5 GENSKO ZDRA VLJENJE RAKA Prof. dr. Gregor Serša, univ. dipl. biol. Onkološki inštitut Ljubljana, Oddelek za eksperimentalno onkologijo gsersa@onko-i.si IZVLE ČEK Gensko zdravljenje je uporaba genov za zdravljenje bolezni. Na podro čju zdravljenja raka poteka veliko raziskav, saj imajo trenutne metode zdravlje- nja omejeno u činkovitost in neželene u činke. Za u činkovito gensko zdra- vljenje raka so potrebni dostavni sistemi, ki jih delimo na virusne in neviru- sne. Pristopi genskega zdravljenja pri raku so imunološki, kjer izkoriš čamo imunski sistem za uni čenje rakavih celic preko antigenskih, stimulatornih in kostimulatornih molekul, in molekularni, kjer izkoriš čamo inaktivacijo on- kogenov, vstavitev genov, ki zavirajo rast tumorja (tumor-supresorski geni), uporabo interferen čne RNA, vnašamo encime za aktivacijo zdravil, onkoli- ti čne viruse ali zaviramo angiogenezo. Klju čne besede: rak, virusni vektorji, nevirusni vektorji, pristopi za zdra- vljenje UVOD Rak je bolezen oziroma skupina bolezni, za katere je zna čilna nekontrolira- na rast celic v razli čnih organih, brez fi ziološke funkcije za ta organ (Serša, 2009). Tumor, ki nastaja, kvari fi ziološke funkcije organa, zaradi invazivno- sti tumorskih celic pa nastajajo oddaljeni zasevki oz. metastaze. Za zdravlje- nje raka uporabljamo razli čne na čine (kirurško zdravljenje, radioterapija, sistemsko zdravljenje), med novejše pa spada gensko zdravljenje. Gensko zdravljenje je uporaba genov za zdravljenje bolezni (Ko čevar, 2010). Pr- votno so z njim poskušali zdraviti pogoste monogenske bolezni krvnih ce- lic, kot sta talasemija beta in anemija srpastih celic (Kohn, Candotti, 2009). Nato se je težiš če v sredini 80-ih let prejšnjega stoletja prestavilo na veliko 6 redkejšo bolezen hude kombinirane imunske pomanjkljivosti (angl. Severe Combined Imunodefi ciency Disease; SCID,), nastale zaradi okvare v enci- mu adenozin deaminaza (ADA) (Kohn, Candotti, 2009). Ravno ta bolezen je postala tar ča prve odobrene klini čne študije z genskim zdravljenjem pri dveh otrocih leta 1990, študija pa je dala zagon novim raziskavam. Tako je število poskusov z genskim zdravljenjem slabo desetletje strmo naraš čalo, vse do smrti 18-letnega bolnika leta 1999 zaradi vnetne reakcije na adenovi- rusni vektor ter razvoja levkemiji podobne klonalne proliferacije limfocitov pri dveh otrocih leta 2002 (Edelstein, Abedi, Wixon, 2007). Po zaustavitvi takrat potekajo čih in na črtovanih študij ter ugotavljanju vzrokov nastanka neželenih u činkov danes njihovo število spet po časi naraš ča in potekajo štu- dije uporabe genskega zdravljenja pri razli čnih boleznih. Ravno pri zdravljenju raka gensko zdravljenje po časi napreduje kljub šte- vilnim predklini čnim raziskavam. Pri uvajanju vsakega novega zdravljenja je za četek težak in po časen, a z razvojem novih molekularnih tehnologij, ki bodo omogo čile cenovno ugodno in sprejemljivo pripravo genskih konstruk- tov za zdravljenje raka, lahko pri čakujemo razmah genskega zdravljenja. Osnovni principi genskega zdravljenja Pri zdravljenju rakavih bolezni lahko z genskim zdravljenjem popravimo oz. zamenjamo genetske okvare, zna čilne za rakave celice. Tako lahko zame- njamo gene z geni, ki zavirajo rast tumorja (tumorje zavirajo či geni), ali po drugi strani onemogo čimo izražanje onkogena, t. j. gena, ki je odgovoren za nastanek bolezni. Poleg tega pa lahko tudi sprožimo smrt tar čnih tumorskih celic, npr. z gensko usmerjeno kemoterapijo, z oja čitvijo imunskega odziva ali s ciljanjem tumorskega žilja (Kamensek, Sersa, 2008). Dostava genet- skega materiala lahko poteka na dva na čina: in vivo ali ex vivo. Pri na činu in vivo DNA dostavimo neposredno v tar čne celice tkiva bolnika. Za razliko od tovrstnega zdravljenja pa pri na činu ex vivo bolniku najprej odvzamemo celice organa, v katerem se izraža genska motnja. Odvzete celice gojimo v celi čni kulturi in vanje vnesemo gensko informacijo, čemur sledi presaditev modifi ciranih celic v tar čno tkivo (Slika 1). Klju čnega pomena za gensko zdravljenje je dostava želenega gena v celice. Za to uporabljamo razli čne tipe vektorjev, ki jih v grobem razdelimo na viru- sne in nevirusne. Virusni ostajajo najpogostejši; do sedaj so jih raziskovalci uporabili v približno dveh tretjinah klini čnih študij z genskim zdravljenjem. 