naklju čnih parjenj. V primeru, da vzrejni centri in poskusne enote nimajo vpeljanega rednega genetskega nadzora, ter ustreznih sistemov piramidalne vzreje priporo čamo, da za poskusne namene kupujejo inbridirane linije od komercialnih vzrejnih centrov z ustreznimi mikrobiološkimi in genetskimi certifikati. V raziskovalnih člankih lahko namre č uporabimo ime neke linije (npr. C57BL/6J, ki jo sicer dobimo le v The Jackson Laboratory) samo v primeru, če uporabimo živali, ki so bile vzrejene v naših vzrejnih enotah do 10 generacij inbridinga ali do treh generacij naklju čnih parjenj. V nasprotnem primeru je potrebno laboratorij registrirati, s čimer k oznaki linije dodeli tudi dodatna koda. Pogosto se inbridirane linije uporabljajo tudi za Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 80 povratna križanja za ohranjanje transgenih modelov v dolo čenem genetskem ozadju. Tudi v tem primeru veljajo zgornja pravila in potreba po genetskem nadzoru in ustreznem sistemu vzreje. Raziskovalci v poskusih pogosto uporabljajo linije, ki so jih razvili sami bodisi z umetno selekcijo ali fiksacijo spontanih oziroma induciranih mutacij. Tudi pri teh linijah veljajo enaka pravila glede nastanka podlinij in pomena genetskega nadzora. Še ve č, ker so bile te linije razvite znotraj poskusne enote in z njimi razpolaga le njihov laboratorij, se v primeru genetske kontaminacije ali nesre če tak vir ne more nadomestiti s ponovnim nakupom iz drugih vzrejnih centrov. Za te primere priporo čamo, poleg striktnega izvajanja vzreje po piramidalnem sistemu, lo čeni vzreji in rednem genetskem nadzoru temeljnih kolonij tudi program kriopreservacije in hranjenja zamrznjenih zarodkov na vsaj dveh lokacijah. Metodološko in cenovno je za manjše vzrejne centre, kot jih imamo v Sloveniji najprimernejša metoda za rutinski genetski nadzor še vedno uporaba mikrosatelitnih ozna čevalcev dolo čanih na gelski elektroforezi. V ta namen lahko uporabimo agarozne gele (navadno 3–4 %), v zadnjem času pa so zelo u činkoviti tudi sistemi, kjer kupimo že vnaprej narejene gele, ki imajo precej krajši čas detekcije (e-geli – Invitrogen). Če je volumen dela ve čji se lahko uporabijo mikrosateliti v multipleks PCR reakcijah (ve č mikrosatelitov naenkrat) na fluorescen čnih DNA analizatorjih (npr. Applied Biosystems). Z ustanovitvijo centra za bio čipe v Sloveniji (center za funkcijsko genomiko in bio čipe na Medicinski fakulteti; http://cfgbc.mf.uni- lj.si/ ) smo tudi v Sloveniji pridobili tehnološko infrastrukturo, ki bo omogo čala razvoj in uporabo SNPjev za genetski nadzor laboratorijskih živali, sploh za tiste raziskovalce in centre, ki izvajajo množi čno genotipiziranje. Če je namen le ob časni genetski nadzor manjšega števila živali in center oziroma laboratorij nima ekspertize na podro čju genetskega nadzora je učinkoviteje, da se v tem primeru poslužujemo sodelovanja z doma čimi ali tujimi laboratoriji, ki imajo že vpeljan sistem rutinskega genetskega nadzora ali komercialnih servisov specializiranih za rutinski genetski nadzor (Komercialni servisi za genetski monitoring). ZAKLJU ČKI Danes imamo torej na voljo veliko število razli čnih metod genetskega nadzora, s pomo čjo katerih lahko zagotovimo uniformnost in avtenti čnost inbridiranih linij. Obi čajno je izbor metod odvisen od števila in sorodnosti linij oziroma podlinij, ki jih imamo v laboratoriju. Toda poleg zanesljivosti metode so pri rutinskem nadzoru pomembni tudi drugi dejavniki kot so enostavnost, hitrost, zmogljivost (so časno testiranje ve čjega števila vzorcev) in ekonomi čnost. Na podlagi pregledane literature na tem podro čju ugotavljamo, da v ve čjih vzrejnih centrih za genetski nadzor