kakovost in varnost/quauty and safety Priporočila za določanje testov trombofilije pri bolnikih z vensko trombembolijo Clinical guidelines for thrombophilia testing in patients with venous thromboembolism Alenka Mavri, Tjaša Vižintin Cuderman, Monika Štalc, Mojca Božič, Gregor Tratar, Mirjam Gubenšek, Anja Boc, Marko Miklič, Nina Vene Klinični oddelek za žilne bolezni, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, Ljubljana Korespondenca/ Correspondence: doc. dr. Alenka Mavri, dr. med., Klinični oddelek za žilne bolezni, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, Ljubljana e-mail: alenka.mavri@ kclj.si Ključne besede: trombofilija, venska trombembolija, laboratorijski testi Key words: thrombophilia, venous thromboembolism, laboratory tests Citirajte kot/Cite as: Zdrav Vestn 2013; 82: 65-79 Izvleček Trombofilija je stanje, ki povečuje nagnjenost k nastanku tromboz zaradi pospešenega strjevanja krvi. V prispevku opisujemo prirojene in pridobljene oblike trombofilije, njihovo prevalenco, pomen pri tveganju za nastanek prve venske trombembolije in njenih ponovitev ter laboratorijske metode za odkrivanje in vrednotenje posameznih oblik trombofilije. Sledi strokovno utemeljen izbor preiskav za ugotavljanje trombofilije pri bolnikih s prebolelo vensko trombembolijo, ki so smiselne le tedaj, ko vplivajo na trajanje antikoagulacijskega zdravljenja ali na ukrepe za preprečevanje ponovitve bolezni. Priporočila testiranja za trombofilijo tako zajemajo klinično najpomembnejše oblike trombofilije, ki jih določimo le pri izbranih bolnikih: ženskah v rodnem obdobju, ki so utrpele idiopatsko vensko trombembolijo, pri bolnikih, mlajših od 50 let, z idiopatsko vensko trombozo na neobičajnem mestu ali s sumom na antifos-folipidni sindrom in pri bolnikih s ponovitvijo idiopatske venske trombembolije pred 50. letom. Testiranje za trombofilijo pri drugih bolnikih z vensko trombembolijo pa strokovno in finančno ni upravičeno. Abstract Thrombophilia is a condition that increases susceptibility for the development of venous thromboembolism due to accelerated blood clotting. The article describes congenital and acquired thrombophilic conditions, their prevalence, the risk for a first and recurrent venous thrombo-embolism, and laboratory methods for the determination and evaluation of thrombophilias. Thrombophilia testing has only limited purpose and may be useful in patients with venous thromboembolism only when the results influence the duration of anticoagulant treatment or measures to prevent a recurrence of the disease. Therefore, thrombophilia testing includes clinically the most important thrombophilias and is recommended only in women of childbearing potential, in patients younger than 50 years with idiopathic venous thrombosis at an unusual site or suspected antiphospholipid syndrome and in patients with recurrence of idiopathic venous thromboembolism before the age of 50 years. Thrombophilia testing in other patients with venous thromboembolism cannot be justified. Prispelo: 27. nov. 2012, Sprejeto: 28. jan. 2013 Uvod Venska tromboza in pljučna embolija, ki ju skupaj imenujemo venska trombembo-lija (VTE), sta pogosti bolezni in predstavljata velik zdravstveni problem. Ker letna pojavnost VTE znaša 1-1,6 na 1.000 oseb,1 ocenjujemo, da v Sloveniji vsako leto utrpi VTE 2.000 do 3.000 bolnikov. VTE je še vedno nemalokrat prezrta, nezdravljena pa ima lahko za bolnika usodne posledice. V zgodnjem obdobju VTE spremlja visoka umrljivost, v poznem obdobju pa se lahko razvijejo trajne posledice, predvsem pljučna hipertenzija in potrombotični sindrom, ki pomembno zmanjšajo kakovost bolnikovega življenja in prinašajo visoke stroške zdravljenja. Pogostnost ponovitve VTE po zaključku antikoagulacijskega zdravljenja je 3-30 %, odvisno od dejavnika, ki je bolezen sprožil.2 S patofiziološkega stališča nastane VTE kot posledica porušenega dinamičnega ravnovesja med nastankom in razgradnjo fibrina, ki se nagne v smer nastajanja fibrina. Dinamično ravnovesje porušijo elementi Virchowe triade: upočasnjeni pretok krvi, poškodba žilne stene in pospešeno strjevanje krvi. S kliničnega stališča pa k nastanku VTE prispevajo sprožilni dejavniki3 oziroma stanja, ki omogočajo nastanek in vzdrževanje enega ali več prvin Virchowove triade. Sprožilni dejavniki so prehodni ali stalno prisotni. Med prehodne dejavnike tveganja prištevamo operacije, poškodbe, vstavljene intravenske katetre, nepomičnost, dolgotrajne letalske polete, nosečnost in porod, uporabo hormonske kontracepcije in nado- mestno hormonsko zdravljenje. Med stalno prisotne dejavnike tveganja sodita aktivni rak in nekatere oblike trombofilije. S pojmom trombofilija označujemo nagnjenost k nastanku tromboz, ki je posledica pospešenega strjevanja krvi. Trombofilijo lahko grobo razdelimo na prirojene in pridobljene oblike. Prirojene oblike trombofili-je so posledica mutacij v genih za beljakovine v koagulacijskem sistemu, ki privedejo do izgube funkcije določene beljakovine (pomanjkanje antitrombina, proteina C in pro-teina S) ali do spremembe funkcije določene beljakovine (polimorfizmi G16910A v genu za faktor V, G20210A v genu za protrom-bin, C10034T v genu za fibrinogen gama).4'5 Pridobljene oblike trombofilije se pojavijo pri nekaterih boleznih (antifosfolipidni sindrom, mieloproliferativne bolezni, paro-ksizmalna nočna hemoglobinurija, rak, itd.) in stanjih (debelost, nosečnost, uporaba oralnih kontraceptivov) in so posledica povečane koncentracije koagulacijskih beljakovin ali nastanka protiteles, ki pospešujejo strjevanje krvi (antifosfolipidna protitelesa). Nekatere oblike trombofilije označimo kot »mešane« saj imajo genetsko ozadje, a so lahko hkrati tudi pridobljene (hiperhomo-cisteinemija, povečana koncentracija faktorjev VIII, XI, IX ter neodzivnost na aktivirani protein C, ki ni povezana s polimorfizmom v genu za faktor V).6'7 Tveganje za nastanek prve VTE se med posameznimi oblikami trombofilije močno razlikuje (Tabela 1). Tabela 1: Razdelitev trombofilije glede na tveganje za nastanek prve venske trombemboLije (VTE). Relativno tveganje za vTE Prirojena trombofilija Pridobljena trombofilija Mešana trombofilija Veliko 5-10 Pomanjkanje antitrombina Pomanjkanje proteina C Pomanjkanje proteina S Antifosfolipidna protitelesa Zmerno 3-5 F V Leiden Protrombin G20210A Hiperhomocisteinemija Povečana koncentracija F Viii Majhno 1-3 MTHFR C667T Krvna skupina A, B aLi AB Povečana koncentracija F iX Povečana koncentracija F Xi Povečana koncentracija fibrinogena Neodzivnost na aktivirani protein C, ki ni povezana s F V Leiden Prirojena trombofilija Pomanjkanje antitrombina PrevaLenca in obLike pomanjkanja antitrombina Antitrombin je naravni antikoagulant, ki zavre aktivne faktorje koagulacije: trombin, IX, X, XI in XII. Prirojeno pomanjkanje antitrombina je redka oblika trombofilije, ki se deduje avtosomno dominantno. Večinoma gre za heterozigotne oblike različnih mutacij v genu za antitrombin, homozigotne oblike običajno niso združljive z življenjem. V populaciji se pojavlja izjemno redko, v 0,02 %.8 Poznamo dva tipa pomanjkanja antitrombi-na:' • Tip