Pregledni œlanki - Review Articles Doloœanje mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma The mouse lymphoma mutagenicity assay (MLA) Andreja Plaper POVZETEK: V vsakdanjem æivljenju smo izpostavljeni øtevilnim kemikalijam, ki na naø organizem delujejo z razliœno mero økodljivosti. Ena od toksiœnih potencialov kemikalij je genotoksiœnost. V prispevku je opisana ena od metod, s pomoœjo katere prikaæemo in ovrednotimo genetske poøkodbe na sesalski celiœni liniji miøjega limfoma L5178Y tk (klon 3.7.2C). Celiœna linija je heterozigotna na Tk1 lokusu timidinske kinaze kromosoma 11. Mutacija v tem predelu kromosoma in inaktivacija tk alela povzroœi izgubo aktivnosti tega encima in s tem pridobitev rezistence na tri-fluorotimidin (TFT). Tako lahko mutante tk loœimo od nemutiranih celic. Mutirane celice, ki rastejo v selektivnem gojiøœu s TFT, kvantifici-ramo po doloœenem œasu, v katerem izrazijo svojo novo fenotipsko lastnost. Namen in cilj metode je prikazati potencial testne substance, da nducira mutacije na lokusu tk tk . Metoda je ena od testov mutagenosti, ki jih regulatorne organizacije uvrøœajo v standardno skupino testov za doloœanje genotoksiœnega potenciala zdravilnih uœinkovin, ki morajo biti izvedeni pred registracijo. Kljuœne besede: mutagenost, celice miøjega limfoma, L5178Y, rezistenca na TFT. SUMMARY: In everyday life we are exposed to many chemicals which express different toxic potential to our organism. One of them is geno-toxicity. In this paper, one of the methods which help to determine the genotoxic potential of chemicals is described. The method is mutagenicity assay on mouse lymphoma cell line (L5178Y tk 3.7.2C), heterozygous at the thymidine kinase locus (Tk1) on chromosome 11. Mutation on this part of the chromosome and inactivation of the tk allele induces trifluorothymidine (TFT) resistance, and tk mutants can be selected in a background of tk non-mutant cells. Mutant cells, grown in the media containing the selective substance TFT, are quantified after a certain period of time, during which the cells express the new phenotypic characteristic. The purpose and aim of the test method is a demonstration of the test material potential to induce forward mutations at the tk tk locus. The method is one of the mutagenicity tests included in the standard test battery for genotoxicity by regulatory agencies, and is obligatory for marketing authorisation of pharmaceuticals. Keywords: mutagenicity, mouse lymphoma cells, L5178Y, TFT resistance; OKRAJØAVE: TFT, tri-fluorotimidin; ATCC, American type culture collection; ICH, International conference on harmonisation of technical requirements for registartion of pharmaceuticals for human use - Mednarodna konferenca za harmonizacijo tehniœnih zahtev za registracijo farmacevtskih uœinkovin za humano uporabo; TK, timidinska kinaza; OECD, Organisation for Economic Co-operation and Development - Organizacija za ekonomsko sodelovanje in razvoj; DMSO, dimetil sulfoksid; R0P, gojiøœe RPMI 1640 z antibiotikom, natrijevim karbonatom in pluronikom F68; R5P, gojiøœe R0P s 5-odstotnim konjskim serumom; R10P, gojiøœe R0P z 10-odstotnim konjskim serumom; CM (cloning medium), gojiøœe za kloni-ranje: R0P z 20-odstotnim konjskim serumom, natrijevim piruvatom in antimikotiki; THGM, timidin, hipoksantin, glicin metotreksat,; THG, timidin hipoksantin, glicin; TMP, timidin monofosfat; UKEMS, United Kingdom Environmental Mutagen Society. 