7 V odobrenih, še trajajo čih ali zaklju čenih klini čnih študijah z genskim zdra- vljenjem za dostavne sisteme najpogosteje uporabljamo adenoviruse, sledi- jo jim retrovirusi, vse pogostejše pa so nevirusne dostavne metode, kot so vnos gole/plazmidne DNA z uporabo elektroporacije in lipofekcija. Gensko zdravljenje lahko cilja somatske ali zarodne celice. Le pri slednjih pride do prenosa spremembe na potomce, je pa tovrstno zdravljenje vprašljivo (pred- vsem eti čno) za izvedbo pri ve čjih živalih in ljudeh (Ko čevar, 2010). Gensko zdravljenje raka Zaenkrat je najve č klini čnih študij genskega zdravljenja usmerjenih v gen- sko zdravljenje raka, približno dve tretjini (Edelstein et al., 2007). Gensko zdravljenje raka je pomemben nov pristop k zdravljenju raka, ki temelji na ciljanem in specifi čnem zdravljenju, podobno kot zdravljenje s tar čnimi zdravili. Cilj obeh pristopov je čim bolj specifi čno ciljati tumorske celice in čim manj prizadeti nemaligne, normalne celice. Ustaljena na čina zdravljenja raka, kot sta radioterapija in sistemsko zdravljenje, ne izpolnjujeta vseh teh pogojev, kar mnogokrat vodi do lokalnih in sistemskih neželenih u činkov. Vnos genske informacije tako predstavlja izziv za potekajo če študije in al- ternativo klasi čnim na činom zdravljenja. Pri vsakem genskem zdravljenju je poglavitnega pomena varen in u činko- vit vnos genskega materiala, od bolezni pa je odvisno, koliko časa mora vzdržati v celicah (El-Aneed, 2004b). Tako je ponekod zaželeno čim daljše izražanje genov, drugje pa je zadosti že kratko obdobje. Ve čina na činov za gensko zdravljenje raka spada k slednjim. Pri dostavi genov za zdravljenje je pomembno tudi, ali bomo genski material vnesli sistemsko ali lokalno (t. i. ciljana dostava). Odlo čitev je odvisna od lokacije oz. dostopnosti tumorja in prisotnosti oddaljenih zasevkov ter samih sposobnosti dostavnih sistemov. Kar nekaj tipov tumorjev je primernih za neposreden vnos genov za zdra- vljenje (npr. melanom) ali druge na čine lokalnega vnosa genov za zdravlje- nje (npr. peritonealno injiciranje za rak jaj čnikov). Pri oddaljenih zasevkih pa pride v poštev vnos materiala v krvni obtok in ciljanje dolo čenega mesta. Tu se lahko zatakne. Dostavni sistemi morajo namre č v krvi preživeti nevar- nost razgradnje in celi čne obrambne mehanizme, ko pridejo do izbranega tkiva se morajo specifi čno vezati na tar čne celice, ko so enkrat v celici, pa se morajo tam izogniti še znotrajceli čnim oviram. Da bi zadostili čim ve č zah- tevam, so v uporabi in razvoju številni virusni in nevirusni dostavni sistemi. 8 Slika 1. Princip genske terapije, Prevc A, 2015. Dostavni sistemi Virusi so naravno razviti za infekcijo celic in vnos svojega genskega ma- teriala vanje (El-Aneed, 2004b). Pri genskem zdravljenju uporabljamo t. i. virusne vektorje, ki so laboratorijsko spremenjeni, tako da so odstranjeni geni za njihovo patogenost (npr. oviranje virusnega razmnoževanja z od- stranitvijo strukturnih genov). Kot dostavni sistemi veljajo virusni vektorji za bolj u činkovite kot nevirusni, a jih pesti vprašanje varnosti. Poleg tega so omejeni z velikostjo vklju čka in jih je težko proizvajati. V uporabi za gensko zdravljenje raka prevladujejo adenovirusni in retrovirusni vektorji, vektor virusa