uporabljajo ve činoma SNP ozna čevalce, v manjših centrih in individualnih laboratorijih pa ve činoma mikrosatelitne ozna čevalce. Druge vrste ozna čevalcev, ki smo jih opisali v prispevku se uporablja vse redkeje in v glavnem kot dopolnilo SNP ali mikrosatelitnim ozna čevalcem. ZAHVALA Za so-financiranje se zahvaljujemo Agenciji za raziskovalno dejavnost (ARRS) in Ministrstvu za zdravje za projekt CRP V3-0365. SUMMARY Today, there are many different genetic monitoring methods to assure uniformity and purity of inbred strains. Each of these methods has its advantages, but usually selection of the methods depends on the number and the level of genetic relatedness between the strains or substrains in Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 81 the facility. However, besides reliability of the method, there are also other factors important for implementation of the method in the facility such as the total assay time per animal or locus, technical simplicity of the method, ability to scale up the method for a high through-put analyses and cost efficiency. On the basis of reviewed literature on the topic of genetic monitoring we conclude that today, large breeding centres tend to use primarily SNP markers whereas smaller breeding facilites or individual animal labs still prefer microsatellites. Other types of markers described herein are being used less frequently and usually only complementary to the SNP or microsatellite-based genetic monitoring. VIRI Aker, M./ Huang, H.V. Extreme heterogeneity of minor satellite repeat arrays in inbred strains of mice. Mamm. Genome, 7(1996), 62–64. Avner, P./ Amar, L./ Dandolo, L./ Guenet, J.L. Genetic analysis of the mouse using interspecific crosses. Trends Genet., 4(1988), 18–23. Balk, M.W. Rodent genetics and genetic quality control for inbred and F1 hybrid strains. Buletin, 1992. Beck, J.A./Lloyd, S./ Hafezparast, M./ Lennon-Pierce, M./ Eppig, J.T./ Festing, M.F./ Fisher, E.M. Genealogies of mouse inbred strains. Nat. Genet., 24(2000), 23–25. Bogue M.A./ Grubb, S.C. The Mouse Phenome Project. Genetica, 122(2004),71–74. Charles River Laboratories. Background strain characterization: Who is that mouse?. The Sentinel, Summer, 2002. Dietrich, W./ Katz, H./ Lincoln, S.E./ Shin, H.S./ Friedman, J./ Dracopoli, N.C./ Lander, E.S. A genetic map of the mouse suitable for typing intraspecific crosses. Genetics, 131(1992), 423–447. Festing, M.F. Laboratory animal genetics and genetic quality control. V: Handbook of laboratory animal science:essential principles and practices (ur.: Hau, J./ van Hoosier, G.L.). Boca Raton, CRC Press LCC, 2003, 173–203. Festing, M.F. Warning: the use of heterogeneous mice may seriously damage your research. Neurobiol. Aging, 20(1999), 237–244. Festing, M.F./ Simpson, E.M./ Davisson, M.T./ Mobraaten, L.E. Revised nomenclature for strain 129 mice. Mamm. Genome, 10(1999a), 836. Flanagan, S.P. 'Nude', a new hairless gene with pleiotropic effects in the mouse. Genet. Res., 8(1966), 295–309. Hardy, P. Gnotobiology and breeding techniques. V: The laboratory mouse (ur.: Hedrich, H.J.) London, Academic Press, 2004, 409–433. Horvat, S./ Bunger, L. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay for the mouse leptin receptor (Lepr(db)) mutation. Lab. Anim., 33(1999), 380–384. International Committee on Standardized Genetic Nomenclature for Mice and Rat Genome and Nomenclature Committee. Rules for nomenclature of mouse and rat strains (on line). Mouse Genome Database, Mouse Genome Informatics Web Site, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine. World Wide Web, 2005. Kaloh, H./ Yoshino, S./ Inui, Y./ Honda, S./ Takabayashi, S. Microsatellite genotyping for genetic quality testing using sperm cells in the mouse. Exp. Anim., 54(2005), 373–376. Knight, A.M./ Dyson, P.J. Detection of DNA polymorphisms between two inbred mouse strains-limitations of restriction fragment length polymorphisms (RFLPs). Mol Cell Probes., 4(1990), 497–504. Komercialni servisi za genetski monitoring: http://www.elchrom.com/public/index.php?page=52; http://www.cidr.jhmi.edu/index.html; http://www.taconic.com/wmspage.cfm?parm1=1426; http://www.criver.com/research_models_and_services/genetic_testing_services/index_gts.html; http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=163); http://www.identigene.com/SWIMX/Products/mouse_genotyping.asp ALI http://www.biopioneerinc.com/bpr/index.php?target=categories&category_id=239 Kurtz, T.W./ Montano, M./ Chan, L./ Kabra, P. Molecular evidence of genetic heterogeneity in Wistar-Kyoto rats: implications for research with the spontaneously hypertensive rat. Hypertension, 13(1989), 188–192. Liu, K./ Hipkens, S./ Yang, T./ Abraham, R./ Zhang, W./ Chopra, N./ Knollmann, B./ Magnuson, M.A./ Roden, D.M. Recombinase-mediated cassette exchange to rapidly and efficiently generate mice with human cardiac sodium channels. Genesis, 44(2006), 556–564. Lo čniškar, F. Katalog znanj: splošna živinoreja, biološke osnove, genetika z enciklopedi čnim opisom pojmov in gesli v slovenš čini, angleš čini in nemš čini, Domžale, Biotehniška fak., Odd. za zootehniko, 1999. Lovell, D.P./ Totman, P./ Bigelow, S.W./ Nebert, D.W./ Hoffman, H.A./ Greig, J.B./ Festing, M.F. An investigation of genetic variation within a series of congenic strains of mice. Lab. Anim., 18(1984), 291–297. Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 82 Mannen, H./ Tsuji, S./ Fukuta, K./ Goto, N. Identification of sublines of inbred strains of mice and assessment of genetic relationships between substrains or sublines by DNA fingerprinting. Jikken Dobutsu, 43(1994), 521–526. Mashimo, T./ Voigt, B./ Kuramoto, T./ Serikawa, T. Rat Phenome Project: the untapped potential of existing rat strains. J. Appl. Physiol., 98(2005), 371–379. Mashimo, T./ Voigt, B./ Tsurumi, T./ Naoi, K./ Nakanishi, S./ Yamasaki, K./ Kuramoto, T./ Serikawa, T. A set of highly informative rat simple sequence length polymorphism (SSLP) markers and genetically defined rat strains. BMC Genet., 4(2006), 19–27. Mouse Genome Database, Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, 2006. Nitzki, F./ Kruger, A./ Reifenberg, K./ Wojnowski, L./ Hahn, H. Identification of a genetic contamination in a commercial mouse strain using two panels of polymorphic markers. Lab. Anim., 41(2007), 218–28. Pennisi, E. A mouse chronology. Science, 288(2000), 248–257. Perše, M./ Rozman, D. Zna čilnosti in pravila poimenovanja inbridiranih linij miši. Vet. Nov., 32(2006), 23–29. Petkov, P.M./ Cassell, M.A./ Sargent, E.E./ Donnelly, C.J./ Robinson, P./ Crew, V./ Asquith, S./ Haar, R.V./ Wiles, M.V. Development of a SNP genotyping panel for genetic monitoring of the laboratory mouse. Genomics, 83(2004a), 902–911. Petkov, P.M./ Ding, Y./ Cassell, M.A./ Zhang, W./ Wagner, G./ Sargent,/ E.E./ Asquith, S./ Crew, V./ Johnson, K. A./ Robinson, P./ Scott, V.E./ Wiles, M.V. An efficient SNP system for mouse genome scanning and elucidating strain relationships. Genome Res., 14(2004b), 1806–1811. Rhodes, M./ Dearlove, A./ Straw, R./ Fernando, S./ Evans, A./ Greener, M./ Lacey, T./ Kelly, M./ Gibson, K./ Brown, S.D./ Mundy, C. High-throughput microsatellite analysis using fluorescent dUTPs for high-resolution genetic mapping of the mouse genome. Genome Res., 7(1997), 81–86. Serikawa, T./ Kuramoto, T./ Hilbert, P./ Mori, M./ Yamada, J./ Dubay, C.J./ Lindpainter, K./ Ganten, D./ Guenet J.L./ Lathrop, G.M./ Beckmann, J.S. Rat gene mapping using PCR-analyzed microsatellites. Genetics, 131(1992), 701–721. Sharp, J.J./ Sargent, E.E./ Schweitzer, P.A. Genetic monitoring. V: Laboratory animal medicine (ur.: Fox, J.G./ Andersen, L.C./ Loew, F.M./ Quimby, F.W.). San Diego, California, Academic Press, 2002, 1117–1128. Silver, L.M. Mouse genetics:Concepts and applications. Oxford, University Press, 1995. Smits B.M.G./ Guryev, V./ Zeegers, D./ Wedekind, D./ Hedrich, H.J./ Cuppen, E. Efficient single nucleotide polymorphism discovery in laboratory rat strains using wild rat-derived SNP candidates. BMC Genomics, 6(2005), 170–179. SNP baze podatkov pri miših: http://phenome.jax.org/pub-cgi/phenome/mpdcgi?rtn=snps/door; http://mousesnp.roche.com/; http://www.well.ox.ac.uk/rmott/mouse/inbreds/; SNP baze podatkov pri podganah; http://cascad.niob.knaw.nl/; http://www.ensembl.org/Rattus_norvegicus/index.html. Specht, C.G./ Schoepfer, R. Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6J inbred mice. BMC. Neurosci., 2(2001), 11. Svenson, K.L./ Von Smith, R./ Magnani, P.A./, Suetin, H.R./ Paigen, B./ Naggert, J.K./ Li, R./ Churchill, G.A./ Peters, L.L. Multiple Trait Measurements in 43 Inbred Mouse Strains Captures the Phenotypic Diversity Characteristic of Human Populations. J. Appl. Physiol., 2007, E-pub pred tiskanim člankom. The Mouse Phenotype Database Integration Consortium. Integration of mouse phenome data resources. Mamm. Genome, 18(2007), 157–163. Threadgill, D.W./ Yee, D./ Matin, A./ Nadeau, J.H./ Magnuson, T. Genealogy of the 129 inbred strains: 129/SvJ is a contaminated inbred strain. Mamm. Genome, 8(1997), 390–393. Van Zutphen, L.F.M./ Hedrich, H.J./ van Lith, H.A./ Prins, J.B. Genetic standardization. V: Principles of laboratory animal science (ur.: Van Zutphen, L.F.M./ Baumans,V./ Beynen, A.C.). Amsterdam, Esevier, 2005, 129–147. Vozelj, M. Temelji imunologije. Ljubljana, DZS, 2000. Wade, C.M./ Kulbokas, E.J./ III, Kirby, A.W./ Zody, M.C./ Mullikin, J.C./ Lander, E.S./ Lindblad-Toh, K./ Daly, M.J. The mosaic structure of variation in the laboratory mouse genome. Nature, 420(2002), 574–578. Wiltshire, T./ Pletcher, M.T./ Batalov, S./ Barnes, S.W./ Tarantino, L.M./ Cooke, M.P./ Wu, H./ Smylie, K./ Santrosyan, A./ Copeland, N.G./ Jenkins, N.A./ Kalush, F./ Mural, R.J./ Glynne, R.J./ Kay, S.A./ Adams, M.D./ Fletcher, C.F. Genome-wide single-nucleotide polymorphism analysis defines haplotype patterns in mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 100(2003), 3380–3385. Witmer, P.D./ Doheny, K.F./ Adams, M.K./ Boehm, C.D./ Dizon, J.S./ Goldstein, J.L./ Templeton, T.M./ Wheaton, A.M./ Dong, P.N./ Pugh, E.W./ Nussbaum, R.L./ Hunter, K./ Kelmenson, J.A./ Rowe, L.B./ Brownstein, M.J./ The development of a highly informative mouse Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP) marker set and construction of a mouse family tree using parsimony analysis. Genome Res., 13(2003), 485–491. Wotjak, C.T. C57BLack/BOX? The importance of exact mouse strain nomenclature. Trends Genet., 19(2003), 183–184. Perše, M. in sod. Genetski nadzor inbridiranih linij. 83 Zimdahl, H./ Nyakatura, G./ Brandt, P./ Schulz, H./ Hummel, O./ Fartmann, B./ Brett, D./ Droege, M./ Monti, J./ Lee, Y.A./ Sun, Y./ Zhao, S./ Winter, E.E./ Ponting, C.P./ Chen, Y./ Kasprzyk, A./ Birney, E./ Ganten, D./ Hubner, N. A SNP map of the rat genome generated from cDNA sequences. Science, 303(2004), 807. Zimmermann, F./ Weiss, J./ Reifenberg, K. Breeding and assisted reproduction techniques. V: The laboratory rat (ur.: Krinke, G.J.). London, Academic Press, 2000, 177–198.