Vid Šuštar1, Mojca Frank2, Vid Janša3, Petra Sušanj4, Henry Hagerstrand5, Peter Veranič6, Veronika Kralj - Iglic7
Mikrovezikli iz krvne plazme, opazovani z elektronsko mikroskopijo
Microvesicles from Blood Plasma Observed by Electron Microscopy
IZVLEČEK_
KJUCNE BESEDE: mikrovezikli, elektronska mikroskopija, krvna plazma, ultrastruktura
Prerazporejanje molekul v celični membrani lahko vodi do brstenja in odpuščanja veziklov, manjših od mikrometra (mikroveziklov), iz membrane. Mikrovezikli v svojih lastnostih odražajo stanje in vrsto celice, iz katere izvirajo. Stanje celic pa je spremenjeno pri različnih bolez -nih, zato lahko mikrovezikli, ki izvirajo iz teh celic, značilno predstavljajo bolezensko stanje in so zanimivo potencialno orodje za diagnostiko bolezni. Kljub mnogim raziskavam in objavljenim postopkom enotnega načina za osamitev in določanje mikroveziklov iz periferne krvi še ni. Za določanje vpliva osamitve in za določanje mikroveziklov smo kot možno orodje uporabili elektronsko mikroskopijo. Vrstična elektronska mikroskopija se je izkazala primerna za določanje tridimenzionalne oblike mikroveziklov. Transmisijska elektronska mikroskopija nam je omogočila vpogled v notranjo strukturo mikroveziklov.
ABSTRACT_ 137
KEY WORDS: microvesicles, electron microscopy, blood plasma, ultrastructure
Lateral redistribution of molecules in cell membrane may result in budding and shedding of vesicles smaller than micrometer, called microvesicles. Microvesicles reflect in their characteristics the state and type of cells wherefrom they originate. The state of cells may be changed in diseases therefore also microvesicles, which originate from those cells, characteristically represent the disease and are an interesting potential diagnostic tool. Despite nume -rous studies and publications there is still no standard protocol for microvesicle isolation and characterisation from the peripheral blood. In this work we used electron microscopy as a pos -sible tool for characterisation of microvesicles and for determination of possible artefacts acquired in the isolation procedure. Scanning electron microscopy proved useful for determination of three-dimensional form of microvesicles. Transmission electron microscopy enabled the insight into inner structure of microvesicles.
1	Vid Šuštar, univ. dipl.biol., Laboratorij za klinično biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; vidsustar @gmail.com
2	Mojca Frank, dr. med., Klinični oddelek za revmatologijo, Bolnica dr. Petra Držaja, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Vodnikova cesta 62, 1000 Ljubljana
3	Vid Janša, štud. med., Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
4	Petra Sušanj, štud. med., Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
5	Doc. dr. Henry Hägerstrand, mag. farm., Department for Biology, Abo Akademi University, Biocity, Tysto-katu 6a, 2nd floor, 20520 Abo/Turku, Finska
6	Doc.dr. Peter Veranič, univ. dipl.biol., Inštitut za biologijo celice, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Lipičeva 2, 1000 Ljubljana
7	Prof. dr. Veronika Kralj - Iglič, univ. dipl. fiz., Laboratorij za klinično biofiziko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Lipičeva 2, 1000 Ljubljana
uvod
Ob neenakomerni lateralni porazdelitvi molekul v zunanjem in notranjem sloju celične membrane se membrana lahko upogne (1-3). Temu procesu pravimo brstenje membrane (1,2). Ce se proces nadaljuje, se brsti vkonč -ni fazi odcepijo od materinske membrane v zunajcelični prostor, kjer se lahko prosto gibljejo (4). Odcepljene brste, ki so manjši od 1 |jm, imenujemo mikrovezikli (MV). MV so z membrano obdani delci, običajno brez cito-skeleta, katerih struktura, sestava in številčnost so odvisne od celic, iz katerih izvirajo, ter stanja le-teh.