1 Uvod Mutageni potencial neke snovi pomeni zmoænost indukcije dedne spremembe genetskega materiala v celici ali organizmu. Mutacija lahko vkljuœuje en sam gen ali pa skupino genov. Genotoksiœnost je øirøi pojem. Razumemo ga kot zmoænost interakcije kemikalije z DNA ali s celiœnim aparatom, ki je vkljuœen v razmnoæevanje genoma (npr. topoizomeraze, delitveno vreteno). Za odobritev uporabe razliœnih kemikalij in proizvodov (pesticidov, kozmetiœnih preparatov, prehrambenih izdelkov in farmacevtikov) regulatorne agencije zahtevajo razliœne skupine genotoksiœnih testov. Kadar ocenjujemo mutagenost oz. genotoksiœnost kemikalije, moramo upoøtevati razliœne konœne uœinke takega delovanja: toœkaste mutacije na molekuli DNA, spremembe v øtevilu (poliplodija, aneuplodija) ali strukturi kromosomov (klastogeneza). Zato seveda preskuøanje genotoksiœnega potenciala uœinkovine z enim testom ne zadoøœa. Kombinacija primernih testov zagotavlja varno uporabo doloœenih kemikalij za ljudi. Med stroæje zakonodajne predpise gotovo sodijo smernice za varno uporabo zdravilnih uœinkovin. Primer predpisane skupine testov za testiranje genotoksiœnosti farmacevtikov vsebuje tri postopke. Prvi je in vitro test povratnih mutacij na bakterijah (Salmonella sp. ali Escherichia sp.), za katerega se je izkazalo, da zazna odgovarjajoœe genetske spremembe za veœino genotoksiœnih glodalskih karcinogenov (1). Druga, tudi in vitro metoda, je doloœanje genskih poøkodb na celicah miøjega lim- dr. Andreja Plaper, KRKA, d. d., Ømarjeøka cesta 6, 8501 Novo mesto farm vestn 2005; 56 115 Pregledni œlanki - Review Articles foma (MLA - mouse lymphoma assay) ali alternativno, test za cito-genetsko vrednotenje kromosomskih poøkodb. Ena ali druga metoda je obvezna v predpisani skupini. Testi na sesalskih celicah zaznajo poøkodbe na DNA, ki jih na bakterijskih celicah ne moremo zaznati (klastogeni uœinki, kromosomske aberacije). Postopki na sesalskih celicah so pomembno dopolnilo predvsem za tiste snovi, ki imajo negativen rezultat na bakterijskem testu za doloœanje mutagenosti. Obvezen v predpisani skupini genotoksiœnih testov je tudi eden od in vivo testov. Ta namreœ zagotovi model, v katerem so vkljuœeni dodatni faktorji, ki vplivajo na genotoksiœno aktivnost spojin. Ti faktorji so absorpcija, distribucija, metabolizem in izloœanje snovi. Za ta namen je primeren in vivo test za zasledovanje kromosomskih poøkodb na glodalskih hematopoietiœnih celicah, ki je lahko analiza kromosomskih aberacij na celicah kostnega mozga ali analiza mikronukleusov v kostnem mozgu ali eritrocitih periferne krvi. Øele kombinacija naøtetih in vitro in in vivo metod zagotavlja konœno oceno varnosti uporabe neke snovi za œloveka. Namen prispevka je prikazati eno od metod, ki so predpisane v obvezni skupini testov za doloœanje genotoksiœnega potenciala kemikalij - metodo doloœanja genskih mutacij na celicah miøjega lim-foma (MLA). Metoda je validirana in se vrsto let uporablja za preizkuøanje mnogih kemikalij (2–7). Testiranje mutacij na speci-fiœnem lokusu sesalskih celic in vitro lahko uporabljamo za prikaz in kvantifikacijo genetskih poøkodb. V prispevku so podani: status metode, zakonodajne zahteve, protokol za izvedbo metode in kriteriji za analizo in evalvacijo rezultatov. 