ERK'2019, Portorož, 318-321 318 Ugotavljanje prvotne stopnje anizotropnosti miˇ siˇ cnega tkiva praˇ siˇ ca z dinamiˇ cnim modelom elektroporacije ex vivo Rok ˇ Smerc 1 , Samo Mahniˇ c-Kalamiza 1 , Matevˇ z Pintar 2 , Janez Langus 2 , Tomaˇ z ˇ Suˇ star 2 , Damijan Miklavˇ ciˇ c 1 1 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Trˇ zaˇ ska cesta 25, 1000 Ljubljana 2 C3M d.o.o., Tehnoloˇ ski park 21, 1000 Ljubljana E-poˇ sta: rok.smerc@fe.uni-lj.si Determining the initial degree of anisotropy of porcine skeletal muscle tissue using the dynamic model of electroporation ex vivo Skeletal muscles are, due to their large size and ease of access, the most widely used tissue for gene electrotrans- fer. Electrical conductivity of skeletal muscles exhibits a high degree of anisotropy, i.e. the electric conductivity in the direction of the muscle fibres is considerably higher than the electric conductivity in the direction perpendic- ular to the muscle fibres. For successful numerical mod- elling that can be used for optimisation of electric pulse parameters and the geometry of the electrodes, electric properties of the skeletal muscles need to be known. In the present study, an attempt was made to determ- ine the degree of initial, i.e. pre-treatment anisotropy of porcine skeletal muscle tissue (Longissimus dorsi) by us- ing ex vivo measurements of the electric voltage and cur- rent in the aforementioned tissue combined with numer- ical modelling. Two different orientations of the electodes with respect to the muscle fibres were used. The first ori- entation, whereby the electrodes are inserted in such a way that the direction of the applied electric field is the same as the direction of the muscle fibres, and the second, whereby the direction of the applied electric field is per- pendicular to the direction of the muscle fibres. With the recently developed dynamic finite-element model we pro- duced curves relating the normalized expected electrical current to the electrode-to-muscle fibre orientation for different values of the ratio of anisotropy, and for differ- ent applied voltages. We then used these curves in order to assess what could have been the initial degree of an- isotropy of porcine skeletal muscle before applying elec- troporation. The initial degree of anisotropy was thusly assessed for 10 pairs of measurements, made in the por- cine skeletal muscle ex vivo. 1 Uvod Z izpostavitvijo celice elektriˇ cnemu polju dovolj visoke jakosti, postane njena membrana zaˇ casno bolj prepustna za molekule, za katere je sicer slabo ali neprepustna. Ta pojav imenujemo elektroporacija ali elektropermea- bilizacija [1]. Elektroporacija je dandanes uveljavljena metoda v razliˇ cnih biomedicinskih aplikacijah, kot so na primer elektrokemoterapija, genska elektrotransfek- cija, DNK vakcinacija, ablacija tkiv z metodo ireverzi- bilne elektroporacije, kot tudi v biotehnoloˇ skih aplikaci- jah, npr. za ekstrakcijo biomolekul iz mikroorganizmov in rastlin ter za inaktivacijo mikroorganizmov [2, 3]. Pri genski transfekciji z uporabo