I: kvantitativna oblika pomanjkanja, pri kateri je nastajanje proteina zmanjšano, zato je v plazmi manj kot 50 % normalne koncentracije antitrombina. Tip I je prisoten pri 80 % bolnikov s pomanjkanjem antitrombina. • Tip II: kvalitativna oblika pomanjkanja, pri kateri nastaja protein z zmanjšano aktivnostjo. Glede na mesto mutacije ločimo tri podtipe (IIa, IIb in IIc). Pomanjkanje antitrombina in tveganje za VTE Pomanjkanje antitrombina odkrijemo pri približno 1 % bolnikov z VTE. Tveganje za nastanek prve VTE je pri osebah s pomanjkanjem antitrombina 5- do 8-krat večje,10'11 tveganje za ponovitev VTE pa 1,9-do 2,6-krat večje kot pri osebah brez te oblike trombofilije.i2'i3 Laboratorijske metode določanja pomanjkanja antitrombina Metoda izbire je funkcijska, z njo izmerimo aktivnost antitrombina s pomočjo razgradnje kromogenega substrata. Bolnikovo plazmo inkubiramo s presežkom trombina ali faktorja Xa. Antitrombin v vzorcu reagira s trombinom ali faktorjem Xa, presežek trombina ali faktorja Xa, ki ga izmerimo s pomočjo kromogenega substrata, pa je obratnosorazmeren aktivnosti antitrombina v vzorcu. Preiskave, ki temeljijo na inhibiciji faktorja Xa, se danes uporabljajo najpogosteje, vendar pa je možno, da ne zajamejo vseh oblik pomanjkanja tipa II. Imunskih metod za določanje koncentracije antitrombina z merjenjem njegovega antigena rutinsko ne uporabljamo, saj ne odkrijejo pomanjkanj tipa II. i4'i5 Diagnoze nikoli ne potrdimo na podlagi enega samega patološkega rezultata, pač pa meritev vedno ponovimo z novim vzorcem krvi. Meritev praviloma ne opravljamo v obdobju akutne VTE, med zdravljenjem s he-parini, ki zmanjšajo vrednosti antitrombina, ter med zdravljenjem s kumarini, ko so vrednosti antitrombina lahko prehodno povečane in lahko pomanjkanje ostane prikrito. Pomanjkanje proteina C Prevalenca in oblike pomanjkanja proteina C Protein C je naravni antikoagulant, ki skupaj s proteinom S inhibira aktivna faktorja koagulacije V in VIII in s tem omeji nastajanje trombina. Prirojeno pomanjkanje proteina C je posledica različnih mutacij v genu za protein C, ki se najpogosteje dedujejo avtosomno dominantno. Odrasli bolniki imajo heterozigotne oblike mutacij v genu za protein C, pri homozigotnih nosilcih pa se hudi, večinoma usodni trombotični zapleti (npr. purpura fulminans) pojavijo že takoj po rojstvu. i® V populaciji se pomanjkanje proteina C pojavlja zelo redko, v 0,2 %.iy Poznamo dva tipa pomanjkanja proteina C: • Tip I: najpogostejša, kvantitativna oblika pomanjkanja, ki je posledica zmanjšanega nastajanja ali zmanjšane stabilnosti proteina, zato sta aktivnost in raven anti-gena proteina C zmanjšana na okoli 50 % normalnih vrednosti. • Tip II: kvalitativna oblika, pri kateri nastaja protein z zmanjšano aktivnostjo, zato je v plazmi koncentracija antigena proteina C običajno normalna, aktivnost pa zmanjšana. Pomanjkanje proteina C in tveganje za VTE Pomanjkanje proteina C odkrijemo pri približno 3 % bolnikov z VTE. Tveganje za nastanek prve VTE je pri osebah s pomanjkanjem antitrombina do 7-krat večje," tveganje za ponovitev VTE pa 1,4- do 1,8-krat večje kot pri osebah brez te oblike trombo-filije.i2'i8 Laboratorijske metode doLočanja pomanjkanja proteina C Metoda izbire je funkcijska. Aktivnost proteina C lahko izmerimo s pomočjo ko-agulacijske ali kromogene metode. S koagu-lacijskimi metodami dobimo lažno visoke rezultate ob prisotnosti lupusnih antikoagu-lantov in direktnih inhibitorjev trombina ter lažno nizke rezultate ob povečani koncentraciji faktorja VIII, neodzivnosti na aktivirani protein C in ob zdravljenju s kumarini. Zato je bolj priporočljiva uporaba kromogene metode, čeprav z njo nekaterih redkih oblik pomanjkanja tipa II ne odkrijemo.19 Pri kromogeni metodi aktiviramo protein C v plazmi s kačjim strupom, trombinom ali kompleksom trombin-trombomodulin. Aktivirani protein C nato cepi specifičen substrat, katerega obarvanost lahko izmerimo. Imunskih metod za določanje antigena proteina C rutinsko ne uporabljamo, z njimi lahko ločimo ali gre za pomanjkanje tipa I ali II, ne moremo pa odkriti pomanjkanja tipa II. Diagnozo vedno potrdimo z dokazom pomanjkanja proteina C na dveh različnih vzorcih krvi bolnika. Meritev ne opravljamo v obdobju akutne VTE ter med zdravljenjem s heparini in kumarini. Pomanjkanje proteina S Prevalenca in oblike pomanjkanja proteina S Protein S je kofaktor proteina C pri inak-tivaciji aktivnih faktorjev V in VIII, koagu-lacijo pa lahko inhibira tudi neodvisno od aktiviranega proteina C. V krvi ga je 40 % v prosti, aktivni obliki in 60 %o v neaktivni obliki, vezanega na C4b-vezavni protein komplementa.20 Prirojeno pomanjkanje proteina S je posledica različnih mutacij v genu za protein S, ki se dedujejo avtosomno dominantno. Podobno kot pri pomanjkanju proteina C imajo homozigotni nosilci hude trombotične zaplete že takoj po rojstvu. V populaciji se pojavlja zelo redko, v 0,2 %.2i Poznamo tri tipe pomanjkanja proteina S: • Tip I: najpogostejša, kvantitativna oblika pomanjkanja, ki je posledica zmanjšanega nastajanja proteina. Zato je raven celokupnega proteina S zmanjšana na okoli 50 % normalnih vrednosti, pomembno manjša je tudi raven prostega proteina S in njegova aktivnost. • Tip II: zelo redka, kvalitativna oblika, pri kateri nastaja protein z zmanjšano aktivnostjo, zato je v plazmi koncentracija celokupnega in prostega antigena proteina S normalna, aktivnost pa zmanjšana. • Tip III: kvantitativna oblika, pri kateri je koncentracija celokupnega proteina S normalna, zmanjšana pa je raven prostega proteina S in njegove aktivnosti na manj kot 40 % normalnih vrednosti. Pomanjkanje proteina S in tveganje za VTE Pomanjkanje proteina S odkrijemo pri približno 1-2 % bolnikov z VTE. Nekatere raziskave niso potrdile povečanega tveganja za nastanek prve VTE pri bolnikih s pomanjkanjem proteina S," medtem ko so druge, predvsem družinske raziskave pokazale 8,5-krat večje tveganje.10 Tveganje za ponovitev VTE je okrog 1,4-krat večje kot pri osebah brez te oblike trombofilije.12 Laboratorijske metode določanja pomanjkanja proteina S Metoda izbire je imunska preiskava za merjenje prostega proteina S, saj bistveno bolje ločuje med heterozigotnimi nosilci pomanjkanja proteina S in normalnimi osebami kot merjenje celokupnega proteina S.22 Danes so dostopne imunske metode (en-cimskoimunske ali imunoturbidimetrične) z monoklonskimi protitelesi, specifičnimi za prosti protein S. Z merjenjem prostega proteina S potrdimo kvantitativni pomanjkanji tipa I in III, ki se pojavljata najpogosteje, ne moremo pa odkriti izjemno redkega pomanjkanja tipa II. Funkcijske preiskave (merjenje aktivnosti proteina S) so zelo slabo specifične, saj lahko številni dejavniki povzročijo lažno povečano ali zmanjšano aktivnost proteina S. Diagnozo vedno potrdimo z dokazom pomanjkanja proteina S na dveh različnih vzorcih krvi bolnika. Meritev ne opravljamo v obdobju akutne VTE, druge akutne bolezni ali vnetja, med zdravljenjem s kumarini, v nosečnosti ter ob jemanju oralnih kontra-ceptivov ali hormonskega nadomestnega zdravljenja, saj je tedaj koncentracija protei-na S