UGOTAVLJANJE SPOR BACILLUS LARVAE V MEDU PRI ZATIRANJU HUDE GNILOBE ČEBELJE ZALEGE
J. MEHLER*, B. KRTA, B. ŠNAJDER*
Veterinarska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo, 'IBEMA, Inštitut za bioelektromagnetiko in okolje
UVOD
Huda gniloba čebelje zalege, imenovana tudi ameriška gniloba ali kuga, ki jo povzroča bakterija Bacillus larvae, je ena izmed najbolj nalezljivih čebeljih bolezni, zaradi katere čebelja družina lahko tudi odmre. Tudi če bolezen odkrijemo dovolj zgodaj, moramo okuženo družino največkrat uničiti, včasih pa moramo s sežiganjem uničiti tudi vse satje in panj, da bi preprečili širjenje bolezni v druge, še zdrave družine. Ta bolezen povzroča tudi znatno gmotno škodo, zahteva veliko napornega dela, pri tem pa čebelar nikoli ne ve, ali se bo bolezen spet pojavila in kdaj se bo to zgodilo. V enakem položaju so tudi čebelarji, ki v svojem čebelnjaku te bolezni še niso imeli, saj obstaja nevarnost, da se bodo znaki hude gnilobe kdaj pojavili tudi pri njih. Huda gniloba se prenaša s sporami bakterije Bacillus larvae, ne pa tudi z rastočimi oblikami teh bakterij, navzočimi v bolni družini. Spore so zelo trdožive, tako da v panju lahko preživijo tudi več deset let, preden se pokažejo znamenja bolezni. Včasih se bolezen razvije v manjšem obsegu, tako da je čebelar niti ne opazi, in potem sama izgine. Vendar pa v vsaki celici, kjer je čebelja ličinka odmrla zaradi hude gnilobe, nastane več milijard novih spor, ki jih potem čebelar največkrat sam s prestavljanjem satja raznese v druge panje. Okužbo čebelnjaka s sporami lahko povečuje tudi čebelar z občasnim preventivnim dodajanjem antibiotikov, če je čebelnjak že okužen s sporami. Antibiotik sicer uniči rastoče bakterije, ki so ta hip v bolnih celicah, in tako odstrani vidne znake bolezni, število spor pa se medtem lahko poveča, s tem pa tudi verjetnost vnovičnega izbruha bolezni.
Da čebelarji ne bi še naprej tavali v temi, so Hansen, Shimanuki in drugi v minulih desetih letih izpopolnili in uvedli v prakso metodo za ugotavljanje števila spor v medu. Po izidih te analize čebelar izve, ali je njegov čebelnjak že okužen s sporami in kakšna je stopnja okuženosti. Zato lahko začne izvajati preventivne ukrepe in tako preprečevati, da bi bolezen sploh izbruhnila. Preventivni so le tisti ukrepi, ki zmanjšujejo število spor v čebelnjaku! Ugotavljanje stopnje okuženosti z analizo medu se je v zadnjih letih uveljavilo že v številnih državah po svetu. Znano je, da se ta bolezen vse bolj pojavlja povsod po svetu. Številni strokovnjaki to naraščanje pripisujejo prav občasni preventivni uporabi antibiotikov.
Lani smo metodo ugotavljanja spor v medu uvedli tudi pri nas, in sicer na pobudo Zveze čebelarskih društev Slovenije in ob podpori Republiške veterinarske uprave. Metodo je v prakso uvedel Inštitut za mikrobiologijo na veterinarski fakulteti.
PREISKAVA MEDU NA SPORE
Preiskavo medu na spore Bacillus larvae je v praksi mogoče opraviti le, če uporabimo posebno metodo, s katero na umetnem gojišču ugotovimo rast bakterij. Na teh gojiščih, na katera nanesemo preiskovani material (med), po določenem času (nekaj dni) iz spor vzklijejo rastoče (vegetativne) oblike bakterij, se tu hitro razmnožujejo in oblikujejo posebne vidne tvorbe, ki jih imenujemo kolonije. Videz kolonije B. larvae je precej specifičen, tako da izkušenemu preiskovalcu razlikovanje od kolonij drugih vrst bakterij, ki so navadno v preiskovanem materialu in ki tudi lahko zrastejo na umetnem gojišču, ne dela posebnih težav. Kolo-
nije drugih vrst bakterij, kot na primer kolonije vrste Bacillus alvei, pogosto rastejo hitreje kot kolonije B. larvae in jih prerastejo, tako da kolonij B. larvae ne opazimo oziroma ne spoznamo.