metode reverzibilne elektroporacije olajˇ samo prehajanje genskega materiala (obiˇ cajno plazmidne DNK) v celice. Najpogosteje upora- bljena tkiva za gensko elektrotransfekcijo so zaradi svoje velikosti in enostavne dostopnosti skeletne miˇ sice. Ker se miˇ siˇ cne celice ne delijo, je izraˇ zanje genov po genski ele- ktrotransfekciji dolgo prisotno [4, 5]. Elektroporacijski pulzi poleg tega, da poveˇ cajo prepustnost celiˇ cne mem- brane, prek elektroforetske sile omogoˇ cijo veˇ cje ˇ stevilo vezav med plazmidno DNK in celiˇ cnimi membranami, ki so potrebne za uspeˇ snost genske transfekcije [6]. Zato je za doseganje visoke uˇ cinkovitosti genske elektrotransfek- cije kljuˇ cnega pomena optimizirati parametre elektriˇ cnih pulzov in geometrijo elektrod upoˇ stevaje lastnosti cilj- nega tkiva, pri ˇ cemer si lahko pomagamo z numeriˇ cnim modeliranjem [7, 8]. Z vidika numeriˇ cnega modelira- nja je pomembno dobro poznavanje elektriˇ cnih lastno- sti tkiva. Pregled literature kaˇ ze, da skeletne miˇ sice iz- kazujejo izrazito anizotropne elektriˇ cne lastnosti [9–12]. Ugotovljeno je bilo, da je elektriˇ cna prevodnost skeletnih miˇ sic v smeri vlaken viˇ sja od elektriˇ cne prevodnosti v smeri pravokotno na vlakna. V priˇ cujoˇ ci ˇ studiji smo skuˇ sali na podlagi ex vivo me- ritev elektriˇ cne napetosti in elektriˇ cnega toka med elek- troporacijo v hrbtni miˇ sici (Longissimus dorsi) praˇ siˇ ca in z uporabo numeriˇ cnega modeliranja doloˇ citi prvotno sto- pnjo anizotropnosti uporabljene skeletne miˇ sice, tj. sto- pnjo anizotropnosti miˇ sice preden so njene lastnosti spre- menjene zaradi elektroporacije. 2 Metode 2.1 Protokol meritev in geometrija uporabljenih ele- ktrod Meritve elektriˇ cne napetosti in elektriˇ cnega toka so bile opravljene ex vivo v hrbtni miˇ sici (Longissimus dorsi) praˇ siˇ ca. Opravljenih je bilo deset parov meritev z apli- ciranimi napetostmi med 60V in 225V. Par meritev se- stavljata meritvi pri enaki napetosti v dveh razliˇ cnih ori- entacijah elektrod glede na smer miˇ siˇ cnih vlaken; v pr- vem primeru je orientacija elektrod takˇ sna, da je smer elektriˇ cnega polja enaka smeri miˇ siˇ cnih vlaken, v drugem primeru pa je orientacija elektrod takˇ sna, da je smer elek- 319 triˇ cnega polja pravokotna na smer miˇ siˇ cnih vlaken. S pro- totipnim elektroporatorjem [13] (Univerza v Ljubljani, Fakulteta za elektrotehniko, Laboratorij za biokiberne- tiko) je bil za vsako meritev doveden en pulz dolˇ zine 100 μs, pri tem sta bila izmerjena in beleˇ zena elektriˇ cna napetost in tok. Slika 1 prikazuje shematski prikaz ori- entacije elektrod z ozirom na smer miˇ siˇ cnih vlaken. Pri tem je s’ oznaˇ cen kot med smerjo elektriˇ cnega polja in smerjo miˇ siˇ cnih vlaken. Uporabljeni sta bili dve para- lelni igelni elektrodi z aktivno dolˇ zino (dolˇ zina neizolira- nega dela v tkivo vstavljenih elektrod) 20mm in preme- rom0;7mm. Razdalja med centroma elektrod je znaˇ sala 4mm. mišična vlakna x y E φ z Slika 1: Shematski prikaz orientacije elektrod z ozirom na smer miˇ siˇ cnih vlaken. 