Oznaka poročila: ARRS-CRP-ZP-2018/29 ZAKLJUČNO POROČILO O REZULTATIH CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU l.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta V4-1435 Naslov projekta Varstvena genetika avtohtone potočne postrvi v Sloveniji Conservation genetics of indigenous brown trout in Slovenia Vodja projekta 11906 Aleš Snoj Naziv težišča v okviru CRP 3.02.03Trajnostno gospodarjenje z avtohtono potočno postrvjo v Sloveniji Obseg efektivnih ur raziskovalnega dela 1468 Cenovna kategorija D Obdobje trajanja projekta 07.2014 - 06.2017 Nosilna raziskovalna organizacija 510 Univerza v Ljubljani 481 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Raziskovalne organizacije -soizvajalke Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 4 BIOTEHNIKA 4.02 Živalska produkcija in predelava 4.02.01 Genetika in selekcija Družbeno-ekonomski cilj 08. Kmetijstvo Raziskovalno področje po šifrantu FORD/FOS 4 Kmetijske vede in veterina 4.02 Znanosti o živalih in mlekarstvu 2.Sofinancerji Sofinancerji 1. Naziv Naslov B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 3.Povzetek raziskovalnega projekta1 SLO_ Slovenske avtohtone populacije potočne postrvi (Salmo trutta) so ogrožene zaradi ribogojniške atlantske linije potočne postrvi, s katero se križajo. Do sedaj je bilo odkritih devet čistih populacij. Zaradi nizke efektivne velikosti (Ne) in genetske pestrosti te populacije ne zadostujejo za repopulacijo celotnega območje potočne postrvi v Sloveniji. Glavni cilj raziskave je bil identifikacija dodatnih genetsko čistih virov in ugotoviti, ali pri potočni postrvi obstajajo teritorialno specifični genetski pooli. Postrvi smo vzorčili na 80 lokacijah v savskem in dravskem rečnem sistemu. V raziskavo smo vključili tudi tri referenčne populacije atlantskih potočnih postrvi. Analizirali smo točkovne polimorfizme na CR mtDNA, 15 nevtralnih mikrosatelitov in tri mikrosatelite z domnevno adaptivno vrednostjo. Ugotavljali smo introgresijo, genetsko pestrost, Ne, strukturo in medpopulacijsko diferenciacijo ter vpliv okolja na selekcijo. Populacije smo glede na stopnjo introgresije razvrstili v pet skupin: (i) >96% nDNA, 17 populacij, (ii) 90 do 95% nDNA, 7 populacij, (iii) 84 do 89% nDNA, 4 populacije, (iv) 60 do 80% nDNA, 19 populacij, (v) < 50% nDNA. Genetska pestrost in Ne sta za prvi dve skupini podpovprečno nizki. F-statistika in PCA sta za prve tri skupine razkrili parne Fst vrednostmi od 0.52 do 0.81. Analiza populacijske strukture je razkrila pet genetsko homogenih in geografsko zaokroženih enot: (1) Bohinjsko območje, (2) sistem tržiške Bistrice, (3) sistem Sore, (4) sistem Savinje in (5) sistem Mislinje; preostalih šest lokacij predstavlja zelo diferencirane genetske skupine. Analiza preživetja zaroda v ribogojnici je pokazala, da na to lastnost bistveno vpliva poreklo očetov; do faze iker z očmi so bile najbolj viabilne ikre, oplojene z divjimi samci, v fazi mladic so imele največje preživetje tiste, ki so jih oplodili ribogojniški samci. Vse populacije z avtohtonim genetskim deležem >90% nDNA imajo glede na ekstremno nizko genetsko pestrostjo in Ne še vedno preskromen evolucijski potencial, da bi z njimi repopulirali celotno Slovenijo, imajo pa lokalen pomen. Če se želi to genetsko in posledično fenotipsko raznolikost ohranjati, bo potrebno z lokalnimi populacijami upravljati oddvojeno. Za rehabilitacijo bi bilo torej nujno najti dodatne vire genetsko sprejemljivih lokalnih plemenskih rib, ki bi zagotavljale zadostno genetsko pestrost, adaptivnost in ohranjanje regijsko specifičnih fenotipov. To troje pa je mogoče doseči le z uporabo lokalnega materiala. Predlagamo, da se areal potočne postrvi v Sloveniji razdeli na smiselne geografska enote upravljanja. V okviru teh bi se neposredno iz cone križanja z genetskima testom izbralo najboljši material in se ga v kombinaciji z genetsko čistimi populacijami uporabilo za vzpostavitev plemenskih jat samic, ki bi se jih oplojevalo z genetsko primernimi lokalnimi samci iz divjine. Predlagamo, da bi za zaščito in varovanje genetsko čistih populacij ustvarjali njihove kopije in z njimi naselili prazne sosednje potoke. ANG_ Slovenian brown trout (Salmo trutta) are threatened due hybridization with introduced brown trout of Atlantic lineage. So far, nine non-introgressed populations were detected. These populations have very low genetic diversity and small effective population size (Ne) and are thus not acceptable for repopulation of entire brown trout range in Slovenia. The main goal of this investigation is identification of additional genetically pure sources and to assess the existence of territorially specific gene pools. Brown trout were sampled in 80 locations in the Sava and Drava drainieges. Three reference Atlantic populations were also included. CR mtDNA single nucleotide polymorphisms, 15 neutral microsatellites and three microsatellites with adaptive value were analyzed. Introgression, genetic diversity, Ne, structure and inter-population differentiation were surveyed. The populations were regarding the rate of native nDNA sorted in five groups: (i) >96%, 17 populations, (ii) 90 do 95%, 7 populations, (iii) 84 do 89%, 4 populations, (iv), 60 do 80%, 19 populations, (v) > 50%. Genetic diversity and Ne were below average for the first two groups; for the first three groups, F-statistics and PCA revealed high inter-population differentiation (Fst up to 0.81). Population structure analysis revealed genetically homogeneous and geographically rounded units: (1) Bohinj area, (2) Tržiška Bistrica river system, (3) Sora river system, (4) Savinja river system and (5) Mislinja river system; the remaining six locations represented much differentiated genetic groups. Analysis of offspring survival in hatchery showed that this trait was significantly influenced by male origin; in the stage of eggs with eyes, eggs fertilized with wild males were the most viable, while in the stage of fry, the highest survival rate was recorded in a group fertilized by hatchery males. Considering extremely low genetic diversity and Ne, evolutionary potential of all the populations with native genetic share>90% is still insufficient to use them for extensive repopulation in Slovenia; rather, they should be used locally. If genetic and consequently phenotypic diversity is to be conserved, the local populations will need to be managed separately. To restore brown trout in Slovenia, it should be vital to find additional sources of genetically acceptable local genitors, which would assure sufficient genetic diversity, adaptiveness and perseveration of locally specific phenotypes. This can only be achieved using local fish. We suggest brown trout range in Slovenia to be divided into reasonable geographic management units. Within each, the best genitors would be genetically selected directly from hybridization zone and, combined with non-introgressed populations, used to establish female genitors to be fertilized with genetically appropriate local males from the wild. To protect non-introgressed populations we suggest making their copies, which should be introduced into neighboring fishless streams. 4.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela oz. ciljev raziskovalnega projekta2 Cilji raziskovalnega projekta so bili sledeči: • Poiskati dodatne vire genetsko čistih populacij. • Vzpostaviti sistem molekularnih markerjev, s katerim bo mogoče ločevati med genetskimi profili, značilnimi za posamezne lokalne populacije oz. regijsko zaključene enote. • Identificirati genetski profil (e.g., v okviru adaptivnih markerjev), ki je značilen za posamezno specifično okolje (e.g., ribogojnica, naravno okolje). • Izdelati predloge ukrepov za obnovo populacije domorodne potočne postrvi. Vsi cilji projekta so bili doseženi. Ključne rezultati raziskovalnega projekta so naslednji: • Našli smo 24 populacij potočne postrvi z avtohtonim genetskim deležem >90%. • Vse populacije imajo izjemno nizko genetsko pestrost in majhno efektivno velikost. • Analiza populacijske strukture je razkrila pet relativno homogenih genetskih in regijsko zaokroženih enot: (1) Bohinjsko območje (2) sistem tržiške Bistrice (3) sistem Sore (4) sistem Savinje (5) sistem Mislinje • Preostalih šest lokacij (posamezni izolirani potoki) predstavlja neodvisne in zelo diferencirane genetske skupine. • Analiza vpliva različnega okolja na selekcijo potočne postrvi je pokazala, da je pri divjih populacijah alelna pestrost med adaptivnimi in nevtralni lokusi sorazmerna, medtem ko je pri ribogojniških populacijah to razmerje nagnjeno v prid alelni pestrosti nevtralnih lokusov, kar kaže, da v ribogojnici na nekatere alele adaptivnih lokusov deluje negativna selekcija. • Analiza preživetja zaroda v ribogojnici je pokazala, da je na to lastnost bistveno vplivalo poreklo očetov; do faze iker z očmi so bile najbolj viabilne tiste ikre, oplojene s samci iz divjine, v fazi mladic pa so imele največje preživetje tiste, ki so jih oplodili ribogojniški samci. Iz dobljenih rezultatov izhajajo naslednje ugotovitve: Genetsko čiste populacije zaradi svojega zelo nizkega evolucijskega potenciala, ki smo ga ocenili preko genetske pestrosti in efektivne velikosti populacij, ekstremno visoke med- populacijske diferenciacije in regijsko specifičnih genetskih profilov niso primerne za celostno repopulacijo potočne postrvi v Sloveniji. Te populacije se zato lahko uporablja za namen repopulacije v omejenem obsegu le na lokalni ravni. Rezultat tega spoznanja je ugotovitev, da je za učinkovit celosten repopulacijski proces v Sloveniji vanj potrebno v kombinaciji z genetsko čistimi populacijami vključiti tudi lokalni material iz cone križanja in v okviru tega z genetskim testom odbrati genetsko najprimernejše osebke za proizvodnjo zaroda za repopulacijo. Glede na negativno selekcijo, ki jo ima ribogojnica na divje populacije, kar smo pokazali v svoji raziskavi, je potrebno plemensko jato samic osveževati z ženskimi osebki iz divjine, za oploditev pa uporabljati izključno samce iz divjine. Za zaščito in varovanje genetsko čistih populacij bi bilo potrebno ustvarjati njihove kopije in z njimi naseliti prazne sosednje potoke. Razširjanje lokalnih genetskih »poolov« z ustvarjanjem populacijskih kopij ima tudi repopulacijski učinek, saj genetski pretok, ki poteka nizvodno, postopno osvežuje introgresirane genome in jih strukturno spreminjajo v prid lokalnim domorodnim linijam. Uporaba rezultatov: (1) Prispevek k ohranjanju oz. varovanje naravne dediščine: Rezultati raziskave v prvi vrsti predstavljajo znanstveno podlago, na osnovi katere lahko strokovne službe izdelajo izpopolnjen varstveni načrt za avtohtono potočno postrv v Sloveniji. (2) Prenos obstoječih znanj v prakso in razvoj novih upravljavskih rešitev: Določena spoznanja raziskave lahko ribiški upravljavci neposredno vključijo v svoje upravljavske programe. (3) Strokovna ocena stanja: V okviru raziskave smo razvili orodja, ki omogočajo ocenjevanje stanja katerihkoli populacij potočne postrvi tudi drugje (izven Slovenije) in/ali v bodoče. Z manjšimi modifikacijami se to metodiko lahko aplicira tudi na druge sorodne salmonidne vrste v Sloveniji in širše. (4) Varovanje okolja in trajnostni razvoj: Učinek raziskave se lahko potencialno realizira preko vzpostavitve ustreznega upravljanja s potočno postrvjo in posledično skozi rehabilitacijo potočne postrvi v Sloveniji. 5.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev3 Cilji projekta so bili sledeči: (1) Poiskati dodatne vire genetsko čistih populacij, (2) vzpostaviti sistem molekularnih markerjev, s katerim bo mogoče ločevati med genetskimi profili, značilnimi za posamezne lokalne populacije oz. regijsko zaokrožene enote, (3) identificirati genetski profil v okviru adaptivnih genov, ki je značilen za posamezno specifično okolje (e.g., ribogojnica, naravno okolje), (4) izdelati predloge ukrepov za obnovo populacije domorodne potočne postrvi. V okviru realiziranega projekta smo odgovorili na vse zastavljene cilje: Našli smo 24 genetsko pristnih populacij domorodne potočne postrvi. Izpolnjen drugi cilj potrjuje identifikacija petih genetsko homogenih in hkrati geografsko zaokroženih enot, ki smo jih izenačili z enotami, primernimi za enovito ribiško upravljanje. Kot je razvidno iz prijave projekta, je bil tretji cilj pilotne narave, saj smo analize adaptivnosti izvajali le na nekaj kandidatnih genih, poznanih iz literature. (Izolacija adaptivnih genov na osnovi RAD sekvenciranja ni bila predmet tega projekta.) Navkljub omejenemu naboru potencialno informativnih markerjev smo uspeli posredno in neposredno prikazati genetske razlike med ribogojniškim in divjim materialom, ki nastanejo kot rezultat selekcije na različna okolja. V okviru četrtega cilja smo na osnovi rezultatov projekta podali svoja mnenja in priporočila za upravljanje s potočno postrvjo v Sloveniji z namenom rehabilitacije njenih avtohtonih virov. 6.Spremembe programa dela raziskovalnega projekta oziroma spremembe sestave projektne skupine4 Ni bilo sprememb. 