Da v preiskavi ne bi nastale takšne motnje, skušamo preiskovani material na različne načine predhodno obdelati (na primer segrevanje materiala na 80 do 90 °C od 5 do 10 minut) in dodajati gojišču posebne zaviralne snovi, ki včasih ustavijo rast nezaželenih bakterij na gojišču. Kljub temu se včasih zgodi, da je v posameznih vzorcih medu preveč spor drugih bakterij, to pa nam onemogoča preiskavo.
Kolonijo bakterij, za katero menimo, da je nastala iz spore B. larvae, preiščemo s posebnimi testi (tudi mikroskopsko), da zanesljivo dokažemo vse lastnosti, značilne za to vrsto.
Raziskovalci (Hansen1 in drugi) so ugotovili, da številne spore B. larvae niso sposobne vzkliti na gojišču. Dokazali so, da od približno 2.000 spor v enem gramu medu na gojišču vzklije samo ena. To pa, na žalost, pomeni, da ne moremo ugotoviti navzočnosti spor v medu, če je število spor majhno. Za pregled vzorca medu na prisotnost spor S. larvae je navadno potrebna posebna priprava vzorca. V literaturi je opisanih več načinov priprave vzorcev. Vsem je skupno to, da vzorec pred nanašanjem na umetno gojišče za 5 do 10 minut termično obdelamo pri 80 do 90 °C . S tem ubijemo vse bakterije, ki niso v obliki spor.
Zažiganje okuženega satja je že stara metoda zatiranja hude gnilobe, ko se že pojavijo znaki bolezni. Foto: A. Gregorc
To je potrebno zaradi tega, da nam številne rastoče bakterije različnih vrst, ki so vedno v medu, ne zrastejo na umetnem gojišču in s tem ne preprečijo, da bi dognali pravilen rezultat preiskave.
V	začetku so pri preiskavah medu2 na prisotnost B. larvae po termični obdelavi nanašali manjše količine medu (pribl. 0,08 g) neposredno na umetno gojišče. Pozneje sta se uveljavila predvsem dva postopka priprave vzorcev za preiskavo.
Po enem postopku vzorec medu (posamezni preiskovalci uporabljajo različne količine, od 25 g do 125 g) najprej raztopimo v sterilni fiziološki raztopini, nato pa s centrifugiranjem pri velikem številu obratov dosežemo, da se bakterije ali njihove spore zberejo skupaj na dnu posode. Usedlino, v kateri so med drugim tudi spore, nato termično obdelamo, tako da ostanejo žive samo spore. Termično obdelano usedlino nanesemo na umetno gojišče. Da bi lahko ugotovili število spor B. larvae, hkrati pa zmanjšali možnost, da bi gojišče prerasle spore drugih vrst bakterij, na gojišče nanašamo različne točno odmerjene količine usedline.
Po drugem postopku3 med raztopino v sterilni fiziološki raztopini in nato vzorec prenesemo v dializno cev, ki jo tesno zapremo in namestimo v večjo količino vode (v 24 urah vodo večkrat zamenjamo). Skozi steno dializne cevi lahko prehajajo samo kristaloidi. Tako se s pomočjo ozmoze iz dializne cevi izloči (sladkor), v cevi pa se
nabere voda. V cevi ostanejo v vodi nekri-staloidi, predvsem pa morebitni večji trdni delčki (smeti) in mikrobi (bakterije in njihove spore). Vsebino cevi nato centrifugiramo. Nadaljnji postopek je enak prvemu. Če v vzorcu pričakujemo majhno število spor, si pri izolaciji spor B. larvae pomagamo tudi s filtracijo.
Laboratoriji sporočajo rezultate preiskav navadno z izrazom »pozitivno«, če v vzorcu ugotovijo spore B. larvae, oziroma »negativno«, če teh spor ne izolirajo. Nekateri ob rezultatu navedejo tudi število ugotovljenih spor B. larvae v enem ali petih gramih. Drugi ugotovljeno število spor izražajo s številom križcev. Na primer takole: Hornit-zky4 označuje pozitiven rezultat, če je v enem gramu medu ugotovil 2.000 do
40.000 spor, s » + «, če jih je ugotovil med
40.000 in 100.000 v enem gramu, s » + + «, če pa je spor v vzorcu več kot 100.000 v enem gramu, rezultat označi s »+ ++«.