2.2 Numeriˇ cno modeliranje Numeriˇ cno modeliranje smo izvedli z dinamiˇ cnim mo- delom, ki omogoˇ ca izraˇ cun ˇ casovnega poteka elek- triˇ cnega toka dovedenih elektroporacijskih pulzov z me- todo konˇ cnih elementov [14, 15]. Model je implemen- tiran kot dodatek za paket Wolfram Mathematica (Wol- fram Research, Champaign, Illinois) z dodatnimi paketi AceFEM in AceGen [16]. Model kot vhodne podatke sprejme ustrezno filtrirane in decimirane ˇ casovne signale napetosti, mreˇ zo konˇ cnih elementov, parametre, s kate- rimi definiramo elektriˇ cne in toplotne lastnosti uporablje- nega tkiva, ter parametre, ki definirajo dinamiko velikosti in ˇ stevila por med elektroporacijo. Nekateri izmed pa- rametrov so empiriˇ cne narave in so bili doloˇ ceni z iska- njem najboljˇ sega ujemanja med izmerjenimi elektriˇ cnimi tokovi v govejih jetrih ex vivo ter tokovi dobljenimi z nu- meriˇ cnimi simulacijami. Z modelom smo najprej doloˇ cili krivulje I norm (’), glej sliko 3, ki smo jih potem uporabili za doloˇ citev pr- votne stopnje anizotropnosti miˇ siˇ cnega tkiva. Krivulje na sliki 3 prikazujejo normirano priˇ cakovano vrednost elektriˇ cnega toka v odvisnosti od orientacije vstavlje- nih elektrod (kot ’) z ozirom na smer miˇ siˇ cnih vlaken za razliˇ cne vrednosti anizotropnega razmerja zaˇ cetnih elektriˇ cnih prevodnosti v smerix proti smeriy miˇ siˇ cnega tkiva, ki smo ga definirali kot: AR 0 xy = 0 xx = 0 yy ; (1) pri ˇ cemer je AR 0 xy anizotropno razmerje zaˇ cetnih elektriˇ cnih prevodnosti ne-elektroporiranega tkiva v smerix proti smeriy (v nadaljevanju kar krajˇ se anizotro- pno razmerje aliAR), 0 xx zaˇ cetna elektriˇ cna prevodnost miˇ siˇ cnega tkiva v smeri miˇ siˇ cnih vlaken in 0 yy zaˇ cetna elektriˇ cna prevodnost miˇ siˇ cnega tkiva v smeri, ki je pra- vokotna smeri miˇ siˇ cnih vlaken in pravokotna na smer vstavitve elektrod v tkivo (glej sliko 1). V modelu smo upoˇ stevali sigmoidno spreminjanje elektriˇ cne prevodnosti tkiva v odvisnosti od jakosti ele- ktriˇ cnega polja, pri ˇ cemer predpostavimo, da pride do poracije tkiva v smeri miˇ siˇ cnih vlaken (x) ˇ ze pri niˇ zji jakosti elektriˇ cnega polja kot v smereh, pravokotnih na miˇ siˇ cna vlakna (y,z). To pomeni, da se elektriˇ cna prevo- dnost tkiva v smeri miˇ siˇ cnih vlaken zaˇ cne viˇ sati ˇ ze pri niˇ zji jakosti elektriˇ cnega polja kot v smereh, pravoko- tnih na miˇ siˇ cna vlakna [17]. Slika 2 prikazuje odvisnosti xx (E) in yy (E) v primeru, ko je vrednost anizotro- pnega razmerjaAR enaka2;0. Pri tem predpostavimo, da jex os koordinatnega sistema usmerjena v smeri miˇ siˇ cnih vlaken. Tako je E rev xx prag reverzibilne elektroporacije v smeri miˇ siˇ cnih vlaken, E rev yy = E rev zz prag reverzibilne elektroporacije v smereh, pravokotnih na miˇ siˇ cna vlakna, E irev pa je prag ireverzibilne elektroporacije in je enak v vseh smereh. Uporabili smo naslednje ˇ stevilske vredno- sti: E rev xx = 80Vcm 1 , E rev yy = E rev zz = 200Vcm 1 in E irev = 450Vcm 1 [7, 17]. Slika 2: Prikaz sigmoidnega spreminjanja elektriˇ cnih prevodno- sti xx(E) in yy(E) v odvisnosti