zmanjšana. Polimorfizem G16910A v genu za faktor v (Faktor v Leiden) PrevaLenca in pomen faktorja V Leiden Faktor V je plazemski glikoprotein, ki sodeluje kot kofaktor pri aktiviranju faktorja X. Najpomembnejši zaviralec faktorja V je aktivirani protein C. Polimorfizem G16910A v genu za faktor V (faktor V Leiden) je posledica točkovne mutacije na mestu 1691 (zamenjava gvanina za adenin), ki ima za posledico zamenjavo arginina z glutaminom na aminokislinskem mestu 506 faktorja V. Tako spremenjen faktor V je manj dovzeten za inaktivacijo z aktiviranim proteinom C, zato se nastajanje trombina poveča. Stanje imenujemo tudi neodzivnost na aktivirani protein C. Zaradi polimorfizma je okrnjena tudi inaktivacija faktorja VIII.23'24 Polimor-fizem se deduje avtosomno dominantno. Najpogosteje se pojavlja pri belcih, v 2-16 %, izjemno redko pa pri Azijcih in Afričanih/5 V homozigotni obliki se pojavlja pri 1,5 % populacije. Faktor V Leiden in tveganje za VTE Faktor V Leiden je najpogostejša oblika trombofilije in jo v heterozigotni obliki najdemo kar pri petini bolnikov z VTE. V homozigotni obliki se pojavlja redkeje, pri približno 2 % bolnikov. Tveganje za prvo VTE je pri heterozigotnih nosilcih mutacije 2- do 7-krat večje kot pri osebah brez tega polimorfizma, pri homozigotih pa celo 80-krat večje.10'26 Tveganje za ponovitev VTE je majhno 1,4-kratno.i3 Laboratorijske metode določanja faktorja V Leiden Faktor V Leiden določamo z gensko analizo, ki temelji na kvantitativni verižni reakciji s polimerazo (PCR). Analizo lahko opravimo kadar koli, saj akutna bolezen ali antikoagulacijsko zdravljenje na rezultat ne vplivata. Polimorfizem G20210A v genu za protrombin Prevalenca in pomen protrombina G20210A Protrombin je predhodnik trombina. Po-limorfizem G20210A v genu za protrombin je posledica točkovne mutacije (zamenjava gvanina za adenin) na mestu 20210 na 3' ne-prevedenem koncu gena za protrombin. Zamenjava vodi do pospešenega prepisovanja gena in stabilnejše ter učinkovitejše informacijske RNA, zato se poveča koncentracija plazemskega protrombina. Zato pride do pospešenega nastajanja trombina. Zaradi delovanja protrombina na aktivirani protein C in S pa se razvije tudi neodzivnost na aktivirani protein C. Poleg tega lahko pro-trombin vpliva na strukturo krvnega strdka in zavira fibrinolizo/7^8 Polimorfizem se deduje avtosomno dominantno. V populaciji se pojavlja v 0,7-4 %.29 Protrombin G20210A in tveganje za VTE Polimorfizem najdemo pri 6,3 % bolnikov z VTE. Tveganje za prvo VTE je pri he-terozigotnih nosilcih mutacije 3-krat večje kot pri osebah brez tega polimorfizma.27 Tveganje za ponovitev VTE je majhno 0,7- do 1,7-kratno.13'18 Laboratorijske metode določanja protrombina G20210A Podobno kakor Faktor V Leiden, tudi protrombin G20210A določamo z gensko analizo, ki temelji na PCR. Analizo lahko opravimo kadar koli, saj akutna bolezen ali antikoagulacijsko zdravljenje na rezultat ne vplivata. Pridobljena trombofilija Med najpogostejše oblike pridobljene trombofilije sodi prisotnost antifosfolipi-dnih protiteles v sklopu antifosfolipidnega sindroma. V to skupino pa sicer prištevamo tudi pridobljeno trombofilijo v okviru nekaterih bolezni, predvsem raka in hematoloških bolezni, kot so paroksizmalna nočna hemoglobinurija in mieloproliferativne bolezni. Prisotnost antifosfolipidnih protiteles PrevaLenca in vrste antifosfolipidnih protiteles Antifosfolipidna protitelesa so heteroge-na družina protiteles. Mednje sodijo protitelesa proti fosfolipidom, protitelesa proti kompleksom fosfolipidov s serumskimi proteini in protitelesa proti nekaterim serumskim proteinom. Antifosfolipidna protitelesa zasledimo pri številnih boleznih, kot so avtoimunske in rakave bolezni, okužbe in druge bolezni. Vendar se trombotični zapleti in zapleti v nosečnosti pojavijo v povezavi z antifosfolipidnimi protitelesi le pri bolnikih s sistemskimi avtoimunskimi boleznimi in v primeru primarnega antifosfolipidnega sindroma (APS). Antifosfolipidna protitelesa, ki opredeljujejo APS, niso usmerjena neposredno proti fosfolipidom, ampak proti fosfolipide vezajoči plazemski beljakovini ^2-glikoproteinu I. Po trenutno veljavnih merilih lahko postavimo diagnozo APS, če izpolnjuje bolnik poleg enega ali več kliničnih znakov (tromboza v venskem ali arterijskem žilnem sistemu, histološko potrjene tromboze malih žil ali zapleti v nosečnosti) še vsaj eno od laboratorijskih meril. Laboratorijska merila vključujejo prisotnost ene ali več skupin antifosfolipidnih protiteles, dokazane vsaj dvakrat v časovnem presledku 12 tednov: • srednje ali visoko pozitivni titri IgG ali IgM antikardiolipinskih protiteles (aCL), • protitelesa proti ^2-glikoproteinu I (anti-^2 GPI), • lupusni antikoagulanti (LA). Mehanizem trombogenega delovanja antifosfolipidnih protiteles še ni dokončno razjasnjen. Domnevajo, da preko različnih mehanizmov zavirajo fiziološko antikoagu-lacijsko aktivnost ter spodbujajo aktivacijo trombocitov, monocitov in endotelijskih celic, vpletajo pa se tudi v delovanje kom-plementnega sistema.30 Pojavnost antifosfo-lipidnih protiteles v splošni populaciji ocenjujejo na 1-5 %, večja je pri starostnikih/2 AntifosfoLipidna protiteLesa in tveganje za VTE Antifosfolipidna protitelesa so prisotna pri okrog 20 % bolnikov s prvo VTE,33'34 vendar vsi bolniki ne izpolnjujejo meril za diagnozo antifosfolipidnega sindroma. Tveganje za prvo VTE je največje, 4- do 16-kratno, ob prisotnosti LA. Tveganje ob prisotnosti aCL je manjše, le 2- do 3-kratno, predvsem če so prisotni visoki titri protiteles razreda IgG/5 Tveganje ob prisotnosti anti-^2 GPI, predvsem razreda IgG, je oce- njeno kot 5-krat večje kot pri osebah brez teh protiteles/6 Prisotnost vseh treh vrst protiteles hkrati je povezana s kar 33-krat večjim tveganjem za prvo VTE v primerjavi z osebami brez njih/7 Tveganje za ponovitev venske tromboze je manj raziskano. Ocenjujejo, da prisotnost LA oziroma aCL v srednje ali visoko pozitivnem titru poveča tveganje za ponovitev VTE za 2- do 6-krat, o vplivu prisotnosti anti-^2 GPI pa ni zanesljivih podatkov/8 Laboratorijske metode določanja antifosfolipidnih protiteles LA določamo s koagulacijskimi metodami. Zaradi slabše občutljivosti posameznih metod vedno uporabimo dve različni metodi. Prva metoda izbire je koagulacijska metoda z razredčenim strupom gada (diluted Russell viper venom time, dRVVT), ki je najbolj specifična. Za drugo metodo uporabimo aktivirani parcialni tromboplastinski čas s kremenom kot aktivatorjem in nizko koncentracijo fosfolipidov. V primeru, da je katera koli preiskava pozitivna, izvedemo potrditveni test z uporabo večje koncentracije fosfolipidov. Ustrezen vzorec za preiskavo je citratna plazma brez trombocitov, ki jih odstranimo s filtriranjem ali dvojnim centrifugiranjem. Če preiskave ne opravimo takoj, moramo plazmo zamrzniti v tekočem dušiku in hraniti pri -70 °C/9 aCL in anti-^2 GPI določamo z imunskimi metodami. Uporabljamo standardizirane ELISA metode. Rezultate za aCL izražamo semikvantitativno (negativni, šibko, srednje ali visoko pozitivni) in glede na razred protiteles (IgG, IgM, IgA). Kot spodnjo mejo