1.1 Zgodovina nastanka mutirane celiœne linije Od leta 1964 so znanstveniki v kulturah sesalskih celic inducirali mutacije, med drugim z namenom, da bi pripravili celiœne linije, na katerih bi bilo mogoœe opazovati mutageni potencial kemikalij (8, 9). Heterozigotni sistem timidinske kinaze, kjer je tk+ lokus mutiran v tk-lokus, je leta 1972 opisal Clive s sodelavci (10) in temelji na celiœni liniji miøjega limfoma, ki jo je osnoval Fisher leta 1958 (11). Bolj natanœen opis testa je Clive s sodelavci objavil leta 1975 (11). Obstajata dve metodi za izvajanje testa: pomnoæevanje (kloniranje) celic v mehkem agarju in novejøa, suspenzijska metoda, ki jo izvajamo v mikrotitrskih ploøœicah (14). +/- 1.2 Genetska osnova testa V MLA uporabljamo celiœno linijo miøjega limfoma L5178Y TK+/- (klon 3.7.2C), ki je heterozigotna v lokusu timidinske kinaze (Tk1) na kromosomu 11. Celice z aktivno timidinsko kinazo (TK) reagirajo na cito-statiœne in citotoksiœne uœinke trifluorotimidina (TFT), tako da odmrejo. Povratne mutacije aktivnega gena TK povzroœijo izgubo aktivnosti tega encima in s tem pridobitev rezistence na TFT. Mutirane celice torej lahko rastejo v prisotnosti TFT, medtem ko normalne celice ne morejo. Mutante kvantificiramo po doloœenem œasu, v katerem izrazijo novo fenotipsko lastnost tako, da jih razmnoæujemo v gojiøœu, ki mu dodamo selektivno substanco TFT (10, 11, 12). 1.3 Zakonodajne zahteve Vrednotenje genotoksiœnega potenciala neke snovi, ki ga zahtevajo mednarodne regulatorne agencije, je doloœeno v razliœnih dokumen- tih. Za registracijo farmacevtskih uœinkovin moramo upoøtevati zahteve in navodila Organizacije za ekonomsko sodelovanje in razvoj (OECD) (15) in Mednarodne konference za harmonizacijo tehniœnih zahtev za registracijo farmacevtskih uœinkovin za humano uporabo (ICH). ICH je v okviru svojih navodil izdala dve poglavji, ki doloœata izbor metod za doloœanje genotoksiœnosti in navodila za izvajanja teh metod: S2A – Navodilo za specifiœne vidike veljavnih genotoksiœnih testov za farmacevtike (16) in S2B – Standardna skupina testov za doloœanje genotoksiœnosti (17). OECD doloœa pravila izvajanja metode MLA v poglavju 476 (15). 2 Postopek +/- 2.1 Celice Za MLA uporabljamo celice miøjega limfoma, klon L5178Y TK 3.7.2C, ki ga lahko kupimo v zbirki ATCC (CRL-9518) ali zbirki Jane Cole, UK. Celice uvrøœamo v varnostni razred 1 (biosafety level: 1) kar pomeni, da je delo s celicami varno z upoøtevanjem obiœajnih pravil ravnanja z bioloøkim materialom v laboratoriju. Celice rastejo v suspenzijski kulturi z generacijskim œasom 11 ur. Imajo stabilno øtevilo diploidnih kromosomov (11) 2.2 Metaboliœna aktivacija Navodila OECD zahtevajo izvajanje MLA v prisotnosti in odsotnost metaboliœne aktivacije. Za metaboliœno aktivacijo uporabljamo encime, ki jih pridobimo iz podganjih jeter, induciranih z znanim induktorji citokromov P450 (Na-fenobarbiton, (3-naftoflavon ali aroclor 1254). Pripravimo postmitohondrijsko frakcijo sesalskih jeter (S9), ki jo v konœnem testnem vzorcu dodamo od 1 % do 10 %. S9 je na voljo komercialno (Molecular Toxicology, Boone, NC, USA) ali jo pripravimo sami po postopku, ki ga je opisal Ames s sodelavci (18) 2.3 Gojiøœa in pogoji za vzgojo celic Za gojenje celic uporabljamo gojiøœe RPMI 1640 z glutaminom (0,3 g/l) brez natrijevega karbonata, ki ga dodajamo naknadno do 0,11 % (R0P). Za razliœne namene v poskusu dodajamo toplotno inaktiviran konjski serum: 5 % v gojiøœe, v katerem celicam dodajamo testno substanco (R5P), 10 % v gojiøœe za gojenje celic (R10P) in 20 % v gojiøœe za pomnoæevanje celic (CM). Obvezno dodajamo tudi pluronik F68 (0,5 %), ki zagotavlja suspenzijsko rast celic (6) in antibiotik. Gojiøœu za razmnoæevanje celic poleg 20 % seruma dodamo tudi antimikotik in Na-piruvat (1,9 mM) Selektivno