UČINEK HPV NA SENZORJE DNA V CELICNIH LINIJAH PLOŠČATOCELIČNEGA KARCINOMA ŽRELA
Kristina Levpušček1'2, Tanja Jesenko1,2, Gregor Serša1,3, Maja Cemažar14, Primož Strojan25
1 Oddelek za eksperimentalno onkologijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana, Slovenija
2Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana, Slovenija 3 Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, 1000 Ljubljana, Slovenija 4Fakulteta za vede o zdravju, Univerza na Primorskem, Polje 42, 6310 Izola, Slovenija 5 Oddelek za teleradioterapijo, Sektor radioterapije, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška cesta 2, 1000 Ljubljana, Slovenija
Elektronski naslov: klevpuscek@onko-i.si Izvleček
Ploščatocelični karcinom orofarinksa (PKO), povzročen s humanim virusom papiloma 16 (HPV16), se bolje odziva na ionizirajoče sevanje kot s HPV16 nepovezani ploščatocelični karcinomi drugih delov žrela (PKŽ). Onkoproteina HPV16 E6 in E7 zavirata delovanje nekaterih citosolnih senzorjev DNA, katerih aktivacija vodi v prepisovanje citokinov in posledično aktivacijo imunskega sistema. Namen študije je bil raziskati vpliv ionizirajočega sevanja na aktivacijo molekularnih poti zaznavanja DNA pri PKŽ z različnim statusom HPV16. Z metodo qRT-PCR smo določili izražanje senzorjev DNA in citokinov štirih humanih celičnih linij PKŽ po obsevanju. Preliminarni rezultati so pokazali, da je izražanje citosolnih senzorjev DNA in citokinov časovno ter dozno odvisno. Opazili smo tudi razlike v izražanju glede na status HPV16. Nadaljnje in vivo študije so potrebne za ovrednotenje povezave med aktivacijo molekularnih poti zaznavanja in imunskim odzivom s HPV16 povezanim PKO po obsevanju.
Ključne besede: Humani virus papiloma, ploščatocelični karcinom žrela, senzorji DNA, obsevanje.
Uvod
Raki glave in vratu so heterogena skupina malignih bolezni, kamor spada tudi ploščatocelični karcinom žrela. Slednje razvrščamo po mestu vznika na tumorje nazofarinksa, orofarinksa (PKO) in hipofarinksa (PKH). Eden izmed dejavnikov tveganja za nastanek PKO je okužba s humanim virusom papiloma (HPV16), ki z onkoproteinoma E6 in E7 vpliva na regulacijo celičnega cikla, kar lahko privede do maligne transformacije okuženih celic (1, 2). Raziskave so pokazale, da je s HPV16 povezan PKO biološka in klinična entiteta, ki se od preostalih tumorjev žrela razlikuje predvsem v občutljivosti na ionizirajoče sevanje (3). Slednje namreč povzroča sproščanje DNA v citosol tumorskih celic, kar privede do aktivacije citosolnih senzorjev DNA, receptorjev za prepoznavo molekularnih vzorcev (4). Aktivirana molekularna pot sproži prepisovanje vnetnih citokinov, predvsem interferonov tipa I (IFN I), ki v nadaljevanju sprožijo imunski odziv. Predklinične študije so pokazale, da se HPV16 izogne imunskemu sistemu tudi preko zaviranja nekaterih citosolnih senzorjev DNA, predvsem z retinojsko kislino induciranega gena I (RIG-I) in ciklično gvanozin monofosfat-adenozin monofosfat sintazo (cGAS) (5, 6). V nasprotju s pričakovanji ima s HPV16
22
povezan PKO burnejši imunski odziv na ionizirajoče sevanje kot s HPV nepovezani PKŽ, navkljub zavrtju molekularnih poti zaznavanja DNA (7). Namen študije je bil raziskati aktivacijo poti zaznavanja DNA kot odziv na obsevanje v s HPV16 povezanimi in s HPV16 nepovezanimi celičnimi linijami PKŽ.