za srednje pozitivna aCL uporabimo 99. percentil zdrave populacije. Za anti-^2 GPI zaradi slabše standardizacije metod priporočajo numerično izražanje rezultatov. V vsaki seriji meritev uporabimo zunanjo kontrolo, ki ima vrednost blizu razmejitvene. Vzorec je praviloma serum.40 Antifosfolipidna protitelesa določamo šele 12 ali več tednov po akutni VTE, saj so lahko rezultati v obdobju akutne bolezni lažno pozitivni. Antikoagulacijsko zdravljenje na rezultate preiskav za določanje prisotnost aCL in anti-^2 GPI ne vpliva, medtem ko LA lahko določamo šele po ukinitvi antiko- agulacijskega zdravljenja. Pozitivni rezultat katerih koli protiteles je potrebno potrditi v novem vzorcu, ki ga odvzamemo 12 tednov po prvi meritvi. Mešane oblike trombofilije Hiperhomocisteinemija PrevaLenca in pomen hiperhomocisteinemije Homocistein je aminokislina, ki nastaja kot vmesni presnovek metionina. V telesu se presnavlja po dveh poteh: v procesu transsulfuracije se iz homocisteina tvori ci-station s cistation-^-sintazo in kofaktorjem vitaminom B6, v procesu remetilacije pa iz homocisteina nastaja metionin. Slednji proces katalizira metionin-sintaza, ki za kofak-tor uporablja vitamin B12, kot donor metilne skupine pa metil-tetrahidrofolat, ki nastane iz folata s pomočjo metiltetrahidrofolat re-duktaze (MTHFR). Pomanjkanje ali zmanjšanje aktivnosti encimov za presnovo homocisteina oziroma pomanjkanje vitaminov B6, B12 ali folne kisline povzroči kopičenje homocisteina. Mehanizmi nastanka VTE ob hiperhomocisteinemiji niso pojasnjeni, domnevajo, da povečana koncentracija homocisteina okvari žilni endotel in vpliva na nekatere faktorje koagulacije.41 Hiperhomocisteinemija je lahko huda, s plazemskimi koncentracijami homocisteina nad 100 ^mol/l, ali blaga do zmerna, s plazemskimi koncentracijami homociste-ina 15-100 ^mol/l. Prirojeni in pridobljeni vzroki zanjo se med seboj prepletajo. Hudo hiperhomocisteinemijo najdemo le pri prirojenem pomanjkanju cistation-^-sintaze ali MTHFR v homozigotni obliki, ki sta izjemno redki avtosomno recesivni bolezni in se kažeta z zgodnjimi trombemboličnimi zapleti in razvojni zaostankom. Blaga do zmerna hiperhomocisteinemija je najpogosteje posledica točkovne mutacije na mestu 677 v genu za MTHFR (zamenjava citozi-na za timin), ki vodi do nastanka encima z zmanjšano aktivnostjo. Pojavi se le pri ho-mozigotnih nosilcih polimorfizma MTHFR C667T ob sočasnem pridobljenem vzroku - pomanjkanju folne kisline/2 Ostali pridobljeni vzroki hiperhomocisteinemije so pomanjkanje vitaminov B12 in B6, kronična ledvična bolezen, hipotiroidizem, kronična vnetna črevesna bolezen in revmatoidni artritis.41 Hiperhomocisteinemija je prisotna pri 5-7 % splošne populacije. Homozigotne oblike pomanjkanja cistation-^-sintaze in MTHFR so zelo redke, prisotne pri pri manj kot 0,001 %, heterozigotne oblike pa pri 0,41,5 % populacije.4i Polimorfizem MTHFR C667T v homozigotni obliki je pogostejši in se v naši populaciji pojavlja pri 13 % oseb/3 Hiperhomocisteinemija in tveganje za VTE Hiperhomocisteinemija je prisotna pri 15 % bolnikov z VTE. Relativno tveganje za nastanek prve VTE znaša 2,5,44 tveganje za ponovitev VTE pa je zelo majhno, 0,9-kra-tno.i8'45 Nadomestno zdravljenje z vitamini B6, B12 in folno kislino učinkovito zmanjša raven serumskega homocisteina, vendar pa na ponovitve VTE ne vpliva/6 Polimorfizem MTHFR C667T v homozigotni obliki je pri bolnikih z VTE enako pogost kot v populaciji in ni jasno povezan s povečanim tveganjem za VTE/7 Laboratorijske metode določanja hiperh omocisteinemije Koncentracijo homocisteina v plazmi določamo z encimskoimunskimi metodami, polimorfizem MTHFR C667T pa z gensko analizo. Povečana koncentracija faktorja vili Prevalenca in pomen povečane koncentracije faktorja VIII Faktor VIII deluje kot kofaktor aktivnega faktorja IX pri aktivaciji faktorja X. Večina faktorja VIII se v krvi nahaja v obliki kompleksa s von Willebrandovim faktorjem. O povečani koncentraciji faktorja VIII govorimo, kadar le-ta presega 90. percentil koncentracije faktorja VIII v zdravi populaciji (> 150 % normale). Na koncentracijo faktorja VIII vplivajo starost, spol, nosečnost, akutne in kronične bolezni, vnetje, rak in posegi, odvisna pa je tudi od krvne skupine; osebe s krvno skupino 0 imajo namreč za 25-30 % manjšo koncentracijo faktorja VIII kot osebe z drugimi krvnimi skupinami.48 Opazno je tudi pojavljanje povečane koncentracije faktorja VIII znotraj družin, ki ga ni moč pojasniti le s krvno skupino,49'50 zato velja mnenje, da je povečana koncentracija faktorja VIII vsaj delno tudi genetsko pogojena. Opisali so polimorfizem gena za protein, ki posredno sodeluje pri razgradnji faktorja VIII in je povezan tako s povečano koncentracijo faktorja VIII kot tudi z večjim tveganjem za VTE." Domnevajo, da povečana koncentracija faktorja VIII povečuje tveganje za nastanek VTE predvsem preko povečane tvorbe trombina," možno pa je, da vpliva tudi na odzivnost na aktivirani protein C. V populaciji se povečana koncentracija faktorja VIII pojavlja v 11 %.53 Povečana koncentracija faktorja VIII in tveganje za VTE Povečano koncentracijo faktorja VIII odkrijemo pri okrog 25 % bolnikov z VTE." Tveganje za nastanek prve VTE je pri osebah s povečano koncentracijo faktorja VIII do 5-krat večje."'^ Podatki o tveganju za ponovitev VTE se precej razlikujejo: od 1,3-kratnega,i8 2,5-kratnega55 do 6-kratne-ga.56 Razlike so posledica različnih metod določanja faktorja VIII in prisotnosti številnih dejavnikov, ki vplivajo na njegovo pla-zemsko koncetracijo. Laboratorijske metode določanja faktorja VIII Metoda izbire je funkcijska, aktivnost faktorja VIII določimo z merjenjem razgradnje kromogenega substrata. Dostopne so tudi encimskoimunske metode za merjenje koncentracije faktorja VIII. Koagulacijske metode, ki jih uporabljamo za ugotavljanje zmanjšane aktivnosti faktorja VIII, za merjenje povečane aktivnosti tega faktorja niso primerne. Meritev opravimo vsaj 3 mesece po VTE, nikoli v času zdravljenja s kumarini, saj je lahko koncentracija faktorja VIII tedaj po-večana.57 Pri interpretaciji rezultatov moramo vedno upoštevati morebitno prisotnost dejavnikov, ki povečajo koncentracijo faktorja VIII. Diagnozo vedno potrdimo s ponovitvijo preiskave 12 mesecev po preboleli VTE.58 Povečana koncentracija faktorjev IX in XI PrevaLenca in pomen povečane koncentracije faktorjev IX in XI Koagulacijska faktorja IX in XI sta se-rinski proteazi intrinzične poti koagulacije, ki se aktivirata drug za drugim. Njuna aktivnost in koncentracija variirata med 50 in 150 % vrednosti normalne zmesne plazme. Povečani sta pri pri starejših ljudeh in ob uporabi oralnih kontraceptivov. O povečanih koncentracijah govorimo, kadar vrednosti presegajo 90. percentil: > 129 E/dL pri koncentraciji faktorja IX in > 120 E/dL pri koncentraciji faktorja XI. Tako povečane koncentracije lahko vodijo do pospešenega nastajanja trombina. V populaciji se pojavljajo v 10 %.59'60 Povečana koncentracija faktorjev IX in XI in tveganje za VTE Povečano koncentracijo faktorjev IX in XI odkrijemo pri okrog 20 % bolnikov z VTE. Relativno tveganje za nastanek prve VT je pri povečani koncentraciji faktorja IX 2,5, pri povečani koncentraciji faktorja XI pa 2,2.59'60 Tveganje za ponovitev bolezni je zelo majhno; pri povečani koncentraciji faktorja IX je 1,2-kratno, pri povečani koncentraciji faktorja XI pa 0,6-kratno.i8 Laboratorijske metode določanja faktorjev IX in XI Koncentracijo faktorjev IX in XI določimo z encimskoimunskimi metodami. Merimo lahko tudi aktivnost faktorjev z določanjem časa nastanka strdka. Povečana koncentracija fibrinogena PrevaLenca in pomen povečane koncentracije fibrinogena Fibrinogen je glikoprotein, iz katerega s pomočjo trombina ob koncu koagulacijske kaskade nastane fibrin. O povečani koncentraciji fibrinogena govorimo, kadar le-ta presega 95. percentil koncentracije fibrinogena v zdravi populaciji (> 4,5 g/L).