gojiøœe V testu uporabljamo dve selektivni gojiøœi: gojiøœe za razmnoæevanje celic z dodatkom TFT (tri fluoro timidin), ki zagotavlja kvantifikacijo in karakterizacijo mutant TK , in THGM, oœiøœevalno gojiøœe, ki odstran spontane mutante in optimizira obœutljivost metode. Sestava THGM je naslednja: timidin (0,03 %), hipoksantin (0,05 %), glicin (0,075 %) metotreksat (10 µg/ml) 2.4 Odstranjevanje spontanih mutant + - - - Heterozigotne celice tk tk v suspenziji spontano mutirajo v tktk z mutacijsko frekvenco 2 x 10 mutacij na generacijo (12, 13) Homozigotne mutante moramo pred poskusom odstraniti 116 farm vestn 2005; 56 Doloœanje mutagenega potenciala snovi na celiœni liniji miøjega limfoma Odstranitev spontanih tk-/- mutant omogoœa metoda s posebnim gojiøœem THGM. Gojiøœe vsebuje metotreksat, ki inhibira timidilatno sintazo odvisno od folata in s tem sintezo timidin monofosfata. Celice so zato prisiljene uporabljati zunajceliœni timidin, ki pa ga mora fosfo-rilirati timidinska kinaza. Homozigotne mutante TK-/- ne morejo fosfo-rilirati eksogenega timidina in odmrejo zaradi pomanjkanja TMP. Drugi dve sestavini gojiøœa sta hipoksantin in timidin, ki ju dodamo zato, da nadomestimo blokado metabolizma folata in posredno sintezo puri-nov. Glicin dodamo kot vir metilnih skupin (13). Celice rastejo v gojiøœu THGM 24 ur, nato jih speremo in resuspendiramo v THG (THGM brez metotreksata). Oœiøœene celice uporabimo za eksperiment, preostanek zavræemo. 3 Doloœanje mutagenosti 3.1 Topnost testnega materiala Topnost testne substance preizkusimo v razliœnih topilih. Za topne substance je najviøja koncentracija, ki jo izberemo, odvisna od tok-siœnosti le-te, vendar ne sme presegati koncentracije 5 mg/ml. Organska topila naj ne bi presegala 1 % skupnega volumna vzorca. 3.2 Testiranje toksiœnosti substance Odmerki uœinkovine za testiranje mutagenosti morajo segati do tok-siœnih koncentracij. Najviøje uporabljene koncentracije dovoljujejo preæivetje v obmoœju od 10-20 % glede na vzporedne kontrole, ki vsebujejo le topilo. Pred testom mutageneze doloœimo toksiœni potencial substance z meøanico S9 in brez nje. Za test uporabimo nasiœeno raztopino substance in øe 8 razredœitev. Celice izpostavimo substanci tako, kot je doloœeno v testu mutagenosti, le da v tem primeru ne delamo v duplikatu. Po tretiranju doloœimo gostoto celic s hemocito-metrom, prilagodimo koncentracijo do 8 celic/ml in po 0,2 ml zaseje-mo na 2 mikrotitrski ploøœi s 96 vdolbinami. Kulture inkubiramo 9 dni na 37 °C v 5-% CO2 atmosferi. Øtevilo negativnih vdolbin po 9 dneh in gostota celic, ki jo doloœimo po tretiranju s substanco, sluæita za izraœun relativnega preæivetja (RS - relative survival)) za vsako celiœno kulturo na dan 0. 3.3 Test mutagenosti Naredimo dva popolna testa mutagenosti v prisotnosti in odsotnosti meøanice S9. Vse kulture, ki jih izpostavimo testni substanci, pozitivnim in negativnim kontrolam, tretiramo v duplikatu. V prvem poskusu izberemo 6 koncentracij. Najviøja koncentracija za prvo testiranje je tista, ki inducira skoraj 100-% smrtnost celic. Dodatne koncentracije izberemo z namenom, da bi dobili rezultate za kritiœne toksiœne koncentracije, tj. v obmoœju od 10-20 % preæivetja. Za netoksiœne substance najviøja koncentracija navadno ne presega 5 mg/ml. Za drugi poskus lahko koncentracije spremenimo, tako da doseæemo ustrezen nivo toksiœnosti. 