7.Najpomembnejši dosežki projektne skupine na raziskovalnem področju5 I I Dosežek 1. COBISS ID Naslov SLO ANG Opis SLO ANG Objavljeno v Tipologija 8.Najpomembnejši dosežek projektne skupine na področju gospodarstva, družbenih in kulturnih dejavnosti6 Dosežek 1. COBISS ID 3934088 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Varstvena genetika avtohtone potočne postrvi v Sloveniji ANG Conservation genetics of native brown trout in Slovenia Opis SLO Prispevek obsega detajlno poročilo projekta in se v celoti nahaja v prilogi. ANG The contribution contains detailed report of the Project and can be found in the attachment. Šifra D.11 Drugo Objavljeno v Biotehniška fakulteta; 2017; 1 CD ROM; Avtorji / Authors: Snoj Aleš, Bravničar Jernej, Sušnik Bajec Simona Tipologija 2.12 Končno poročilo o rezultatih raziskav 2. COBISS ID 3991176 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Genetska pestrost in atlantska postrv v Sloveniji ANG Genetic diversity and Atlantic brown trout in Slovenia Opis SLO Obravnavan je bil pomen genetske pestrosti kot osnovno merilo za ugotavljanje evolucijskega potenciala vrst in populacij s poudarkom na lokalnih genetsko čistih populacijah potočne postrvi, ki so bile predmet obravnave v tem projektu. Razpravljalo se je tudi o vplivu vnesenih atlantskih ribogojniških populacij potočne postrvi na slovenske domorodne populacije. ANG The role of genetic diversity as a basic measure for assessing evolutionary potential of species and populations was discussed with special emphasis on local genetically pure brown trout, studied in this project. The impact of introduced Atlantic hatchery-reared populations on Slovenian native brown trout populations was also discussed. Šifra F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Objavljeno v 2017; Avtorji / Authors: Snoj Aleš Tipologija 3.15 Prispevek na konferenci brez natisa 3. COBISS ID 3991432 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Predstavitev rezultatov raziskave in izhodišč za upravljanje s potočno postrvjo v smeri njene rehabilitacije ANG Presentation of the results of the project and bases for managing the brown trout in the direction of its rehabilitation Opis SLO Seminar je bil organiziran za ribiške upravljavce z namenom predstavitve rezultatov projekta in kot uvod v osnove genetskega menedžmenta na primeru potočne postrvi. Dosežek ANG The seminar was organised for brown trout managers in order to present them the results of the project and to introduce them into the principles of genetic management using the studied brown trout as an example. Šifra F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Objavljeno v 2017; Avtorji / Authors: Bravničar Jernej Tipologija 3.15 Prispevek na konferenci brez natisa 9.Drugi pomembni rezultati projektne skupine7 i i 10.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine8 10.1. Pomen za razvoj znanosti9 SLO Za analizo, izvedeno v tem ciljnem raziskovalnem projektu, smo uporabili že uveljavljena molekularna orodja, zato projekt ne prispeva neposredno k razvoju osnovnih znanosti. Z znanstvenega vidika so rezultati projekta doprinesli k širšemu poznavanju molekularne ekologije potočne postrvi, predvsem v smislu poznavanja filogeografije te vrste; za območje Slovenije predhodno namreč še ni bilo zadostnih podatkov o geografski razporejenosti evolucijskih linij potočne postrvi. Poleg tega smo natančno raziskali vrsto populacijsko genetskih parametrov divjih populacij potočne postrvi v Sloveniji in tako osvetlili predvsem njihovo populacijsko strukturo, genetsko pestrost in njihov evolucijski potencial ter s tem pripomogli k boljšemu poznavanju biologije vrste. Novost na področju genomike je zagotovo študija adaptivnih sprememb, izvedena v okviru poljskega poskusa, preko katerega smo spremljali vpliv različnih selekcijskih pritiskov na poskusne živali. Po našem vedenju tak poskus še ni bil izveden na salmonidih. ANG For the analysis performed in this target research project already well established molecular tools were used, so the project does not directly contribute to the development of basic science. Nevertheless, from the scientific perspective, the results of the project extended the general knowledge of molecular ecology of brown trout, especially in terms of the species phylogeography given the data on the distribution of evolutionary lineages of brown trout in Slovenia were previously insufficient. In addition, we carefully studied an array of population genetic parameters of wild populations in Slovenia, thus highlighting their population structure, genetic diversity and their evolutionary potential, thereby contributing to better knowledge of species biology. A novelty in the field of genomics surely represents the genetic study of adaptive variation that was performed through the field experiment, in which different selection pressures and corresponding genetic change were followed. According to our knowledge, such an experiment has not yet been implemented on salmonids. 10.2. Pomen za razvoj Slovenije10 SLO_ Glavni pomen rezultatov predlaganega projekta je varovanje naravne dediščine, katere del v Sloveniji je nedvomno tudi avtohtona potočna postrv, ki je bila upodobljena celo na kovancu slovenskega tolarja. Projekt je izrazito praktično usmerjen in je namenjen kot neposredna pomoč pri izdelavi varstvenega načrta za avtohtono potočno postrv v Sloveniji s končnim ciljem njene repopulacije. Podatke o lokacijah genetsko čistih donavskih populacij smo posredovali MKO in ZZRS ter ribiškim družinam, ki bodo to informacijo implementirali v ukrepe za obnovo populacije avtohtone potočne postrvi, hkrati pa bo služila pri strateškem odločanju glede upravljanja rib v slovenskih celinskih vodah. Sistem molekularnih markerjev za regijsko in inter-populacijsko ločevanje osebkov bo omogočal ugotavljanje identitete posameznih enot potočne postrvi in s tem tudi sledenje in nadziranje njihovega prenašanja izven dovoljenega geografskega območja. Predvidevamo, da se bo gospodarjenje s potočno postrvjo preselilo v okvir lokalnih območij upravljanja, kjer bodo za potrebe dopolnilnega vlaganja uporabljali izključno svoj lokalni material. Pričakujemo, da se lahko s takim upravljanjem in skupaj z drugimi priporočili, ki jih predlagamo, doseže, da bo v območjih, ki jih trenutno naseljuje hibridna združba donavskih in atlantskih potočnih postrvi, pri teh populacijah prišlo do znatne zamenjave neavtohtonih genov z avtohtonimi geni. Poleg tega predvidevamo, da se bodo ponovno vzpostavili regijsko značilni fenotipski profili potočnih postrvi, kar bo v okviru športnega ribolova predstavljalo dodano vrednost za posamezne regije v Sloveniji. ANG_ The main significance of the results of the proposed project is the protection of the natural heritage, which in Slovenia is undoubtedly also an autochthonous brown trout, which was even depicted on the one tolar coin of the former Slovenian currency. The project is very practically oriented and is intended as direct assistance in the development of a protective plan for autochthonous trout in Slovenia with the ultimate goal of its repopulation. Data on the locations of genetically pure Danube populations were forwarded to the Ministry of Agriculture, Forestry and Food, Fisheries Institute of Slovenia and angling clubs, which will implement this information in the measures for the restoration of the autochthonous brown trout populations, while serving as strategic decision makers for fish management in Slovenian inland waters. A system of molecular markers for regional and inter-population separation of specimens will enable the identification of individual units of brown trout and thus also track and monitor their transfer outside the permitted geographical area. It is assumed that the management of brown trout will be transferred to the local management areas, where they will use exclusively their local material for the needs of supplemetal stocking. We expect that with such management and together with the other recommendations we suggest, it will be possible to achieve significant replacement of non-autochthonous genes with native genes in these populations in the areas currently occupied by the hybrid swarm of the Danube and Atlantic brown trout. In addition, it is anticipated that the regionally significant phenotypic profiles of brown trout will be restored, which will, in the context of sport fishing, be of added value for individual regions in Slovenia. ll.Vpetost raziskovalnih rezultatov projektne skupine 11.1. Vpetost raziskave v domače okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? 1 v domačih znanstvenih krogih 2 pri domačih uporabnikih Kdo (poleg sofinancerjev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih?11 Zavod za ribištvo Slovenije, Ribiške družine Bled, Tržič, Škofja Loka, Ljubno, HIDROSVET d.o.o., Zavod Umbra, Zavod Revivo. 11.2. Vpetost raziskave v tuje okolje Kje obstaja verjetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva? 1 v mednarodnih znanstvenih krogih 2 pri mednarodnih uporabnikih Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujini raziskovalnimi inštitucijami:12 / Kateri so rezultati tovrstnega sodelovanja:1^ / 12.Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Ж Uporaba rezultatov F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat T Uporaba rezultatov F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov T F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov T F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Ж Uporaba rezultatov F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat T Uporaba rezultatov F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov T F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov T F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj dada nene Rezultat Uporaba rezultatov F. 10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F. 13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F. 14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F. 15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F. 16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F. 17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Dosežen bo v naslednjih 3 letih | Uporaba rezultatov Uporabljen bo v naslednjih 3 letih | F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj dada nene Rezultat Dosežen | Uporaba rezultatov Delno 1 F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat 1 Dosežen _|| Uporaba rezultatov V celoti 1 F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj DA DA nene Rezultat Uporaba rezultatov F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj dada NE ne Rezultat Dosežen bo v naslednjih 3 letih | Uporaba rezultatov Uporabljen bo v naslednjih 3 letih | F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj DA DA NENE Rezultat Uporaba rezultatov F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov F.35 Drugo Zastavljen cilj dada ne ne Rezultat Uporaba rezultatov Komentar ' — 13.Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja 1 2 3 4 G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja 1 2 3 4 G.01.03. Drugo: 1 2 3 4 G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu 1 2 3 4 G.02.02. Širitev obstoječih trgov 1 2 3 4 G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje 1 2 3 4 G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije 1 2 3 4 G.02.05. Razširitev področja dejavnosti 1 2 3 4 G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost 1 2 3 4 G.02.07. Večji delež izvoza 1 2 3 4 G.02.08. Povečanje dobička 1 2 3 4 G.02.09. Nova delovna mesta 1 2 3 4 G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih 1 2 3 4 G.02.11. Nov investicijski zagon 1 2 3 4 G.02.12. Drugo: 1 2 3 4 G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti 1 2 3 4 G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti 1 2 3 4 G.03.03. Uvajanje novih tehnologij 1 2 3 4 G.03.04. Drugo: 1 2 3 4 G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja 1 2 3 4 G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja 1 2 3 4 G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave 1 2 3 4 G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti 1 2 3 4 G.04.05. Razvoj civilne družbe 1 2 3 4 G.04.06. Drugo: 1 2 3 4 G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete 1 2 3 4 G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj 1 2 3 4 G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura 1 2 3 4 G.07.02. Prometna infrastruktura 1 2 3 4 G.07.03. Energetska infrastruktura 1 2 3 4 G.07.04. Drugo: 1 2 3 4 G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva 1 2 3 4 G.09. Drugo: 1 2 3 4 Komentar i -1 14.Naslov spletne strani za projekte, odobrene na podlagi javnih razpisov za sofinanciranje raziskovalnih projektov za leti 2015 in 201614 i -1 C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni; • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja in obdelavo teh podatkov za evidence ARRS; • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki (v primeru, da poročilo ne bo oddano z digitalnima podpisoma); • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta; • bomo sofinancerjem istočasno z zaključnim poročilom predložili tudi elaborat na zgoščenki (CD), ki ga bomo posredovali po pošti, skladno z zahtevami sofinancerjev. Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba in vodja raziskovalnega projekta: raziskovalne organizacije: Univerza v Ljubljani, Biotehniška Aleš Snoj fakulteta ZIG Datum: 7.3.2018 Oznaka poročila: ARRS-CRP-ZP-2018/29 1 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku). Nazaj 2 v v Navedite cilje iz prijave projekta in napišite, ali so bili cilji projekta doseženi. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11). Nazaj 4 Navedite morebitna bistvena odstopanja in spremembe od predvidenega programa dela raziskovalnega projekta, zapisanega v prijavi raziskovalnega projekta. Navedite in utemeljite tudi spremembe sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta (t. j. v letu 2016). . Če sprememb ni bilo, navedite »Ni bilo spremeb«. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikosti pisave 11). Nazaj 5 Navedite dosežke na raziskovalnem področju (največ deset), ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj Navedite dosežke na področju gospodarstva, družbenih in kulturnih dejavnosti (največ pet), ki so nastali v 6 okviru tega projekta. Dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka, sistem nato sam izpolni podatke, manjkajoče rubrike o dosežku pa izpolnite. Dosežek na področju gospodarstva, družbenih in kulturnih dejavnosti je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek dosežka na področju gospodarstva, družbenih in kulturnih dejavnosti praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta ... - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 7 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 7 in 8 (npr. v sistemu COBISS rezultat ni evidentiran). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 8 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja. Nazaj 9 v v Največ 4.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 1 1 Največ 500 znakov, vključno s presledki. Nazaj 12« Največ 500 znakov, vključno s presledki. Nazaj 1 3 v v Največ 1.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 14 Izvajalec mora za projekte, odobrene na podlagi Javnega razpisa za izbiro raziskovalnih projektov Ciljnega raziskovalnega programa »CRP 2016« v letu 2016 in Javnega razpisa za izbiro raziskovalnih projektov Ciljnega raziskovalnega programa »Zagotovimo.si hrano za jutri« v letu 2016, na spletnem mestu svoje RO odpreti posebno spletno stran, ki je namenjena projektu. Obvezne vsebine spletne strani so: vsebinski opis projekta z osnovnimi podatki glede financiranja, sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS, faze projekta in njihova realizacija, bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta ter logotip ARRS in drugih sofinancerjev. Spletna stran mora ostati aktivna še 5 let po zaključku projekta. Nazaj Obrazec: ARRS-CRP-ZP/2018 v1.00 11-03-2E-A6-28-58-AF-B0-D6-97-AD-43-96-CC-7 3-19-59-45-BF-E3 Priloga h končnemu poročilu projekta VARSTVENA GENETIKA AVTOHTONE POTOČNE POSTRVI V SLOVENIJI Jernej Bravničar, Simona Sušnik in Aleš Snoj ABSTRAKT Slovenske avtohtone populacije potočne postrvi (Salmo trutta) so ogrožene zaradi domesticirane ribogojniške atlantske linije potočne postrvi, s katero so nekaj desetletij poribljali odprte vode, kjer se je le-ta križala z avtohtonimi osebki. Dosedanje genetske raziskave so pokazale, da prevladujoči del areala potočne postrvi naseljujejo križanci, medtem ko so genetsko čiste avtohtone populacije omejene le na izolirane zgornje tokove manjših potokov. Do sedaj je bilo odkritih devet čistih populacij, večina v dravskem porečju na Koroškem, vse imajo zelo nizko efektivno velikost in zelo nizko genetsko pestrost, kar kaže na njihov skromen evolucijski potencial, zaradi česar te populacije ne zadostujejo za repopulacijo celotnega območje potočne postrvi v Sloveniji. Osnovni cilj raziskave je bil najti primerno strategijo za rehabilitacijo avtohtone potočne postrvi v Sloveniji. Ključen element tega je bila identifikacija dodatnih genetsko čistih virov, ki naj bi zagotovili zadostno genetsko pestrost in s tem možnost uporabe tega materiala za repopulacijo avtohtone potočne postrvi. Ugotavljali smo tudi, ali pri potočni postrvi obstajajo teritorialno specifični genetski »pooli«, s katerimi bi bilo potrebno oddvojeno upravljati in jih medsebojno ne mešati. Poleg tega v raziskavi preučujemo vpliv različnega okolja na selekcijo potočne postrvi. Na osnovi dobljenih rezultatov načrtujemo podati smernice za repopulacijo avtohtone potočne postrvi v Sloveniji. Postrvi smo vzorčili na 80 lokacijah (po ca. 20 osebkov) v 20 ribiških družinah v savskem in dravskem rečnem sistemu. V raziskavo smo vključili tudi večino populacij, ki smo jih kot genetsko ustrezne prepoznali v predhodni raziskavi, poleg tega pa še tri plemenske jate in tri referenčne ribogojniške populacije atlantskih potočnih postrvi. Analizirali smo posamezne točkovne polimorfizme (SNP-je) na kontrolni regiji mtDNA, 15 nevtralnih mikrosatelitnih lokusov in tri mikrosatelitne lokuse z domnevno adaptivno vrednostjo. Ugotavljali smo introgresijo neavtohtonih genov za populacije in osebke; populacijam smo določali genetsko pestrost, efektivno velikost, strukturo in medpopulacijsko diferenciacijo. Za analizo podatkov smo uporabljali programe Genetix, Populations, FSTAT, STRUCTURE in STRUCTURE Harvester. Populacije smo glede na prisotnost donavskega in atlantskega genetskega deleža mitohondrijske in jedrne DNA razvrstili v pet skupin: (i) z zelo visokim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, >96% nDNA), 17 populacij, (ii) z visokim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, 90 do 95% nDNA), 7 populacij, (iii) s solidnim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, 84 do 89% nDNA), 4 populacije, (iv) 100% mtDNA, 60 do 80% nDNA, 19 populacij, (v) introgresija z atlantskimi geni nad 50%. Genetska pestrost in efektivna velikost populacij (Ne) sta za prvi dve skupini ekstremno nizki (H = 0.125 do 0.350; A = 1.42 do 3.18; 1.26 haplotipa na populacijo; Ne = 2-20). F-statistika in analiza PCA sta za prve tri skupine razkrili zelo visoko medpopulacijsko diferenciacijo (Fst=0.52), podprto z visokimi parnimi Fst vrednostmi (do 0.81). Analiza populacijske strukture je razkrila pet relativno homogenih genetskih in geografsko zaokroženih enot: (1) Bohinjsko območje, (2) sistem Tržiške Bistrice, (3) sistem Sore, (4) sistem Savinje in (5) sistem Mislinje; preostalih šest lokacij (posamezni izolirani potoki) predstavlja neodvisne in zelo diferencirane genetske skupine. Analiza vpliva različnega okolja na selekcijo potočne postrvi je pokazala, da je pri divjih populacijah alelna pestrost med adaptivnimi in nevtralni lokusi sorazmerna, medtem ko je pri ribogojniških populacijah to razmerje nagnjeno v prid alelni pestrosti nevtralnih lokusov, kar nakazuje, da v ribogojnici na nekatere alele adaptivnih lokusov deluje negativna selekcija. Analiza preživetja zaroda v ribogojnici je pokazala, da je na to lastnost bistveno vplivalo poreklo očetov; do faze iker z očmi so bile najbolj viabilne tiste ikre, oplojene s samci iz divjine, v fazi mladic pa so imele največje preživetje tiste, ki so jih oplodili ribogojniški samci. Ker imajo vse populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem ekstremno nizko genetsko pestrostjo in Ne, menimo, da imajo kljub temu, da se pojavljajo v večjem številu kot v predhodni raziskavi, še vedno preskromen evolucijski potencial in da zato niso primerne za obsežno repopulacijo potočne postrvi v Sloveniji, temveč bi morale imeti zato le lokalen pomen. Specifične genetske profile populacij smo dokazali na osnovi nevtralnih markerjev. Če naj bi to genetsko in posledično fenotipsko raznolikost ohranjali, bo potrebno z lokalnimi populacijami oddvojeno upravljati in se izogibati njihovemu medsebojnemu mešanju. Za rehabilitacijo avtohtone potočne postrvi v Sloveniji bi bilo torej nujno najti dodatne vire genetsko sprejemljivih lokalnih plemenskih rib, ki bi zagotavljale zadostno genetsko pestrost, adaptivnost in ohranjanje regijsko specifičnih fenotipov. To troje pa je mogoče doseči le z uporabo lokalnega materiala. Mnenja smo, da je bolje uporabiti lokalni material, pa čeprav ta ni povsem genetsko čist, in na ta način ohraniti vsaj preostanek avtohtonih lokalnih genov, ki zagotavljajo adaptivnost in potencial za izražanje lokalnih fenotipov. Predlagamo, da se areal potočne postrvi v Sloveniji razdeli na smiselna geografska območja, ki bodo predstavljala najmanjše enote upravljanja. V okviru teh območij bi neposredno iz cone križanja s pomočjo genetskega testa izbrale najboljši material in ga v kombinaciji z genetsko čistimi populacijami (kjer so na voljo) uporabili za vzpostavitev plemenskih jat samic s sprejemljivim donavskim deležem. Ikre teh samic bi vsakoletno oplojevali s semenom lokalnih samcev iz divjine. Kako visok delež neavtohtonih genov bi bil v neki lokalni populaciji sprejemljiv, je odvisno od konkretnih razmer v posameznem ribiškem območju oz. ribiški družini. Predlagamo, da bi za zaščito in varovanje genetsko čistih populacij ustvarjali njihove kopije in z njimi naselili prazne sosednje potoke. Razširjanje lokalnih genetskih »poolov« je tudi repopulacijski ukrep, saj genetski pretok, ki poteka nizvodno, postopno osvežuje introgresirane genome in jih strukturno spreminjajo v prid donavski liniji. ABSTRACT Slovenian native brown trout (Salmo trutta) are threatened due to domesticated hatchery brown trout of the Atlantic lineage, which have been stocked in the wild for decades, hybridizing with native individuals. According to recent genetic tests, hybrids prevail in the vast area of brown trout range, whilst native purebreds are confined only to some upper isolated reaches of small streams. So far, nine apparently non-introgressed (genetically "pure", pristine) populations were detected, most of them found in the Drava river system in Slovenian Carinthia; all of these populations have very low genetic diversity and small effective population size (Ne) indicating their low evolutionary potential, for which these populations are not recommended to be used as a source for brown trout repopulation across its entire range in Slovenia. The goal of this investigation is to invent a proper strategy for native brown trout rehabilitation in Slovenia, of which the main objective is to identify additional genetically pristine sources of brown trout in order to provide sufficient genetic diversity needed for brown trout repopulation. We also aim to determine if geographically specific genetic pools of brown trout, that should not to be mixed but rather managed separately, exist in Slovenia. In addition, we also tend to study the impact of different environments (wild vs. hatchery) on brown trout selection. On the basis of obtained results, we wish to suggest guidelines for brown trout repopulation in Slovenia. Brown trout were sampled in 80 locations (ca. 20 individuals per location) in 20 angling clubs across the Sava and Drava river systems. Most of the populations considered as genetically pristine in previous investigation, three genitor stocks and three hatchery Atlantic reference populations were also included in the investigation. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) on mtDNA control region, 15 neutral microsatellite loci and three microsatellite loci with apparently adaptive value were analyzed. Introgression with non-native genes was assessed at the individual and population level; populations were tested for genetic diversity, effective population size, structure and inter-population differentiation. Data analysis was conducted using programs Genetix, Populations, FSTAT, STRUCTURE in STRUCTURE Harvester. The populations were, regarding the presence of Danubian and Atlantic genetic proportion in mitochondrial and nuclear DNA, sorted in five groups: (i) with very high Danubian proportion (100% mtDNA, >96% nDNA), 17 populations, (ii) with high Danubian proportion (100% mtDNA, 90 do 95% nDNA), seven populations, (iii) with fair Danubian proportion (100% mtDNA, 84 do 89% nDNA), four populations, (iv) with moderate Danubian proportion (100% mtDNA, 60 do 80% nDNA), 19 populations, (v) highly introgressed (> 50%) with Atlantic genes. Genetic diversity and effective population size were on average very low, whilst the data for the first two groups show extremely low levels: H = 0.125 to 0.350; A = 1.42 to 3.18; 1.2 haplotype per population; Ne = ca. 2-20). For the first three groups, F-statistics and PCA revealed very high inter-population differentiation (Fst = 0.52), supported with extremely high pairwise Fst values (up to 0.81). Population structure analysis revealed five relatively homogeneous genetic and geographically rounded units: (1) Bohinj area, (2) Tržiška Bistrica river system, (3) Sora river system, (4) Savinja river system and (5) Mislinja river system; the rest six locations (single isolated streams) represented independent and much differentiated genetic groups. Analysis of different environmental impact on brown trout selection pointed out proportionate share of allelic richness between neutral and adaptive loci in wild populations, while in hatchery populations this ratio was in favor to allelic richness of neutral loci suggesting that in hatchery, certain alleles of adaptive loci are affected by negative selection. Analysis of offspring survival in hatchery showed that this trait was significantly influenced by male origin; in the stage of eyed eggs, the eggs fertilized with the wild males were the most viable, while in the stage of fry, the highest survival rate was recorded in a group fertilized by hatchery males. As all the populations with high or very high native genetic share have extremely low genetic diversity and Ne, we reckon that despite higher number of genetically pristine populations comparing to previous study, their evolutionary potential is still not high enough to use them for extensive repopulation of brown trout in Slovenia; rather, they should be used only locally. Using neutral genetic markers, we proved specific genetic profiles for most populations. If this diverse pattern of genetic and consequently also phenotypic heterogeneity is to be conserved, the local populations will need to be managed separately. To restore brown trout in Slovenia, it should be vital to find additional sources of genetically acceptable local genitors, which would provide sufficient genetic diversity and adaptiveness, and assure perseveration of locally specific phenotypes. This can only be achieved by using local fish. We think that it is better to use local material even if it is partially introgressed; by doing so the remaining native genes with local adaptive value and with ability to express local phenotypes would be preserved. We suggest the brown trout range in Slovenia to be divided into several reasonable