od jakosti elektriˇ cnega polja z oznaˇ cenimi pragovi elektroporacije za vrednostAR = 2;0. Poleg odvisnosti elektriˇ cne prevodnosti tkiva od ja- kosti lokalnega elektriˇ cnega polja, smo upoˇ stevali tudi dodatno poviˇ sanje elektriˇ cne prevodnosti tkiva v smeri polja [18, 19]. Pojav je bil opaˇ zen med spremljanjem elektriˇ cne prevodnosti pri elektroporaciji piˇ sˇ canˇ cjih jeter ex vivo z uporabo magnetne resonanˇ cne elektriˇ cne impe- danˇ cne tomografije [18], in ga razlagamo kot posledico tvorbe veˇ cine por v celiˇ cni membrani na mestih, kjer je vsiljena transmembranska napetost najviˇ sja, tj. na me- stih, kjer je celiˇ cna membrana pravokotna na smer ele- ktriˇ cnega polja [1]. Vrednosti elektriˇ cne prevodnosti v smerehx iny nad ireverzibilnim pragom poracije (velja samo za’ = 0 in ’ = 90 ) sta doloˇ ceni z naslednjima enaˇ cbama: 1 xx =A 0 xx (1+Bcos’); (2) 1 yy =A 0 yy (1+Bsin’); (3) 320 Slika 3: Normirana priˇ cakovana vrednost elektriˇ cnega toka v odvisnosti od orientacije elektrod’ za razliˇ cne vrednosti parametra AR. Velja za en doveden pulz dolˇ zine100 μs in napetosti150V. pri ˇ cemer parameterA odraˇ za poviˇ sanje elektriˇ cne prevo- dnosti zaradi elektriˇ cnega polja v vseh smereh, parame- terB pa dodatno poviˇ sanje elektriˇ cne prevodnosti samo v dominantni smeri elektriˇ cnega polja. V tej ˇ studiji smo uporabili vrednosti A = 3;0 in B = 0;25, v grobem doloˇ ceni na podlagi literature ter smiselno preraˇ cunani za prouˇ cevani primer. Z modelom smo naredili veˇ cje ˇ stevilo simulacij, in sicer smo na podlagi izmerjenega ˇ casovnega poteka elek- triˇ cne napetosti elektroporacijskega pulza dolˇ zine 100 μs simulirali priˇ cakovan ˇ casovni potek elektriˇ cnega toka. Pri tem smo uporabili pet razliˇ cnih napetosti pulzov (iste vre- dnosti napetosti, kot so bile uporabljene pri meritvah v hrbtni miˇ sici praˇ siˇ ca) za 19 razliˇ cnih kotov ’ (med 0 in 90 , s korakom 5 ) in za 23 razliˇ cnih vrednosti ani- zotropnega razmerja AR (med 0;5 in 5;0). Skupaj smo tako izvedli 2185 simulacij. Nato smo izraˇ cunane vre- dnosti elektriˇ cnega toka pri razliˇ cnih orientacijah elek- trod, ki ustrezajo doloˇ ceni vrednosti aplicirane elektriˇ cne napetosti in doloˇ ceni vrednosti anizotropnega razmerja, normirali z ustrezno izraˇ cunano vrednostjo elektriˇ cnega toka pri orientaciji’ = 0 . Tako smo za vsako izmed iz- branih anizotropnih razmerij in za vsako od izbranih ele- ktriˇ cnih napetosti dobili krivuljo, ki prikazuje priˇ cakovan elektriˇ cni tok v odvisnosti od orientacije elektrod glede na miˇ siˇ cna vlakna. Doloˇ canje stopnje anizotropnosti miˇ siˇ cnega tkiva smo izvedli tako, da smo za vsak par meritev (enaka am- plituda, enkrat pri orientaciji 0 in drugiˇ c pri 90 ) vzeli izmerjeno vrednost elektriˇ cnega toka na koncu pulza, nato pa vrednost pri 90 normirali z vrednostjo pri 0 (slika 4 prikazuje eno izmed opravljenih meritev, kjer je s kriˇ zcem oznaˇ cena vrednost toka, ki smo jo upora- bili). Vrednost anizotropnega razmerja AR smo nato doloˇ cili z linearno interpolacijo med dvema