Mikrovezikli so prisotni v telesnih tekočinah, kot so kri, sklepna tekočina ter tekočina iz trebušne in pljučne votline (5-7). Število MV je povečano pri bolezenskih stanjih, kot so na primer rak, sladkorna bolezen tipa 2, različne motnje strjevanja krvi in avtoimunske bolezni (8-15). Hkrati so lahko mikrovezikli tudi sodejavnik bolezni (19, 20).
Večje znanje o mikroveziklih bi pripomoglo k njihovi uporabi za nove diagnostične metode naštetih bolezni in pomagalo pri odločitvi o najustreznejšem načinu zdravljenja.
Kljub številnim raziskavam in širokemu zanimanju za MV enotnega in zanesljivega načina za njihovo izolacijo in analizo še ni. Največ raziskav v zvezi z MV se opravi s pretočno citometrijo, kjer laserski žarek sveti na curek medija, v katerem so MV, fotodetektor pa beleži odklone žarka zaradi MV v curku. Ta analiza nam poda informacije predvsem o številu in velikostni zastopanosti MV v po -pulaciji. Ce MV označimo s fluorescentnimi protitelesi za določene molekule in se ta veže -jo na MV, nam analiza MV lahko potrdi ali ovrže prisotnost določenih molekul na MV oz. na podpopulaciji analiziranih MV. Pretočna citometrija nam ne razkrije strukture, oblike in drugih morfoloških značilnosti mikrovezi-klov (8-21).
Oblika in notranja struktura celic je vid -na s svetlobno mikroskopijo. V hematologiji se za opazovanje celic in njihovih nepravil -nosti običajno uporablja svetlobna mikroskopija v kombinaciji z barvili za celice (22). Zaradi majhnih dimenzij MV oz. zaradi nezadostne ločljivosti mikroskopa pa svetlobna mikroskopija ni primerna za opazovanje MV.
Ločljivost mikroskopa je dovolj velika za opa -zovanje, če med seboj ločimo dve sosednji točki, ki sta oddaljeni za razdaljo d . Zaradi uklona na objektivu je d = ^nat, kjer je j valovna dolžina sevanja, NA je numerična apertura objektiva, NA = nsin a, n je lomni količnik sredstva med predmetom in objektivom, a pa kot med optično osjo in zvezni-co, ki povezuje gorišče in rob objektiva (1-2).
Valovna dolžina ni le lastnost svetlobe, ampak jo lahko pripišemo tudi delcem z maso, kot je leta 1924 ugotovil Louis de Broglie (23). De Broglieva enačba, j = ~p, poveže valovno dolžino X z gibalno količino p, enačba f= pa frekvenco f in energijo E, pri čemer je h Planckova konstanta (3-4).
Zaradi mase in posledično večje gibalne količine v primerjavi s fotoni elektroni dosegajo večje frekvence valovanja in manjše valovne dolžine od vidne svetlobe. Elektroni imajo mnogo manjšo valovno dolžino (10-2-10-3 nm) od valovne dolžine vidne svetlobe (400-700 nm), zato je tudi ločljivost mikroskopa, ki uporablja snop elektronov namesto svetlobe, boljša (d je manjša).
Elektroni pri elektronski mikroskopiji (EM) ob težjih atomih na preparatu spremenijo smer gibanja - se sipajo. Vtransmisijski EM (TEM) se elektroni sipajo, ko prehajajo skozi preparat, ki mora biti označen s težki -mi kovinami, hkrati pa dovolj tanek. Pri vrstični EM (angl. scanning, SEM) površino vzorca napršimo s težko kovino, npr. z zlatom, in opazujemo sekundarno izbite elektrone s tri -dimenzionalne površine. Pri SEM je poveča -va manjša od povečave pri TEM (24, 25).
Brstenje membrane je mogoče tudi umetno spodbuditi. To lahko naredimo z dodaja -njem molekul, ki vplivajo na reakcije v celici. Primer take molekule je kalcijev ionofor A21387, ki omogoči vnos ionov Ca2+ iz celične okolice preko celične membrane v celico. V trombocitih tako pride do porasta znotraj-celične koncentracije kalcija, kar povzroči njihovo aktivacijo (iz diskaste oblike prei -dejo v zvezdasto obliko, v okolico sprostijo granule itd.) ter nastajanje veziklov, obdanih z membrano (26). Za primerjavo notranje strukture izoliranih MV, ki so nastali na raz -lične načine, smo umetno sprožili vezikulacijo prašičjih trombocitov s kalcijevim ionofo -
rom A21387 in jih primerjali z izoliranimi MV iz človeške plazme.