3.3.1 Pozitivna in negativna kontrola Negativna kontrola so celiœne kulture, ki jih obdelamo popolnoma enako kot kulture v testu, le da namesto substance dodajamo topilo, v katerem raztapljamo preizkuøanec. Kot pozitivno kontrolo lahko uporabimo razliœne mutagene. Pozitivna kontrola, ki potrebuje metaboliœno aktivacijo z meøanico S9, je za indukcijo malih in velikih kolonij obiœajno 3-metilkolantren (3-MC topen v DMSO). Konœna koncentracija v celiœni kulturi je 2,5 µg/ml Mutagena kemikalija, ki ne potrebuje metaboliœne aktivacije, je za indukcijo velikih kolonij, etilmetan sulfonat (EMS), katerega konœna koncentracija v kulturi je 250 µg/ml. Za indukcijo malih kolonij pa uporabljamo metilmetan sulfonat do konœne koncentracije 15 µg/ml 3.3.2 Tretiranje kultur V gojiøœu, ki ga uporabljamo ob tretiranju, zmanjøamo nivo seruma do 5 %, ker previsoka koliœina seruma lahko zabriøe uœinek nekaterih mutagenov (12). Za vsako pozitivno in negativno kontrolo ter vsako testno koncentracijo pripravimo po dve centrifugirki. V vsak par cen-trifugirk dodamo odgovarjajoœo koliœino gojiøœa, celice do koncentracije 6 x 10 celic/ml, meøanico S9 oz. gojiøœe, pozitivno kontrolo oz. topilo ali eno od koncentracij preizkuøanca. Vse epruvete inkubiramo na rolerju 4 ure pri 37 °C. Odvzamemo majhen vzorec celic (~0,2 ml) iz vsake kulture in doloœimo øtevilo celic (øtevilo celic dneva 0). Celice nato speremo z 20 ml gojiøœa R10P in resuspendiramo v R10P do gos- 5 tote ~ 3x10 celic/ml. Del kultur razredœimo v gojiøœu CM do koncentracije 8 celic/ml. V vsako vdolbino na ploøœici zasejemo po 200 µ razredœene kulture. Inkubiramo v CO2 inkubatorju 9 dni. Relativno preæivetje doloœimo na enak naœin, kakor je opisano pri testiranju toksiœnosti Naslednji dan celice ponovno preøtejemo (øtevilo celic na dan 1) in jih razredœimo tako, da imajo gostoto ~ 3x10 celic/ml. Kulture damo nato nazaj v inkubator, kjer jih pustimo øe en dan Tretji dan (dan 2) celice spet preøtejemo. Vse pozitivne in negativne kontrole ter tiste kulture, ki so bile izpostavljene øtirim najviøjim koncentracijam testne substance in imajo najmanj 3x10 celic/ ml, izberemo za izraæanje genetskih poøkodb 3.3.3 Izraæanje genetskih poøkodb Uœinkovitost kloniranja Vsako kulturo razredœimo v gojiøœu za pomnoæevanje celic (CM) do 8 celic/ml. Po 200 µl kulture odpipetiramo na mikrotitrske ploøœe s 96 vdolbinami Selekcija mutant Selekcijo mutant izvedemo tako, da h gojiøœu CM dodamo TFT (3 µg/ml). Celice resuspendiramo v selekcijskem gojiøœu (1x10 celic/ml) in razdelimo po 200 µl na mikrotitrske ploøœice s 96 vdolbinami Vse ploøœe inkubiramo pri 37°C v atmosferi 5 % CO2, 95 % zraka (v/v) dokler se kolonije popolnoma ne razvijejo (9 dni za doloœanje uœinkovitosti kloniranja in 12 dni za selekcijo mutant). Po konœanem poskusu pregledamo ploøœe pod lupo z osvetljeno podlago. Na ploøœah poskusa uœinkovitosti kloniranja (iz dneva 2) po devetih dneh preøtejemo prazne jamice. Izraœunamo uœinkovitost kloniranja (cloning efficiency-CEnemutante) Na ploøœah poskusa selekcije mutant po 12 dneh preøtejemo vdolbine, ki imajo male kolonije, in vdolbine, ki vsebujejo velike kolonije. Izraœunamo øtevilo praznih vdolbin. Molekularna osnova za velike in male kolonije øe ni povsem razjasnjena. Ena hipoteza predpostavlja gen, ki kontrolira celiœno rast in naj bi bil blizu Tk1 gena (19) farm vestn 2005; 56 1 Pregledni œlanki - Review Articles Poøkodba kromosoma v tem delu naj bi vodila do upoœasnjene rasti celice. Ugotovili so, da pri malih kolonijah dejansko prihaja do kromosomskih aberacij in nastajanja mikronukleusov z veœjo frekvenco kot pri velikih kolonijah (20, 21). Avtorji so zakljuœili, da doloœitev øtevila malih kolonij lahko nakazuje obseg klastogenosti testirane substance poleg mutagenosti, ki jo pokaæejo velike kolonije. Iz podatkov, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa selekcije mutant, doloœi-mo razmerje med malimi in velikimi kolonijami in uœinkovitost kloniran-ja za mutante (CEmutante). Iz razmerja (CEmutante) / (CEnemutante) izraœu-namo mutacijsko frakcijo. 