®i Domnevajo, da je povečana koncentracija fibrinogena povezana z nastankom večjega in bolj trdnega strdka, ki je manj podvržen fibrinolizi. V populaciji se pojavlja v 5 %. Povečana koncentracija fibrinogena in tveganje za VTE Povečano koncentracijo fibrinogena odkrijemo pri okrog 3 % bolnikov z VTE.62 Relativno tveganje za nastanek prve VTE je pri povečani koncentraciji fibrinogena v celotni populaciji 2,8, pri starejših od 45 let pa kar 4,2.61,62 Tveganje za ponovitev VTE je majhno, 1,7-kratno.18 Laboratorijske metode doLočanja fibrinogena Koncentracijo fibrinogena merimo v ci-tratni plazmi z modificirano Claussovo metodo. Neodzivnost na aktivirani protein C, ki ni povezana s faktorjem v Leiden Prevalenca in pomen Aktivirani protein C deluje kot naravni zaviralec koagulacije. Nastajanje trombina zavira tako, da cepi aktivirana koagulacijska faktorja V in VIII. Kadar v in vitro pogojih z dodatkom aktiviranega proteina C plazmi ne izzovemo ustreznega podaljšanja časa strjevanja krvi, govorimo o neodzivnosti na aktivirani protein C. Neodzivnost na aktivirani protein C je lahko dedno pogojena ali pridobljena. Dedno pogojena neodzivnost na aktivirani protein C je v 95 % posledica prisotnosti faktorja V Leiden, v preostalih 5 % pa jo povzročajo druge mutacije v genu za faktor V (HR2 haplotip, FV Liverpool, FV Cambridge) in druge oblike trombofilije (pomanjkanje proteina S, mutacija v genu za protrombin). Pridobljeno neodzivnost na aktivirani protein C najdemo pri povečani koncentraciji faktorja VIII, prisotnosti lupusnih antikoagulantov, v nosečnosti, pri uporabnicah hormonske kontracepcije ali hormonskega nadomestnega zdravljenja in pri bolnikih s plazmocitomom/4 V populaciji se pojavlja pri do 10 % oseb/5 Tveganje za VTE Neodzivnost na aktivirani protein C, ki ni posledica faktorja V Leiden, je neodvisni dejavnik tveganja za VTE, ki je prisoten pri do 25 % bolnikov z VTE. Tveganje za prvo VTE povečuje za 2,5-krat, odvisno pa je od stopnje neodzivnosti.65 Podatkov o tveganju za ponovitev VTE ni. Laboratorijske metode za ugotavljanje neodzivnosti na aktivirani protein C Neodzivnost na aktivirani protein C ugotavljamo s pomočjo preiskave, ki temelji na aktiviranem parcialnem tromboplastinskem času z dodatkom aktiviranega proteina C in brez njega/6 Rezultate izražamo v obliki razmerja med obema časoma. Preiskava je dobro občutljiva, vendar za ugotavljanje prisotnosti faktorja V Leiden, ki je glavni vzrok za neodzivnost na aktivirani protein C, ni dovolj specifična. Krvne skupine Pomen in prevalenca krvnih skupin Gen za krvno skupino ABO kodira številne glikozil-transferaze, ki sodelujejo pri nastanku antigenov A in B. Ti antigeni ležijo na površini von Willebrandovega faktorja in upočasnjujejo njegovo razgradnjo. Von Wil-lebrandov faktor je glavni določitelj koncentracije faktorja VIII. Osebe s krvno skupino A, B ali AB imajo zato večjo koncentracijo von Willebrandovega faktorja in faktorja VIII kot osebe s krvno skupino O. Najverjetneje je to najpomembnejši razlog za povečano tveganje za VTE pri bolnikih s krvnimi skupinami A, B in AB/7^9 V Sloveniji ima krvno skupino A približno 40 %, O 38 %, B 15 % in AB 7 % ljudi. Krvne skupine in tveganje za VTE Že v šestdesetih letih prejšnjega stoletja so poročali, da je pojavnost VTE manjša pri osebah s krvno skupino O/0 Bolniki s krvno skupino A ali B imajo približno 1,8-krat, bolniki s krvno skupino AB pa do 2,7-krat večje tveganje za prvo VTE kot bolniki s krvno skupino O/7'7i Pogostnost ponovitev VTE pa se med bolniki s krvno skupino O in tistimi s krvno skupino A, B ali AB ne raz-likuje.72 izbor testov trombofilije pri bolniku z vTE Nastanek VTE najpogosteje povzroči več sočasno prisotnih sprožilnih dejavnikov. Posamezni sprožilni dejavnik na obliko zdravljenja VTE ne vpliva, določa pa trajanje zdravljenja. Glavni cilj podaljšanega zdravljenja je preprečevanje ponovitev VTE. Tveganje za ponovitev bolezni je najmanjše ob prisotnosti prehodnih sprožilnih dejavnikov (okoli 8 % v 2 letih po zaključku zdravljenja), največje pa pri bolnikih z idi-opatsko VTE, za katero jasnega sprožilne-ga dejavnika ne najdemo (20 % v 2 letih po zaključku zdravljenja).13 Kar pri polovici bolnikov z VTE je prisotna ena izmed oblik trombofilije, vendar večina oblik na ponovitev VTE bistveno ne vpliva (Tabela 2). Določanje vseh oblik trombofilije pri vseh bolnikih z VTE zato ni ne strokovno, ne finančno upravičeno. Posamezne oblike trombofilije je smiselno določati le v primerih, ko lahko vplivajo na trajanje zdravljenja ali na ukrepe pri stanjih, ko je tveganje za ponovitev VTE povečano (npr.: nosečnost, uporaba hormonskih kontraceptivov, nadomestnega hormonskega zdravljenja, velike operacije, poškodbe z imobilizacijo). V slovenskem prostoru se trenutno opravljajo številni testi trombofilije, pogosto povsem neselektivno in brez premisleka, ali in kako vplivajo na obravnavo bolnika. Rutinsko testiranje za trombofilijo pri bolnikih s prebolelo VTE večina strokovnjakov odsvetuje, nekateri pa izpostavijo posamezne skupine bolnikov, pri katerih so lahko posamezni testi trombofilije v pomoč pri odločitvah o nadaljnjem zdravljenju.^-79 V nadaljevanju predstavljamo skupine bolnikov, pri katerih je smiselno opraviti izbrane teste trombofilije (Tabela 3). Ženske v rodnem obdobju z idiopatsko VTE Pri ženskah, ki so utrpele idiopatsko VTE in v prihodnosti načrtujejo nosečnost, lahko Tabela 2: Razvrstitev prirojenih in pridobljenih obLik trombemboLije (VTE). opravimo določitev antitrombina, proteina C in S, genetiko za ugotavljanje faktorja V Leiden in protrombina G20210A ter anti-fosfolipidnih protiteles. Zaradi povečanega tveganja za ponovitev VTE ob potrjenem pomanjkanju antitrombina, proteina C ali S, bosta morala biti nosečnost in poporodno obdobje skrbno nadzorovana, uporaba oralnih kontraceptivov pa odsvetovana. Podobno velja tudi za odkritje nosilk faktorja V Leiden in/ali protrombina G20210A, saj se pri njih tveganje za VTE ob uporabi oralnih kontraceptivov poveča za 15-krat, v nosečnosti pa celo 35-krat/4 Potrditev antifosfo-lipidnega sindroma bo vplivala na trajanje zdravljenja VTE in na vodenje teh bolnic v nosečnosti in v poporodnem obdobju. MLajši moški z idiopatsko VTE Pri moških, mlajših od 50 let, z idiopat-sko VTE določimo antifosfolipidna protitelesa. V primeru izpolnjenih