V članku prikazujemo poskus uporabe elektronske mikroskopije ter ugotovljanje primernosti te metode za opazovanje zunanje in notranje strukturne lastnosti MV, ki so zanimivi za razumevanje določenih bolezni in kot možno diagnostično orodje.
metode
Metodi odvzema človeške krvi in diferencialnega centrifugiranja sta povzeti po Diamantu et al., metode odvzema prašičje krvi, umetno sproženega brstenja in vezikulacije prašičjih trombocitov (PT) v MV (PMV) ter njihovega TEM-mikroskopiranja so povzete po Hager-strandu et al. (11, 26).
Odvzem krvi
Teščim prostovoljcem, ki so se strinjali s po -skusom, smo odvzeli do 15ml krvi v epruvete, ki so vsebovale antikoagulant 0,109 M natrijev citrat (10% končnega volumna) (11). Prašičjo kri iz bližnje klavnice smo zajeli v epruveto z 0,15 v/v prostornine citrata dekstroze (angl. acid citrate dextrose, ACD; 85 mM trina -trijev citrat, 111 mM glukoza, 71 mM citron-ske kisline). Odvzemi krvi so bili izvedeni v skladu s Helsinško-tokijsko deklaracijo in etičnimi načeli.
Diferencialno centrifugiranje za pridobitev MV iz odvzetih telesnih tekočin
Za ločitev krvnih celic od plazme z MV (su -pernatanta) smo odvzeto kri centrifugirali 20 minut pri hitrosti 1550 g in temperaturi 20 °C. Za usedanje MV iz plazme smo 250 |jl supernatanta ponovno centrifugirali pri višji hitrosti (17570 g pri temperaturi 20 °C, 30 mi -nut). Za izpiranje MV in odstranjevanje plaz -me smo po centrifugiranju odstranili 225 jl vrhnjega supernatanta (plazma brez MV) in usedlini (MV) dodali 225 jl izoosmolarnega fosfatnega pufra s citratom (angl. phospha -te buffer saline, PBS: 0,109 M trinatrijevega citrata, v V:V, 9:1). Za boljše izpiranje smo usedlino MV ponovno suspendirali v pufru na mešalniku. Pred izvedbo nadaljnjih postopkov je bilo potrebno ponovno koncentriranje
in usedanje MV, zato smo ponovili zadnji korak centrifugiranja pri 17570g (20 °C, 30 mi -nut).
Prašičjo kri z antikoagulantom ACD smo centrifugirali 20 min pri 150 g. Supernatant, to je plazma, bogata s trombociti (angl. pla -telet rich plasma, PRP), smo prenesli v novo 15-mililitrsko epruveto in centrifugirali 15 min pri 200 g za dodatno odstranitev krvnih celic.
Da bi preprečili agregacijo PT ob nadaljnjem centrifugiranju, smo dodali 5ng pro-staglandina I na 1 ml PRP. Nato smo PRP centrifugirali 15 min pri 800 g, da smo dosegli usedanje trombocitov. Dobljeni PT smo ponovno suspendirali v pufru za PT (163 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 12mM NHCO3, 0,3mM Na2HPO4, 2 mM MgCl2 x 6H2O, 5,6 mM glukoza, pH 7,4), ki je vseboval 5 % plazme brez PT. Po 60-minutni inkubaciji pri temperaturi 37°C s 300 ng/ml PGI2 smo celice sprali s cen -trifugiranjem, kot že omenjeno, in ponovno suspendirali do 109 celic/ml v pufru. Za poskus smo uporabili kri dveh živali. Vsi poskusi so bili izvedeni takoj po osamitvi celic.
Tretiranje prašičjih trombocitov z A21387
Alikvote na 37 °C predogrete suspenzije PT smo pipetirali v 2 ml epruvete, ki so vsebovale na 37 °C predogreti PT-pufer in 1 mM kal -cijev ionofor A21387. Končna koncentracija PT je bila 108 celic/ml in inkubacija je bila izvedena v 1 minuti pri 37 °C.