3.3.4 Izraœuni IZRAŒUN RELATIVNEGA PREÆIVETJA Uœinkovitost kloniranja (CE-cloning efficiency) Iz razmerja med praznimi in polnimi jamicami izraœunamo uœinkovitost kloniranja (CE) po naslednji formuli (22): P(o) = prazne jamice/vse jamice CE = -ln(P(o))/øtevilo celic na jamico Faktor celiœnega øtetja (CCF – cell count factor) Na zaœetku eksperimentiranja je gostota celic 3x105 celic/ml. Vsako odstopanje od te gostote na koncu eksperimentiranja izraœunamo tako, da øtevilo celic v individualni kulturi, ki smo jo tretirali, delimo s popreœjem øtevila celic v kontrolnih kulturah: CCF = individualna vrednost gostote celic po tretiranju /srednja vrednost gostote celic, tretiranih s topilom Preæivetje Preæivetje (S – survival) izrazimo kot zmnoæek uœinkovitosti kloniranja (CE) s faktorjem celiœnega øtetja CCF: S = CE x CCF Relativno preæivetje Relativno preæivetje (RS) je izraæeno kot razmerje med vrednostjo preæivetja (S) individualne kulture in popreœno vrednostjo preæivetja (S) kontrolnih kultur. RS = S individualne kulture/ popreœna vrednost S kontrolnih kultur. RELATIVNA SUSPENZIJSKA RAST (RSG – relative suspension growth) Pri testiranju toksiœnosti doloœimo tudi relativno suspenzijsko rast, to je zmoænost kulture, da se namnoæi v dveh dneh do gostote 3 x 105 celic/ml: Izraœun za totalno suspenzijsko rast je: (øtevilo celic dneva 1 /konœna koncentracija dneva 0) x (øtevilo celic dneva 2 /konœna koncentracija dneva 1) % RSG (relativna suspenzijska rast) = ((vrednost suspenzijske rasti individualne kulture) / (vrednost suspenzijske rasti za popreœje kontrolnih kultur)) x 100. OCENA PREÆIVETJA CELIC Priporoœeno izhodiøœe za oceno preæivetja pri poskusu na mikrotitrskih ploøœah je relativno preæivetje v dnevu 0. Relativno preæivetje v dnevu 0 predstavlja uœinkovitost kloniranja kulture takoj po tretiranju. Izraœun je prilagojen tako, da upoøteva izgubo celic zaradi toksiœnosti med tretiranjem (22). Izraœun relativnega preæivetja izvedemo po naslednjem postopku: Na ploøœah za poskus uœinkovitosti kloniranja preøtejemo prazne jamice. Iz teh podatkov izraœunamo uœinkovitost kloniranja (CE), faktor celiœnega øtetja (CCF), preæivetje (S) in relativno preæivetje (RS) po formulah toœke 3.3.4. Iz podatkov øtevila celic v posamezni kulturi ob upoøtevanju dnevnih razredœitev izraœunamo totalno suspenzijsko rast in relativno suspen-zijsko rast (RGS) po formulah toœke 3.3.4. OCENA MUTACIJSKIH FRAKCIJ Mutacijsko frakcijo doloœimo tako, da izraœunamo razmerje med uœinkovitostjo kloniranja mutant (CEmutant) in uœinkovitostjo kloniranja nemutant (CE nemutant). Uœinkovitost kloniranja nemutant (CE nemutant) izraœunamo iz øtevila praznih jamic, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa uœinkovitosti kloniranja dneva 2 po formuli iz toœke 3.4.4. Upoøtevamo øtevilo zasejanih celic (1,6 celic/ jamico). Uœinkovitost kloniranja za mutante (CEmutant) izraœunamo iz øtevila praznih jamic, ki jih dobimo iz ploøœe poskusa selekcije mutant po enaki formuli kot zgoraj. Upoøtevamo, da smo na teh ploøœah zasejali 2000 celic na jamico. Mutacijsko frakcijo izraœunamo iz razmerja mutacij med kulturo, ki smo jo gojili v selektivnem gojiøœu, in kulturo, ki smo jo gojili v nese-lektivnem gojiøœu. Mutacijska frakcija = CEmutant / CE nemutant Vsako mutacijsko frakcijo izrazimo glede na 106 æivih celic. Frakcija velikosti kolonij Za vsako kulturo doloœimo razmerje med øtevilom malih in velikih kolonij. 