Borut Kovači?1, Veljko Vlaisavljevic2 Oploditev in nepravilnosti oploditve v • • • v -t • po vnosu semencice v jajčno celico pri človeku Fertilization and Fertilization Anomalies in Humans after Sperm Injection into the Oocyte IZVLEČEK KLJUČNE BESEDE: oploditev in vitro, intracitoplazmatsko vbrizganje spermijev, oociti, spermiji-jajčece interakcije Oploditev je proces združevanja očetovskih in maternih kromosomov v aktivirani jajčni celici. Najpogostejši vzrok za neoplojenost je nesposobnost semenčic, da bi prodrle v jajčno celico. V takšnih primerih lahko spolne celice spojimo tudi mehansko, združevanje njihovih kromosomov pa prepustimo delovanju ooplazme. Pogoj za združitev kromosomov je skladno razvitje očetovskega in maternega kromatina in nastanek moškega in ženskega pronukleusa. Preoblikovanje kromatina ni vedno usklajeno, kar lahko privede do zastoja oploditve. Tehnika imunofluorescenčne mikroskopije neuspešno oplojenih jajčnih celic nam omogoča sočasno opazovanje kromatina in pripadajočih mikrotubulov, najpomembnejših struktur za dinamiko kromosomov med oploditvijo. Z njo lahko ugotavljamo nepravilnosti v procesu združevanja spolnih celic in nekatere vzroke zanje. 95 ABSTRACT_ KEY WORDS: fertilization in vitro, sperm injection intracytoplasmic, oocyte, sperm-ovarium interactions Fertilization is the process of paternal and maternal chromosomes uniting in the activated oocyte. The most frequent reason for fertilization failure is sperm incapacity to penetrate into the oocyte. In such cases the gametes can be united mechanically, but the fusion of their chromosomes is resigned to the action of the ooplasm. The condition required for uniting is synchroneous decondensation of paternal and maternal chromatin and formation of a male and female pronucleus. Chromatin transformation is not always coordinated, which may lead to fertilization arrest. With the technique of immunofluorescent microscopy of oocytes failing to fertilize, allowing the simultaneous observation of chromatin and pertaining microtubules - the most important structures for chromosome dynamics during fertilization, we can establish anomalies in the process of gamete union and elucidate some of their causes. 1 Dr. Borut Kovačič, univ. dipl. biol., Služba za ginekologijo in perinatologijo, Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Splošna bolnišnica Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor. 2 Prof. dr. Veljko Vlaisavljevic, dr. med., Služba za ginekologijo in perinatologijo, Oddelek za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Splošna bolnišnica Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor. PT M II FIZIOLOGIJA OPLODITVE 96 Oploditev je proces spajanja starševskih spolnih celic in njihovih kromosomov. Da lahko združevanje teče normalno, se morajo v spolnih celicah zvrstiti določene spremembe. Semenčica se pred vstopom v jajčno celico hiperaktivira, kapacitira in ob stiku z zono pelucido sproži akrosomsko reakcijo. Jajčna celica ji omogoči vstop v citoplazmo, sama se metabolno aktivira, zaključi redukcijsko delitev in izloči drugo polarno telo. Vstop semenčice v jajčno celico je odvisen predvsem od dogajanj na zoni pelucidi - ovojnici jajčne celice. Le-ta je izbirčna, saj normalno veže nase le morfološko idealne semenčice. Prehod skoznjo omogoči samo tisti semenčici, ki prva točno ob stiku z zono sproži akrosomsko reakcijo. Nepravilnosti semenčic in jajčnih celic na tej stopnji oploditve so pogosto lahko vzrok neplodnosti, ki ga lahko s postopkom intracitoplazmatskega injiciranja semenčice v jajčno celico (ICSI) uspešno rešimo in gamete mehansko spojimo. Združevanje njihovih kromosomov pa je nato prepuščeno delovanju