Predpriprava vzorca za elektronsko mikroskopijo
Za stabilizacijo in večjo obstojnost MV smo vzorcu dodali fiksativ glutaraldehid (angl. glu -taraldehyde, GA, razredčen v izoosmolarnem PBS-citratu), ki zamreži proteine na dveh mestih in utrdi njihovo tridimenzionalno strukturo. GA smo dodali toliko, da je bila v vzorcu njegova končna koncentracija 1 %. Vzorec smo inkubirali v GA 1 uro na sobni temperaturi (23 °C). Vzorec z 1 % GA smo do nadaljevanja postopka hranili v hladilniku pri temperaturi 4°C. Za zamreženje in obstoj -nost membran v vzorcu smo vzorec fiksira -li z OsO4, ki poveže nenasičene maščobno kislinske ostanke v fosfolipidnih molekulah v membrani. OsO4 se veže tudi na GA, zato
139
smo z vzorca izprali nevezani GA s PBS-citra-tom; izpiranje je potekalo s štirikratno izmenjavo supernatanta s polurnimi presledki. Vzorec smo z OsO4 fiksirali na enak način kot z GA (končna koncentracija OsO4 1 %). Nato smo ga inkubirali pri sobni temperaturi 23°C za eno uro in nevezani OsO4 izprali. Za nadaljnjo pripravo je bilo treba iz vzorca odstraniti vodo oziroma jo izmenjati z manj polarnimi tekočinami, predvsem za zavarovanje fosfo-lipidnih membran. To smo storili z izmenjavo pretežno vodne vsebine celic in supernatan-ta z manj polarnim acetonom. Vzorcu smo v 10-minutnih korakih dodajali in izmenjavali mešanico acetona in PBS-citratnega pufra. V mešanicah acetona in pufra smo z namenom, da bi preprečili morebitni osmotski šok, koncentracijo acetona stopnjevali: 50%, 60%, 90%. Zadnji korak je potekal v 100% acetonu 1 uro z dvema izmenjavama acetona.
PT smo koncentrirali v usedlino s cen-trifugiranjem pri 3000 g 10 minut. Prašičje mikrovezikle (PMV) smo centrifugirali pri 30000 g 60 minut iz supernatanta po centri-fugiranju pri 11000 g 2 minuti za odstranje-
_ vanje preostalih trombocitov. PT in PMV
I 40 smo fiksirali v suspenziji v 1 % GA 30 minut, postfiksirali v 1 % OsO4 v 0,9 % NaCl 30 mi -nut pri 22 °C, dehidrirali v stopnjujočih serijah aceton-voda (50-100 % v/v).
Priprava vzorca za SEM
Za SEM-mikroskopijo, kjer opazujemo zunanjo tridimenzionalno strukturo, je treba vzor -ce posušiti za obstoj v vakuumu, v katerem deluje EM, hkrati pa suhi vzorci ne dopuščajo pojava izparin, ki bi ovirale nemoteno pot elektronom. Za vir sekundarnih elektronov, ki se odbijajo s površine vzorca, so vzorci napr-šeni s težko kovino. Fosfolipidne membrane se ob neposrednem sušenju na zraku poškodu -jejo zaradi prehajanja znotrajcelične raztopine preko membrane. Za ohranitev celovitosti membrane smo morali vzorce sušiti s teko -čim CO2, ki pri kritični točki 72 barov in 31 °C sublimira v plinasto agregatno stanje. CO2 v plinastem stanju nemoteno in nekvarno prehaja preko membrane. Da bi omogočili prevajanje toka elektronov in vzpostavili vir sekundarnih elektronov, smo posušene vzor -ce napršili z zlatom. Vzorce smo opazovali z mikroskopom Cambridge Instruments S360.
Priprava vzorca za TEM
Vzorce za TEM je za zadovoljivo prehodnost elektronov in njihovo sipanje le v določeni ravnini treba narezati na 40-50 nm debele (ultratanke) rezine. Za rezanje vzorca na ultratanke rezine smo vzorec potopili v eponsko smolo, ki se po segrevanju polimerizira in str-di. Utrjene vzorce lahko režemo z diamantnim ali s steklenim nožem.