vakcinije, adenovirusom pridruženi virusni vektorji ter vektor herpesa simpleksa. Nekatere slabosti virusnih dostavnih sistemov, kot sta npr. varnost ali pro- izvodnja na veliko, so manj izrazite pri nevirusnih dostavnih sistemih (El- -Aneed, 2004b). V tej kategoriji za uporabo v genskem zdravljenju raka prevladujejo gola DNA kot posebna enota ter kationski lipidi in polimeri. Prva je bila uspešno uporabljena za neposredno injiciranje v tumorje ali kot cepivo DNA, vendar pa jo organizem lahko hitro odstrani. Za zaš čito in za zmanjšanje velikosti oz. kompleksnosti lahko DNA »vgradimo« v kation- ske nevirusne dostavne sisteme, kot so kationski lipidi in kationski polimeri (Ogris, Wagner, 2002). Ti z negativno nabito DNA interagirajo (vstopajo v interakcijo) preko elektrostati čnih interakcij, neto naboj celega kompleksa pa ostane pozitiven, kar v nadaljnji stopnji omogo či u činkovito interakcijo z 9 negativno nabitimi celi čnimi membranami in vstop molekule v celico, ki v glavnem poteka z endocitozo. Kationske nevirusne vektorje sicer pesti slab- ša učinkovitost v primerjavi z virusnimi in so odvisni od svojih fi zikalno-ke- mijskih lastnosti, vendar pa jih z lahkoto preoblikujemo, npr. za zmanjšanje nespecifi čnih interakcij s sestavinami krvi ali za ciljanje receptorjev na po- vršini tar čne celice (Ogris, Wagner, 2002). Golo DNA lahko neposredno uporabimo za vnos, če jo vnesemo blizu bo- lezenskega mesta in stran od elementov, ki bi jo utegnili razgraditi. Tako jo na primer v krvi ogrožajo nukleaze. Gola DNA brez ustreznega dostavnega sistema ne vstopa v celice. Za uspešen vnos genske informacije v celice so nam v pomo č številne fi zikalne in kemijske metode. U činkovita in varna metoda je elektroporacija – fi zikalna metoda za dostavo razli čnih molekul v celice z aplikacijo kontroliranih zunanjih elektri čnih polj, ki ustvarijo pore v celi čni membrani in tako za časno pove čajo njeno propustnost (Cemazar, Sersa, 2007). Z metodo elektroporacije smo prou čevali uporabo razli čnih genov za zdravljenje tumorjev. Še posebej primerna je za dostavo genov, ki ciljajo na tumorsko žilje, saj že metoda sama po sebi deluje žilno razdiralno. Na Onkološkem inštitutu Ljubljana smo izvedli zdravljenje prvega bolnika z uporabo elektroporacije kot dostavnega sistema za antiangiogeni gen pri zdravljenju kožnih metastaz melanoma v okviru evropske klini čne študije. Pristopi k zdravljenju Razvoj raka je povezan s številnimi spremembami na genskem nivoju. Za- radi njegove kompleksne narave gensko zdravljenje na tem podro čju poteka s pomočjo razli čnih pristopov. Njihova razdelitev je težka, ker se med seboj prepletajo. Ena izmed možnosti je delitev na imunološke in molekularne pristope (Ko čevar, 2010), posamezne pristope pa lahko tudi kombiniramo z že obstoje čimi na čini zdravljenja, npr. z radioterapijo (Kamensek, Sersa, 2008). Kombinacija radioterapije kot lokalnega zdravljenja in promotorjev, katerih delovanje sprožimo z ionizirajo čim sevanjem, lahko omogo či nad- zorovano izražanje genov za zdravljenje v tumorju (t. i. transkripcijsko cilja- nje) in s tem prispeva k zmanjšanju toksi čnosti za normalno tkivo. Imunološki pristop Rakave celice so po naravi imunogene, vendar pa so se sposobne izogibati imunskemu sistemu. To lahko po čnejo zaradi izlo čanja imunosupresivov, znižanega izražanja antigenov ali molekul poglavitnega histokompatibilno- 10 stnega sistema in pomanjkanja kostimulacije (El-Aneed, 2004a). Posledi čno imunski odziv organizma ni dovolj za prepoznavanje in uni čenje tumorskih celic. Gensko zdravljenje, ki spreminja imunski odziv bolnika (imunotera- pija), lahko izkoristimo kot spodbudo celi čni imunosti, predmet raziskav pa so tudi celi čna cepiva in cepiva DNA z antigen-kodirajo čimi geni, ki se predstavijo imunskim celicam