citoplazme jajčne celice. Očetovski in materni kromosomi se v jajčni celici razpro-strejo, obdajo z jedrno ovojnico, in ko sta pronukleusa drug ob drugem, so ustvarjeni pogoji za združitev starševskih genomov. Tudi napake na katerikoli stopnji tega dela oploditve so lahko usodne za jajčno celico oziroma zigoto, ker preprečijo njun nadaljnji razvoj. S tehniko imunofluorescenčne mikroskopije neuspešno oplojenih jajčnih celic iz postopkov fertilizacije in vitro (IVF) in ICSI, ki omogoča sočasno opazovanje kromatina in pripadajočih mikrotubulov, najpomembnejših struktur za dinamiko kromosomov med oploditvijo, lahko ugotavljamo nepravilnosti v procesu združevanja kromosomov spolnih celic in nekatere vzroke zanje. Kromosomi in mikrotubuli jajčne celice ob vstopu semen~ice Preovulatorna jajčna celica (sliki 1 in 2) ima materne kromosome v metafazi II. Le-ti so kondenzirani in razporejeni v ekvatorialni ravnini drugega mejotičnega delitvenega vretena, ki je usmerjeno pravokotno na celični korteks. Semenčica po vstopu aktivira jajčno celico in Slika 1. Zrela preovulatorna jajčna celica. Materni kromosomi so v metafazi druge redukcijske delitve (M II), razporejeni v ekvatorialni ravnini delitvenega vretena, ki leži v korteksu pod prvim polarnim telesom (PT). Slika 2. Zrela preovulatorna jajčna celica. Materni kromosomi so v metafazi druge redukcijske delitve (M II), razporejeni v ekvatorialni ravnini delitvenega vretena; prvo polarno telo (PT) je odmaknjeno od delitvenega vretena. vzpodbudi dokončanje druge redukcijske delitve. Tedaj se izloči ena garnitura kromatid v obliki drugega polarnega telesa. Delitveno vreteno se nato razgradi (1). Centrosom semenčice in astralno žarkovje Po vstopu semenčice v citoplazmo jajčne celice se na bazi glavice pojavi majhna, zvezdi podobna struktura iz mikrotubulov. To je začetek rasti mikrotubulov astralnega žarkovja semenčice, ki izrašča iz očetovskega centrosoma. Le-ta je v semenčici v skrajno reducirani obliki in v jajčno celico vstopi le kot ogrodje, na katerega se začnejo pripenjati molekule iz citoplazme jajčne celice (2). Ugotavljajo, da je ponovno izoblikovanje centrosoma in rast mikrotubulov iz njega odvisno od prisotnosti gradbenih elementov za centrosom in mikrotubule v citoplazmi jajčne celice. Med njimi prevladuje tubulin gama. Astralno žar-kovje, ki izraste iz centrosoma semenčice, ima vlogo pri združevanju pronukleusov (3, 4). VKLJUČEVANJE SEMENČICE V CITOPLAZMO JAJČNE CELICE Kromosomi semenčice so zaščiteni tako, da so histoni - kromosomski proteini - zamenjani s protamini. Pogoj za uspešno vključitev očetovskih kromosomov v jajčno celico je preoblikovanje jedra semenčice z redukcijo protaminskih disulfidnih vezi in nadomesti- tev histonov. Ko je dovolj vezi reduciranih, postane kromatin semenčice občutljiv na citoplazmatske faktorje jajčne celice in začne se njegovo razvijanje (5). Jedrna membrana semenčice se razgradi in vsebina jedra se raz-prostre. Jedro semenčice se najpogosteje nahaja pod celičnim korteksom. Z razprosti-ranjem semenčice raste tudi astralno žarkovje in se širi proti neizločenim kromatidam jajčne celice. V naslednji fazi se razprostrta semenčica po zaslugi astralnega žarkovja začne premikati proti središču celice. Kroma-tide semenčice in jajčne celice se raztegnejo 97 Slika 3. Shema preoblikovanja kromatina semenčice in maternih kromosomov med procesom oploditve pri človeku ter vloga posameznih citoplazmatskih faktorjev. Semenčica ima ob vstopu v citoplazmo jajčne celice odstranjeno ali vsaj poškodovano membrano. Samo tako lahko na njeno jedro deluje spermijevo jedro dekondenzirajoči faktor (SNDDF). Le-ta povzroči nabrekanje glavice semenčice. Zaradi razširjanja jedra