districts representing the basic management units. Within each district, the best genitor material would be selected directly from the hybridization zone on the basis of genetic test and combined with non-introgressed populations (where available) to establish female genitor stocks with acceptable native genetic share. For egg fertilization, genetically appropriate males would be annually selected from the wild. The level of acceptable non-native genes would depend on specific circumstances within a fishing district or angling club. To protect non-introgressed populations, we suggest making their copies, which should be then introduced into neighboring fishless streams. The propagation of local genetic pools has also a repopulation meaning as downstream directed gene-flow gradually refreshes the introgressed genomes by replacing non-native genes with the local ones. 1 UVOD Postrvi (Salmo sp.) so glede na porečja, od koder izvirajo, in glede na genetski profil mitohondrijske DNA (mtDNA) v grobem razvrstili v pet osnovnih razvojnih ali t.i. filogeografskih linij: v atlantsko, donavsko, jadransko, sredozemsko in linijo marmoratus (Bernatchez, 2001). Atlantsko linijo so na Zahodu domesticirali že pred ca. 150 leti. Ta domesticirana linija v ribogojniških razmerah dobro uspeva, medtem ko se zaradi selekcije na ribogojniško okolje v divjem okolju slabo prilagodi. Ogroženost avtohtonih potočnih postrvi, zaradi njihovega genetskega mešanja z ribogojniško atlantsko linijo, je v Evropi poznana že več desetletij. Ribogojci in ihtiologi opažajo, da je poribljanje odprtih voda z domesticirano linijo dokaj neučinkovito in škodljivo: več kot 90% vloženih rib se namreč ne uspe prilagoditi in propade (Weiss & Schmutz, 1999; Wills, 2006), tiste, ki se uspejo drstiti, pa svoje »slabe« gene zanesejo v avtohtone populacije, ki na tak način slabijo in izgubljajo svojo lastno genetsko identiteto (t.i. depresija zaradi »outbreeding-a«; Hansen & Loeschcke, 1994). Poleg tega domesticirana linija odraža značilen zunanji videz, ki je genetsko pogojen in ki skozi proces križanja popači originalno podobo avtohtone populacije (Slika 1). Slika 1: Značilen zunanji videz domesticirane linije atlantske potočne postrvi (zgoraj) in divje avtohtone potočne postrvi iz zgornjesavskega porečja. Tudi slovenske reke so bile podvržene mnogim zabeleženim in nezabeleženim vnosom neavtohtonih postrvi. Tako so potočne postrvi atlantskega porekla (iz Danske in Italije) od 80-ih let prejšnjega stoletja pa do nedavnega masovno vlagali v donavski rečni sistem. S škodljivimi vplivi domesticirane atlantske postrvi na domače potočnice smo se v Sloveniji soočili šele v 90-ih letih prejšnjega stoletja. Genetsko mešanje med domačimi populacijami in vnesenimi osebki je bilo prvič opaženo l. 1997 na potočnicah iz spodnje Iške in Cerkniščice (Snoj, 1997). Nadaljnje genetske raziskave na potočnih postrvih v Sloveniji, ki so potekale v okviru treh diplomskih nalog (Jug, 1998; Melkič, 2000; Bogataj, 2010), v okviru projekta CRP (2008 - 2010), in avstrijsko-slovenskega projekta »Karafish« (l. 2012; Konar et al., 2013) so vključevale nove oz. izboljšane metodološke pristope in 61 vzorčnih lokacij (Snoj, 2004; Snoj et al., 2015), od katerih je bilo le devet takih z avtohtonim genetskim deležem 95% in več (t.i. genetsko »čiste« populacije ). Vse so omejene na izolirane, težko dostopne zgornje tokove manjših pritokov. Večina genetsko čistih populacij je bila odkrita v dravskem porečju na slovenskem Koroškem. Vse čiste populacije imajo zelo nizko efektivno velikost in zelo nizko genetsko pestrost (poprečno število alelov na lokus A= ca. 2.8; heterozigotnost H= ca. 0.36; Jug et al., 2005; Snoj et al., 2015), kar kaže na njihov nizek evolucijski potencial. Glede na to in ker čiste populacije zastopajo le manjši del areala potočne postrvi v Sloveniji, le-te niso primerne, da bi z njimi repopulirali celotno območje Slovenije; zaradi nizkega evolucijskega potenciala je namreč vprašljiva njihova sposobnost prilagajanja na različna okolja, poleg tega obstaja nevarnost, da bi z njihovim prenosom v druga območja ogrozili genetsko integriteto tamkajšnjih lokalnih populacij. Poleg negativnih učinkov, ki jih za avtohtone potočne postrvi v Sloveniji predstavlja vnašanje atlantske ribogojniške linije, se je treba zavedati, da do prilagojenosti na ribogojniško okolje in neprilagojenosti na življenje v divjini lahko ob neustreznem gospodarjenju hitro pride tudi pri domorodnih donavski postrvih, predvsem kadar proizvodnja zaroda temelji na plemenski jati, ki se jo dolgoročno ohranja v ribogojnici in ki se je ne obnavlja z materialom iz divjine. Selekcija na ribogojniško okolje se še dodatno povečuje z zadrževanjem zaroda v ribogojnicah. Poleg selekcije igra pomembno vlogo tudi efekt ozkega grla, do katerega pride, kadar se populacija močno zmanjša; ta efekt, ki je pogost v ribogojnicah, kjer plemensko jato predstavlja le nekaj rib, povzroči padec genetske pestrosti zaroda in s tem dodatno zmanjša njegovo sposobnost za preživetje v divjini. Osnovni cilj raziskave je najti primerno strategijo za rehabilitacijo avtohtone potočne postrvi v Sloveniji. To pomeni, da je potrebno najti ustrezen plemenski material, ki bo proizvajal potomce, primerne za repopulacijsko vlaganje. Da bi bili potomci za repopulacijo čim bolj sposobni prilagajanja na različna okolja njihovega izpusta, bi morali vzpostaviti dosti širok nabor po poreklu ustreznega plemenskega materiala, (vir potomcev za repopulacijo), ki bi imel čim višjo genetsko pestrost. To bi bilo možno doseči predvsem z identifikacijo večjega števila dodatnih genetsko čistih populacij, kar je tudi poglavitna naloga te raziskave. Višjo genetsko pestrost je mogoče doseči tudi z odbiranjem genetsko ustreznih osebkov, ulovljenih v coni križanja, in z njihovimi spolnimi celicami osvežiti zarod, namenjene za repopulacijo. Hkrati je treba biti pozoren, da ne bi vneseni osebki negativno interferirali z lokalnimi populacijami. Zato smo v raziskavi ugotavljali tudi, ali obstajajo teritorialno specifični genetski »pooli«, s katerimi bi bilo potrebno oddvojeno upravljati in jih medsebojno ne mešati. Poleg omenjenega je bil naš namen pričeti z genomskimi asociacijskimi študijami, ki predstavljajo novo orodje za identifikacijo adaptivnega genetskega ozadja intraspecifičnih organizmov, ki so prilagojeni na različna okolja. V ta namen smo zasnovali poskus, katerega namen je bil ugotavljati, ali različno okolje vpliva na genetsko strukturo in preživitveno sposobnost postrvi. Za primerjavo smo izbrali dva ekstremna okolja, ribogojnico in naravni potok. Na osnovi dobljenih rezultatov načrtujemo izdelati priporočila in predloge ukrepov za obnovo populacije avtohtone potočne postrvi. 2 MATERIAL IN METODE 2.1 Material Pri izbiri potencialnih lokacij z genetsko čisto potočnico smo se glede na lastne izkušnje osredotočili predvsem na tiste odseke potokov, • kjer so si bile postrvi v določenem velikostnem razredu podobne po zunanjem videzu (obarvanost in oblika telesa). Če so bili osebki iz določenega potoka že na videz zelo različni, smo to smatrali kot precej zanesljivo znamenje, da populacija ni genetsko homogena. • ki so bili od spodnjega toka razmejeni s pregrado (slap, zajetje, elektrarna...), ki trajno preprečuje prehod rib iz spodnjega toka navzgor. Upoštevali smo predvsem prepreke, starejše od 30 let (vnašanje atlantske postrvi se je v Sloveniji začelo v začetku osemdesetih let prejšnjega stoletja) • ki so tako odročni, da od izvira do pregrade k potoku ne vodi lahko dostopna, urejena avtomobilska pot oz. da je vlaganje rib na takem odseku fizično težko izvedljivo • za katere ni katastrskih podatkov, da so bili kadar koli poribljani. Glede izbire lokacij smo upoštevali tudi mnenje lokalnih ribičev, saj nekateri v domačem okolju spremljajo ribe že desetletja in so zelo dober vir informacij o vlaganjih in morebitnih nahajališčih čistih potočnih postrvi. Po teh kriterijih smo v okviru savskega in dravskega rečnega sistema v Sloveniji povzorčili 80 lokacij, kar predstavlja 20 ribiških družin (Tabela 1) in v grobem pokriva v savskem porečju rečne sisteme zgornje Save (nad Kranjem), Sore, Ljubljanice in Savinje, v dravskem pa rečne sisteme Meže, desnih pritokov med Radljami in Rušami in sistem Dravinje (Tabela 1, Slika 3). Omenjeni kriteriji niso bili izpolnjeni v pritokih spodnje Save, Krke in Kolpe, zato teh sistemov ni zajetih v pričujoči raziskavi. Na vsaki izbrani lokaciji smo z elektro-izlovom naključno odlovili ca. 20 osebkov. Dejansko število je nihalo zaradi razpoložljivosti rib v konkretnem potoku. V analizo smo zaradi metodološkega poenotenja vključili tudi večino populacij, ki smo jih kot genetsko sprejemljive prepoznali v raziskavi, ki je potekala od 1.1.2008—31.8.2010 v okviru projekta CRP V4-0538. V treh primerih smo v analizo vključili tudi plemensko jato, prav tako po ca. 20 vzorcev. Poleg tega smo v analizo vključili tudi tri referenčne populacije atlantskih potočnih postrvi iz danske in češke ribogojnice ter iz ribogojnice Povodje v Sloveniji. Vse ribe, vključene v raziskavo, smo anestezirali, vsakemu osebku smo odrezali ca. 0.75 cm2 velik košček analne plavuti in ga za namen genetske analize individualno shranili v 70% etanolu. Postrvi iz vsake divje lokacije smo foto-dokumentirali. Vse osebke smo po obravnavi in rekuperaciji vrnili na mesto izlova. Tabela 1: Lokacije vzorčenja potočnih postrvi. Poševno so označene lokacije iz predhodne raziskave. Območje Zap. Št. Vodotok Y X Datum Plemenske jate 1 Ribogojnica Ljubno - - CRP V4-0538 2 Ribogojnica Povodje - - CRP V4-0538 3 Ribogojnica Železniki - - - Referenčne populacije Atlantske linije 4 Avstrija - Jezerke (AT) - - - 5 Cerkniščica (AT) - - - 6 Češka(AT) - - - 7 Danska(AT) - - - 8 Podbreg - Volarja - Soča (AT) 397112 121926 9.1.2015 9 Zgornja Ložnica - Savinja - Sava (AT) 507166 127262 CRP V4-0538 RD Barje 10 Granjevica - Želimeljščica - Iščica 469612 80795 20.2.2015 11 Iška - Ljubljanica - Sava (zgornji tok) 461907 78225 11.8.2015 95 Iška - Ljubljanica - Sava (pri Domu) 461347 85193 17.7.2015 96 Iška - Ljubljanica - Sava (pri Kamnu) 460971 83414 5.6.2015 12 Pojaščica - Benšetov graben - Želimeljščica 466171 83993 2.3.2015 13 Šumnik- Granjevica - Želimeljščica - Iščica 467564 80943 20.2.2015 14 Zala - Iška - Ljubljanica - Sava 458019 80788 2014 RD Bled 15 Jezernica - Sava Dolinka 430783 135125 CRP V4-0538 16 Vlaganje Bled - - CRP V4-0538 RD Bohinj 17, 18 Ribnica - Mostnica - Sava Bohinjka 416681 130310 19.9.2016 19 Suha - Sava Bohinjka 413971 125076 CRP V4-0538 RD Cerknica 20 Hruškarski potok - Cerkniško jezero 457097 77180 CRP V4-0538 21, 22, 23 Mahnečica - Cerkniščica 455967 74244 30.9.2015 RD Dolomiti 24 Jernejčkov graben - Velika Božna -Gradaščica 440409 101346 23.4.2015 25 Kolarica - Jernejčkov graben - Velika Božna 440962 102437 23.4.2015 26 Kotarjev graben - Horjulka - Gradaščica 453249 99493 13.11.2015 RD Jesenice 27 Jerman - Sava Dolinka 411242 150238 11.6.2015 28 Krotnjek - Sava Dolinka 404630 152193 11.6.2015 29 Potok Martuljek - Sava Dolinka 410678 148625 11.6.2015 30 Triglavska Bistrica - Sava Dolinka 417438 145433 11.6.2015 RD Koroška 31 Bistra - Meža - Mislijna - Drava 483991 144365 CRP V4-0538 32 Glažuta - Izvirni del Mislinje - Drava 522176 148524 12.10.2016 33 Koprivna - Meža - Drava 479396 148109 2013 34 Koroška kramarica - Javorski potok - Meža -Drava 491376 144218 12.10.2016 35 Meža - Drava 484739 146719 2013 36 Bistra (izvirni del) - Meža - Mislijna - Drava 482699 143927 12.10.2016 37 Podgorica - Jazbinski potok - Meža - Drava 493942 149138 12.10.2016 Območje Zap. Št. Vodotok Y X Datum 38 Šentanelski potok - Meža - Mislinja - Drava 490300 160754 12.10.2016 39 Suhadolnica- Mislinja 499703 147384 CRP V4-0538 40 Zelenobreški potok - Meža - Mislinja- Drava 494804 160226 12.10.2016 RD Kranj 41 Nemiljščica - Sava 439499 123642 CRP V4-0538 RD Ljubno 42 Gračnica - Savinja - Sava 490597 132646 11.10.2016 43 Jurčef - Savinja 476752 142848 2013 44 Kozlov graben - Krumpah - Ljubnica 489933 139854 11.10.2016 45 Krumpah - Ljubnica - Savinja - Sava 490037 138894 11.10.2016 46 Revsov graben - Savinja - Sava 485215 137592 11.10.2016 47 Robanšek - Krumpah - Ljubnica 488729 140354 11.10.2016 RD Medvode 48 Malešnica - Sava 452853 108016 CRP V4-0538 RD Mozirje 49 Kramarica - Ljubija - Savinja - Sava 494578 141707 7.10.2016 50 Leskovšek - Ljubija - Savinja - Sava 493885 139670 7.10.2016 RD Radovljica 51, 52 Begunjščica (desni krak) - Zgoša - Sava 440528 139776 7.9.2016 53 Močilnik - Lipnica - Sava 440328 127565 12.6.2015 RD Radlje 54 Josipdolski potok - Velka - Drava 522712 152350 13.10.2016 55 Kapusov potok - Drava 529028 158387 CRP V4-0538 56 Krajnica - Velka - Drava 524344 153102 13.10.2016 57 Vaški potok - Drava 521293 162026 13.10.2016 RD Ribnica 58 Črni graben - Robarica - Rašica 466837 79333 14.5.2015 59 Kozariščica - Kozmanjka - Rašica 466977 74740 14.5.2015 60 Lehnj'ak - Robarica - Rašica 466558 77080 14.5.2015 RD Ruše 61 Piklarica - Lobnica - Drava 532470 146704 5.10.2016 62 Pritok Lamprehtovega potoka - Radoljna -Drava 532706 150729 5.10.2016 63 Verna - Lobnica - Drava 535592 148860 5.10.2016 RD Sl. Bistrica 64 Izvir Dravnije - Drava 526815 143872 CRP V4-0538 65 Resniški potok - Dravinja - Drava 527847 143788 CRP V4-0538 RD Sora 66 Bodoljska grapa - Poljanska Sora 443668 108230 12.11.2015 67 Gabrški potok - Poljanska Sora 442038 110862 12.11.2015 68 Petruzova grapa - Poljanska Sora 440562 110235 12.11.2015 69 Pevenski potok - Selška Sora 446319 116647 19.5.2016 70 Planica - Starološki potok - Selška Sora 445704 116307 19.5.2016 71 Sopotnica - Poljanska Sora 441413 112603 12.11.2015 72 Sovpot - Poljanska Sora 441223 107372 12.11.2015 73 Žabnica (B.s.) - struga