421 STROKOVNI ČLANEK Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije Avtorske pravice (c) 2024 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije The platelet antibodies testing in the diagnostics of immune thrombocytopenia Maja Grundner,1 Primož Rožman,1 Barbara Skopec2 Izvleček Imunska trombocitopenija je avtoimunska bolezen, za katero sta značilna povečana razgradnja in zmanjšano nastajanje trombocitov, ob padcu njihovega števila pa še zvečana nagnjenost h krvavitvi. Nastanek bolezni je povezan s tvorbo avto- protiteles proti trombocitom in megakariocitom, a tudi s celično posredovano imunostjo. Za bolezen so značilne krvavitve v kožo in sluznice, ki se kažejo kot hematomi, purpure, petehije ter druge krvavitve. Ker je za ustrezno zdravljenje nujno hitro postaviti pravilno diagnozo, običajno pa ni na voljo specifičnega laboratorijskega označevalca, uporabimo navadno postopek izključevanja drugih možnih vzrokov za izolirano trombocitopenijo. V pomoč pri diagnosticiranju nam je lahko tudi laboratorijska določitev trombocitnih avtoprotiteles v krvi bolnika, za katero je na voljo že kar nekaj metod. Članek obravnava imunohematološke metode za določanje in specifikacijo trombocitnih avtoprotiteles in klinično pomembnost teh preiskav. Abstract An autoimmune disorder - immune thrombocytopenia - is characterized by low platelet counts and increased bleeding tendency. The development of autoantibodies against megakaryocytes and platelets, together with cell-mediated immu- nity, are linked to the disease’s development. Clinically, immune thrombocytopenia is typified by bleeding into the skin and the mucous membranes, which can appear as purpura, petechiae, haematomas, bleeding from mucosal membranes, and other types of haemorrhage. Since a timely and precise diagnosis is necessary for appropriate treatment, and since there is currently no specific diagnostic laboratory test marker, the diagnosis is frequently established by excluding other possible causes for isolated thrombocytopenia. The laboratory measurement of platelet autoantibodies in the patient’s blood can be a useful aid in the diagnostics of immune thrombocytopenia, for which numerous techniques exist. The man- uscript covers immunohaematological techniques for identifying and characterizing platelet autoantibodies as well as the practical applications of these assays. Zdravniški VestnikSlovenia Medical Journal 1 Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, Ljubljana, Slovenija 2 Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Ljubljana, Slovenija Korespondenca / Correspondence: Maja Grundner, e: maja.grundner@ztm.si Ključne besede: imunska trombocitopenija; trombocitni membranski glikoproteini; trombocitna avtoprotitelesa; specifikacija trombocitnih avtoprotiteles; Luminex Key words: immune thrombocytopenia; platelet membrane glycoproteins; platelet autoantibodies; autoantibodies specification; Luminex Prispelo / Received: 21. 5. 2024 | Sprejeto / Accepted: 29. 9. 2024 Citirajte kot/Cite as: Grundner M, Rožman P, Skopec B. Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije. Zdrav Vestn. 