4 Analiza in interpretacija rezultatov 4.1 Statistiœna analiza Statistiœno znaœilno frekvenco mutacij doloœimo v skladu z navodili UKEMS (23). Logaritem frekvence mutacij kontrole primerjamo z logaritmom frekvence mutacij vsake testirane koncentracije z Dunnettovim testom. Iz podatkov, ki smo jih pridobili s testiranjem, z uteæno regresijo preverimo linearni trend mutacijske frekvence. Test za linearni trend je »enorepi«, negativnega trenda ne upoøtevamo. Ta test potrebuje izraœun faktorja heterogenosti, da dobimo modificirano oceno variance. 4. 2 Kriteriji za veljaven poskus Poskus je veljaven, œe doseæemo kriterije, ki se ujemajo z navodili UKEMS (21) in sklepi Portlandskega delovnega sreœanja (24). Doseœi moramo naslednje kriterije: 1. Frekvenca mutacij negativne kontrole (topilo) mora doseœi vrednosti, ki so znotraj normalnega obmoœja (nad 60 mutant na 106 118 farm vestn 2005; 56 Doloœanje mutagenega celic, vendar ne trikrat veœ od srednje vrednosti zgodovinskih okvirov) (23, 24). 2. Vsaj ena koncentracija vsake pozitivne kontrole mora izzvati statis-tiœno znaœilno poveœanje frekvence mutacij 3. Uœinkovitost kloniranja negativnih kontrol iz eksperimentov mutagenosti mora biti v okviru med 60 in 140 % na dan 0 in med 70 in 130 % na dan 2 (23, 24). 4. Ne smejo se pojavljati tehniœni problemi, kot je npr. kontaminacija, prevelika toksiœnost, spremembe ozmolarnosti ali pH. 4.3 Kriteriji za vrednotenje rezultatov Preizkuøanec ocenimo kot mutagen, œe so izpolnjeni naslednji kriteriji: 1. œe je poskus veljaven (toœka 4.2); 2. œe je frekvenca mutacij ene ali veœ testiranih koncentracij statis-tiœno veœja od negativne kontrole (p<0,05); 3. œe analiza linearnega trenda pokaæe od doze odvisno poveœanje frekvence mutacij. 5 Sklep Kriteriji za mutagenost, ki jo doloœimo s tem testom, so enaki za vse kemikalije. Konœna ocena o varnosti je odvisna od rezultatov ostalih testov in namena uporabe snovi. Pri zagotavljanju varne uporabe far-macevtikov je potrebno pred prvim preizkuøanjem zdravilne uœinkovine na œloveka narediti in vitro teste za vrednotenje mutacij in kromosomskih poøkodb. Standardna skupina predpisanih testov (omenjena v uvodu prispevka) mora biti narejena pred zaœetkom II. stopnje kliniœnega preskuøanja zdravila. Opisana metoda je torej eno od pomembnih orodij farmacevtske industrije za zagotavljane varne uporabe zdravilnih uœinkovin. 6 Literatura 1. Ames BN, McCann J, Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/Mammalian-microsome mutagenicity test. Mutation Res 1975; 347-64). 2. McGregor DB, Martin R, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay to Coded Chemicals.I: Results for Nine Compounds. Environ Mutag 1987; 9: 143-160. 3. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay II: 18 Coded Chemicals. Environ Molec Mutag 1988; 11; 91-118. 4. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Riach C Caspary WJ. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay III: 72 Coded Chemicals. Environ Molec Mutag 1988; 12:85-154. 5. McGregor DB, Brown A, Howgate S, McBride D P, Riach CG , Caspary WJ,. Responses of the L5178 tk+/tk- Mouse Lymphoma Cell Forward Mutation Assay V: 27 Coded Environ Molec Mutag 1991; 17: 196-219. 