Reteče - Selška Sora 450415 113372 19.5.2016 74 Zaplotnica - Poljanska Sora 444885 112680 12.11.2015 RD Tržič 75 Dovžanka - Tržiška Bistrica - Sava 449659 140456 14.9.2016 76 Košutnik - Tržiška Bistrica - Sava 453931 141580 14.9.2016 Območje Zap. Št. Vodotok Y X Datum 77 Mošenik - Tržiška Bistrica - Sava 444247 141382 CRP V4-0538 78 Stegovnik - Tržiška Bistrica - Sava 454347 139540 14.9.2016 79 Zali potok - Tržiška Bistrica - Sava 451787 141504 14.9.2016 RD Visoko 80 Gabrška grapa - Poljanska Sora 438907 110133 27.5.2016 81 Prileški potok (preleški) - Sovpaščica -Brebovščica - Poljanska Sora 436735 103546 27.5.2016 82 Sevniščica - Ločivnica - Poljanska Sora 436040 112452 27.5.2016 83 Srednska Grapa - Poljanska Sora 434862 109166 27.5.2016 RD Vrhnika 84 Hlevščica - Podliščica - Ljubljanica 439660 95902 2013 85 Pečnikarca - Podlipščica - Ljubljanica 440335 94905 28.1.2015 RD Železniki 86, 87 Desni pritok - Zala - Davča - Selška Sora 429291 116062 20.5.2016 88 Jahodnica - Selška Sora 437118 115539 CRP V4-0538 89 Muštrova grapa (Osojnik) - Davča - Selška Sora 432308 116174 20.5.2016 90 Plenšak - Selška Sora - Sora - Sava 431518 120479 20.5.2016 RD Žiri 91 Plastuhova grapa - Račeva - Poljanska Sora 433620 101303 28.9.2016 92 Raskovec - Žirovnica - Poljanska Sora 430161 95633 28.9.2016 93 Poljanska Sora 433883 95864 CRP V4-0538 94 Radovna - Sava Dolinka 421552 142990 CRP V4-0538 2.2 Metode 2.2.1 Genetske analize 2.2.1.1 Analiza mitohondrijske DNA Analiza mtDNA je potekala na osnovi številnih linijsko specifičnih točkovnih polimorfizmih (SNP) na kontrolni regiji mtDNA, kar se je v preteklih študijah pokazalo kot najprimernejši način za razčlenitev filogeografske strukture preučevanih populacij postrvi (e. g., Bernatchez, 2001). Ta pristop je bil primeren tudi kot prvi kriterij za ugotavljanje genetske kontaminiranosti avtohtonih populacij z geni vnesenih osebkov (atlantska linija potočne postrvi ali soška postrv). Pri vseh vzorčenih ribah smo celotno kontrolno regijo mtDNA analizirali z genotipizacijo, ki je temeljila na alelno specifičnem PCR-pomnoževanju. V ta namen smo uporabili diagnostični protokol (Apostolidis et al., 2007), ki omogoča ločevanje med zgoraj omenjenimi linijami potočne postrvi. Linijsko specifične PCR-profile smo prepoznavali s kapilarno elektroforezo (ABI 3100XL). Podroben postopek je opisan v Apostolidis et al., 2007. Populacijam, ki so se pokazale kot genetsko sprejemljive, smo določili celotno nukleotidno zaporedje kontrolne regije mtDNA po Sangerjevi metodi in na ta način določili mitohondrijske haplotipe. Ta analiza je vključevala ca. šest vzorcev na populacijo, konkretno število je bilo odvisno od tega, kako polimorfna je bila določena populacija. Glede na to, da v prehodnem projektu V4-0538 pri genetsko čistih populacijah nismo določali haplotipske strukture, smo v analizo nukleotidnih sekvenc mtDNA vključili tudi te populacije. 2.2.1.2 Analiza genomske DNA V populacijskih študijah potočne postrvi, ki so jih izvajali v Evropi, je bilo osnovanih veliko mikrosatelitnih lokusov, od katerih so nekateri nevtralni in linijsko specifični (Lerceteau-Köhler & Weiss, 2006; Keenan et al., 2013; Scheneker et al., 2014), drugi pa so vezani na določene genske segmente, ki preko izražanja specifičnih genetskih variant proteinov ali preko regulacijskih funkcij vplivajo na različne fenotipske lastnosti (Meier et al., 2011). Nevtralni mikrosateliti Za ugotavljanje genetskega deleža donavske in atlantske linije za posamezen osebek, za ugotavljanje genetske podobnosti oz. različnosti med populacijami (F-statistika, PCA analiza) ter za genetsko analizo strukture populacij (heterozigotnost, alelna pestrost, F-statistika) smo uporabljali 12 nevtralnih in med seboj nepovezanih mikrosatelitnih lokusov (Scheneker et al., 2014). Z njimi smo analizirali vse vzorčene ribe. Obdelavo podatkov smo izvajali s programi Genetix, Populations, FSTAT, STRUCTURE in Structure Harvester. Mikrosateliti z adaptivno vrednostjo Z vidika ugotavljanja primernosti osebkov za sonaravno ali ribogojniško vzrejo so potencialno informativni tisti mikrosatelitni lokusi, ki so funkcijsko ali fizično povezani z geni, ki vplivajo na adaptivne lastnosti. Geni poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa (MHC) razreda I in II, ki imajo v okviru celične imunosti ključno vlogo pri prepoznavanja antigenov, so bistveni za imunski odziv in imajo zato neposreden vpliv na fitnes živali; so izjemno polimorfni in imajo precej zapleteno strukturo (Bernatchez & Landry, 2003; pregledni članek). Zato vpliv selekcije na te gene včasih raje preučujejo posredno preko markerjev (e.g., mikrosateliti), ki ležijo zelo blizu MHC genov ali celo na njihovih neprepisovanih odsekih, in se zato z njimi vezano dedujejo. Geni MHC in predvsem z njimi vezani markerji so se v zadnjem času uporabljali za ugotavljanje adaptivnih lastnosti tudi pri potočni postrvi (e.g. Coughlan et al., 2006; Hansen et al., 2007; Jensen et al., 2008; Meier et al., 2011; O'Farrell et al. 2013 ). V teh študijah so analizirali zlasti mikrosatelitni lokus UBA, ki leži v MHC kompleksu v intronu gena UBA. Na podoben posreden način so preučevali tudi gene, ki fizično sicer ne spadajo v MHC kompleks, so pa funkcionalno z njim povezani, kot npr. geni TAP, ki imajo vlogo pri prehodu kompleksov antigen-MHC molekula iz endoplazmatskega retikuluma v citoplazmo. Tudi ti geni so pomembni za učinkovitost imunskega odziva in torej za fitnes živali. Tudi v njihovi bližini se nahajajo mikrosatelitni lokusi, preko katerih naj bi bilo mogoče spremljati spremembe na genih TAP v odnosu do prilagojenosti živali na okolje. Med kandidatnimi mikrosatelitnimi lokusi z domnevno adaptivno vrednostjo smo na vseh vzorčenih ribah analizirali sledeče: • Satr-UBA (Coughlan et al. 2006) • Satr-TAP2b (Grimholt et al. 2002) • Ssa60NVH (Gharbi et al., 2006) Mikrosatelitne lokuse smo pomnožili s polimerazno verižno reakcijo (PCR) in dolžino pomnoženih alelnih fragmentov ugotavljali na sistemu kapilarne elektroforeze (ABI 3100XL). 2.2.2 Poskus preučevanj vpliva okolja na selekcijo alelov z adaptivno vrednostjo Zgornjesavsko porečje Seme smo odvzeli samcem iz treh populacij: Suha RD Bohinj, Mošenik RD Tržič in Malešnica RD Medvode in sicer po osem osebkov na populacijo. Samci iz prvih dveh lokacij so bili vzeti neposredno iz divjine, medtem ko so bili »samci iz Malešnice« dejansko vzrejeni v ribogojnici in predstavljajo F1 generacijo, ki je produkt križanja divjih samcev in samic iz Malešnice. S semenom vseh samcev smo oplodili 60 samic (potomke samic iz potoka Hudi potok in samcev iz potoka Suha) iz ribogojnice RD Bled. Vsaki samici smo odvzeli čim bolj enako število iker (ca. 800). Nato smo podoben delež iker (ca. 100 iker) vsake samice oplodili s semenom vsakega izmed samcev. Tako smo od 3x8 samcev in 3x20 samic dobili 480 kombinacij teoretičnih skupin potomcev. Vsem staršem v poskusu smo odvzeli genetski vzorec za DNA analize. V fazi oči smo približno 7.000 oplojenih iker združili v enotno skupino in jih vložili v pet umetno pripravljenih drstnih jam v Bitenjski potok (ZZRS), ki nima nadzemnega stika z glavno reko Savo Bohinjko, in kjer so za namen tega poskusa predhodno odlovili lokalno prisotne postrvi. Drugo polovico iker smo obdržali v valilnikih ribogojnice RD Bled. Soško porečje Vzporedno smo poskus izvajali na populaciji atlantske potočne postrvi. Za poskus smo uporabili populacijo, ki naseljuje zgornji tok (nad neprehodnim slapom) potoka Podbreg, ki je pritok potoka Volarja, ki teče v Sočo med Kobaridom in Bovcem, torej izven naravnega areala potočne postrvi v Sloveniji. S to populacijo ne upravljajo in je relikt introdukcije potočne postrvi v areal soške postrvi v začetku prejšnjega stoletja. Za poskus smo 24 samicam odvzeli cca. 4200 iker in seme 10 samcem. Ikre smo zmešali, jih razdelili na enake deleže ter vsak delež oplodili s semenom po enega samca. Ribe so tekom poskusa rasle bazenih ribogojnice RD Tolmin in podjetja Faronika d.o.o. Vzorce za DNA analize smo jemali po razporedu, kot je razvidno preko Tabele 2. DNA analize so vključevale genotipizacijo s setom nevtralnih mikrosatelitov in tistih z adaptivno vrednostjo. Tabela 2: Skupine v selekcijskem poskusu RD Bled Okolje Lokacija N (genotipizacija) Datum vzorčenja Potomci F1 Divjina Potok Bitenj 47 11. 11. 2015 39 24. 1. 2017 Ribogojnica 3 x 20 24.7. 2015 60 17. 2. 2016 20 zdravih; 20 plesnivih 27. 12. 2016 RD Tolmin Starši Divjina Potok Podbreg 66 25. 11. 2015 Potomci F1 Ribogojnica 44 22. 7. 2016 40 16. 1. 2017 Vpliv selekcije na adaptivne lokuse smo neodvisno od poskusa ugotavljali tudi z analizo alelne pestrosti (A), pri čemer smo primerjali alelno pestrost ribogojniških atlantskih populacij z alelno pestrostjo prvih dveh skupin populacij z visokim avtohtonim genetskim deležem. 3 REZULTATI Med 80 vzorčenimi lokacijami postrvi v desetih postrvi nismo našli. Gre za lokacije v ribiških družinah Vrhnika, Barje in Dolomiti. 3.1 Razporeditev populacij glede na avtohtoni genetski delež Glede na alelno specifično analizo mitohondrijske DNA smo za vsak vzorec določili, ali pripada donavski ali atlantski filogenetski liniji. Med 70 analiziranimi divjimi populacijami smo 100% donavski genetski delež našli pri 45 populacijah. Nizek donavski delež smo našli pri populacijah Vrh_Pečnikarca (10%), Vis_Prileški potok (20%), Kor_Podgorica (30%), Bar_Granjevica (33%) in Rib_ČrniG; pri vseh ostalih populacijah pa se je ta vrednost gibala nad 50% (Tabela 3). Donavski haplotipi, ki smo jih našli v slovenskih populacijah, ne odražajo značilne regijske razporeditve. To je očitno že na ravni savski vs. dravski rečni sistem kot tudi na bolj specifični ravni. Tudi analiza jedrne DNA (nDNA) je pokazala, da areal potočne postrvi v Sloveniji naseljujeta dve genetski liniji in sicer avtohtona donavska in atlantska (Slika 2). Z računalniškim programom Structure 2.3.4 smo določili genetski delež donavske in atlantske postrvi za vsak posamezen osebek in izračunali poprečen genetski delež za posamezno populacijo (Slika 2, Tabela 3). Upoštevati je treba, da računalniški algoritem deluje tako, da tudi povsem genetsko neoporečen osebek ne doseže 100% čistosti ampak 2 do 4 odstotke manj. Slika 2: Rezultati STRUCTURE analize vzorčenih populacij z donavskimi in atlantskimi genetskimi deleži (K=2) Populacije smo glede na prisotnost donavskega in atlantskega genetskega deleža mitohondrijske in jedrne in DNA razvrstili v pet skupin: I. Populacije z zelo visokim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, >96% nDNA). Takih je 14 (Tabela 3) in sicer: 1. Bar_Pojaščica (12) 2. Boh_Ribnica Zg. (18) 3. Lju_KozlovG (44) 4. Lju_Krumpah (45) 5. Lju_Robanšek (47) 6. Moz_Kramarica (49) 7. Moz_Leskovšek (50) 8. Sor_PetrG (68) 9. Sor_Sovpot (72) 10. Trž_Dovžanka (75) 11. Trž_ZaliPotok (79) 12. Žel_DPZale (86) 13. Žel_Plenšak (90) 14. Žir_Raskovec (92) Iz projekta V4-0538 se v to skupino uvrščajo: • SloB_ResPO (Resniški potok) (65) • Trž_Mošenik (77) • Željahodnica (88) Za populaciji Koprivna in Malešnica, ki sta se predhodno uvrstili kot populaciji z zelo visokim avtohtonim genetskim deležem, ni podatkov. II. Populacije z visokim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, 90 do 95% nDNA): 15. Boh_RibnicaSp (17) 16. Kor_Glažuta (32) 17. Ruš_Verna(63) 18. Vis_Sevniščica (82) 19. Žir_PlastuhG (91) 20. Boh_Suha (19) Iz projekta CRP V4-0538 se v to skupino uvršča: • SloB_Dravja (Izvir Dravinje) (64) III. Populacije s solidnim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, 84 do 89% nDNA), vendar so prisotni posamezni osebki, ki precej odstopajo od poprečja in s tem »kvarijo genetsko čistost« populacije. Sem so se uvrstile samo populacije, ki so bile v predhodni raziskavi (V4-0538) prepoznane kot nadpovprečne glede zastopanosti avtohtonega deleža: • Bar_Zala (14) • Kor_Mislinja (36) • Kra_Nemilj (41) • LjuJurčevPO (43) IV. Populacije, ki imajo sicer 100% donavski genetski delež po mtDNA, medtem ko se giblje donavski genetski delež po nDNA okrog 60 do 80%. Značilnost teh populacij je, da so glede na donavski genetski delež precej heterogene, zaradi česar predstavljajo relativno dober material za odbiro ustreznih osebkov, temelječo na genetskem testu. 21. Jes_Jerman (27) 22. Jes_Krotnjek (28) 23. Jes_TriglBis (30) 24. Kor_KorKram (34) 25. Kor_ZelbreškiP (40) 26. Lju_Gračnica (42) 27. Rad_BegunjVel (52) 28. Ruš_Piklarica (61) 29. Ruš_PriLampP (62) 30. Sor_PevskiP (69) 31. Sor_Sopotnica (71) 32. Sor_Zaplotnica (74) 33. Trž_Stegovnik (78) 34. Vis_GabrG (80) 35. Vrh_Pečnikarca (85) Populacije iz predhodne raziskave (V4-0538): • Kor_Kop_Mež (33) • Kor_Meža (35) • Kor_Suhado (39) • RadDR_KapuP (55) V. Populacije, pri katerih je introgresija z atlantskimi geni visoka (nad 50%) in dokaj enakomerno razporejena. Pri teh populacijah je zelo težko oz. nemogoče najti posamezne osebke z zadovoljivim donavskim genetskim deležem. 