se plazma membrana semenčice razpre na več mestih, kar omogoči sprostitev spermije-vega oocit aktivirajočega faktorja (SAOAF) v citoplazmo jajčne celice. SAOAF preko drugih proteinov, ki delujejo na inozitol trifosfat receptorje (IRR) in rianodin receptorje (RRRR), povzroči aktivacijo jajčne celice in sprostitev ionov Ca++ iz znotrajceličnih rezerv v citosol. Ioni Ca++ aktivirajo specifične kinaze, ki povzročijo degradacijo ciklina in inaktivirajo mitozo promovirajoči faktor (MPF), ki sestoji iz ciklina in podenote, homologne produktu gena kvasovk cdc2. Inaktivacija MPF omogoči nadaljevanje redukcijske delitve jajčne celice, prehod iz metafaze II v anafazo II, izločitev enega seta kromatid v drugo polarno telo in dekondenzacijo maternih kromosomov. Po vstopu semenčice v jajčno celico izrastejo iz baze glavice radialno izhajajoči mikrotubuli astralnega iarkovja. Med nastajanjem pronukleusov se astralno žarkovje še bolj razraste, doseže ženski pronukleus in ga pritegne k moškemu pronukleusu. 98 in obdajo z jedrno ovojnico, kar je pod svetlobnim mikroskopom vidno kot moški in ženski pronukleus. Pronukleusa sta sprva majhna in vsebujeta več jedrcem podobnih struktur. Kasneje se pronukleusa povečata in pojavi se nekaj večjih jedrc. Ko astralni mikro-tubuli semenčice dosežejo ženski pronukleus, se njihova rast ustavi in omeji le na območje okoli pronukleusov. Center astralnega žarkovja je ponavadi nameščen med pronu-kleusi (1, 4) (slika 3). Učinek različnih citoplazmat-skih faktorjev na kromatin Moški in ženski pronukleus se kljub enotni citoplazmi jajčne celice razvijata vsak po svoje. Jedro semenčice je ves čas v interfazi. Njeno spreminjanje v jajčni celici poteka le v smeri razprostiranja kromatina in nastajanja pronukleusa. Materni kromosomi, ki so ob oploditvi v metafazni obliki, najprej zaključijo redukcijsko delitev, šele nato se razprostrejo. Usklajeno razprostiranje očetovskih in mater-nih kromosomov omogočajo tudi specifični citoplazmatski faktorji (slika 3). Mitozo promovirajoči faktor Mitozo promovirajoči faktor (MPF - iz angl. mitosispromoting factor) je citoplazmatski faktor, prisoten v celicah v času delitve. To je proteinski kompleks, ki deluje kot kinaza, njegov substrat pa so kromosomski proteini in lamin, zato aktivnost MPF v metafazi celičnega cikla povzroča kondenzacijo kromosomov. Ciklične spremembe v aktivnosti MPF ustrezajo spremembam v kondenziranosti kromatina in omogočajo prehode celice iz ene faze celičnega cikla v drugo. Aktivacija MPF omogoči prehod jajčne celice iz profaze v metafazo I; nato sledi inaktivacija MPF in delitev kromosomov. Njegova ponovna aktivacija pa vodi celico v metafazo II. Takrat je MPF tudi najbolj delujoč. Aktivnost citostatskega faktorja preprečuje ponovno inaktivacijo MPF, kar zadržuje jajčno celico v metafazi II. Sele oploditev in dvig koncentracije ionov Ca++ sproži dokončanje redukcijske delitve (8-10). Spermijev oocit aktivirajoči faktor Način aktivacije jajčne celice dolgo ni bil znan. Poskusi na živalih so pokazali, da semenčice različnih vrst vsebujejo specifični spermijev faktor za aktivacijo jajčne celice (SAOAF - iz angl. sperm associated oocyte activating factor). Prisotnost enako delujoče snovi so dokazali tudi v človeških semenčicah (11). Eksperimentalne ugotovitve Dozortseva in sodelavcev (12), da jajčna celica sama ni sposobna razgraditi membrane semenčice, ampak je membrano pred injiciranjem treba poškodovati, da se lahko SAOAF sprosti, so znatno povečale uspešnost metode ICSI. Spermijevo jedro dekondenzirajoci faktor Citoplazma jajčne celice mora ob vstopu semenčice vanjo že vsebovati proteine, odgovorne za razprostiranje kromatina in oblikovanje moškega pronukleusa. Te