2024;93(11–12):421–7. DOI: https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3546 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn.3546 doi 21.5.2024 date-received 29.9.2024 date-accepted Immunology, serology, transplantation Imunologija, serologija, transplantacija discipline Professional article Strokovni članek article-type The platelet antibodies testing in the diagnos- tics of immune thrombocytopenia Določanje trombocitnih protiteles pri diagnostici- ranju imunske trombocitopenije article-title The platelet antibodies testing in the diagnos- tics of immune thrombocytopenia Določanje trombocitnih protiteles pri diagnostici- ranju imunske trombocitopenije alt-title immune thrombocytopenia, platelet mem- brane glycoproteins, platelet autoantibodies, autoantibodies specification, Luminex imunska trombocitopenija, trombocitni mem- branski glikoproteini, trombocitna avtoprotitele- sa, specifikacija trombocitnih avtoprotiteles, Luminex kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2024 93 11 12 421 427 name surname aff email Maja Grundner 1 maja.grundner@ztm.si name surname aff Primož Rožman 1 Barbara Skopec 2 eng slo aff-id Slovenian Institute for Transfusion Medicine, Ljubljana, Slovenia Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, Ljubljana, Slovenija 1 Department of Haematology, Division of Internal Medicine, University Medical Centre Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Ljubljana, Slovenija 2 422 IMUNOLOGIJA, SEROLOGIJA, TRANSPLANTACIJA Zdrav Vestn | November – december 2024 | Letnik 93 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3546 1 Uvod Imunska trombocitopenija (ITP) je avtoimunska bolezen, za katero je značilno zmanjšano število trom- bocitov (Tr) (< 100 x 109/L) in s tem povezano povečano tveganje za krvavitve. ITP je posledica imunske razgra- dnje sicer zdravih Tr, ki jo povzročijo proti Tr usmer- jena avtoprotitelesa (aPt) ali imunske celice T. Hkrati je lahko v kostnem mozgu zmanjšano nastajanje Tr iz megakariocitov. Bolezen je najpogosteje idiopatska in nastane spontano, kar je primarna oblika ITP, ali pa se pojavi po virusnih in drugih kroničnih okužbah (npr. bakterija Helicobacter pylori, virus HIV – virus humane imunske pomanjkljivosti, virus HCV – virus hepatitisa C), malignih boleznih (npr. adenokarcinom, limfom), po avtoimunskih boleznih (npr. sistemski eritematozni lupus, avtoimunski hepatitis, bolezni ščitnice itd.) ter po jemanju številnih zdravil. V vseh teh primerih govo- rimo o sekundarni obliki ITP (1,2). Za ustrezno zdravljenje ITP je ključnega pomena pravilna in pravočasna postavitev diagnoze. Bolnikovo število Tr mora biti manj kot 100 x 109/L, trombocito- penija v njegovi krvni sliki pa kot izolirana motnja. Za postavitev diagnoze se v praksi po večini še vedno upo- rablja načelo izključevanja, kar pomeni, da je najprej potrebno izključiti vse ostale možne vzroke tromboci- topenije, kot so pridobljene in prirojene motnje (npr. von Willebrandova bolezen tipa 2B, metabolne motnje itd.) ter različni imunski (alergije, posttransfuzijska purpura, pri novorojenčkih tudi fetalna aloimunska ITP itd.) in neimunski vzroki (hepatomegalija in sple- nomegalija, AIDS – sindrom pridobljene imunske po- manjkljivosti, tularemija itd.) (1,3). Glede na to, da je ITP avtoimunska bolezen, je smi- selno preveriti tudi prisotnost določenih aPt, ki so po- sledica imunskega odziva (4). Za določitev prisotnosti Tr protiteles (Pt) obstaja vrsta preiskav, ki se med seboj močno razlikujejo predvsem po občutljivosti, specifič- nosti in zahtevnosti izvedbe (5). 