Preizkušali smo vse opisane postopke za ugotavljanje spor Bacillus larvae v medu. Odločili smo se za postopek, po katerem večjo količino medu (50 do 150 g) raztopimo v sterilni vodi, centrifugiramo, usedlino termično obdelamo in jo v različnih točno znanih količinah nanesemo na več posebnih selektivnih gojišč. Vzorec inkubi-, ramo do 10 dni pri 36 °C. Če nam vsa gojišča, ki smo jih cepili za en vzorec, prerastejo druge vrste bakterij, postopek ponovimo.
Rezultate analiz smo v prvem letu prei-
Tabela 1: Rezultati preiskav medu na spore Bacillus laivae
Preiskava	Rezultat	Število	Odstotek
	pozitiven	116	39.73
Čebelnjakov	negativen	176	60.27
	skupaj	292	100.00
	pozitiven	137	42.02
Vzorcev medu	negativen	189	57.98
	skupaj	326	100.00
skav (1993) sporočali povečini z oznako »pozitivno« oziroma »negativno«. Le v nekaj primerih smo navedli tudi ugotovljeno število spor v enem gramu vzorca.
Preiskave vzorcev medu smo začeli julija 1993. Do 1. 12. 1993 smo pregledali 326 vzorcev medu 292 čebelarjev. Povečini so nam vzorce pošiljali v preiskavo pooblaščeni veterinarji. Rezultati preiskav so razvidni iz tabele številka 1.
V	začetne preiskave smo želeli zajeti predvsem vzorce iz okolišev z ugotovljeno hudo gnilobo čebelje zalege oziroma s sumom na to bolezen. Tak je bil tudi pred-
Dobro oskrbovana in ži-valna družina z močnim čistilnim nagonom je že precejšnja garancija, da se družina lahko do neke meje sama obrani okužbe. Foto: J. Mihelič
Grafikon L* Odstotek vzorcev glede na število spor Bacillus larvae
0(2-1
1-10 10-100 100-1000 Število spor (x 10.000)
> 1000
log Republiške veterinarske uprave, ki je financirala preiskave. Zaradi tega je bilo število pozitivnih vzorcev in število spor v vzorcih razmeroma veliko. Zelo podobne rezultate so v raziskavah ugotovili tudi v nekaterih drugih državah. Tako so v začetnih raziskavah v Avstriji5 leta 1992 preiskali le vzorce (79 domačih in 5 iz tujine) iz sumljivih in obolelih čebelnjakov. Ugotovili so 52,7 odstotka pozitivnih vzorcev.
V začetnih preiskavah od pošiljateljev vzorcev nismo zahtevali in povečini tudi nismo dobili podatkov o zdravstvenem stanju čebel glede na hudo gnilobo čebelje zalege. Tako nismo mogli primerjati ugotovljenega števila spor v posameznih vzorcih z zdravstvenim stanjem v čebelnjakih.
RAZPRAVA IN SKLEPI
V	prvem letu uvajanja metode nismo
namenili posebne pozornosti sistematiki odvzemanja vzorcev medu. Tako so bili vzeti vzorci medu iz bolnih družin, iz družin brez znamenj hude gnilobe in v večini primerov vzorci medu zadnjega točenja. V prihodnje bomo jemali samo povprečne vzorce, torej vzorce zadnjega točenja. Rezultat analize takega vzorca medu nam pove povprečno stopnjo okuženosti čebelnjaka. Stopnji okuženosti bodo potem prilagojeni tudi preventivni ukrepi.
Seveda bi bilo ugodno, če bi imeli dovolj preprosto metodo, po kateri bi hkrati lahko ugotovili stanje okuženosti oziroma navzočnosti spor v vsakem posameznem panju. Take metode intenzivno iščejo in preučujejo v svetu in tudi že pri nas.
Literatura:
1. Hansen, H.: Methods for determining the presence of the fouibrood bacterium Baciullus larvae in honey. Tidsskr. Planteavl 88 (1984), 325-328.
2. Hansen, H.: The incidence of the fouibrood bacterium Bacillus larvae in honeys retailed in Denmark. Tidsskr. Planteavl 88 (1984), 329-336.
3. Shimanuki, H.; Knox, D. A.: Improved Method
for the Detection of Bacillus larvae Spores in Honey. American Bee Journal, maj 1988, 353-354.
4. Hornitzky, M. A. Z.; Clark S.: Culture of Bacillus larvae from bulk honey samples for the detection of American fouibrood. Journal of Api-cultural Research, 30(1) (1992) 13-16.
5. Grimm, M.; Moosbeckhofer, R.: Untersuchung österreichischer Honige auf das Vorhandensein von Bacillus larvae - Sporen. Bienenvater 4 (1993), 167-171.