najbliˇ zjima krivuljama (slika 3 prikazuje te krivulje za primer pulza dolˇ zine100 μs napetosti150V). Na ta naˇ cin preko primerjave med simuliranim in de- janskim izmerjenim tokom pri enakem vhodnem signalu (ˇ casovni potek napetosti pulza) retrogradno sklepamo na zaˇ cetno, tj. prvotno stopnjo anizotropnosti tkiva, ki jo po- daja z enaˇ cbo (1) definirani parameterAR. Slika 4: Ena izmed opravljenih meritev elektriˇ cnega toka. S kriˇ zcem je oznaˇ cena vrednost, ki smo jo uporabili pri doloˇ canju vrednosti parametraAR. 3 Rezultati Z numeriˇ cnim modelom smo doloˇ cili krivulje, ki prikazu- jejo normirano priˇ cakovano vrednost elektriˇ cnega toka v odvisnosti od orientacije elektrod’ za razliˇ cne vrednosti parametraAR. Oblika teh krivulj je odvisna od geome- trije elektrod in od dolˇ zine ter napetosti pulza. Slika 3 pri- kazuje krivulje, ki veljajo za v naˇ sem eksperimentalnem 321 primeru uporabljeno geometrijo elektrod in en doveden pulz dolˇ zine100 μs napetosti150V. Iz meritev toka ter z uporabo simuliranih krivulj nor- mirane priˇ cakovane vrednosti toka v odvisnosti od ori- entacije elektrod smo doloˇ cili vrednost parametraAR za vseh deset parov opravljenih meritev (glej sliko 5). Ge- ometrijsko povpreˇ cje anizotropnih razmerijAR za vseh deset parov meritev znaˇ sa1;15, faktor geometrijske stan- dardne deviacije pa 1;67. Geometrijsko povpreˇ cje in standardno deviacijo navajamo zato, ker mora statistiˇ cna funkcija za povpreˇ cje obratnih vrednosti vrniti vrednost 1, saj je anizotropno razmerjeAR definirano kot kvoci- ent dveh vrednosti. Slika 5: Dobljene vrednosti parametraAR za vseh deset parov opravljenih meritev. 4 Razprava Pri dobljenih vrednostih anizotropnega razmerja AR lahko opazimo velik raztros. Najniˇ zja vrednostAR znaˇ sa 0;58, najviˇ sja pa2;81. Geometrijsko povpreˇ cje vseh ani- zotropnih razmerij znaˇ sa 1;15, kar kaˇ ze na to, da je v povpreˇ cju prvotna prevodnost v smeri miˇ siˇ cnih vlaken res viˇ sja kot v smeri, pravokotno na miˇ siˇ cna vlakna, ven- dar je raztros rezultatov prevelik, da bi to vrednost lahko sprejeli kot zanesljivo. Eden od moˇ znih vzrokov za velik raztros je k´ ot vsta- vitve elektrod glede na miˇ siˇ cna vlakna, ki ga ni bilo moˇ c natanˇ cno izmeriti, saj bi bilo to moˇ c storiti le s histoloˇ sko analizo. Elektrode so bile v tkivo vstavljene na podlagi vizualnega pregleda povrˇ sine miˇ sice v prizadevanju, da bi bila orientacija elektrod kar se le da vzporedna oz. pra- vokotna na vlakna. Problematiˇ cna je lahko tudi lokacija vstavitve elektrod. Miˇ siˇ cno tkivo je dokaj nehomogeno, lastnosti se spreminjajo z oddaljenostjo od narastiˇ sˇ ca, po- leg tega usmerjenost vlaken lahko variira v danem volu- mnu miˇ sice, v katerem se vzpostavi elektriˇ cno polje. S to ˇ studijo smo ˇ zeleli pokazati, kako je moˇ c prek mo- deliranja elektroporacije doloˇ citi prvotno stopnjo anizo- tropnosti miˇ siˇ cnega tkiva kot intrinziˇ cno in od elektropo- racije neodvisno lastnost tkiva. Za zanesljivejˇ se rezultate je potrebno zagotoviti visoko natanˇ cnost pri vstavljanju