proteine so poimenovali spermijevo jedro dekondenzirajoči faktor (SNDF - iz angl. sperm nucleus decondensing factor) ali pa moški pronukleus rastoči faktor (MPGF - iz angl. male pronucleus growth factor). Ugotavljajo, da se SNDF razvija v času dozorevanja jajčne celice in da signali za njegovo sintezo in delovanje prihajajo iz foli-kularnih celic (13). NEPRAVILNOSTI OPLODITVE Zaradi določenih nepravilnosti se lahko proces oploditve zaustavi v različnih fazah združevanja starševskih kromosomov. Materni kromosomi in mikrotu-buli v neoplojenih jajčnih celicah V neuspešno oplojenih jajčnih celicah lahko zasledimo naslednje morfološke značilnosti maternih kromosomov in pripadajočih mikro-tubulov (slika 4): • jajčna celica se nahaja v metafazi II, kromosomi so v ekvatorialni ravnini, delitveno vreteno je bipolarno; • jajčna celica je v metafazi II, mikrotubuli vretena so neorganizirani; • jajčna celica se nahaja v metafazi II in vsebuje dve mejotični vreteni ter dvojna garnitura kromosomov; • jajčna celica je v telofazi II in ima vse materne kromosome v polarnem telesu; • postmejotično zaustavljena jajčna celica v anafazi II ali telofazi II z neoblikovanim ženskim pronukleusom; • aktivirana jajčna celica (slika 5) z ženskim pronukleusom. Slika 4. Konfiguracija maternih kromosomov in mikrotubulov v neoplojenih jajčnih celicah po ICSI. Slika 5. Aktivirana jajčna celica. Materni kromosomi so raztegnjeni in v obliki ženskega pronukleusa (PN). Jedro semenčice (S) se ni uspelo preoblikovati v moški Pronukleus. Kromosomi in mikrotubuli semenčice v neoplojenih jajčnih celicah Semenčice se v navidezno neoplojenih jajčnih celicah lahko nahajajo v naslednjih oblikah (slika 6): • nerazprta spermijeva glavica; • nabrekla glavica z delno razprostrtim kromatinom in opaznim astralnim žarkov-jem; • predčasno kondenzirani kromosomi semenčice (G1-PCC); 99 Nerazprta spermijeva glavica O~etovsko delitveno vreteno Nabrekla spermijeva glavica Zgodnji mo{ki pronukleus Pred~asna kondenzacija kromosomov Mo{ki pronukleus • • Slika 6. Oblike semenčic v neoplojenih jajčnih celicah po ICSI - postopku, glede na razprtost kromatina in konfiguracijo astralnega žarkovja. 100 • očetovsko delitveno vreteno in G1-PCC; • zgodnji moški pronukleus; • moški pronukleus. RAZLOGI ZA NEUSPEŠNO VKLJUČEVANJE SEMENČICE V JAJČNO CELICO Pri iskanju razlogov za neoplojenost posameznih jajčnih celic je treba obravnavati morfološke značilnosti maternih in očetovskih kromosomov in mikrotubulov skupaj, ker eni drugim pogojujejo nadaljnji razvoj (14). Jajčne celice, zaostale v metafazi II Različne študije na jajčnih celicah po postopkih IVF in ICSI kažejo, da več kot 80% neoplojenih jajčnih celic kljub vstopu semenčice vanje ostane v metafazi II (14-16). Metafaza II je očitno najbolj kritična faza v procesu oploditve. V tem stadiju se celični cikel zaustavi in jajčna celica čaka na oploditev. Ponovni zagon celičnega cikla je odvisen od semenčice oziroma njenega SAOAF. Le-ta predstavlja dražljaj za sprostitev ionov Ca++ iz znotrajceličnih rezerv, ki ponovno aktivirajo celični cikel (17). V metafazi II pa ima jajčna celica tudi kontrolno točko celičnega cikla. Za prehod te točke mora celica izpolnjevati zrelostne pogoje, sicer ostane v metafazi II. Med njimi omenjajo citoplazmatsko zrelost in razvit mehanizem za aktivacijo jajčne celice ter pravilno oblikovano in funkcionalno drugo mejotično delitveno vreteno s kondenzirani-mi kromosomi v njem (18, 19). Sposobnost jajčne celice, da ob oploditvi sprosti zadostne količine ionov Ca++ iz zalog v citosol, se razvije v procesu oogeneze (20). Verjetno je torej, da mnoge jajčne celice v metafazi II, ki jih skušamo mehansko oploditi, še nimajo