kliničnih in laboratorijskih meril za APS se bomo odločili za trajno antikoagulacijsko zdravljenje. MLajši bolniki z idiopatsko vensko trombozo na neobičajnem mestu Kot neobičajna mesta venske tromboze pojmujemo trombozo možganskih venskih sinusov ter trombozo vene porte, vene lie-nalis, mezenteričnih ven ter hepatalnih ven. Na teh mestih se VT pojavlja redko, vendar lahko ogrozi življenje. Pri bolnikih, mlajših od 50 let, z idiopatsko vensko trombozo na neobičajnem mestu določimo antitrombin, protein C in S, genetiko za ugotavljanje faktorja V Leiden in protrombina G20210A trombofilije glede na tveganje za ponovitev venske Tveganje za Oblika trombofilije Relativno tveganje ponovitev VTE Veliko Antifosfolipidna protitelesa 2-6 Kombinacija faktor V Leiden in Protrombin G20210A 1,4-5,0 Majhno Pomanjkanje antitrombina 1,9-2,6 Pomanjkanje proteina C 1,4-1,8 Pomanjkanje proteina S 1,4 F V Leiden 1,4 Protrombin G20210A 0,7-1,7 Povečana koncentracija fibrinogena 1,7 Povečana koncentracija F Viii 1,3-6 Zelo majhno Hiperhomocisteinemija 0,9 Povečana koncentracija faktorja iX in Xi 0,6-1,2 ter antifosfolipidna protitelesa. Potrditev pomanjkanja antitrombina, proteina C ali S, antifosfolipidnega sindroma ali odkritje homozigotnih nosilcev ali nosilcev kombinacije heterozigotnih oblik polimorfizmov faktorja V Leiden in protrombina G20210A ali drugih kombinacij trombofilij bo pomagala pri odločitvi v prid trajnega antikoagu-lacijskega zdravljenja. Pri mlajših bolnikih z vensko trombozo na neobičajnem mestu ne smemo pozabiti na možnost pridobljene trombofilije v sklopu nekaterih hematoloških bolezni, zato moramo v skladu s klinično sliko opraviti dodatne usmerjene preiskave (genetska analiza za ugotavljanje mutacije gena JAK2 V617F ter preiskave za ugotavljanje prisotnosti klona paroksizmal-ne nočne hemoglobinurije). MLajši boLniki s ponovitvijo idiopatske VTE Teste za ugotavljanje pomanjkanja an-titrombina, proteina C in S ter genetiko za ugotavljanje faktorja V Leiden in protrom-bina G20210A lahko opravimo tudi pri bolnikih, ki so utrpeli 2 ali več idiopatskih VTE pred 50. letom, zlasti, če so se idiopatske VTE pojavljale tudi pri sorodnikih prvega kolena. Običajno pri bolnikih s ponovitvijo idiopatske VTE opravimo tudi določitev antifosfolipidnih protiteles. Rezultat teh testiranj sicer na trajanje zdravljenja, ki je pri ponovitvi idiopatske VTE praviloma trajno, ne bo vplival, pomemben pa bo pri odločitvah ob morebitnem nastopu zadržkov za nadaljevanje zdravljenja in pri genetskem svetovanju. Osebe brez simptomov Pri sorodnikih bolnikov z VTE testov za trombofilijo rutinsko ne opravljamo. Posamezne oblike trombofilije je smiselno določiti le pri ženskah, ki želijo zanositi ali uporabljati oralne kontraceptive in izhajajo iz družin, v katerih se pojavlja pomanjkanje antitrombina, proteina C ali S, oziroma so potomke nosilcev homozigotnih mutacij faktorja V Leiden ali protrombina G20210A. Letno tveganje za VTE je pri družinskem pomanjkanju antitrombina, proteina C ali S ob uporabi oralnih kontraceptivov in v nosečnosti ocenjeno na okoli 4 %. Pri nosilkah faktorja V Leiden ali protrombina G20210A Tabela 3: Določanje posameznih obLik prirojene in pridobljene trombofilije pri bolnikih z vensko trombemboLijo. (VTE-venska trombemboLija, VT-venska tromboza, MTHFR- metiltetrahidrofolat reduktaza, PNH-paroksizmalna nočna hemoglobinurija). oblika trombofilije Ženske v rodnem obdobju z idiopatsko vTE Moški, mlajši od 50 let, z idiopatsko vTE osebe, mlajše od 50 let, z idiopatsko vT na neobičajnem mestu osebe, mlajše od 50 let, s ponovitvijo idiopatske vTE Pomanjkanje antitrombina, proteina C in S DA ne DA DA Faktor V Leiden in protrombin G20210A DA ne DA DA Antifosfolipidna protitelesa DA DA DA DA Hiperhomocisteinemija ne ne ne ne MTHFR C667T ne ne ne ne Povečana koncentracija faktorja VIII ne ne ne ne Povečana koncentracija faktorja iX in XI ne ne ne ne Povečana koncentracija fibrinogena ne ne ne ne Neodzivnost na aktivirani protein C, ki ni povezana s F V Leiden ne ne ne ne Krvna skupina A, B ali AB ne ne ne ne Pridobljena trombofilija v sklopu hematološke bolezni ne ne JAK2 V617F Won PNH ne pa je letno tveganje za VTE ob uporabi oral-nih kontraceptivov okoli 0,5 %, v nosečnosti pa 2-16 %.74 Testov za določitev ostalih oblik trombo-filije v teh skupinah bolnikov ne izvajamo, saj je njihova napovedna vrednost za ponovitev VTE premajhna, na odločitev o trajanju zdravljenja pa ne vplivajo. Pri bolnikih, ki ne sodijo v nobeno od navedenih skupin (predvsem bolniki z jasnimi sprožilnimi dejavniki za VTE), testov za ugotavljanje prisotnosti prirojenih ali pridobljenih oblik trombofilije ne izvajamo. Izbor laboratorija in časa odvzema krvi Večina preiskav trombofilije zahteva precejšnje znanje in izurjenost, predvsem pri interpretaciji rezultatov, zato so za izvajanje teh preiskav najprimernejši specializirani koagulacijski laboratoriji.®0 Slaba medlabo-ratorijska primerljivost nekaterih preiskav je dodaten argument za to, da se te preiskave omejijo na manjše število laboratorijev. Ne glede na to, v katerem laboratoriju so preiskave opravljene, pa je potrebno dobro sodelovanje med laboratorijskim osebjem in zdravniki, saj se na ta način bistveno zmanjša delež lažno pozitivnih rezultatov. Pri večini bolnikov opravimo preiskave po ukinitvi antikoagulacijskega zdravljenja. Pri tem naj od ukinitve zdravljenja do odvzema krvi minejo vsaj 4 tedni, da učinek antikoagulacijskih zdravil povsem izzveni. Izjemoma se lahko odločimo za določanje trombofilije že v času akutne VTE oziroma v času, ko antikoagulacijsko zdravljenje še traja, vendar moramo to upoštevati pri interpretaciji rezultatov. Ob akutni VTE so vrednosti naravnih antikoagulantov zmanjšane, zato jih tedaj praviloma ne določamo. Kasneje, v kroničnem obdobju bolezni, izjemoma ob zdravljenju s kumarini določimo antitrombin, ob zdravljenju s heparini pa proteina C in S, če je res prisoten močan sum na njuno pomanjkanje. Določanju an-tifosfolipidnih protiteles se izogibamo prvih 12 tednov po akutni VTE, saj so v tem obdobju lahko rezultati lažno pozitivni. Kasneje lahko antikardiolipinska protitelesa in protitelesa proti ^2-glikoproteinu I določimo kadarkoli, lupusne antikoagulante pa šele po ukinitvi antikoagulacijskega zdravljenja. Na genetske preiskave za določanje polimorfiz-mov v genih za faktor V in za protrombin obdobje VTE in način zdravljenja ne vplivata, zato jih opravimo kadar koli. Zaključek Izvedba široke palete testov za ugotavljanje prirojene ali pridobljene trombofilije pri večini bolnikov z VTE ni ne strokovno ne finančno upravičena. Določene teste trombofilije opravimo pri izbranih bolnikih le v primeru, da bo njihov rezultat vplival na odločitev o trajanju zdravljenja ali na druge ukrepe za preprečevanje ponovitve bolezni. Literatura 1. Goldhaber SZ, Bounameaux H. Pulmonary embolism and deep vein thrombosis. Lancet 2012; 379: 1835-46. 2. Kearon C, Akl EA, Comerota AJ, Prandoni P, Bounameaux H, Goldhaber S, et al. Antithrombotic therapy for VTE disease: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest 2012; 141: 419S--94S. 3. Rosendaal FR. Risk factors for venous thrombotic disease. Thromb Haemost 1999; 82: 610-9. 