0 12.5 25 50 }Km Slika 3: Zemljevid populacij potočne postrvi z donavskim genetskim deležem nDNA >84% 3.2 Genetska pestrost populacij Analiza nukleotidne sekvence kontrolne regije mtDNA, ki smo jo izvajali na prvih štirih skupinah populacij, je razkrila devet mitohondrijskih haplotipov, od katerih štirje (slo1 - slo4) predhodno še niso bili opisani (Tabela 3). Najbolj zastopani haplotipi so Da1a (56%), slo1 (16%) in Da2a (12%), vsi ostali so bili zastopani v bistveno manjših deležih (od 2,5 do 0,5%). Razporeditev haplotipov je bila v povprečju 1.26 haplotipa na populacijo, pri čemer nobena populacija ni imela več kot dva haplotipa. Ti podatki kažejo na zelo nizko genetsko pestrost testiranih populacij. Genetsko pestrost posameznih populacij smo ocenjevali tudi z jedrno DNA. Ta se običajno ocenjuje glede na alelno pestrost (A; višja kot je njena vrednost, večja je genetska pestrost) in glede na heterozigotnost (H; vrednosti za heterozigotnost se gibljejo od 0 do 1, pri čemer 1 pomeni najvišjo stopnjo heterozigotov). Omenjena parametra smo izračunali v programu FSTAT. Iz Tabele 3 je razvidno, da imajo populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem praviloma zelo nizko genetsko pestrost; na primer, v prvi skupini (100% mtDNA, >96% nDNA) se H giblje od 0.125 do 0.350, A pa od 1.42 do 3.18. Po nekoliko višjih vrednostih odstopa Mošenik (77; H =0.454; A=3.42), ki v okviru te skupine predstavlja največjo populacijo. Po drugi strani populacije z nižjim donavskim genetskim deležem (e.g. skupina z mtDNA donavskim deležem <100%), odražajo bistveno višje vrednosti: H od ca. 0.6 do 0.75 in A od ca. 3.7 do 9.0, kar je lahko sicer posledica introgresije. Tabela 3: Populacijsko genetskih parametri vzorčenih populacij potočne postrvi; zaporedne številke se skladajo s Tabelo 1, Sliko 2, Sliko 3 in Sliko 4, Sliko 5, obenem pa so navedene okrajšave lokalitet. Podatki zajemajo rezultate analiz na mtDNA, nevtralnih jedrnih markerjih in adaptivnih jedrnih markerjih. N: število vzorcev, Ne: efektivna velikost populacije, Da%: donavski genetski delež, He: opažena heterozigotnost, Fis: koeficient inbreedinga, A: alelna pestrost. *Ne statistično vprašljive vrednosti, z lila barvo obrobljene Fis vrednosti statistično signifikantno odstopajo od H-W ravnovesja Lokalitete Zap St. N Ne Da % haplotip Da % He Fis A Da % He Fis A mtDNA Nevtralni jedrni markerji Adaptivni jedrni markerji (MHC) Aqu_Ljubno 1 17 19,1 (11,2 - 42,6) - 0,15 0,80 0,12 8,08 0,43 0,88 0,06 3,34 Aqu_Povodje 2 9 *47,1 (102 - *) - 0,11 0,82 0,12 6,67 0,19 0,89 0,30 3,33 Aqu_Zelezniki 3 18 114,1 (44,2 - *) - 0,08 0,77 0,01 8,50 0,23 0,88 0,01 3,32 AT_AutJez 4 15 2,1 (1,6 - 2,8) - 0,08 0,64 -0,16 5,17 0,09 0,70 -0,01 2,68 AT_Cerkniscica 5 17 83,5 (17,2 - *) - 0,03 0,67 0,16 5,36 0,06 0,70 -0,07 2,61 AT_Ceska 6 5 *10,8 (64,5 - *) - 0,03 0,62 -0,05 3,58 0,10 0,77 -0,22 2,96 AT_Danska 7 11 59,3 (21,6 - *) - 0,03 0,79 0,03 6,58 0,07 0,89 0,04 3,36 AT_Podbreg 8 20 11,4 (5,2 - 29,3) - 0,02 0,50 0,00 3,08 0,05 0,59 -0,10 2,29 AT_ZgLoznica 9 19 16,4 (9,9 - 32,6) 75 0,05 0,76 0,09 7,67 0,29 0,82 0,24 3,12 Bar_Granjevica 10 12 18,2 (10,2 - 45,5) 33 0,18 0,79 0,07 8,25 0,44 0,86 0,07 3,25 Bar_Iska 11 17 19 (2,5 - *) 100 DA9, DA2a 0,25 0,35 0,09 2,83 0,28 0,59 0,37 2,22 Bar_Iska 95 18 42,3 (23,7 - 128,1) - 0,18 0,75 0,18 7,67 0,27 0,84 0,18 3,14 Bar_Iska 96 17 7,4 (3,3 - 13,7) - 0,42 0,62 0,17 5,58 0,20 0,68 0,09 2,56 Bar_Pojasnica 12 15 15,9 (1,3 - *) 100 DA1a 0,97 0,12 -0,27 1,42 0,98 0,30 -0,48 1,54 Bar_Sumnik 13 20 8,3 (6,3 - 10,8) 89 0,20 0,69 0,05 6,92 0,67 0,77 0,21 2,88 Bar_Zala 14 9 35,9 (6,2 - *) 100 DA2a 0,89 0,42 -0,04 3,08 0,98 0,29 0,24 1,56 Ble_Jezernica 15 8 7,1 (3,1 - 15,3) 100 DA1a, DA23c 0,39 0,60 -0,14 3,83 0,52 0,72 0,13 2,58 Bled_Vlaganje 16 19 17,8 (12,6 - 27) - 0,07 0,74 0,00 7,67 0,14 0,84 0,07 3,18 Boh_RibnicaSp 17 6 300,9 (3,1 - *) 100 Slo1, DA1a 0,90 0,38 0,04 2,25 0,59 0,34 -0,15 1,76 Boh_RibnicaZg 18 17 *75,3 (11,8 - *) 100 0,96 0,26 -0,04 2,17 0,81 0,28 0,23 1,51 Boh_Suha 19 20 2,8 (1,8 - 7,6) - DA1a 0,91 0,36 0,13 3,17 0,92 0,49 0,36 2,07 Cer_Hruska rPo 20 20 40,8 (21,7 - 147,5) 100 DA2a, DA1a 0,28 0,68 0,09 8,83 0,48 0,54 0,20 2,32 Cer_Mahnecica1 21 4 *3,6 (* - *) 100 0,35 0,58 0,17 2,42 0,13 0,63 0,01 2,42 Lokalitete Zap St. N Ne Da % haplotip Da % He Fis A Da % He Fis A Cer_Mahnecica2 22 19 75,3 (16,3 - *) 100 0,22 0,64 0,16 5,17 0,17 0,50 0,17 2,07 Cer_Mahnecica 23 17 40,5 (17,7 - *) - Slo1, DA1a 0,11 0,69 0,17 5,00 0,27 0,64 0,06 2,52 DoMernejckovG 24 19 26 (15,7 - 55) 79 0,51 0,62 0,07 6,67 0,43 0,68 0,10 2,56 Dol_Kolarica 25 20 6,2 (3 - 11,1) 100 slo2, DA1a 0,41 0,51 0,11 4,00 0,27 0,54 0,17 2,12 Dol_KotarjevGra 26 6 *156,4 (10,6 - *) 100 0,04 0,67 -0,04 3,92 0,11 0,65 0,03 2,39 Jes_Jerman 27 18 15,8 (10,8 - 24,7) 100 0,69 0,68 0,18 7,17 0,59 0,80 0,23 3,03 Jes_Krotnjek 28 11 33,8 (15,5 - 908,5) 100 0,62 0,66 0,07 6,17 0,60 0,77 -0,07 2,91 Jes_Martuljek 29 10 755,3 (55,1 - *) 100 0,45 0,70 0,06 7,17 0,55 0,78 0,30 2,97 Jes_TriglBis 30 15 28,8 (12,8 - 389,9) 100 DA1a 0,82 0,62 0,11 5,00 0,72 0,72 0,16 2,73 Kor_Bistra 31 19 119,5 (29 - *) 89 0,58 0,57 0,20 6,08 0,63 0,78 -0,04 2,93 Kor_Glazuta 32 20 6,1 (2,7 - 12,6) 100 Slo4 0,94 0,40 0,13 3,50 0,95 0,40 0,21 1,79 Kor_Kop_Meza 33 10 59,7 (21,1 - *) 100 0,75 0,50 0,15 4,17 0,93 0,52 0,02 2,12 Kor_KorKram 34 20 161,9 (24,1 - *) 100 0,62 0,54 0,17 5,58 0,55 0,76 0,08 2,82 Kor_Meza 35 2 *1 (* - *) 100 0,69 0,52 0,04 2,25 0,97 0,50 0,00 2,00 Kor_Mislinja 36 19 28,6 (14,6 - 112) 100 DA1a 0,87 0,54 0,10 4,83 0,94 0,39 0,22 1,81 Kor_Podgorica 37 20 13,3 (9,5 - 19,7) 30 0,23 0,69 0,06 8,50 0,55 0,80 0,12 3,03 Kor_SentanelP 38 17 21,7 (11,5 - 65,5) 55 0,16 0,80 0,13 8,92 0,38 0,89 -0,02 3,45 Kor_Suhado 39 17 1,6 (0,9 - 2,9) 100 DA1a 0,81 0,48 0,43 3,17 0,95 0,67 0,28 2,47 Kor_ZelbreskiP 40 18 5,2 (2,4 - 12) 100 DA22 0,62 0,40 -0,05 2,92 0,95 0,60 0,01 2,27 Kra_Nemilj 41 20 20,9 (9,2 - 106,6) 100 DA1a 0,87 0,51 -0,06 3,08 0,42 0,68 0,00 2,49 Lju_Gracnica 42 20 8,3 (5,4 - 12,5) 100 0,60 0,55 0,07 5,17 0,77 0,74 0,17 2,74 Lju_Jurcef 43 10 17,4 (3,3 - *) 100 Slo1, DA2a 0,84 0,33 -0,01 2,33 0,95 0,55 -0,22 2,09 Lju_KozlovG 44 20 8 (2 - 73,8) 100 Slo1 0,98 0,23 0,05 2,00 0,87 0,54 0,32 2,16 Lju_Krumpah 45 18 7,3 (1,6 - *) 100 0,98 0,23 0,13 1,83 0,98 0,27 -0,10 1,50 Lju_RevsovG 46 19 18,7 (11,4 - 37) 82 0,33 0,71 -0,01 7,42 0,77 0,77 0,15 2,85 Lju_Robansek 47 19 6,3 (2,4 - 17,6) 100 Slo1 0,98 0,35 -0,05 3,18 0,91 0,53 0,06 2,03 Med_Zlebe 48 12 69,3 (12,3 - *) 85 0,13 0,52 0,08 5,42 0,98 0,08 0,65 1,15 Moz_Kramarica 49 18 24,5 (5,4 - *) 100 DA2a 0,96 0,27 0,14 2,36 0,97 0,35 0,15 1,73 Moz_Leskovsek 50 18 *12,1 (83,5 - *) 100 DA2a 0,98 0,18 0,09 1,73 0,95 0,25 -0,15 1,45 Rad_Begunjscica 51 10 3,1 (2,6 - 5,4) 93 Slo1, DA1a 0,31 0,70 0,19 5,42 0,18 0,61 0,05 2,40 Rad_BegunjVel 52 3 *1 9 (* - *) 100 Slo1, DA1a 0,69 0,48 -0,24 2,17 0,60 0,02 2,38 Rad_Mocilnik 53 9 2,1 (1,5 - 3,2) 100 0,19 0,48 -0,16 2,92 0,13 0,54 -0,09 2,12 RadDR_JosipdiP 54 15 *963,9 (27,2 - *) 82 0,15 0,67 0,20 5,67 0,47 0,57 0,09 2,38 RadDR_KapuP 55 20 26,1 (14,4 - 71,1) 100 DA1a,DA22 0,67 0,52 -0,01 5,42 0,85 0,67 -0,02 2,52 RadDR_Krajnica 56 14 10,6 (5,4 - 24,4) 100 0,18 0,68 0,23 5,42 0,55 0,64 0,53 2,47 RadDR_VaskiP 57 17 4,3 (2,6 - 8,4) 94 0,32 0,59 0,10 4,83 0,39 0,61 0,35 2,40 Rib_CrniG 58 14 5,3 (3,1 - 8) 43 0,14 0,70 0,11 6,75 0,41 0,79 -0,04 2,97 Rib_Kozariscica 59 6 822,9 (19,7 - *) 100 0,20 0,74 0,13 4,50 0,49 0,81 0,01 3,04 Rib_Lehnjak 60 16 21,2 (8,9 - 242,7) 100 0,13 0,56 0,08 5,08 0,76 0,70 0,12 2,70 Rus_Piklarica 61 15 10,1 (3,3 - 39,2) 100 0,77 0,39 0,03 4,00 0,94 0,68 0,05 2,55 Rus_PriLampP 62 18 110,3 (12,2 - *) 100 DA1a 0,83 0,24 0,14 2,20 0,94 0,49 -0,14 2,03 Rus_Verna 63 17 *13,1 (3,8 - *) 100 DA1a 0,94 0,22 0,00 1,80 0,98 0,00 NA 1,00 Lokalitete Zap St. N Ne Da % haplotip Da % He Fis A Da % He Fis A SloB_Dravja 64 20 1,3 (0,1 - *) 100 DA1a 0,94 0,11 0,18 1,45 0,97 0,16 0,12 1,28 SloB_ResP 65 20 740,3 (13,5 - *) 100 DA1a 0,96 0,32 -0,12 2,91 0,98 0,37 0,04 1,68 Sor_BodGr 66 10 16,8 (6,5 - 1139) 100 0,41 0,72 0,15 6,00 0,57 0,81 0,14 3,03 Sor_GabrskiP 67 15 5,8 (3,1 - 9,1) 100 Da1a, Slo1 0,55 0,56 -0,07 4,08 0,88 0,67 0,04 2,52 Sor_PetrG 68 16 13,9 (1,9 - *) 100 DA1a 0,97 0,29 -0,14 2,17 0,98 0,41 0,31 1,79 Sor_PevskiP 69 19 10,2 (6,4 - 17,1) 86 0,81 0,54 0,12 4,33 0,93 0,75 0,16 2,76 Sor_Planica 70 6 10,7 (5,4 - 27,7) 90 0,05 0,80 0,14 5,42 0,29 0,86 0,18 3,23 Sor_Sopotnica 71 18 17,2 (9,1 - 45,2) 100 0,64 0,56 0,07 4,75 0,97 0,55 0,14 2,27 Sor_Sovpot 72 20 13,6 (2,8 - *) 100 Slo1 0,96 0,30 0,06 2,17 0,98 0,42 0,09 1,76 Sor_Zabnica 73 5 *13,6 (* - *) 86 0,08 0,78 0,19 4,92 0,55 0,82 0,13 3,07 Sor_Zaplotnica 74 15 10,6 (3,2 - 51,2) 85 0,73 0,61 0,23 3,75 0,80 0,69 0,01 2,59 Trz_Dovzanka 75 20 12,8 (5,2 - 44,2) 100 DA1a 0,97 0,46 0,03 3,08 0,98 0,43 0,02 1,87 Trz_Kosutnik 76 16 0,9 (0,8 - 1) 100 0,39 0,67 0,04 4,42 0,53 0,78 0,04 2,92 Trz_Mosenik 77 20 14,8 (6,8 - 46,7) 100 DA1a 0,98 0,45 0,03 3,42 0,98 0,53 0,06 2,08 Trz_Stegovnik 78 10 *51,9 (9,9 - *) 100 DA1a, Slo1 0,83 0,63 0,36 3,27 0,72 0,69 0,35 2,56 Trz_ZaliPotok 79 20 5,8 (2,3 - 15,5) 100 DA1a 0,97 0,40 -0,05 2,58 0,98 0,27 0,06 1,52 Vis_GabrG 80 17 30,6 (10,8 - *) 100 DA1a 0,65 0,57 0,09 4,42 0,92 0,52 0,07 2,12 Vis_PrileskiP 81 16 7,5 (3 - 17,4) 22 0,32 0,51 0,14 3,50 0,30 0,64 -0,02 2,44 Vis_Sevniscica 82 16 7,4 (2,4 - 32,2) 100 DA2a, DA1a 0,95 0,38 0,10 2,50 0,98 0,48 0,02 1,94 Vis_SredenG 83 15 11,6 (6,6 - 23,2) 100 0,08 0,67 -0,07 4,17 0,87 0,67 -0,10 2,55 Vrh_Hlevscica 84 20 7,9 (4 - 14) - DA1a 0,51 0,56 0,08 4,25 0,93 0,55 -0,09 2,18 Vrh_Pecnikarca 85 18 1,8 (1,5 - 2,2) 10 ATcs21 0,59 0,56 -0,06 4,25 0,86 0,58 -0,18 2,38 Zel_DPZale 86 14 2,2 (0,8 - 28,1) 100 DA1a, DA2a 0,97 0,27 -0,02 2,00 0,98 0,46 0,19 1,89 Zel_DPZale 87 15 19,9 (1,7 - *) 100 0,97 0,24 -0,18 1,83 0,98 0,44 0,02 1,79 Zel_Jahodnica 88 20 6,8 (0,2 - *) 100 DA1a 0,97 0,08 -0,14 1,55 0,97 0,17 0,02 1,30 Zel_MustrovaG 89 13 9,4 (4,6 - 21,3) 75 0,24 0,70 0,15 5,75 0,55 0,83 -0,01 3,13 Zel_Plensak 90 13 2,1 (0,5 - *) 100 DA1a 0,97 0,22 0,13 1,75 0,98 0,05 0,65 1,10 Zir_PlastuhG 91 19 3,2 (2,2 - 8,2) 100 DA2a 0,93 0,35 -0,05 2,67 0,91 0,53 -0,17 2,07 Zir_Raskovec 92 19 *32,2 (26,3 - *) 100 Slo3 0,96 0,25 0,22 2,08 0,97 0,45 0,07 1,88 Zir_Sora 93 17 7,4 (4,2 - 12) 62 Da1a, ATcs21 0,42 0,74 0,09 9,08 0,54 0,87 0,10 3,30 ZZRS_Radovna 94 16 *186,4 (95,2 - *) 81 DA22 0,34 0,78 0,08 9,00 0,58 0,80 0,04 3,02 3.3 Populacijsko ravnotežje Vse divje testirane populacije smo z F-statistiko testirali glede na to, ali se nahajajo v Hardy-Weinbergovem (H-W) ravnotežju ali ne. To smo ocenjevali glede na vrednost Fis, katere signifikantno odstopanje od 0 nakazuje, da zaradi različnih vzrokov (e.g., migracije, selekcija) v testiranih populacijah ne prihaja do naključnega parjenja. Populacij, ki so imele Fis vrednosti signifikantno različne od nič, je bilo osem, vse se uvrščajo v skupino populacij z visoko introgresijo atlantskih genov (Tabela 3, rdeče obrobe Fis vrednosti). Vse preostale populacije so v H-W ravnotežju. 3.4 Genetska diferenciacija med populacijami Medpopulacijska genetska diferenciacija, ki smo jo ocenjevali za prve tri skupine populacij (100% mtDNA, >84% nDNA, N = 24), je bila zelo visoka, kar je razvidno preko F-statistike, ki je pokazala zelo visoko poprečno Fst vrednost, Fst = 0.52. Ocene genetske diferenciacije glede na populacijske pare (parne Fst vrednosti; izvzeta je primerjava med Dovžanko in Zalim potokom, saj gre za kopiji populacije iz Mošenika) so se gibale od 0.30 do 0.81. Visoko medpopulacijsko genetsko diferenciacijo so potrdili rezultati, dobljeni s programom STRUCTURE. Pri omenjeni analizi prvih treh skupin populacij je bilo glede na M metodo (Evanno et al., 2005) statistično najbolj verjetno, da analizirane populacije predstavljajo 15 genetsko homogenih enot (vrednost K = 15). Na grafu je skoraj vsaka populacija predstavljena s svojo barvo oz. s sebi lastnim vzorcem barvnih kombinacij, ki se med osebki ne spreminja, kar kaže na njihove specifične genetske profile (Sliki 4 in 5). Slika 5 prikazuje pozicije analiziranih populacij v prostoru PCA grafa (izračunano v programu Genetix), ki ga definirajo tri glavne osi Y, X in Z. Iz diagrama je razvidno, da večina populacij predstavlja genetsko homogene enote; nekatere so jasno ločene od ostalih (e.g., Resniški potok, Dravinja, Verna), druge, ki izhajajo večinoma iz enotnega geografskega območja, se združujejo v večje genetske enote (e.g., Ribnica in Suha ), nekatere (predvsem populacije iz Sore) tvorijo osebki, katerih pozicija se delno prekriva. Slika 5: Analiza glavnih komponent (PCA) treh dimenzij za prvi dve skupini populacij (100% mtDNA, >90% nDNA) Skozi presek rezultatov vseh treh zgoraj navedenih analiz lahko prepoznamo naslednje relativno homogene genetske enote: SAVSKO POREČJE Bohinjsko območje: 1 Boh_Ribnica Zg. (18)/ Boh_Suha (19), Fst = 0.35; Sistem Tržiške Bistrice: 2 Trž_Mošenik (77) Trž_Dovžanka (75) in Trž_ZaliPotok (79), Fst = 0.025 - 0.071 V tem primeru gre za populacijo iz Mošenika, ki je bila prenesena v Dovžanko in Zali potok. Sistem Sore: Skupina petih populacij iz Poljanske Sore in treh iz Selške Sore (Jahodnica se ne uvršča v to skupino); med njimi obstajajo določene genetske razlike, vendar proti preostalim populacijam tvorijo relativno homogeno genetsko enoto, značilno za rečni sistem Sore. Na PCA grafikonu zavzemajo centralni položaj. Sistem Savinje: Dve genetski enoti, ki se povezujeta v relativno homogeno skupino. 3 Lju_Robanšek (47)/ Lju_KozlovG (44)/ Lju_Krumpah (45), Fst = 0.37 - 0.39; 4 Moz_Kramarica (49)/ Moz_Leskovšek (50), Fst = 0.4 Relativno neodvisne genetske strukture: 5 Bar_Pojašnica (12) /Ljubljanica/ 6 Kra_Nemilj (41) /zgornja Sava/ 7 Žel_Jahodnica (88) /Selška Sora/ DRAVSKO POREČJE Sistem Mislinje 8 Kor_Glažuta (32)/ Kor_Mislinja (36), Fst = 0.08 Relativno neodvisne genetske strukture: 9 Ruš_Verna(63)/Drava/ 10 SloB_Dravinja (64) /Drava/ 11 SloB_Resniški potok (65) /Dravinja/ Izpostaviti velja, da so nekatere geografsko bližnje populacije genetsko zelo diferencirane, npr. populaciji iz Selške Sore, Žel_DPZale (86)/ Žel_Jahodnica (88), Fst = 0.66. V nekaterih primerih pa so populacije medsebojno geografsko zelo oddaljene pa vendar genetsko dokaj podobne (Kor_Mislinja (36)/Kra_Nemilj (41), Fst = 0,23). 