6. McGregor DB, Brown A, Cattanach P, Edwards I, McBride D, Riach C Shepherd W, Caspary WJ. Responses of the L5178Y Mouse Lymphoma Forward Mutation Assay: V. Gases and Vapors. Environ Molec Mutag 1991;17: 122-29. snovi na celiœni liniji miøjega limfoma 7. Clive D, Johnson KO, Spector JF, Batson AG, Brown MM. Validation and Characterization of the L5178Y/TK± mouse lymphoma mutagen assay system. Mut Res 1979; 59(1): 61-108. 8. Ficher, GA and Sartorelli AC. Develpment, Maintenance and Assay of Drug Resistance. Methods in Medical Research 1964; 10: 247-62. 9. Kao FT and Puck TT. Genetics of somatic mammalian cells, VII. Induction and isolation of nutritional mutants in Chinese hamster cells.Procedures of National Academy of Science USA 1968; 60: 1275-81. 10. Clive D, Flamm WG, Machesko MR, Bernheim NJ. A Mutational Assay System Using the Tymidine Kinase Lokus in Mouse Lymphoma Cells. Mutation Res 1972;16: 77-87. 11. Fisher GA. Studies of The Culture of Leukemia Cells In vitro Ann Ny Acad Sci 1958; 76: 673-80. 12. Clive D, Spector JFS. Laboratory Procedure for Assessing Specific Locus Mutations at the TK Locus in Cultured L5178Y Mouse Lymphoma Cells. Mut Res 1975;31: 17-29. 13. Clive D, Caspary W, Kirby PE, Krehl R, MOore M, Mayo J, Oberly TJ. Guide for Performing the Mouse Lymphoma Assay for Mammalian Cell Mutagenicity. Mut Res 1987; 189: 143-156. 14. Cole J, Arlett CF, Green MHL, Lowe J Muriel W. A comparison of the agar cloning and microtitration techniques for assaying cell survival and mutation frequency in L5178Y mouse lymphoma cells. Mut Res 1983; 111: 371-386. 15. OECD guidelines for testing of chemicals; Section 4, Subpart 476; OECD, 1997. 16. ICH Topic S2A; Harmonised Tripartite Guideline CPM/ICH/141/95, approved September 1995 Guidance on Specific Aspects of Regulatory Genotoxicity Tests for Pharmaceuticals; ICH 1995. 17. ICH Topic S2B: Genotoxicity: A Standard Battery for Genotoxicity Testing of Pharmaceuticals for Humane Use. Step 4 Guideline, Brussels; ICH 1997. 18. Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mut Res 1983;113: 173-215. 19. Liechty MC, Scalzi JM, Sims KR, Crosby H, Spencer DL, Davis LM, Caspary WJ and Hoizer JC. Analysis of large and small colony L5178Y tk-/- mouse lymphoma mutants by loss of heterozygosity (LOH) and by whole chromosome 11 painting: detection of recombination. Mutagenesis 1998; 13: 461-474. 20. Hozier J, Sawyer J, Moore M, Howard B, Clive D. Cytogenetic analysis of the L5178Y tk-/- ?tk-/- mouse lymphoma mutagenesis assay system. Mutat Res 1981; 84: 169-181. 21. Blazak WF, os FJ, Rudd CJ, Caspary WJ. Chromosome analysis of small and large L5178Y mouse lypmhoma cell colonies from mutagen-treated and control cultures. Mutat Res 1989; 224: 197-208. 22. Clements J. The Mouse Lymphoma Assay. 2000. Mut Res 455: 97-110. 23. Robinson WD, Green MHL, Cole J, Garner RC, Healy MJR, Gatehouse D, 1989; Statistical evaluation of bacterial/ mammalian fluctuation tests. V Statistical Evaluation of mutagenicity test data (Edited by Kirkland DJ) Cambridge University Press, pp 102-140. 24. Clive D, Bolcsfoldi G, Clements J, Cole M, Honma J, Majeska M, Moore L, Muller B, Myher T, Oberly M, Oudelhkim MC, Rudd C, Shimada H, Sofuni T, Thybaud V, Vilcox P. Consensus agreement regarding protocol issues discussed during the mouse lymphoma workshop: PortlandOregon, May7, 1994; Environ Mol Mutagen 1995; 25: 165-168. farm vestn 2005; 56