4. Franco RF, Reitsma PH. Genetic risk factors for venous thrombosis. Hum Genet 2001; 109: 369-84. 5. Rosendaal FR. Genetics of venous thrombosis. J Thromb Haemost 2009; 7: 301-4. 6. Bertina RM. Molecular risk factors for thrombosis. Thromb Haemost 1999; 82: 601-9. 7. Simioni P, Tormene D, Spiezia L, Tognin G, Ros-setto V, Radu C, Prandoni P. Inherited throm-bophilia and venous thromboembolism. Semin Thromb Hemost 2006; 32: 700-8. 8. Tait RC, Walker ID, Perry DJ, Islam SI, Daly ME, McCall F, et al. Prevalence of antithrombin deficiency in the healthy population. Br J Haematol 1994; 87: 106-12. 9. Lane DA, Bayston T, Olds RJ, Fitches AC, Cooper DN, Millar DS, et al. Antithrombin mutation database: 2nd (1997) update. For the Plasma Coagulation Inhibitors Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost 1997; 77: 197-211. 10. Martinelli I, Mannucci PM, De Stefano V, Taioli E, Rossi V, Crosti F, et al. Different risks of thrombosis in four coagulation defects associated with inherited thrombophilia: a study of 150 families. Blood 1998; 92: 2353-8. 11. Koster T, Rosendaal FR, Briet E, van der Meer FJ, Colly LP, Trienekens PH, et al. Protein C deficiency in a controlled series of unselected outpatients: an infrequent but clear risk factor for venous thrombosis (Leiden Thrombophilia Study). Blood 1995; 85: 2756-61. 12. De Stefano V, Simioni P, Rossi E, Tormene D, Za T, Pagnan A, et al. The risk of recurrent venous thromboembolism in patients with inherited deficiency of natural anticoagulants antithrombin, protein C and protein S. Haematologica 2006; 91: 695-8. 13. Baglin T, Luddington R, Brown K, Baglin C. Incidence of recurrent venous thromboembolism in relation to clinical and thrombophilic risk factors: prospective cohort study. Lancet 2003; 362: 523-6. 14. Patnaik MM, Moll S. Inherited antithrombin deficiency: a review. Haemophilia 2008; 14: 1229-39. 15. Ungerstedt JS, Schulman S, Egberg N, Antovic J, Blombäck N. Discrepancy between antithrombin activity methods revealed in Antithrombin Stockholm: do factor Xa-based methods overestimate antithrombin activity in some patients? Blood 2002; 99: 2271-2. 16. Price VE, Ledingham DL, Krümpel A, Chan AK. Diagnosis and management of neonatal purpura fulminans. Semin Fetal Neonatal Med 2011; 16: 318-22. 17. Miletich J, Sherman L, Broze G Jr. Absence of thrombosis in subjects with heterozygous protein C deficiency. N Engl J Med 1987; 317: 991-6. 18. Christiansen SC, Cannegieter SC, Koster T, Van-denbroucke JP, Rosendaal FR. Thrombophilia, clinical factors, and recurrent venous thrombotic events. JAMA 2005; 293: 2352-61. 19. Johnson NV, Khor B, Van Cott EM. Advances in laboratory testing for thrombophilia. Am J Hema-tol 2012; 87: 108-12. 20. Dahlbäck B. Inhibition of protein Ca cofactor function of human and bovine protein S by C4b--binding protein. J Biol Chem 1986; 261: 12022-7. 21. Beauchamp NJ, Dykes AC, Parikh N, Campbell Tait R, Daly ME. The prevalence of, and molecular defects underlying, inherited protein S deficiency in the general population. Br J Haematol 2004; 125: 647-54. 22. Simmonds RE, Ireland H, Lane DA, Zöller B, Garcia de Frutos P, Dahlbäck B. Clarification of the risk for venous thrombosis associated with hereditary protein S deficiency by investigation of a large kindred with a characterized gene defect. Ann Intern Med 1998; 128: 8-14. 23. Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369: 64-7. 24. Dahlbäck B, Carlsson M, Svensson PJ. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: Prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1004-8. 25. Rees DC. The population genetics of factor V Leiden (Arg506Gln). Br J Haematol 1996; 95: 579-86. 26. Rosendaal FR, Koster T, Vandenbroucke JP, Reit-sma PH. High risk of thrombosis in patients homozygous for factor V Leiden (activated protein C resistance). Blood 1995; 85: 1504-8. 27. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3'-un-translated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996; 88: 3698-703. 28. Castoldi E, Simioni P, Tormene D, Thomassen MC, Spiezia L, Gavasso S, et al. Differential effects of high prothrombin levels on thrombin generation depending on the cause of the hyperprothrom-binemia. J Thromb Haemost 2007; 5: 971-9. 29. Rosendaal FR, Doggen CJ, Zivelin A, Arruda VR, Aiach M, Siscovick DS, et al. Geographic distribution of the 20210 G to A prothrombin variant. Thromb Haemost 1998; 79: 706-8. 30. Tripodi A, de Groot PG, Pengo V. Antiphospholi-pid syndrome: laboratory detection, mechanisms of action and treatment. J Intern Med 2011; 270: 110-22. 31. Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, Cervera R, et al. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost 2006; 4: 295-306. 32. Biggioggero M, Meroni PL. The geoepidemiology of the antiphospholipid antibody syndrome. Autoimmun Rev 2010; 9: 299-304. 33. Roldan V, Lecumberri R, Muñoz-Torrero JF, Vicente V, Rocha E, Brenner B, et al. RIETE Inve-stigators.Thrombophilia testing in patients with venous thromboembolism. Findings from the RIETE registry. Thromb Res 2009; 124: 174-7. 34. Farmer-Boatwright MK, Roubey RA. Venous thrombosis in the antiphospholipid syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2009; 29: 321-5. 35. Galli M, Luciani D, Bertolini G, Barbui T. Lupus anticoagulants are stronger risk factors for thrombosis than anticardiolipin antibodies in the an-tiphospholipid syndrome: a systematic review of the literature. Blood 2003; 101: 1827-32. 36. Galli M, Luciani D, Bertolini G, Barbui T. Anti-beta 2-glycoprotein I, antiprothrombin antibodies, and the risk of thrombosis in the antiphospholipid syndrome. Blood 2003; 102: 2717-23. 37. Pengo V, Ruffatti A, Legnani C, Gresele P, Barcel-lona D, Erba N, et al. Clinical course of high-risk patients diagnosed with antiphospholipid syndrome. J Thromb Haemost 2010; 8: 237-42. 38. Middeldorp S, van Hylckama Vlieg A.Does thrombophilia testing help in the clinical management of patients? Br J Haematol 2008; 143: 321-35. 39. Pengo V, Tripodi A, Reber G, Rand JH, Ortel TL, Galli M, et al. Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the International Society on Thrombosis and Haemo-stasis. J Thromb Haemost 2009; 7: 1737-40. 40. Lakos G, Favaloro EJ, Harris EN, Meroni PL, Tincani A, Wong RC, et al. International consensus guidelines on anticardiolipin and anti-ß2-glycoprotein I testing: report from the 13th International Congress on Antiphospholipid Antibodies. Arthritis Rheum 2012; 64: 1-10. 41. Cattaneo M. Hyperhomocysteinemia, atherosclerosis and thrombosis. Thromb Haemost 1999;81:165-76. 42. Jacques PF, Bostom AG, Williams RR, Ellison RC, Eckfeld JH, Rosenberg IH, et al. Relation between folate status, a common mutation in methylente-trahydrofolate reductase and plasma homocystei-ne concentrations. Circulation 1996; 93: 7-9. 43. Bedenčič M, Božič M, Peternel P, Stegnar M. Major and potential prothrombotic genotypes in patients with venous thromboembolism and in healthy subjects in Slovenia. Patophysiol Haemost Thromb 2008; 36: 58-63. 