Po dehidraciji z acetonom v predpripravi smo vzorce inkubirali v mešanici epo-na in acetona. Mešanico acetona in epona smo izmenjali v korakih, s stopnjujočim (zaradi preprečevanja osmotskega šoka) deležem epona. Vzorec smo inkubirali pri 23 °C za 10 minut v mešanici epon-aceton (1:1), za 30 minut v mešanici epon-aceton (2:1) ter preko noči v 20 |jl 100 % epona, da je izhlapel preostali aceton v vzorcu. 100% epon smo izmenjali (odstranili 100 % epona nad vzorcem in dodali enak volumen 100 % epona) in vzorce dali na inkubacijo ter polimerizacijo epona v pečico na 60 °C za 48 ur. Vzorce smo narezali na mikrotomu na 40 nm tanke rezine. Rezine smo nabrali na mrežice, na katere smo nanesli folijo iz formvara. Za večji kontrast oziroma sipanje elektronov pri opazovanju smo rezine na mrežicah kontrastirali z raztopinami soli težkih elementov, in sicer z uranil acetatom in s svinčevim citratom. Po sušenju na zraku so bili pripravljeni za opazovanje. Človeške vzorce smo opazovali z elektronskim mikroskopom JEM 100 CX, PT ter PMV z JEOL 100 SX (JEOL, Japonska) pri delovni napetosti 80 kV.
rezultati SEM-mikrografi
Slika 1 prikazuje izolate iz krvne plazme zdravega prostovoljca. Objekti na SEM-mikrogra -fih so v povprečju za 30 % manjši kot v resnici. Premer eritrocitov je na SEM-mikrografu (slika 1A) v povprečju 5 jm (in vivo okoli 7 jm). Na sliki 1A so ob eritrocitih vidne manjše globularne in podolgovate oblike s povpreč -nim premerom 0,46 jm (n = 120, standardna deviacija = 0,21 jm). Povprečni premer MV na sliki 1B je 0,39 jm (n = 35, standardna deviacija = 0,23 jm), ustrezni povprečni pre -mer MV na sliki 1C je 0,086 jm (n = 30, stan -
Slika 1. Vrstični elektronski mikrograf mikroveziklov, izoliranih z diferencialnim centrifugiranjem iz človeške krvi. S centrifugiranjem najprej posedamo in odstranimo celice in v naslednjem, hitrejšem centrifugiranju še mikrovezikle (MV) iz supernatanta. A - Vizola -tu MV so še vedno lahko prisotni posamezni eritrociti. B in C- drugo področje iste frakcije MV, C- zrnate strukture na MV so posle -dice priprave vzorcev. Na slikah je vidna velikostna in oblikovna raznolikost MV.
dardna deviacija = 0,03 |jm). Na sliki 1C so vidne posledice priprave vzorca, nanašanja zlatega poprha, to so zrnate strukture na povr -šini MV.
TEM-mikrografi
Objekti na TEM-mikrografu na sliki 2A so v povprečju veliki 0,38 jm (n = 9, standardna deviacija = 0,33). Oblika MV je v primerjavi
z obliko MV na SEM-mikrografih oglata. Vse -bina MV je bolj prosojna kot citoplazma sosednjih celic (levkocita levo in desno ter eritrocita na sredini na sliki 2A).
MV so po obliki membrane in prosojnosti vsebine podobni MV, pridobljenim s spro -ženim brstenjem prašičjih trombocitov z ionoforom A23187 (slika 2B - aktivirani trombociti, slika 2C - s centrifugiranjem koncentrirani mikrovezikli).