3.5 Poskus preučevanj vpliva okolja na selekcijo alelov z adaptivno vrednostjo Populaciji zaroda iz poskusa na zgornjesavskem območju, od katerih smo eno vložili v divjino, drugo pa gojili v ribogojniških razmerah, smo testirali na genetsko podobnost z mikrosateliti z adaptivno vrednostjo in s tem ugotavljali, ali je med njima prišlo do genetskih sprememb zaradi selekcije na specifično okolje. Test genetske podobnosti, ki je vključeval F-statistiko, STRUCTURE analizo in preverjanje odstopanja pojavnosti posameznih alelov med populacijama, je na vseh treh ravneh pokazal, da se osebki obeh skupin med seboj genetsko ne razlikujejo statistično značilno. Do enakega rezultat smo prišli, če smo obravnavali vsak lokus posebej ali če smo vse tri lokuse združili in analizirali kot celoto. Do enakih zaključkov smo prišli na osnovi poskusa v Posočju, kjer smo primerjali genetski profil divje populacije, iz katere so izhajali starši, ki so dali zarod, ki smo ga gojili v ribogojnici, in genetski profil omenjenega zaroda. Analiza preživetja zaroda v vališču RD Bled je pokazala različno preživetje mladic glede na izvor očetov. Tako mladice iz Suhe intenzivneje poginjajo v primerjavi z mladicam iz Mošenika ter Malešnice (Tabela 4). Vpliv očetov je bil statistično analiziran s testom x2 v programu SAS in v vseh primerih potrjen z verjetnostjo >0,9999. Tabela 4: Delež preživetja postrvi v ribogojnici v selekcijskem poskusu Datum vzorčenja 27.11.2014 7.1.2015 24.7.2015 Delež preživetja (št. oplojenih iker) Delež preživetja do faze iker z očmi Delež preživetja do mladice RD Bohinj Suha 100 % (20600) 80.5 % (16583) 10.7 % (2218) RD Tržič Mošenik 100 % (21300) 73.9 % (15655) 19.6 % (4173) RD Medvode Malešnica 100%% (21800) 76 %% (16568) 31.3 % (6808) Vpliv selekcije na adaptivne lokuse z analizo alelne pestrosti (A) ribogojniških atlantskih in genetsko čistih divjih donavskih populacij: Za vsako skupino smo izračunali razliko med alelno pestrostjo za vse tri adaptivne lokuse in alelno pestrost za nevtralne lokuse: A(adapt) - A(nevt.) Preko dobljenih vrednosti smo opazili: • da sta A(adapt.) in A(nevt.) pri divjih populacijah sorazmerni • da je pri ribogojniških populacijah A(adapt.) ca. 2-krat nižja od A(nevt.) • da je pri ribogojniških populacijah A(nevt.) ca. 2-krat večja kot pri genetsko čistih divjih populacijah • da je razmerje med A(adapt.) - A(nevt.) za divje in A(adapt.) - A(nevt.) za ribogojniške populacije 1:4 To pomeni, da so pri ribogojniških populacijah nekateri aleli pri adaptivnih lokusih pod selekcijskim pritiskom, saj je pri divjih populacijah alelna pestrost med adaptivnimi in nevtralni lokusi sorazmerna, medtem ko je pri ribogojniških populacijah to razmerje v prid alelni pestrosti nevtralnih lokusov (Slika 6). Slika 6: Razlika alelne pestrosti med MHC I in nevtralnimi markerji. Nižje vrednosti predstavljajo okrnjeno pestrost na adaptivnih lokusih napram nevtralnim lokusom, kar nakazuje na negativno selekcijo, ki je opazna pri atlantski domesticirani liniji (vijolični krogi), medtem ko sta alelni pestrosti pri populacijah z v donavskim genetskim deležem >84% v ravnovesju 4 DISKUSIJA Raziskava je potrdila rezultate prejšnje študije (Bogataj, 2010), da so v Sloveniji naravne populacije potočne postrvi z visokim avtohtonim genetskim deležem precej redke in omejene na zgornje, izolirane odseke manjših potokov. Ne glede na splošno kritično stanje avtohtonih potočnic v Sloveniji nam je uspelo identificirati 20 novih populacij s 100% mtDNA in >90 % nDNA donavskim deležem in med omenjenimi kar 14 takih z 100% mtDNA in >96% nDNA. Pomembno je tudi spoznanje, da obe ribogojniški populaciji, ki smo ju vključili v raziskavo (i.e., iz RD Ljubno in RD Železniki), formirajo križanci s poprečnim atlantskim genetskim deležem okrog 90%. Glede na enoten vir (Ribogojnica Povodje), ki je oskrboval ribiške upravljavce z atlantskimi ribogojniško vzrejenimi potočnimi postrvmi v zadnjih nekaj desetletjih, lahko pričakujemo podobne razmere tudi v ribogojnicah preostalih ribiških družin. Nekatere populacije iz prejšnje raziskave, ki smo jih ponovno analizirali v tej raziskavi, sedaj niso dosegle tako visokega genetskega deleža; ta je lahko nižji celo za ca. 30%. Razlog je v izpopolnjeni metodiki in bistveno večjem naboru mikrosatelitnih lokusov, ki smo jih uporabili v tej raziskavi. Očitno pa močno izstopa populacija iz Malešnice (Žlebe), pri kateri je bil v predhodni analizi genetski delež nDNA 97% in mtDNA< 84%, sedaj pa smo na vzorcih iz iste lokacije zabeležili le 13% delež nDNA in 85% delež mtDNA. Razlog za to neskladje je najbrž predvsem v tem, ker smo lokacijo na Malešnici vzorčili dva krat, 28. marca 2009 in naslednjič 23. 6. 2010. Genetski test je bil v predhodni raziskavi narejen na prvem setu vzorcev, v pričujoči raziskavi pa na drugem. Zelo verjetno je, da je v vmesnem obdobju prišlo do vnosa osebkov, ki so spremenili prvotni genetski profil populacije. Pri opredeljevanju genetske čistosti populacij bi bilo torej smiselno podatke o avtohtonem genetskem deležu ažurno preverjati in posodabljati. 4.1 Genetska pestrost Ugotovili smo, da imajo vse populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem zelo nizko efektivno velikost (Ne), kar pomeni, da v procesu parjenja v takih populacijah sodeluje in prenaša svoje gene v naslednjo generacijo le manjši del populacije (ponavadi je to ca. 10% od celotne (census) populacije). Kjer je teh osebkov malo, neizbežno prihaja do parjenja v sorodstvu, kar vpliva na padec populacijskega fitnesa. Poleg tega se pri nizki Ne iz generacije v generacijo prenaša le del genetske pestrosti, s katero »razpolaga« določena populacija, pri čemer v naslednjih generacijah prihaja do spremenjene pojavnosti alelov nekega gena glede na predhodno generacijo (genetski zdrs). Za majhne populacije je torej značilen trend zmanjševanja genetske pestrosti, k čemur najbolj doprinese zgoraj opisani fenomen, ki lahko privede do tega, da določeni aleli povsem izginejo, zaradi česar se zmanjša genetska pestrost; k temu pa pripomorejo še razni stohastični dogodki (naravne nesreče kot so zemeljski plazovi, hudourniške vode...), ki povzročijo še dodatno zmanjšanje že tako majhnih populacij (t.i. ozko grlo), kar še pospeši redukcijo genetske pestrosti. Genetska pestrost pa je za populacijo izjemnega pomena, ker omogoča, da se populacija prilagaja na spremenjene okoljske razmere in se brani pred različnimi boleznimi. Zato genetska pestrost predstavlja osnovno merilo možnosti za dolgoročno preživetje populacije in je torej osnovna ocena njene uspešnosti. Genetsko pestrost se običajno ocenjuje preko stopnje heterozigotnosti (H, vsota deležev heterozigotov na vseh testiranih lokusih) in stopnje poprečnega števila alelov na lokus (A). Genetske analize na potočni postrvi v Sloveniji so pokazale, da imajo prav vse populacije, ki so uspele ohraniti visok avtohtoni genetski delež, v primerjavi z drugimi vrstami sladkovodnih rib (DeWoody & Avise, 2000) izredno nizko genetsko pestrost. Ekstremno nizko genetsko pestrost smo npr. ugotovili pri populaciji iz Pojašnice (12), ki ima H = 0. 12 in A = 1.4; v tem primeru gre za zelo majhno populacijo. Pri večjih populacijah, za katere je bila večinoma značilna tudi visoka kontaminiranost z atlantskimi geni, pa smo zasledili tudi bistveno višjo genetsko pestrost; pri potočnih postrvih iz osrednjega dela Poljanske Sore (93) smo na primer opazili stopnjo genetske pestrosti (H = 0.74 in A = 9), ki je značilna za velike populacije z nizkim genetskim zdrsom. K visoki genetski pestrost v tem primeru verjetno še dodatno pripomoreta dopolnilno vlaganje potočnih postrvi iz ribogojnic in introgresija. Glede na strategije upravljanja s potočno postrvjo v Sloveniji, ki potencialno vključujejo njene genetsko čiste populacije kot izhodišče za njeno repopulacijo, in ob zavedanju, kako nizka je genetska pestrost teh populacij, se zastavlja vprašanje, ali bi potomci teh populacij uspeli preživeti in se razmnoževati tudi v okoljih (e.g., reke in večji potoki), ki se razlikujejo od njihovih izvornih, in ali bi uspeli konkurirati tam živečim hibridnimi populacijam. Ali je torej primerno z osebki, ki razpolagajo samo z zelo omejenim naborom genetskega polimorfizma donavske postrvi, naseljevati celoten areal potočne postrvi v Sloveniji? Naše mnenje je, da material s tako osiromašeno genetsko pestrostjo nikakor ni primeren za obsežno repopulacijo potočne postrvi v Sloveniji in da bi morale imeti omenjene populacije zato predvsem lokalen pomen. 4.2 Medpopulacijska diferenciacija Poleg nizke genetske pestrosti in nizke efektivne velikosti je za populacije potočne postrvi v Sloveniji z visokim avtohtonim genetskim deležem značilna zelo močna genetska diferenciacija. Tako smo med 24 analiziranimi populacijami (100% mtDNA in >90 % nDNA; 20 populacij iz te raziskave in štiri iz predhodne) prepoznali kar 11 genetsko izrazito diferenciranih enot, ki so se glede na parne Fst vrednosti med seboj ločevale za Fst = od 0.6 do 0.8. Tako visoke vrednosti presegajo najvišje vrednosti, ki so jih do sedaj našli na obsežnejši geografski skali na mikrostalitni DNA pri salmonidih na medpopulacijski ravni drugod po Evropi (zabeležena poprečna Fst vrednost je bila od 0.33 do 0.36; Taylor et al., 2001; Koskinen et al., 2001; Angers & Bernatchez, 1998). Izjema so genetsko čiste populacije soške postrvi (Salmo marmoratus) na območju porečja zgornje Soče in Idrijce (Fumagalli et al., 2002), kjer so Fst vrednosti med temi populacijami primerljive z vrednostmi, ki smo jih opazili v tej raziskavi. Izmed 11 zgoraj omenjenih genetsko homogenih enot smo opazili štiri take, ki so jih sestavljale nekoliko bolj genetsko podobne populacije, ki pa so bile hkrati tudi regijsko specifične; kot primer navajamo populacije iz Mislinje v dravskem rečnem sistemu in populacije iz Sore v savskem rečnem sitemu. Vendar gre tudi v teh primerih le za relativno povečano genetsko podobnost, saj tudi tu parne Fst vrednosti presegajo vrednost 0.3, kar je splošno gledano objektiven pokazatelj za znatno genetsko diferenciacijo. In celo v sistemu Selške Sore smo našli populacijo, i.e. iz Jahodnice ( 88), ki se od drugih populacij iz tega rečnega sistema kot tudi od preostalih populacij loči za Fst = ca. 0.7. Kaže torej, da so populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem popolnoma izolirane med seboj, najsi gre za sosednje ali geografsko oddaljene populacije. Ta ugotovitev namreč izhaja iz dejstva, da je popolna odsotnost genskega pretoka, ocenjevanega z mikrosatelitno DNA, dosežena že celo pri nižjih Fst vrednostih, kot smo jih opazili v svoji raziskavi, in sicer zaradi visoke mutacijske stopnje mikrosatelitov, ki postopoma povečuje znotraj-populacijsko genetsko raznolikost (Balloux & Lugon-Moulin, 2002). Vzrok za tako visoko medpopulacijsko diferenciacijo je torej izostanek genetskega pretoka med populacijami in genetski zdrs, ki v posameznih populacijah poteče naključno in se manifestira v specifičnih genetskih profilih populacij. Neposreden razlog za omenjeno izolacijo so neprehodne ovire kot npr. slapovi, ki preprečujejo migracijo rib po toku navzgor. Posreden razlog pa je verjetno v ledeniško pogojenem geomorfološkem preoblikovanju s postrvmi naseljenih območij v Sloveniji, ki se je dokončno formiralo pred ca. 10.000 leti in je vplivalo na omejeno možnostjo migracij med določenimi populacijami postrvi. Neodvisno od tega je k dodatni diferenciaciji verjetno pripomogla tudi izolacija zaradi razdalje, i.e. ko genetska diferenciacija med osebki narašča skladno z naraščajočo geografsko razdaljo med njimi. Glede na omenjeno lahko ekstrapoliramo, da so se potočne postrvi v Sloveniji dokaj ločeno razvijale med posameznimi sistemi večjih rek, da pa je do očitne diferenciacije prihajalo tudi znotraj teh sistemov. S temi ugotovitvami so skladni tudi rezultati populacijsko genetske analize čistih populacij soške postrvi v Sloveniji (Fumagalli et al., 2002), ki naseljuje območja s podobnim zemeljskim reliefom kot preučevane potočne postrvi. Da naši rezultati niso pokazali očitnejše regijsko vezane genetske podobnosti, je verjetno razlog v tem, da smo bili pri analizi diferenciacije omejeni na izredno majhne populacije, ki so že zelo dolgo ločene od ostalih, in pri katerih je naključni genetski zdrs verjetno prevladujoči evolucijski dejavnik; le-ta je verjetno tudi preprečil formiranje izrazitih filogeografskih linij. Specifične genetske profile populacij z visokim avtohtonim genetskim deležem smo dokazali na osnovi nevtralnih mikrosatelitnih markerjev, pri tem pa je treba upoštevati, da so enakemu genetskemu dogajanju (e.g. genetskemu zdrsu) podvrženi tudi drugi geni, ki jih v svoji raziskavi neposredno nismo preučevali; sem sodijo torej tudi vsi geni z vplivom na nevtralne fenotipske lastnosti. Ni torej nepričakovano, da postrvi v Sloveniji odražajo veliko fenotipsko raznolikost, o kateri poročajo tako med različnimi območji kot celo med posameznimi potoki znotraj posameznega območja. Če želimo to fenotipsko raznolikost ohranjati, bo potrebno z lokalnimi populacijami oddvojeno upravljati in se izogibati njihovemu medsebojnemu mešanju. 