popolnega mehanizma sproščanja Ca++. Lahko pa je prešibek tudi dražljaj SAOAF, ki ne doseže praga občutljivosti mehanizma sproščanja ionov Ca++. Neučinkovitost SAOAF je lahko tudi vzrok neplodnosti (21). Za sprostitev SAOAF iz semenčice je nujna nabreklost spermijeve glavice v citoplazmi jajčne celice (17). Kromatin semenčice in pripadajoči mikrotubuli v neaktiviranih jajčnih celicah Nerazprta semenčica Za uspešno vključevanje injicirane semenčice v jajčno celico je že pred postopkom ICSI treba poškodovati membrano semenčice na Tabela 1. Zastopanost posameznih oblik kromatina in mikrotubulov semenčice v neoplojenih jajčnih celicah, zaostalih v metafazi II, in hipotetična razlaga vzrokov za zastoj oploditve. MPF - mitozo promovirajod faktor. Stadij jajčne celice ob zastoju Možni vzroki zastoja (jajčna celica) MPF Oblika semenčice v jajčni celici Možni vzroki zastoja (semenčica) Nikoli prisotne oblike semenčic Neaktivirana jajčna celica v metafazi II Nepopolna kondenzacija kromosomov Poškodbe delitvenega vretena Aktiven m— Mrtva semenčica Nepoškodovana membrana repa Denaturirana DNA 4- Nepopoln mehanizem za aktivacijo jajčne celice Aktiven Nefunkcionalno astralno žarkovje ©- Neaktiven SNDF Neaktiven SAOAF Aktiven Neaktiven SAOAF PCC njenem repu. Samo tako lahko nanjo vplivajo citoplazmatski faktorji iz jajčne celice. Semenčice, ki kljub poškodovanosti membrane ne začnejo z razprostiranjem kromatina v jajčni celici, so bile lahko preveč poškodovane in ob injiciranju niso bile več žive, ali pa so odraz drugih nepravilnosti semenčic oziroma jajčnih celic. Med njimi omenjajo slabo zaščito kromatina semenčice s protamini in/ali dena-turacijo DNA; neučinkovitost proteaze v semenčici, sodelujoče pri nabrekanju glavice, in neučinkovitost SNDF, ki naj bi ga vsebovale jajčne celice (22-24). Razprostira-nje semenčice je zatorej odvisno tako od nje same kot tudi od jajčne celice. Nabrekla glava semen~ice V večini injiciranih, vendar neoplojenih jajčnih celic se semenčice začnejo vključevati v jajčne celice, vendar se proces razprostiranja kromatina zaustavi v različnih fazah (tabela 1) (14). Pogosto najdemo vcitoplazmi jajčne celice nabreklo glavico semenčice (slika 7), obdano z astralnimi mikrotubuli. Zaradi napak delovanja centrosoma semenčice se lahko mikrotubuli astralnega žarkovja prenehajo razraščati ali pa se sploh ne pojavijo, kar onemogoči popolno razvitje kromatina (4, 25). Slika 8. Predčasna kondenzacija kromosomov (PCC) semenčice. Kromatin se ni preoblikoval v moški pronukleus, ampak v kondenzirane kromatide. Okoli kromatid so mikrotubuli astralnega iarkovja semenčice. PDV PCC Slika 9. Predčasno kondenzirani kromosomi (PCC) semenčice, obdani z bipolarnim očetovskim vretenom (PDDV) (merilce = 10 pm). 101 Slika 7. Nabrekla glavica semenčice (S). Pred~asna kondenzacija kromosomov semen~ice v fazi G1 Namesto razprostiranja glave semenčice lahko zasledimo obraten pojav predčasne kondenzacije kromosomov semenčice (sliki 8 in 9), ko ima le-ta jedro še v fazi G1 (G1-PCC) (14). Pojav G1-PCC je najpogostej- ši v metafaznih jajčnih celicah. Povzroča pa ga visoka aktivnost MPF, ki je značilna za neaktivirane jajčne celice, v katerih ohranja kromosome v metafazi (26). O~etovsko delitveno vreteno Pojav G1-PCC večinoma spremlja tudi očetovsko delitveno vreteno. Mikrotubuli, ki izhajajo iz baze glavice semenčice, bi morali oblikovati unipolarno astralno žarkovje. V tem primeru pa nastane bipolarno delitveno vreteno s kondenziranimi kromatidami semenčice v ekvatorialni sredini. Ker delitev kromosomov ponavadi časovno sovpada s spremembami in delitvijo centrosomov, menijo, da visoko aktiven MPF vpliva tudi na podvojitev centrosoma. Razlogi za nastanek očetovskega delitvenega vretena v neaktiviranih jajčnih celicah so potemtakem verjetno enaki razlogom za nastanek pojava G1-PCC (4, 14). 