2 Trombocitna protitelesa in imunska trombocitopenija V trombocitni membrani so poleg različnih, povsod prisotnih molekul tudi različne trombocitno-specifične molekule, med katerimi so tudi glikoproteini s števil- nimi trombocitnospecifičnimi bialelnimi antigeni HPA (angl. human platelet antigens) (6,7). Ob že omenjenih različnih vzrokih se lahko proti različnim antigenom membrane tvorijo Pt, ki so klinično pomembna pri šte- vilnih imunskih boleznih (8). HPA antigeni se nahajajo na glikoproteinih GPIIb, GPIIIa, GPIbα, GPIbβ, GPIa in proteinu CD109, ki se združujejo v komplekse (Slika 1). Glikoproteinski Slika 1: Shematski prikaz dela trombocitne membrane. Slika prikazuje glikoproteine in CD109 z nekaterimi bialelnimi polimorfnimi antigeni HPA, ki so del membrane trombocita. Prirejeno po Curtis B., et al., 2014 (8). 423 STROKOVNI ČLANEK Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije kompleks GPIIb/IIIa je eden od najbolj imunogenih, verjetno tudi zaradi dejstva, da je na površini Tr kar okoli 80.000 teh molekul. Trombociti izražajo tudi mo- lekule CD109, GPIV (CD36) in GPVI, ki so lahko tarče milejših oblik ITP (8). Večina bolnikov z ITP ima Pt, usmerjena proti glikoproteinskemu kompleksu GPIIb/ IIIa (v 60–80 % primerov), v 50 % pa proti komplek- su GPIb/IX/V, pri čemer imajo bolniki z ITP navadno protitelesa razreda IgG, ki so večinoma usmerjena proti obema omenjenima glikoproteinoma, v 10–40 % pa le proti enemu. Redkeje so tarče tudi GPIa/IIa, GPVI ali GPIV (1,9). Trombociti, na katerih so vezana aPt, postanejo raz- poznavni za fagocitozno razgradnjo v vranici in jetrih, ista aPt pa lahko sprožijo tudi s komplementom posre- dovano lizo Tr preko klasične poti aktiviranja komple- menta. Obstajajo pa še drugi mehanizmi uničevanja Tr z aPt, kot sta npr. sprožitev preoblikovanja glikanskega dela glikoproteinov na površini Tr ali sprožitev apopto- ze Tr. Trombocitna aPt se lahko vežejo tudi na mega- kariocite v kostnem mozgu, ki prav tako izražajo GPIb in GPIIb/IIIa, s tem pa preprečijo nastajanje novih Tr. Možen je tudi zaviralen vpliv aPt na adhezijo in migra- cijo megakariocitov, lahko pa nastanejo tudi določena aPt s specifičnostjo proti trombopoetinskemu recep- torju v membrani megakariocitnih progenitorjev, ki zavirajo megakariopoezo (1). Na trombocitni membrani se nahajajo tudi humani levkocitni antigeni I. razreda (HLA-I), v nizkem števi- lu pa so prisotni tudi antigeni krvnih skupin, I, P, in ABO(H). Z izjemo Pt razreda ABO, pa Pt proti tem antigenom pri imunskih motnjah Tr niso pomembna (25). 3 Serološko določanje trombocitnih protiteles pri imunski trombocitopeniji Pri sumu na ITP so za postavitev diagnoze potrebni zdravstvena zgodovina bolnika, družinska anamneza, klinični pregled, pregled celotne krvne slike, delež reti- kuliranih Tr, včasih tudi testi strjevanja krvi, koncentra- cija trombopoetina in analiza kostnega mozga (4,10). Ena od začetnih laboratorijskih preiskav pa je tudi do- ločitev trombocitnih Pt v krvi bolnika (9-11), pri čemer pa se je treba zavedati, da lahko aPt dokažemo le pri okoli 60 – 80 % bolnikov. Negativni rezultat tako še ne pomeni izključitve diagnoze, saj so lahko patofiziološki mehanizmi veliko bolj kompleksni (11). Kot je bilo že omenjeno, je možnih razlogov več, in sicer: a) da pri nekaterih bolnikih mehanizem za razgradnjo Tr ni povezan z aPt, temveč s celično posredovano razgradnjo Tr; b) da lahko zdravljenje pri bolniku zniža raven aPt pod zaznavno mejo; c) da je pri neposrednem testu potrebna zadostna koli- čina bolnikovih Tr, in č) da včasih izbrani test ne omogoča zanesljivega di- agnosticiranja, zaradi česar je potrebno uporabiti drugo metodo. Pri tem je potrebno upoštevati razmerje med veza- nimi in prostimi trombocitnimi Pt, ki je posledica afi- nitete ter klonalne narave trombocitnih Pt, zaradi česar lahko prihaja do paradoksnih rezultatov različnih te- stov in težav pri interpretiranju rezultatov (10). 