in aktivirajo njihov odziv za uni čenje tumor- skih celic. Ena izmed možnosti imunološkega pristopa je prenos gena za imunostimu- latirajo čo molekulo (npr. citokini), pri čemer se aktivirajo predvsem limfoci- ti T in naravne celice ubijalke (El-Aneed, 2004a). Daud in sodelavci (Daud et al., 2008) so ta princip uporabili pri bolnikih z metastatskim melanomom, in sicer z elektroporacijskim vnosom gena za interlevkin-12 (IL-12). Gre za prvo klini čno študijo za dostavo plazmidne DNA z elektroporacijo in vivo na ljudeh. Na 24 bolnikih so v svoji klini čni študiji I. faze ugotovili, da je postopek varen in ga bolniki dobro prenašajo. Še posebej pa je vredno izpostaviti, da ima metoda potencial tudi za zdravljenje razsejane bolezni. Pri nekaj vklju čenih bolnikih so se poleg lezij, v katere so injicirali plazmid, zmanjšale tudi oddaljene, nezdravljene lezije. Pri polovici teh bolnikov so opazili sistemski odziv na gensko zdravljenje, bodisi v obliki stabilizirane bolezni bodisi kot zmanjšanje nezdravljenih lezij, pri treh bolnikih pa celo popolno regresijo oddaljenih lezij. Molekularni pristop Za tumorje je zna čilno spremenjeno izražanje nekaterih genov, za kar so krive predvsem mutacije. Te spremembe lahko izkoriš čamo za gensko zdravljenje z molekularnim pristopom in tako na razli čne na čine ciljamo onkogene in gene, ki zavirajo rast tumorja, gene, vpletene v angiogenezo itd. Poleg tega lahko za zdravljenje uporabimo tudi viruse, ki se selektivno razmnožujejo v rakavih celicah (onkoliti čni virusi), in gene, ki pretvarjajo neaktivna zdravila v aktivna (samomorilski geni). Cilj omenjenih možnosti je zaustavitev celi čnega cikla ali programirana celi čna smrt (apoptoza) (El- -Aneed, 2004b). Onkogeni in geni, ki zavirajo rast tumorja Ena glavnih genskih skupin, vpletenih v nastanek raka, je skupina onkoge- nov. Na njihovo biološko aktivnost lahko vplivamo s t. i. antionkogeni (pro- tismiselni oligonukleotidi, angl. antisense oligonucleotides), ki se vežejo na mRNA preko parjenja baz in tako zavirajo onkogeno aktivnost. 11 Predmet raziskav so tudi antionkogeni, ki se vežejo na zaporedje v DNA (antigenski oligonukleotidi, angl. antigene oligonucleotides) z vodikovimi vezmi in tako zavirajo onkogeno aktivnost. Druga velika skupina, vpletena v nastanek raka, je skupina genov, ki zavira- jo rast tumorjev. Ti nadzorujejo delitev celice in jo lahko, če je treba, usme- rijo v apoptozo. Za gensko zdravljenje lahko prenesemo divji tip proteina v celice z mutiranim genom in tako nadomestimo njegovo funkcijo. Glavni predstavnik teh genov je p53, ki je mutiran v skoraj 40 % rakov (El-Aneed, 2004b). Uporaba interferen čne RNA V posebno skupino pristopov lahko uvrstimo uporabo interferen čne RNA (Prosen, 2014). Princip delovanja temelji na komplementarnosti med krat- kimi dvoverižnimi RNA (mikro RNA (miRNA), kratke interferen čne RNA (siRNA)) in tar čno mRNA, kar vodi v utišanje izbranega gena. V grobem razdelimo kratke dvoverižne molekule RNA na tiste, ki jih sintetiziramo v laboratoriju in jih vnašamo v celice z dostavnimi sistemi (siRNA), in na en- dogene miRNA, ki nastanejo s prepisom iz molekule DNA (De Fougerolles, 2007). V sklop interferen čnih RNA spadajo tudi male nekodirajo če miRNA, ki na- stanejo s prepisom iz DNA. Njihova funkcija je predvsem uravnavanje iz- ražanja proteinov. Povezali so jih z razli čnimi boleznimi, med drugim tudi z onkogenim ali tumor-zavirajo čim vplivom pri raku, kadar so deli DNA, ki kodirajo za miRNA, mutirani ali se druga če nepravilno izražajo. Tako na primer mutirana oblika miRNA ne razgrajuje tar čnega onkogena mRNA, kar vodi v pove čano izražanje tega onkoproteina. Gre za novejše podro čje, kjer še ni klini čnih testiranj pri genskem zdravljenju raka. Samomorilski geni Naslednji pristop uporablja t. i. samomorilske