44. den Heijer M, Rosendaal FR, Blom HJ, Gerrits WB, Bos GM. Hyperhomocysteinemia and venous thrombosis: a meta-analysis.Thromb Haemost 1998; 80: 874-7. 45. Eichinger S, Stümpflen A, Hirschl M, Bialonczyk C, Herkner K, Stain M, et al. Hyperhomocysteine-mia is a risk factor of recurrent venous thrombo-embolism. Thromb Haemost 1998; 80: 566-9. 46. den Heijer M, Willems HP, Blom HJ, Gerrits WB, Cattaneo M, Eichinger S et al. Homocysteine lowering by B vitamins and the secondary prevention of deep vein thrombosis and pulmonary embolism: A randomized, placebo-controlled, double-blind trial. Blood 2007; 109: 139-144. 47. Naess IA, Christiansen SC, Romundstad PR, Cannegieter SC, Blom HJ, Rosendaal FR, et al. Prospective study of homocysteine and MTHFR 677TT genotype and risk for venous thrombosis in a general population—results from the HUNT 2 study. Br J Haematol 2008; 141: 529-35. 48. Terraube V, O'Donnell JS, Jenkins PV. Factor VIII and von Willebrand factor interaction: biological, clinical and therapeutic importance. Haemophilia 2010; 16: 3-13. 49. Kamphuisen PW, Lensen R, Houwing-Duisterma-at JJ, Eikenboom JC, Harvey M, Bertina RM, et al. Heritability of elevated factor VIII antigen levels in factor V Leiden families with thrombophilia. Br J Haematol 2000; 109: 519-22. 50. Bank I, Libourel EJ, Middeldorp S, Hamulyak K, van Pampus EC, Koopman MM, et al. Elevated levels of FVIII:C within families are associated with an increased risk for venous and arterial thrombosis. J Thromb Haemost 2005; 3: 79-84. 51. Vormittag R, Bencur P, Ay C, Tengler T, Vukovich T, Quehenberger P, et al. Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 polymorphism 663 C > T affects clotting factor VIII activity and increases the risk of venous thromboembolism. J Thromb Haemost 2007; 5: 497-502. 52. Ryland JK, Lawrie AS, Mackie IJ, Machin SJ. Persistent high factor VIII activity leading to increased thrombin generation - a prospective cohort study. Thromb Res 2012; 129: 447-52. 53. Koster T, Blann AD, Briet E, Vandenbroucke JP, Rosendaal FR. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet 1995; 345: 152-5. 54. Kraaijenhagen RA, Anker PS, Koopman MM, Re-itsma PH, Prins MH, van den Ende A, et al. High plasma concentration of factor VIIIc is a major risk factor for venous thromboembolism. Thromb Haemost 2000; 83: 5-9. 55. Cosmi B, Legnani C, Cini M, Favaretto E, Pala-reti G. D-dimer and factor VIII are independent risk factors for recurrence after anticoagulation withdrawal for a first idiopathic deep vein thrombosis. Thromb Res 2008; 122: 610-7. 56. Kyrle PA, Minar E, Hirschl M, Bialonczyk C, Stain M, Schneider B, et al. High plasma levels of factor VIII and the risk of recurrent venous thromboembolism. N Engl J Med 2000; 343: 457-62. 57. Passamonti SM, Bucciarelli P, Bader R, Martinelli I. Influence of anticoagulant therapy with vitamin K antagonists on plasma levels of coagulation factor VIII. Thromb Res 2010; 126: 243-5. 58. Barcat D, Vergnes C, Constans J, Boulon C, Conri C. When to measure factors VIII:C and XI after an acute venous thromboembolic event? J Thromb Haemost 2006; 4: 1631-2. 59. van Hylckama Vlieg A, van der Linden IK, Bertina RM, Rosendaal FR. High levels of factor IX increase the risk of venous thrombosis. Blood 2000; 95: 3678-82. 60. Meijers JC, Tekelenburg WL, Bouma BN, Bertina RM, Rosendaal FR. High levels of coagulation factor XI as a risk factor for venous thrombosis. N Engl J Med 2000; 342: 696-701. 61. van Hylckama Vlieg A, Rosendaal FR. High levels of fibrinogen are associated with the risk of deep venous thrombosis mainly in the elderly. J Thromb Haemost 2003; 1: 2677-8. 62. Koster T, Rosendaal FR, Reitsma PH, van der Ve-lden PA, Briet E, Vandenbroucke JP. Factor VII and fibrinogen levels as risk factors for venous thrombosis. Acase-control study of plasma levels and DNA polymorphisms—the Leiden Thrombophilia Study (LETS). Thromb Haemost 1994; 71: 719-22. 63. van Hylckama Vlieg A, Rosendaal FR. High levels of fibrinogen are associated with the risk of deep venous thrombosis mainly in the elderly. J Thromb Haemost 2003; 1: 2677-8. 64. Castoldi E, Rosing J. APC resistance: biological basis and acquired influences. J Thromb Haemost 2010; 8: 445-53. 65. de Visser MC, Rosendaal FR, Bertina RM. A reduced sensitivity for activated protein C in the absence of factor V Leiden increases the risk of venous thrombosis. Blood 1999; 93: 1271-6. 66. Dahlback B, Carlsson M and Svensson PJ. Familial thrombophilia due to a previously unrecognized mechanism characterized by poor anticoagulant response to activated protein C: prediction of a cofactor to activated protein C. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90: 1004-8. 67. Wiggins KL, Smith NL, Glazer NL, Rosendaal FR, Heckbert SR, Psaty BM, et al. ABO genotype and risk of thrombotic events and hemorrhagic stroke. J Thromb Haemost 2009; 7: 263-9. 68. Kamphuisen PW, Eikenboom JC,Bertina RM. Elevated factor VIII levels and the risk of thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2001; 21: 731-8. 69. O'Donnell J, Boulton FE, Manning RA, Laffan MA. Amount of H antigen expressed on circulating von Willebrand factor is modified by ABO blood group genotype and is a major determinant of plasma von Willebrand factor antigen levels. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 335-41. 70. Jick H, Slone D, Westerholm B, Inman WH, Ves-sey MP, Shapiro S, et al. Venous thromboembolic disease and ABO blood type. A cooperative study. Lancet 1969; 1: 539-42. 71. Morelli VM, De Visser MC, Vos HL, Bertina RM, Rosendaal FR. ABO blood group genotypes and the risk of venous thrombosis: effect of factor V Leiden. J Thromb Haemost 2005; 3: 183-5. 72. Tirado I, Mateo J, Soria JM, Oliver A, Martinez-Sanchez E, Vallve C, et al. The ABO blood group genotype and factor VIII levels as independent risk factors for venous thromboembolism. Thromb Haemost 2005; 93: 468-74. 73. Kearon C. Influence of hereditary or acquired thrombophilias on the treatment of venous thromboembolism. Curr Opin Hematol 2012; 19: 363-70. 74. Middeldorp S. Is thrombophilia testing useful? Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2011; 2011: 150-5. 75. Dalen JE. Should patients with venous thrombo-embolism be screened for thrombophilia? Am J Med 2008; 121: 458-63. 76. Merriman L, Greaves M. Testing for thrombophilia: an evidence-based approach. Postgrad Med J 2006; 82: 699-704. 77. Heit JA. Thrombophilia: common questions on laboratory assessment and management. Hematolo-gy Am Soc Hematol Educ Program 2007: 127-35. 78. Ho WK, Hankey GJ, Eikelboom JW. Should adult patients be routinely tested for heritable throm-bophilia after an episode of venous thromboem-bolism? Med J Aust 2011; 195: 139-42. 79. Baglin T, Gray E, Greaves M, Hunt BJ, Keeling D, Machin S, et al. British Committee for Standards in Haematology. Clinical guidelines for testing for heritable thrombophilia. Br J Haematol 2010; 149: 209-20. 80. Tripodi A, Mannucci PM. Laboratory investigation of thrombophilia. Clinical Chemistry 2001; 47: 1597-606.