3.1 Prvi testi Prvi testi za določitev trombocitnih Pt so bili slabo specifični in občutljivi. Kasneje so se razvili zaneslji- vejši testi, ki se med seboj razlikujejo predvsem v ob- čutljivosti, pri čemer razlike izvirajo predvsem iz vrst uporabljenih diagnostičnih Pt in testiranih antigenov, iz prezentacije delov glikoproteinov, števila uporablje- nih Tr itd. (5). Eden prvih testov, ki so jih razvili, je bil agregacijski test, s katerim so odkrili prvo, trombocitno-specifično Pt, anti-HPA-1a (12). Okoli leta 1970 so raziskovalci razvili radioimunski test RIA (angl. radioimmunoassay) (13), imunofluorescenčno preiskavo PSIFT (angl. plate- let suspension immunofluorescence test; v nadaljeva- nju PIFT) (6), različico PAIFT (angl. platelet adhesion immunofluorescence test) (14) ter hemaglutinacijski test MPHA (angl. mixed passive hemagglutination) (15). Vsi testi omogočajo zaznavanje bolnikovih Pt, ki se vežejo na panelne donorske Tr (indirektni test), ali pa so le-ta že vezana na Tr bolnika (direktni test). Nji- hova skupna slabost je v tem, da je včasih težko ločiti med nespecifično vezavo molekul IgG na Fc-receptor v membrani Tr od specifične vezave na avtoantigene (9). Med temi testi se v azijskih laboratorijih še vedno uporablja test MPHA (15), po drugih laboratorijih pa presejalni test PIFT (Slika 2). Preiskava PIFT je obču- tljiva, vendar ne omogoča identifikacije Pt, poleg tega pa tudi ne zazna Pt z nizko avidnostjo ali v nizkem titru, kot npr. Pt anti-HPA-5a/b in anti-HPA-15a/b (5,16). Test zazna aPt pri samo okoli 60 – 80 % bolnikov z ITP, poleg tega pa je rezultat neposrednega testa PIFT zaradi nespecifične vezave Pt lahko tudi lažno pozitiven (5). 424 IMUNOLOGIJA, SEROLOGIJA, TRANSPLANTACIJA Zdrav Vestn | November – december 2024 | Letnik 93 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3546 3.2 Naprednejši testi: MAIPA, ELISA, Luminex Kasneje so raziskovalci za odkrivanje Pt razvili teste z uporabo izoliranih glikoproteinov in poliakrilamidne gelske elektroforeze, vendar zaradi denaturacije pro- teinov med postopkom ti testi niso zanesljivi (18,19). Z uporabo neionskih detergentov in glikoproteinsko specifičnih monoklonskih Pt so razvili nove metode za odkrivanje Pt, usmerjenih proti določenim glikoprote- inom (9). Prvo metodo za odkrivanje Pt proti GPIIb/ IIIa in GPIb/IX sta opisala Woods in McMillan leta 1984 (20), kasneje pa so raziskovalci razvili teste ACE (angl. antigen-capture ELISA; ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay) (21), SASPA (angl. simultane- ous analysis of specific platelet antibodies) (22), MA- CE (angl. modified antigen capture ELISA) (23) in test MAIPA (angl. monoclonal antibody immobilization of platelet antigens) kot zlati standard (24). Vendar je sle- dnji nepraktičen, saj zahteva številne validacije, pono- vitve in pozitivne kontrole, ki se lahko med laboratoriji razlikujejo. Poleg tega je zamuden, kar oteži uporabo v večini laboratorijev (10,25). Danes mnogo laboratorijev namesto testa MAIPA uporablja tehnično manj zahtevna in časovno krajša komercialna testa PakPlus ELISA (Immucor, Nemči- ja) ali