4.3 Mitohondrijska DNA Iz raziskave je razvidno, da se je v številnih genetsko mešanih populacijah z zmernim ali celo zelo visokim atlantskim genetskim deležem na jedrni DNA donavski delež na mitohondrijski DNA ohranil 100-odstotno. Očitno gre v teh primerih za omejen doprinos gamet ženskih neavtohtonih osebkov. Ker se mtDNA deduje samo po maternalni liniji, jedrna pa po obeh spolih, na splošno velja, da prihaja do genetskega zdrsa in posledično do fiksacije oz. izgube genetskih variant pri mtDNA haplotipih štirikrat hitreje kot pri alelih jedrne DNA. Dinamika genetskega zdrsa je še bolj izrazita pri majhnih populacijah v kombinaciji z ozkim grlom (značilnost večine divjih populacij te raziskave), kar lahko privede do minimalne efektivne velikosti populacije in do pospešenega naključnega razporejanja genov. Torej se lahko v takih razmerah določen mtDNA haplotip (e.g. atlantski) hitro v celoti izgubi. Zelo verjetno pa je, da k temu naključnemu razporejanju genov v populacijah, ki jih obravnavamo v tej raziskavi, pripomore še proces selekcije: predvideva se namreč, da naravna selekcija v divjini deluje močneje proti ribogojniškim atlantskimi samicam kot proti ribogojniškim atlantskim samcem, ki imajo v naravnem okolju torej več možnosti prenesti svoje gene v avtohtono populacijo kot ribogojniške samice (Hansen, 2002; Wills, 2006). Rezultat tega je, da populacija navkljub introgresiji z atlantskimi osebki ohrani avtohton mitohondrijski genetski profil. To hipotezo potrjujejo naši rezultati, ki pri skoraj 1/3 mešanih populacij odražajo 100% donavski haplotip in več kot 50% introgresijo z atlantskimi jedrnimi geni. Ker smo v raziskavo vključili le tiste divje populacije, za katere velja, da niso upravljane, je možno, da je že enkraten (nezabeležen) vložek atlantskih potočnic doprinesel k neuravnoteženem genetskem profilu, ki ga opisujemo zgoraj. 4.4 Poskus preučevanja vpliva okolja na selekcijo potočne postrvi Dobljeni rezultati poskusa, s katerim smo preučevali vpliv okolja na selekcijo alelov z adaptivno vrednostjo, kažejo na to, da na osnovi treh kandidatnih lokusov, vezanih na MHC kompleks, genetskih sprememb, ki bi nastale zaradi vpliva različnega okolja, nismo mogli dokazati. Po drugi strani nam je uspelo s statistično visoko signifikantnostjo dokazati, da je izbor očetov bistveno vplival na preživetje zaroda v ribogojnici. Pri tem je ključno izpostaviti, da so se skupine očetov med seboj ločile glede na stopnjo vpliva ribogojnice: prvo skupino so predstavljali samci iz divjine, drugo skupino naključna kombinacija divjih samcev in v ribogojnici vzrejenih samcev, ki so bili kot mladice vloženi v potok z divjimi samci, medtem ko je tretjo skupino predstavljala prva generacija samcev, vzrejenih v ribogojnici (Tabela 4). Glede na rezultate bi lahko sklepali, da je do faze iker z očmi viabilnost iker najvišja pri »divjih« ikrah. To razmerje se spremeni v fazi mladic, ko so bile najuspešnejše tiste, katerih starši so bili ribogojniški samci. Na osnovi teh ugotovitev bi lahko predpostavili preliminarno hipotezo, da je zgodnejši ontogenetski razvoj pri potočni postrvi bolj konzervativen, medtem ko je na kasnejše faze razvoja lažje vplivati s selekcijo. Vsekakor je omenjeno domnevo potrebno nadalje testirati na večjem številu informativnih poskusnih skupin. Nedvomno pa je vpliv samcev na preživetje mladic, ki smo ga dokazali s populacijskim poskusom, pokazal, da ribogojniška vzreja ima vpliv na gensko selekcijo. Tega nam očitno za sedaj ni uspelo dokazati na molekularni ravni. Razlog za to je morda v tem, da na to lastnost vpliva večja količina genov in/ali da posamezni geni učinka zaradi spremenjenega okolja ne morejo tako močno izraziti že v prvi generaciji. Araki et al. (2007) so npr. pokazali, da pride do drastičnega padca reprodukcijske sposobnosti ribogojniških populacij anadromnih šarenk (Oncorhynchus mykiss) v divjini šele po treh letih njihovega življenja v ribogojnici. Možno pa je tudi, da se selekcija na različno okolje odraža preko različne stopnje ekspresije določenih genov, o čemer za šarenko poroča Christie et al. (2016), kar pa je možno dokazovati le preko RNA študij. Raziskave vpliva okolja na selekcijo alelov z adaptivno vrednostjo nameravamo pri potočni postrvi nadaljevati, pri čemer bomo glede na izkušnje iz pričujoče raziskave vpeljali metodo genetske asociacijske študije, temelječe na množici SNP markerjev, pridobljenih preko sekvenciranja nove generacije. 4.5 Smernice za repopulacijo potočne postrvi in vloga populaciji z visokim avtohtonim genetskim deležem Vse populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem imajo ekstremno nizko genetsko pestrost in vse izvirajo iz ekološko podobnega okolja (izvirni deli majhnih gorskih potokov), zato je navkljub večjemu številu detektiranih genetsko pristnih populacij kot v predhodni raziskavi, tvegano verjeti, da bi se njihovi potomci uspešno odzvali na različna okolja njihovega vnosa, ki ga v veliki meri predstavljajo precej večji vodni sistemi z višjo temperaturo, z obstoječo hibridno populacijo in bistveno večjim spektrom patogenih mikroorganizmov. Prav tako smo tudi ugotovili, da translokacije lokalnih populacij niso primerne, če želimo ohranjati fenotipsko heterogenost potočne postrvi, in da je genetsko primerne populacije smiselno vključevati le v repopulacijski proces lokalnih območij, od koder te populacije izvirajo. Poleg tega bi bili številni posegi (e.g. elektroizlov, odvzem spolnih celic...), ki bi bili v primeru eksploatacije teh populacij za repopulacjio neizogibni, za te krhke populacije škodljivi in bi na daljši rok zagotovo ogrozili njihov obstoj. Dejstvo je tudi, da zaradi obsežnega minulega vlaganja in specifične topografije v mnogih ribiških družinah populacij z genetsko visokim donavskim delež enostavno ni več. Primer je celoten rečni sistem Kolpe v Sloveniji in rečni sistem Krke. Nekateri v takih primerih vidijo rešitev v poribljanju s čistimi postrvmi, ki izvirajo izven lokalnega ribiškega območja. To pa zaradi vprašljive sposobnosti prilagajanja na drugačno okolje in zaradi dodatnega poseganja v genetsko strukturo lokalnih postrvi močno odsvetujemo. Za rehabilitacijo avtohtone potočne postrvi v Sloveniji in za vzpostavitev sonaravnega upravljanja z njo bi bilo torej nujno najti številne dodatne vire genetsko sprejemljivih lokalnih plemenskih rib, ki bi zagotavljale zadostno genetsko pestrost, adaptivnost in ohranjanje regijsko specifičnih fenotipov. To troje pa je mogoče doseči le z uporabo lokalnega materiala. V takih primerih se je treba torej vprašati, ali ni morda za repopulacijo bolje uporabiti lokalni material, pa čeprav ta ni povsem genetsko čist, in na ta način ohraniti vsaj preostanek avtohtonih lokalnih genov, ki zagotavljajo adaptivnost in potencial za izražanje lokalnih fenotipov; le-te pa v končni fazi oblikuje naravna selekcija, ki jo narekuje specifično okolje in specifičen nabor genov. Zavedati se je treba, da je bila z več desetletnim vnašanjem atlantske potočne postrvi v slovenske vode narejena avtohtonim potočnicam ogromna in nepopravljiva škoda, in da je potrebno pri nadaljnjem upravljanju to dejstvo sprejeti in se osredotočiti na možnosti, ki so ostale. Naš predlog je torej, da se areal potočne postrvi v Sloveniji razdeli na smiselna geografska območja, ki bodo predstavljala najmanjše enote upravljanja. Pri tem so lahko v pomoč homogene genetske enote, ki smo jih identificirali v tej raziskavi. V okviru teh območij bi bilo potrebno neposredno iz cone križanja s pomočjo genetskega testa izbirati najboljši material, ki bi ga v kombinaciji z genetsko čistimi populacijami (kjer so na voljo) uporabili za vzpostavitev plemenskih jat s sprejemljivim donavskim deležem. S plemensko jato je pomembno gospodariti na način, da iz odbranih osebkov ne bi spet nastala domesticirana linija, kar je bil poleg neavtohtonosti največji problem atlantske linije. Zato predlagamo, da se v na novo vzpostavljene donavske plemenske jate vključi samo samice, ikre teh samic pa bi vsakoletno oplojevali s semenom lokalnih samcev iz divjine, ki se ga odvzame na mestu samem, samce pa se po odvzemu vrne na mesto izlova. Priporočamo, da se pred uporabo semena določi tudi genetsko primernost odbranih samcev. S tehnologijo krioprezervacije semena, kar nekatere ribiške družine že rutinsko uporabljajo (i.e., Tolmin, Bled in Radovljica), je možno uskladiti časovna neskladja, do katerih lahko zaradi takih postopkov pride pri oplojevanju iker. Zarod, ki ni domesticiran (kar je predpogoj za uspešno repopulacijo), slabo uspeva v vališču in ribogojnici, kar so podprli tudi rezultati te raziskave. In ker je selekcija na ribogojnico nezaželena, je treba zarod vlagati v divjino v čim zgodnejših fazah njegovega razvoja, najbolje v fazi iker z očmi, kar kot najboljšo opcijo nakazujejo tudi rezultati našega poskusa, vezanega na vpliv očetov na selekcijo zaroda potočne postrvi. Odgovor na vprašanje, kako visok delež neavtohtonih genov je pri repopulaciji še mogoče dopuščati, je raznovrsten in odvisen od konkretnih razmer v posameznem ribiškem območju oz. ribiški družini, gotovo pa je osnovna orientacija pri odločanju natančno poznavanje poprečne genetske strukture postrvi konkretnega območja. Svetujemo, da se v takih primerih kandidatnim plemenskim postrvim, ulovljenim v divjini, pred smukanjem odvzame tkivo za genetske analize, na osnovi katerega bo možno ugotoviti delež genetske kontaminiranosti za posamezen osebek, kar naj bi bil kriterij za končno odbiro. Čeprav populacije z visokim avtohtonim genetskim deležem zaradi navedenih razlogov niso primerne kot edino sredstvo, na katerem bi temeljila repopulacija potočne postrvi v Sloveniji, vseeno predstavljajo dragocen vir, saj pri njih še ni prišlo do genetskega mešanja z atlantskimi postrvmi, zaradi česar jih je potrebno primerno zaščititi in ohranjati. Zaradi svoje majhnosti so namreč vse te populacije zelo ogrožene, predvsem jih ogrožajo naključni naravni dogodki, vezani npr. na destrukcijo okolja, klimatske spremembe etc. Iz lastnih izkušenj lahko povemo, da je bila npr. zaradi zemeljskega plazu l. 2002 uničena ena izmed devetih genetsko čistih populacij soške postrvi, nedavno pa so posledice žleda uničile populacijo potočne postrvi iz Malešnice (48). Kot eden izmed učinkovitih načinov za zaščito tovrstnih populacij je ustvarjanje njihovih kopij, s katerimi se nato poseljuje odseke sosednjih potokov, ki so težko dostopni za ribe nizvodno in ki so brez rib ali iz katerih je bila predhodno izlovljena nezaželena populacija. Poleg zaščite originalne populacije ima tak pristop tudi repopulacijski pomen, ker s povečevanjem obsega lokalnih avtohtonih genetskih »poolov« vpliva tudi na nizvodne populacije; genetski pretok, ki poteka nizvodno, namreč z lokalnimi geni postopno osvežuje introgresirane genome in jih tako strukturno spreminjajo v prid donavski liniji. Taka praksa se že več let uveljavlja v okviru rehabilitacije soške postrvi v Sloveniji; pri potočni postrvi pa smo na primeru kopije, narejene na osnovi populacije iz Mošenika (77), ki je bila vložena v Zali potok (79) in prazen odsek Dovžanke (75), opazili, da sta novonastali populaciji pet let po translokaciji ohranili praktično celotno originalno genetsko pestrost in se razvili v viabilni populaciji. 5 ZAHVALA Vsem ribiškim družinam, ki so sodelovale pri zbiranju vzorcev, se lepo zahvaljujemo za učinkovito pomoč in dobro voljo na terenu. Hvala tudi Tonetu Strgarju in Dušanu Jesenšku za pomoč pri tehnični izvedbi poskusa. 6 LITERATURA Araki et al., 2007. Science, 318:100-103. Angers & Bernatchez 1998. Molecular Biology and Evolution, 15:143-159. Apostolidis et al., 2007. Conservation Genetics, 8:1025-1028. Balloux & Lugon-Moulin, 2002. Molecular Ecology, 11:155-165. Bernatchez, 2001. Evolution, 55:351-379. Bernatchez & Landry, 2003. J. Evol. Biol., 16:363-377. Bogataj 2010, Diplomsko delo, Univerza v Ljubljani, BF, Oddelek za zootehniko. Christie et al., 2016. Nat Commun., 7:10676. Clement et al., 2000. Mol. Ecol., 9:1657-1659. Coughlan et al., 2006. ICES Journal of Marine Science, 63:1248-1255. DeWoody & Avise, 2000. Journal of Fish Biology, 56:461-473. Evanno et al., 2005. Molecular Ecology, 14:2611-2620. Fumagalli et al., 2002. Molecular Ecology, 11:2711-2716. Gharbi et al., 2006. Genetics, 172:2405-2419. Grimholt et al., 2003. Immunogenetics, 55:210-219. Hansen & Loeschcke, 1994. Conservation Genetics. Birkhauser Verlag Basel, Switzerland, pp 273-289. Hansen, 2002. Molecular Ecology, 11:1003-1015. Hansen et al., 2007. Mol. Ecol., 16:1413-1425. Jensen et al., 2008. Heredity, 100:79-91. Jug et al., 2005. Biological Conserv., 123:381-388. Jug, 1998. Univerza v Ljubljani, BF, Oddelek za zootehniko. Konar et al., 2013. Karafish Final report, Klagenfurt am Wörthersee: Kärtner Institut für Seenforschung, pp. 702. Koskinen et al. 2001. Conservation Genetics, 2:133-143. Keenan et al., 2013. Journal of Fish Biology, 82:1789-1804. Lerceteau-Köhler in Weiss, 2006. Aquaculture, 258:641-645. Meier et al., 2011. Heredity, 106:488-499. Melkič, 2000. Univerza v Ljubljani, BF, Oddelek za zootehniko. O'Farrell et al., 2013. PLoS ONE, 8:e63035. Povž et al., 1996. The Merble trout, in the Soča River basin, Slovenia. Tour du Valat Publications, 65 p. Schenekar et al., 2014. Conserv. Genet., DOI 10.1007/s10592-013-0561-0. Snoj, 1997. Zbornik Biotehniške fakultete UL. Kmetijstvo. Zootehnika, 70:111-116. Snoj, 2004. Ribič, 10:239-243. Snoj et al., 2015. Ribič, 1-2:5-9. Taylor et al., 2001. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 58:406-420. Templeton et al., 1992. Genetics, 132:619-633. Wills, 2006. North American Journal of Fisheries Management, 26: 535-544. Weiss & Schmutz, 1999. Transactions of the American Fisheries Society, 128:302-316. Danzmann et al., 1999. Aquaculture, 173:45-58 Priloga: Slike lokacij in rib iz prve skupine z zelo visokim donavskim genetskim deležem (100% mtDNA, >96% nDNA), iz fenotipsko heterogeniz lokacij in iz ribogojnice; številke v oklepajih se ujemajo z zaporednimi številkami populacij iz Tabele 1. Slika 1: Pojaščica (12), RD Barje Slika 4: Krumpah (45), RD Ljubno Slika 5: Robanšek (47), RD Ljubno Slika 6: Kramarica (49), RD Mozirje Slika 7: Leskovšek (50), RD Mozirje Slika 8: Petruzova grapa (68), RD Sora Slika 10: Dovžanka (kopija iz Mošenika; 75), DR Tržič Slika 13: Plenšak (90), RD Železniki Slika 14: Raskovec (92), RD Železniki Slika 15: Dva primera fenotipsko heterogene populacije, ki indicira introgresijo. Zgoraj: Stegovnik (78), RD Tržič (mtDNA 100%, nDNA 83%). Spodaj: Muštrova grapa (89), RD Železniki (mtDNA 75%, nDNA 24%).