Slika 2. A - Transmisijski elektronski mikrograf mikroveziklov, izoliranih z diferencialnim centrifugiranjem iz (loveške krvi. Na desni in levi sta vidna dela levkocitov, zgoraj sredi del eritrocita. Primerjava sestave in izvora mikroveziklov z umetno sproženo aktivacijo in brstenjem praši(jih trombocitov z ionoforom A23187. B- Puš(ice prikazujejo brstenje mikroveziklov na aktiviranih trombocitih. C - Scen -trifugiranjem koncentriranimikrovezikli.
razprava
Mikrovezikle, izolirane iz periferne krvi zdra -vega prostovoljca, smo opazovali s SEM in TEM. Ugotovili smo, da je povprečna velikost MV, izmerjena iz mikrografov, skladna z dimenzijami MV, navedenimi v literaturi, ugo -tovljenimi s pretočno citometrijo (6-20). Ugo -tovili smo, da je koncentracija in velikostna razporeditev MV na različnih delih vzorca raz -lična. Možen vzrok za to je centrifugiranje. Največji delci, mnogo gostejši od medija, se pri centrifugiranju usedajo najhitreje in jih je največ na dnu usedline, medtem ko je manj -ših in manj gostih delcev več na vrhu used -line. Ob analiziranju posameznih mikrolokacij na usedlini se je treba zavedati, kje se - gle -de na prvotno orientacijo usedline - posamez -na mikrolokacija nahaja.
Z uporabo SEM smo ugotovili, da je pre -težni del mikroveziklov okrogle oziroma
diskoidne oblike, manjši del pa cevaste oblike. Samo z uporabo TEM tega ne bi bilo mogoče ugotoviti, saj omogoča analizo le v dveh dimenzijah.
Pri pripravi se vzorci skrčijo ob sušenju pri kritični točki CO2, zato je treba vse izmer -jene velikosti interpretirati z upoštevanjem tega dejavnika. Pri interpretaciji velikosti lahko ocenimo dejansko velikost videnih objektov s primerjavo prisotnih celic, katerih velikost že poznamo. Primerni za to so eritrociti, ki imajo homogeno velikost. Na SEM posnetku so veliki 5 |jm, v nativnem stanju pa so (pod optičnim mikroskopom) veliki okrog 7jm. S pomočjo tega razmerja ocenimo nativno velikost neznanega objekta. Ocena je približna. Do razlike pri krčenju celic in mikrovezi -klov bi lahko prišlo zaradi različne sestave in vpliva citoskeleta, ki nudi določeno oporo celi -cam. Se boljši način ugotavljanja vpliva pri -prave preparatov je primerjava rezultatov,
dobljenih z enakim preparatom s TEM. Pri pripravi vzorca za TEM ni vpliva krčenja zaradi sušenja, saj se vzorec vklopi v eponsko smolo, ki polimerizira in ohrani strukture v prvotni velikosti.
Na površini MV je (npr. na sliki 1C) vidna zrnata strukturiranost, ki je posledica priprave vzorca za SEM, najverjetneje naprševanja zlata. Podobnih struktur ni videti na prečnem prerezu MV s TEM, kjer ni naprševanja zlata na površino vzorca ali druge dodatne obdelave površine vzorca.
TEM v primerjavi s SEM omogoča analizo notranjosti MV. Ugotovili smo, da se MV po notranji strukturiranosti razlikujejo od bližnjih celic. Notranjost MV je, kot je vidno na mikrografih, bolj prosojna od notranjosti sosednjih celic, kar bi lahko bila posledica odsotnosti ali pa delnega razkrajanja citoske-leta v MV.
Natančnejše sklepanje, iz katere vrste celic izvirajo posamezni MV, kakšen je izvor in mera ohranitve vsebine MV glede na izvorne celice, smo dosegli z uporabo dodatne tehnike.
Določevalne značilnosti nekega tipa izvornih celic smo dosegli z analizo in vitro sprožene mikrovezikulacije na celičnih kulturah. Umetno spodbujeno brstenje je možno dose -či z dodajanjem različnih molekul v raztopino, ki obdaja celice. Primer za umetno inducirano vezikulacijo je dodajanje kalcijevega iono-fora A23187 trombocitom (27). A23187 nase veže in prenaša ione Ca2+ v notranjost celic, tudi trombocitov, ter s tem povzroči aktivacijo, agregacijo in brstenje trombocitov (26-28). Ob primerjavi MV, izoliranih iz krvne plaz -me, z umetno induciranimi MV iz prašičjih trombocitov (slika 2A, B in C), se pokaže podobna ultrastruktura obeh populacij MV. Ta ugotovitev je skladna z dejstvom, da veči -na MV izvira iz trombocitov (29). Obstaja torej verjetnost, da izolirani MV na mikrografih izvirajo iz trombocitov. Za tehtnejšo primer -javo MV in določanje izvora MV na podlagi notranje strukture bi bilo treba inducirati in primerjati MV iz več vrst celic.