PakLx oz. test Luminex (Immucor, Nemčija) (9). Testa se izvajata v mikrotitrski plošči ali mikrosferah s predhodno vezanimi antigeni ter opravita analizo s čitalcem mikrotitrskih plošč ali napravo Luminex (Lu- minex Corporation, ZDA) (26). Najboljšo specifičnost in občutljivost pri zaznavi Pt omogoča test Luminex, čigar prednost je predvsem v tem, da je analiza hitrejša in enostavnejša ter da lahko s t. i. multipleksno metodo določimo veliko število imunskih reakcij v enem sa- mem vzorcu (Slika 3). Metoda omogoča tudi dodatne obdelave vzorca (npr. toplotna inaktivacija, redčitve vzorca itd.) v zapletenih primerih, npr. pri interferenci z anti-HLA Pt, ki so prisotna pri velikem številu bolni- kov (13,14). S testom Luminex lahko hkrati zaznamo Pt proti GPIV, GPIIb/IIIa, GpIa/IIa in antigenu HLA-I v serumu ali plazmi preiskovanca (16). Kombinacijo tehnologije Luminex in testa MACE nudi test ICFA (angl. immune-complex capture fluo- rescence analysis), ki je v začetnem delu izvedbe podo- ben testu MACE. Metoda zahteva panelne Tr daroval- cev, vendar v manjših količinah kot pri klasičnih testih (27). 3.3 Ostali testi in težave pri določanju trombocitnih protiteles Za izvedbo vseh neposrednih testov je potrebno za- gotoviti bolnikove Tr, kar pa je pri hujši trombocitope- niji problematično. Pri posrednih testih v tehniki PIFT pa potrebujemo darovalce trombocitnega panela, kar spet predstavlja določeno težavo. Zato so proizvajalci testov ELISA in MAIPA za antigene kmalu pričeli upo- rabljati izolirane glikoproteine iz tipiziranih celičnih linij (9). Ker lahko pri izoliranju glikoproteinov pride do konformacijskih sprememb, zaradi česar so lahko Slika 2: Shematski prikaz metode PIFT. Pri metodi PIFT se izolirani trombociti darovalcev ali bolnika inkubirajo s serumom ali plazmo bolnika in če so prisotna Pt, se le-ta vežejo na trombocitne antigene. Pozitiven rezultat preiskave PIFT predstavljajo kompleksi med bolnikovimi Pt na membrani Tr in s fluorokromom označenimi sekundarnimi Pt, ki jih lahko zaznamo s fluorescenčnim mikroskopom. Prirejeno po Matsuhashi M., et al., 2018 (17). 425 STROKOVNI ČLANEK Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije rezultati testov napačni, so raziskovalci razvili rekom- binantne glikoproteine, ki jih uporabljajo v testih ELI- SA ali Luminex (28,29). Drugačno nadgradnjo mikroskopske imunofluo- rescenčne tehnike PIFT predstavlja pretočna citometri- ja, ker omogoča avtomatsko določitev trombocitnih Pt v majhni količini krvi in v vzorcih z majhnim številom Tr. Vendar je ta metoda izjemno variabilna, k čemur so po izkušnjah že sledile napake ob primerjavi rezultatov pred zdravljenjem in po njem itd. Poleg tega je zaradi pomanjkanja standardizacije metode in določitve mej težavno že samo interpretiranje rezultatov (30,31). Fenotipsko in funkcionalno analizo več parame- trov hkrati omogoča tudi masna citometrija, pri kateri uporabljajo različne probe (protitelesa, t.i. RNA probe itd.), konjugiranje z izotopi težkih kovin, analizo celic z metodo pretočne citometrije in masno spektrometrijo kot metodo detekcije. Z metodo je teoretično mogoče simultano meriti do 100 različnih parametrov, njena slabost pa je, da ne omogoča odkriti granuliranosti ali velikosti celic tako kot pretočna citometrija (32). Slika 3: Primer rezultata testa Luminex. Slika prikazuje primer analize vzorca bolnika z zaznanimi Pt proti GPIIb/IIIa (neobj.). Slika je primer rezultata, pridobljenega s pomočjo programa xPONENT. 