102 Pomejotično zaustavljene jajčne celice Razvoj jajčne celice se redko zaustavi po aktivaciji in pred oblikovanjem pronukleusa. Takšni pojavi so kljub temu mogoči, saj je znano, da je ob nastanku pronukleusa in pred sintezo DNA naslednja kontrolna točka celičnega cikla. Celični cikel se ne nadaljuje, če kromosomi niso popolnoma razprostrti in če okoli njih ni oblikovana jedrna ovojnica (18). Med pomejotično zaustavljene jajčne celice uvrščamo dve skupini celic: tiste, ki so izločile celotno kromosomsko maso v prvo ali drugo polarno telo, in jajčne celice, ki so ostale v anafazi ali telofazi druge redukcijske delitve in se v njih ni izoblikoval ženski pro-nukleus (14). Oblike semenčic v pomejoticno zaustavljenih jajčnih celicah V pomejotično zaustavljenih jajčnih celicah ne najdemo intaktnih semenčic (tabela 2). To dokazuje, da se mora glava semenčice za sprostitev SAOAF vsaj delno razprostreti. Pogosta pa sta pojava G1-PCC in očetovsko delitveno vreteno, kar dokazuje, da v pome- jotično zaustavljenih jajčnih celicah ostaja MPF pogosto v aktivni obliki. V primerih, ko se pri redukcijski delitvi iz jajčne celice izločijo vsi materni kromosomi, ostane v njih samo očetovski kromatin. Le-ta se skondenzira, centrosom semenčice pa se podvoji. Zaradi predčasne kondenzaci-je kromosomov kljub podvojitvi centrosomov ni mitotske delitve, zato se takšen androge-netski razvoj jajčne celice ustavi. Jajčne celice z enim pronukleusom Androgenetske jajčne celice z moškim pronukleusom V nekaterih jajčnih celicah se lahko ustvarijo pogoji, ki omogočajo nastanek le moškega pronukleusa, prepoznavnega po pripetem spermijevem repu (14, 27). Najverjetneje se je v teh primerih jajčna celica aktivirala, bodisi spontano bodisi s SAOAF. Aktivnost MPF je upadla, materni kromosomi pa so se izločili v polarno telo ali pa se niso uspeli oblikovati v ženski pronukleus. V takšnih pogojih se semenčica lahko razvije do pronukleusa. Ce se podvoji še centrosom semenčice, se tak- Tabela 2. Zastopanost posameznih oblik spermijevega kromatina in mikrotubulov v neoplojenih jajčnih celicah, zaostalih v anafazi ali telofazi II, in hipotetična razlaga vzrokov za zastoj oploditve. MPF - mitozo promovirajoči faktor. Stadij jajčne celice ob zastoju Možni vzroki zastoja (jajčna celica) MPF Oblika semenčice v jajčni celici Možni vzroki zastoja (semenčica) Nikoli prisotne oblike semenčic Jajčna celica v anafazi II oz. telofazi II Izguba vseh maternih kromosomov Neoblikovanje pronukleusa Neaktiven Nefunkcionalno astralno žarkovje Neaktiven SAOAF m— Nepopoln mehanizem za inaktivacijo MPF Aktiven Neaktiven SAOAF Neaktiven SNDF Spontana aktivacija Ponovno aktiven Napaka pri oblikovanju pronukleusa Zakasnitev pri razvijanju kromatina Neaktiven šna androgenetska jajčna celica verjetno lahko tudi mitotsko deli. Ginogenetske jajčne celice z ženskim pronukleusom Pogosteje lahko zasledimo ginogenezo -pojav, ko jajčna celica nadaljuje razvoj brez semenčice. Pogoj za nastanek pronukleusa je inaktivacija MPF. Zaradi tega jajčne celice z enim ženskim pronukleusom nikoli ne vsebujejo kromosomov semenčice v obliki G1-PCC ali očetovskega delitvenega vretena (tabela 3). Analiza zigot z enim pronukleusom tudi kaže, da mnoge med njimi verjetno niso spontano aktivirane (14). Mnogo jih namreč poleg ženskega pronukleusa vsebuje tudi razprostrt kromatin semenčice in bi po tem sodeč lahko bile aktivirane tudi s SAOAF. Očitno se v ginogenezo lahko sprevrže tudi pravilno začeti proces oploditve, ko se razpro-stiranje kromatina semenčice zaustavi. Do zaustavitve lahko