Materiali in metode
Pri raziskavi smo uporabili štiri humane celične linije PKŽ, natančneje dve celični liniji PKO (UM-SCC-6 in UPCI: SCC090) in dve celični liniji PKH (FaDu in 2A3). Status HPV16 smo določili na in vitro ravni z izražanjem onkoproteinov HPV16 E6 in E7. Radiosenzitivnost celic smo določili s testom viabilnosti PrestoBlue po štirih celičnih delitvah, saj nekatere izbrane celične linije ne tvorijo kolonij. Za določanje izražanja senzorjev DNA in citokinov smo celične linije obsevali z različnimi enkratnimi odmerki (0, 4 in 8 Gy). Po 24 in 48 urah smo izolirali mRNA in jo kasneje prepisali v cDNA. Z metodo qRT-PCR smo določili časovni potek izražanja senzorjev DNA (cGAS, STING, RIG-I, DAI, IFI16, DDX60) ter citokinov (IFNy, TNFa, IL10).
Rezultati
Opazili smo značilno razliko v radiosenzitivnosti med s HPV16 povezano in s HPV16 nepovezano celično linijo PKO. Povečano izražanje senzorjev DNA in citokinov po obsevanju je bilo časovno in dozno odvisno. Izražanje senzorjev DNA DAI in RIG-I po obsevanju je bilo statistično povečano samo v s HPV16 nepovezanimi celičnim linijami PKŽ. Izražanje citokinov IFNy in IL1^ je bilo prav tako statistično povečano le v s HPV16 nepovezanimi celičnimi linijami PKŽ. Izražanje senzorjev DNA in citokinov je bilo večje pri s HPV16 povezano celično linijo 2A3 v primerjavi s HPV16 povezano celično linijo UPCI: SCC090. Pri slednji smo zaznali višjo raven izražanja mRNA onkoproteinov E6 in E7.
Razprava
Klinične smernice priporočajo zdravljenje bolnikov s PKŽ s frakcioniranim obsevanjem z nizkimi dnevnimi dozami (1,8-2 Gy) do skupne doze 66-70 Gy, z ali brez sočasne kemoterapije, ne glede na status HPV16. Namen naše študije je bil raziskati aktivacijo poti zaznavanja DNA kot odziv na obsevanje v povezavi s HPV16 okužbo. Rezultati na celičnih kulturah so pokazali, da se senzorji DNA in citokini po obsevanju povišano izražajo le v s HPV16 nepovezanimi celičnimi linijami PKŽ, medtem ko v s HPV16 povezanima celičnima linijama PKŽ ostajajo zavrti. Na izražanje pomembno vpliva tudi doza in čas, ki preteče po obsevanju. Razumevanje časa aktivacije teh poti, bi lahko izboljšalo sheme zdravljenja z radioterapijo. Potrebne so nadaljnje in vivo študije za ovrednotenje povezave med signalnimi potmi zaznavanja DNA in imunskim odzivom PKŽ z različnim statusom HPV16 po obsevanju.
Zahvala
Zahvaljujem se svojim sodelavcem Oddelka za eksperimentalno onkologijo za njihovo pomoč, ter finančni podpori Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (P3-0003, P3-0307 ter Program usposabljanja mladih raziskovalcev).
Literatura
1.	Kobayashi K, Hisamatsu K, Suzui N, et al. A Review of HPV-Related Head and Neck Cancer. J Clin Med 2018; 7(9): 241.
2.	Faraji F, Zaidi M, Fakhry C, et al. Molecular mechanisms of human papillomavirus-related carcinogenesis in head and neck cancer. Microb Infect 2017; 19(9-10): 464-75.
3.	Mirghani H, Amen F, Tao Y, et al. Increased radiosensitivity of HPV-positive head and neck cancers: Molecular basis and therapeutic perspectives. Cancer Treat Rev 2015; 41(10): 844-52.
4.	Vanpouille-Box C, Alard A, Aryankalayil MJ, et al. DNA exonuclease Trex1 regulates radiotherapy-induced tumour immunogenicity. Nat Commun 2017; 8(1): 15618.
5.	Shaikh MH, Bortnik V, McMillan NA, et al. cGAS-STING responses are dampened in high-risk HPV type 16 positive head and neck squamous cell carcinoma cells. Microb Pathog 2019; 132: 162-5.
6.	Chiang C, Pauli E-K, Biryukov J, et al. The human papillomavirus E6 oncoprotein targets USP15 and TRIM25 to suppress RIG-I-mediated innate immune signaling. J Virol 2017; 92 (6).
7.	Wondergem NE, Nauta IH, Muijlwijk T, et al. The immune microenvironment in head and neck squamous cell carcinoma: on subsets and subsites. Curr Oncol Rep 2020; 22(8): 1-14.
4