Za določanje izvora MV obstajajo tudi manj agresivne metode, kot je umetno spod -bujeno brstenje. Metoda, s kakršno bi se prib -ližali bolj naravnemu stanju MV in celic, bi bila uporaba imunolokalizacije s koloidnimi
zrnci zlata. Pri tej metodi bi celicam in MV dodali specifična protitelesa za antigene, ki se nahajajo le na določenih tipih celic. Na protitelesa proti določenim antigenom so pritrjene nanometrske kroglice zlata (oz. so pritrjene na sekundarna protitelesa, ki se specifično vežejo na primarna protitelesa, ta pa se veže -jo na antigene) (30). Ce bi se protitelo vezalo hkrati na mikrovezikel in le na določen tip celice, bi lahko sklepali, da s protitelesi označeni mikrovezikel izvira (vsebuje komponente, ki so hkrati prisotne) iz z enakimi protitelesi označenega tipa celic.
Metodi umetno spodbujenega brstenja in imunolokalizacije s protitelesi bi lahko združili in primerjali spontano nastale in umetno spodbujene vezikle glede na vsebnost komponent iz matičnih celic. Z združitvijo metod bi deloma lahko sklepali na mehanizme, ki so prisotni pri tvorbi mikroveziklov, in na stanje materinskih celic, prisotno ob določeni vrsti brstenja.
zaključek
Na podlagi rezultatov naše študije lahko zaključimo, da je uporaba kombinacije SEM in TEM primeren način za ugotavljanje in analiziranje ultrastrukture mikroveziklov ter za določanje lastnosti populacije mikrovezi-klov, izoliranih iz človeške plazme. Ugotovili smo, da se po izmerjeni velikosti mikrovezikli ujemajo z navedbami iz literature. Za natanč -nejše ugotavljanje izvora in karakterizacijo mikroveziklov bi bilo primerno, v kombina -ciji z obstoječo, uporabiti še dodatne metode. Primer dodatne metode je umetno spodbujeno brstenje tipov celic, ki so potencialni izvor nativnih MV. Hkrati bi bila primerna dodatna metoda imunolokalizacija značilnih komponent MV in celic njihovega izvora s koloidnim zlatom.
zahvala
Avtorji se zahvaljujemo Anii Wrobel za nas -vete in diskusije ter Lindi Strus z Inštituta za biologijo celice Medicinske fakultete Uni -verze v Ljubljani in Gunilli Henriksson iz Abo Akademi na Finskem za pomoč pri pripravi EM-vzorcev.
143
LITERATURA:
1.	Iglic A, Kralj - Iglic V. Budding of liposomes - role of intrinsic shape of membrane constituents. In: Leitmannova Liu A, ed. Advances in planar lipid bilayers and liposomes, Vol. 4. Amsterdam: Elsevier; 2006. p. 253-79.
2.	Iglic A, Babnik B, Bohinc K, et al. On the role of anisotropy of membrane constituents in formation of a membrane neck during budding of a multicomponent membrane. J Biomech 2007; 40: 579-85.
3.	Fošnarič M, Iglic A, May S. Influence of rigid inclusions on the bending elasticity of a lipid membrane. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2006; 74: 051503.
4.	Iglič A, Slivnik T, Kralj - Iglič V. Elastic properties of biological membranes influenced by attached proteins. J Biomech. 2007; 40: 2492-500.
5.	Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 1967; 13: 269-88.
6.	Berckmans RJ, Nieuwland R, Tak PP, et al. Cell-derived microparticles in synovial fluid from inflamed arthritic j oints support coagulation exclusively via a factor VII-dependent mechanism. Arthritis Rheum. 2002; 46: 2857-66.
7.	Junkar I, Šuštar V, Frank M, et al. Blood and synovial microparticles as revealed by atomic force and scanning electron microscope. Open Autoimmun J. 2009; 1: 50-8.