pride zaradi nepravilnosti centrosoma semenčice in napak pri oblikovanju in delovanju pripadajočih astralnih mikrotubulov (4). Lahko pa je zaustavitev razprostiranja semenčice tudi posledica asinhronega nasta- janja moškega in ženskega pronukleusa. Ko razprostiranje očetovskih kromosomov precej kasni za razprostiranjem maternih kromosomov, se lahko aktivnost MPF še pred oblikovanjem moškega pronukleusa ponovno zviša, kar onemogoči nastanek jedrne ovojnice okoli novo nastajajočega moškega pronukleusa, saj MPF razgrajuje jedrni lamin (28). Visoko aktiven MPF povzroči še pojav PCC - stanja na že delno razprostrtem kromatinu semenčice, ko je ta že v fazi S. Zanj so značilne drobne zgostitve kromatina (oblika S-PCC) (29). ZAKLJUČEK Proces vključevanja semenčice v citoplaz-mo jajčne celice se začne pogosteje, kot je opazno s svetlobno mikroskopijo, vendar se pogosto zaustavi še pred oblikovanjem moškega pronukleusa. Vzroki za nezdružitev starševskih genomov v jajčni celici so številni in lahko hkrati izhajajo iz semenčice in jajčne celice. Najpogostejši vzrok za zaustavitev razprostiranja semenčic v jajčnih celicah je neaktiviranje ali nezadostno aktiviranje ]03 jajčne celice in ohranjena aktivnost njenega Tabela 3. Zastopanost posameznih oblik kromatina in mikrotubulov semenčice v neoplojenih jajčnih celicah z enim ženskim pronukleusom in hipotetična razlaga vzrokov za zastoj oploditve. Stadij Možni MPF Oblika semenčice Možni vzroki Nikoli jajčne celice vzroki zastoja v jajčni zastoja prisotne ob zastoju (jajčna celica) celici (semenčica) oblike semenčic Aktivirana jajčna Spontana aktivacija Neaktiven ^^--Mrtva semenčica sjv celica z ženskim pronukleusom Nepoškodovana membrana repa Denaturirana DNA Neaktiven SNDF Neaktiven 4- Nefunkcionalno astralno žarkovje Neaktiven Napaka pri oblikovanju pronukleusa Zakasnitev pri dekondenzaciji Neaktiven Nefunkcionalno astralno žarkovje MPF, ki povzroči predčasno kondenziranje spermijevih kromosomov. V teh primerih se namesto astralnega žarkovja večinoma oblikujejo bipolarna očetovska delitvena vretena. Med pogostejšimi napakami v procesu združe- vanja starševskih genomov je tudi asinhronija v nastajanju moškega in ženskega pronukleusa. Podatki o konfiguraciji kromatina in mikrotubulov v posamezni jajčni celici nam pomagajo pri iskanju možnih vzrokov neoplojenosti. LITERATURA 1. Simerly C, Navara C, Wu G-J, Schatten G. Cytoskeletal organization and dynamics in mammalian oocytes during maturation and fertilization. In: Grudzinskas JG, Yovich JL, eds. Gametes - The Oocyte. New York: Cambridge U Pr; 1995. p. 54. 2. Stearns T, Kirschner M. In vitro reconstitution of centrosome assembly and function: the central role of y-tu-bulin. Cell 1994; 76: 623-37. 3. Oakley BR, Oakley CE, Yoon Y, Jung MK. "¡"-tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans. Cell, 1990; 61:1289-301. 4. Schatten G. The centrosome and its mode of inheritance: The reduction of the centrsome during gametogene-sis and its restoration during fertilization. DevBiol 1994; 165: 299-335. 5. Colleu D, Lescoat D, Thomas D, Gouranton J. Changes in protamine 1 distribution in human sperm nucleus during in vitro sperm-oocyte interaction: an immunoelectron microscopic study. FertilSteril 1997; 67:123-8. 6. Lewin B. Driving the cell cycle: M phase kinase, its partners and substrates. Cell 1990; 61:743-52. 7. Kimura K, Hirano M, Kobayashi R, Hirano T. Phosphorylation and activation of 13S condensin by Cdc2 in vitro. Science 1998; 282:487-90. 8. Hashimoto H, Kishimoto T. Regulation of meiotic metaphase by a cytoplasmic maturation - promoting factor during mouse oocyte maturation. Dev Biol 1988; 126: 242-52. 9. Masui Y, Markert CL. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J Exp Zool 1971; 177:129-46. 10. Holloway SL, Glotzer M, King RW, Murray AW. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inacti-vation of maturation-promoting factor. Cell 1993; 73:1393-402. 11. Homa ST, Swann KA cytosolic sperm factor triggers calcium oscillations and membrane hyperpolarizations in 104 human oocytes. Hum Reprod 1994; 9: 2356-61. 12. Dozortsev D, Rybouchkin A, De Sutter P, Qian C, Dhont M. Human oocyte activation following intracytopla-smic injection: the role of the sperm cell. Hum Reprod 1995; 10:403-7. 13. Dozortsev D, Qian C, Ermilov A, Rybouchkin A, De Sutter P, Dhont M. Sperm-associated oocyte-activating factor is released from the spermatozoon within 30 minutes after injection as a result of the sperm-oocyte interaction. Hum Reprod 1997; 12: 2792-6. 14. Kovacic B, Vlaisavljevic V. Configuration of maternal and paternal chromatin and pertaining microtubules in human oocytes failing to fertilize after intracytoplasmic sperm injection. Mol Reprod Dev 2000; 55:197-204. 15. Asch R, Simerly C, Ord T, Ord VA, Schatten G. The stages at which human fertilization arrests: microtubule and chromosome configurations in inseminated oocytes which failed to complete fertilization and development in humans. Hum Reprod 1995; 10:1897-906. 16. Flaherty SP, Payne D, Swann NJ, Matthews CD. Aetiology of failed and abnormal fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1995; 10: 2623-9. 17. Dozortsev D, De Sutter P, Rybouchkin A, Dhont M. Timing of sperm and oocyte nuclear progression after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1995; 10: 3012-7. 18. Whitaker M, Patel R. Calcium and cell cycle control. Development 1990; 108: 525-42. 19. Sluder G. Role of spindle microtubules in the control of cell cycle timing. J Cell Biol 1979; 80: 674-91. 20. Carroll J, Jones KT, Whittingham DG. Ca2+ release and the development of Ca2+ release mechanisms during oocyte maturation: a prelude to fertilization. Rev Reprod 1996; 1:137-43. 21. Rybouchkin AV, Van der Straeten F, Quatacker J, De Sutter P, Dhont M. Fertilization and pregnancy after assisted oocyte activation and intracytoplasmic sperm injection in a case of round-headed sperm associated with deficient oocyte activation capacity. Fertil Steril 1997; 68: 1144-7. 22. Sakkas D, Urner F, Bianchi PG, Bizzaro D, Wagner. I, Jaquenoud N, Manicardi G, Campana A. Sperm chromatin anomalies can influence decondensation after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1996; 11:837-43. 23. Zirkin BR, Chang TSK, Heaps J. Involvement of acrosin-like proteinase in the sulfhydryl-induced degradation of rabbit sperm nuclear protamine. J Cell Biol 1980; 85:116-21. 24. Usui N, Yanagimachi R. Behavior of hamster sperm nuclei incorporated into eggs at various stages of maturation, fertilization and early development: J Ultrastruct Res 1976; 57: 276-88. 25. Van Blerkom J. Sperm centrosome dysfunction: a possible new class of male infertility in the human. Mol Hum Reprod 1996; 2: 349-54. 26. Plachot M. Chromosome analysis of oocytes and embryos. In: Verlinsky Y, Kuliev A, eds. Preimpbntation Genetics. New York: Plenum Pr; 1991. p. 103-12. 27. Balakier H, Squire J, Casper RF. Characterization of abnormal one pronuclear human oocytes by morphology, cytogenetics and in-situ hybridization. Hum Reprod 1993; 8:404-8. 28. Usui N, Ogura A, Kimura Y, Yanagimachi R. Sperm nuclear envelope: breakdown of intrinsic envelope and de novo formation in hamster oocytes or eggs. Zygote, 1997; 5: 35-46. 29. Schmiady H, Kentenich H. Premature chromosome condensation after in vitro fertilization. Hum Reprod 1989; 4: 689-95. Prispelo 10. 8. 2000 105