gene. Tu gre za pretvorbo neaktivne snovi z nesesalskimi encimi v fi ziološko aktivno (citotoksi čno) obliko. Eden izmed najbolj prou čevanih sistemov je timidin kinaza iz virusa herpesa simpleksa (Nasu Y, 2007), ki fosforilira in s tem aktivira ganciklo- vir. Slednji preko apoptotskih in neapoptotskih mehanizmov uni či rakavo celico (El-Aneed, 2004a). Onkoliti čni virusi Virusni vektorji za uporabo pri genskem zdravljenju raka so lahko replikacijsko 12 okvarjeni ali replikacijsko selektivni (onkoliti čni). Slednji imajo naravno ali ume- tno vgrajeno sposobnost tumorske selektivnosti. Na ta na čin so se sposobni raz- množevati in uni čiti le tumorske celice, brez ogrožanja normalnih (Lu, 2004). Angiogeneza Angiogeneza je tvorba novih žil iz že obstoje čih in je, med drugim, potreb- na za rast tumorjev. Brez nje tumorji težko zrastejo ve č kot 2-3 mm. Eden izmed pristopov genskega zdravljenja raka je ciljanje na gene, povezane z angiogenezo. To lahko dosežemo na dva na čina, in sicer z zaviranjem njenih aktivatorjev ali z vstavitvijo njenih zaviralcev (Liu, 2006). ZAKLJU ČEK Gensko zdravljenje je zadnja desetletja predmet številnih raziskav, velik de- lež pa jih poteka na podro čju zdravljenja raka. Pri tem je velikega pomena, kako dostavimo želeni gen za zdravljenje. Pričakujemo lahko, da bo v priho- dnosti uspešno zdravljenje raka z genskim zdravljenjem vklju čevalo pred- vsem kombinacije, bodisi z že obstoje čimi na čini zdravljenja raka bodisi z razli čnimi pristopi genskega zdravljenja. LITERATURA Cemazar M, Sersa G. Electrotransfer of therapeutic molecules into tissues. Current Opinion in Molecular Therapeutics. 2007; 9:554-62. Daud AI, DeConti RC, Andrews S, Urbas P, Riker AI, Sondak VK et al. Phase I Trial of Interleukin-12 Plasmid Electroporation in Patients With Metastatic Mela- noma. Journal of Clinical Oncology. 2008; 26:5896-903. De Fougerolles A, V ornlocher HP , Maraganore J, Lieberman J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 20 07; 6:443-53. Edelstein ML, Abedi MR, Wixon J. Gene therapy clinical trials worldwide to 2007 - an update. Journal of Gene Medicine. 2008; 9:833-42. El-Aneed A. Current strategies in cancer gene therapy. European Journal of Phar- macology. 2004a; 498:1-8. 13 El-Aneed A. An overview of current delivery systems in cancer gene therapy. Jour- nal of Controlled Release. 2004b; 94:1-14. Kamensek U, Sersa G. Targeted gene therapy in radiotherapy. Radiology and On- cology. 2008; 42:115-35. Kočevar N, Čemažar M, Serša G. Gensko zdravljenje raka. Farm Vest. 2010; 61:8- 16. Kohn DB, Candotti F. Gene Therapy Fulfi lling Its Promise. New England Journal of Medicine. 2009; 360:518-21. Liu CC, Shen Z, Kung HF , Lin MC. Cancer gene therapy targeting angiogenesis: an upda- ted review. World J Gastroenterol. 2006; 12:6941-8. Lu W, Zheng S, Li XF, Huang JJ, Zheng X, Li Z. Intra-tumor injection of H101, a recombi- nant adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with advanced cancers: a pilot phase II clinical trial. World J Gastroenterol. 2004; 10:3634-8. Nasu Y, Saika T, Ebara S, Kusaka N, Kaku H, Abarzua F , Manabe D, Thompson TC, Kumon H. Suicide gene therapy with adenoviral delivery of HSV-tK gene for patients with local recurrence of prostate cancer after hormonal therapy. Mol Ther. 2007; 15:834-40. Ogris M, Wagner E. Targeting tumors with non-viral gene delivery systems. Drug Discovery Today. 2002; 7:479-85. Prevc A, Onkološki inštitut Ljubljana, 2015. Prosen L, Markelc B, Dolinsek T, Music B, Cemazar M, Sersa G. Mcam Silencing With RNA Interference Using Magnetofection has Antitumor Effect in Murine Melanoma. Mol Ther Nucleic Acids. 2014; 3:205. Serša G. Biološke in molekularne zna čilnosti malignih celic ter njihove tar če pri zdravljenju raka. Farm Vest. 2009; 60:43-7.