8.	Rauch U, Antoniak S. Tissue factor-positive microparticles in blood associated with coagulopathy in cancer. Thromb Haemost. 2007; 97: 9-10.
9.	Langer F, Spath B, Haubold K, et al. Tissue factor procoagulant activity of plasma microparticles in patients with cancer-associated disseminated intravascular coagulation. Ann Hematol. 2008; 87: 451-57.
10.	Janowska-Wieczorek A, Marquez-Curtis LA, Wysoczynski M, et al. Enhancing effect of platelet-derived micro-vesicles on the invasive potential of breast cancer cells. Transfusion. 2006; 46: 1199-209.
11.	Diamant M, Nieuwland R, Pablo RF, et al. Elevated numbers of tissue-factor exposing microparticles correlate with components of the metabolic syndrome in uncomplicated type 2 diabetes mellitus. Circulation. 2002; 106: 2442-7.
12.	Mallat Z, Hugel B, Ohan J, et al. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human atherosclerotic plaques: a role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation. 1999; 99: 348-53.
13.	Berckmans RJ, Nieuwland R, Boing AN, et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 2001; 85: 639-46.
14.	Dignat-George F, Camoin-Jau L, Sabatier F, et al. Endothelial microparticles: a potential contribution to the throm-144 botic complications of the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 2004; 91: 667-73.
15.	Distler JH, Pisetsky DS, Huber LC, et al. Microparticles as regulators of inflammation: novel players of cellular crosstalk in the rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 2005; 52: 3337-48.
16.	Boulanger CM, Amabile N, Tedgui A. Circulating microparticles: a potential prognostic marker for atherosclerotic vascular disease. Hypertension. 2006; 48: 180-6.
17.	Van Wijk MJ, Van Bavel E, Sturk A, et al. Microparticles in cardiovascular diseases. Cardiovasc Res. 2003; 59: 277-87.
18.	Diamant M, Tushuizen ME, Sturk A, et al. Cellular microparticles: new players in the field of vascular disease? Eur J Clin Invest. 2004; 34: 392-401.
19.	Piccin A, Murphy WG, Smith OP. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 2007; 21: 157-71.
20.	Freyssinet JM. Cellular microparticles: what are they bad or good for? J Thromb Haemost. 2003; 1: 1655-62.
21.	Jy W, Horstman LL, Jimenez JJ, et al. Measuring circulating cell-derived microparticles. J Thromb Haemost. 2004; 2: 1842-3.
22.	McKenzie S. Textbook of Hematology. 2nd ed. Philadelphia (PA): Williams & Wilkins; 1996.
23.	De Broglie L. [Researches on the quantum theory]. Thesis. 1924.
24.	Hayat M A. Principles and Techniques of Electron Microscopy Biological Applications. 4th ed. UK: Cambridge University Press; 2000.
25.	Crewe AV, Isaacson M, Johnson D. A Simple Scanning Electron Microscope. Rev Sci Inst. 1969; 40: 241-46.
26.	Hagerstrand H, Bobrowska-Hagerstrand M, Lillsunde I, et al. Vesiculation induced by amphiphiles and ionop -hore A23187 in porcine platelets: a transmission electron microscopic study. Chem Biol Interact. 1996; 101: 118-26.
27.	F Basse, P Gaffet, A Bienvenue. Correlation between inhibition of cytoskeleton proteolysis and anti-vesiculation effect of calpeptin during A23187-induced activation of human platelets: are vesicles shed by filopod fragmentation? Biochim Biophys Acta. 1994; 1190: 217-24.
28.	Stark R J, O'Doherty J. Effect of ionophore A23187 on cytosolic Ca2+ and enzyme secretion. Am J Physiol Cell Physiol. 1982; 243: 196-9.
29.	Horstman LL, Ahn YS. Platelet microparticles: a wide-angle perspective. Crit Rev Oncol Hematol. 1999; 30: 111-42.
30.	Roth J, Heitz PU.Immunolabeling with the protein A-gold technique: an overview. Ultrastructural Pathol. 1989; 13 (5-6); 467-84.
Prejeto 13.10.2009