elektrod v tkivo, nato pa tudi izmeriti dejanski kot vsta- vljenih elektrod glede na potek miˇ siˇ cnih vlaken v kolikor je to mogoˇ ce, ter skuˇ sati kar se le da zmanjˇ sati vpliv de- javnikov z naslova bioloˇ ske variabilnosti. Zahvala ˇ Studijo sta delno financirala Javna agencija za razisko- valno dejavnost Republike Slovenije in podjetje RenBio. Literatura [1] T. Kotnik et al.: Membrane Electroporation and Electroper- meabilization: Mechanisms and Models. Annu. Rev. Bio- phys. 48: 63-91, 2019. [2] ML. Yarmush et al.: Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu. Rev. Biomed. Eng. 16: 295-320, 2014. [3] S. Haberl et al.: Cell membrane electroporation – Part 2: The applications. IEEE Electr. Insul. M. 29(1): 29-37, 2013. [4] C. Rosazza et al.: Gene electrotransfer: A mechanistic per- spective. Curr Gene Ther. 16: 98–129, 2016. [5] E. Sokolowska et al.: A Critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20(11): 2776, 2019. [6] C. Faurie et al.: Electro-mediated gene transfer and expres- sion are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J. Gene Med. 12: 117-125, 2010. [7] A. ˇ Zupaniˇ c et al.: Numerical optimization of gene electro- transfer into muscle tissue. Biomed Eng Online 9:66, 2010. [8] T. Forjaniˇ c & D. Miklavˇ ciˇ c: Numerical study of gene elec- trotransfer efficiency based on electroporation volume and electrophoretic movement of plasmid DNA. Biomed. Eng. Online 17:80: 1-10, 2018. [9] C. Gabriel et al.: The dielectric properties of biological tis- sues: I. Literature survey. Phys. Med. Biol. 41: 2231–2249, 1996. [10] S. Gabriel et al.: The dielectric properties of biological tissues: II. Measurements in the frequency range 10 Hz to 20 GHz. Phys. Med. Biol. 41: 2251–2269, 1996. [11] S. Gabriel et al.: The dielectric properties of biological tissues: III. Parametric models for the dielectric spectrum of tissues. Phys. Med. Biol. 41: 2271– 2293, 1996. [12] D. Miklavˇ ciˇ c et al.: Electric properties of tissues. Wi- ley Encyclopedia of Biomedical Engineering: 3578-3589, 2006. [13] P. Mekuˇ c: Razvoj in preizkus visokofrekvenˇ cnega bipo- larnega elektroporatorja: magistrsko delo. Ljubljana, 2017. [14] J. Langus et al.: Dynamic finite-element model for effici- ent modelling of electric currents in electroporated tissue. Sci. Rep. 6: 26409, 2016. [15] M. Pintar et al. Time-dependent finite-element analysis of ex vivo electrochemotherapy treatment. Technol. Cancer. Res. Treat. 17: 1-9, 2018. [16] J. Korelc & P. Wriggers: Automation of Finite Element Methods. Springer International Publishing; 2016. [17] S. ˇ Corovi´ c et al.: The influence of skeletal muscle aniso- tropy on electroporation: ex vivo study and numerical mo- deling. Med. Biol. Eng. Comput. 48: 637-648, 2010. [18] M. Essone Mezeme et al.: Assessing how electroporation affects the effective conductivity tensor of biological tis- sues. Appl. Phys. Lett. 101: 213702, 2012. [19] N. Labarbera & C. Drapaca: Anistropically varying con- ductivity in irreversible electroporation simulations. Theor. Biol. Med. Model. 14(1): 20, 2017.