426 IMUNOLOGIJA, SEROLOGIJA, TRANSPLANTACIJA Zdrav Vestn | November – december 2024 | Letnik 93 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3546 4 Pomen določitve trombocitnih protiteles pri postavitvi diagnoze imunske trombocitopenije Več študij poroča, da zanesljivost klinične diagnoze ITP na podlagi izključevanja ni optimalna, čeprav se ve- čina obstoječih smernic za diagnosticiranje in zdravlje- nje ITP še vedno zanaša zgolj na določitev števila Tr, splošni pregled in analizo krvne slike. Določitev priso- tnosti trombocitnih aPt bi zlahka vključili v začetno te- stiranje, saj lahko pozitiven rezultat pomembno prispe- va k določitvi nadaljnjih diagnostičnih postopkov in k poteku zdravljenja (9-11). Večja metaanaliza je pokaza- la, da je testiranje trombocitnih aPt visoko specifično in bi lahko podprlo klinično diagnozo ter prispevalo tudi k prilagajanju terapije pri veliki večini bolnikov (10,33). Med drugim lahko vidimo, da je pri bolnikih z aPt speci- fičnosti anti-GPIb/IX izid zdravljenja z imunoglobulini ali s steroidi manj ugoden kot pri bolnikih, ki imajo aPt specifičnosti anti-GPIIb/IIIa, pri katerih je uspešnejše zdravljenje z rituksimabom (1). Določitev specifičnosti Pt pa je pomembna tudi pri diagnosticiranju nekaterih redkih motenj strjevanja krvi, ki so se primarno diagnosticirale kot posledica iz- gube funkcij Tr. Avtoprotitelesa lahko npr. ob vezavi na vezavno mesto kompleksa GPIIb/IIIa-fibrinogen to ve- zavo inhibirajo, kar vodi v relativno pomanjkanje GPI- Ib/IIIa in s tem motnjo agregacije. Ali pa avtoprotitelesa inhibirajo vezavo von Willebrandovega faktorja na GPIb in s tem povzročijo nastanek pridobljenega sindroma Bernard Soulier oz. motnjo adhezije trombocitov (9). Nenazadnje avtorji menijo, da je koristni učinek do- ločitve prisotnosti in specifičnosti trombocitnih Pt pri bolnikih z ITP tudi dejstvo, da lahko te preiskave pri bol- nikih, ki so že prejemali transfuzije krvi ali trombocitov, opozorijo zdravnika na nastanek aloprotiteles razreda HLA-I, ki lahko napovejo neučinkovitost transfuzije v prihodnosti. Pri bolnikih, ki jemljejo najrazličnejša zdravila, pa opozorijo na prisotnost od zdravil odvis- nih trombocitnih aPt, ki povzročajo pogosto prisotno, a podcenjeno iatrogeno trombocitopenijo (9). Imunska trombocitopenija je redka bolezen, saj je vzrok za trombocitopenije večkrat sekundaren. Bolni- ke s trombocitopenijo lahko tako obravnavajo različni specialisti internističnih strok, največkrat specialist he- matolog. Zdravnik na primarni ravni bolnika napoti na sekundarno ali terciarno raven obravnave, če so vred- nosti Tr manjše od 100 x 109/L ali če bolnik krvavi. Spe- cialist se nato odloča o nadaljnjih preiskavah za pojasni- tev trombocitopenije. Kolikor se odloči za preiskave za določitev trombocitnih Pt, je pomembno sodelovanje s specialistom transfuzijske medicine, ki opravi preiskavo in interpretira rezultate. Napotni zdravnik nato rezultate preiskave skupaj z izvidi preostalih preiskav in klinične- ga pregleda umesti v celoto. Pri tem je ključnega pomena dejstvo, da pa kljub izboljševanju diagnostičnih preiskav za ITP še vedno ni na voljo jasnega biološkega označe- valca. Zato je za pravilno diagnozo nujno izključiti vse ostale možne vzroke trombocitopenije. 5 Zaključek Diagnoza ITP še vedno temelji na empiričnih meto- dah izključevanja, pri čemer so za postavitev diagnoze ključnega pomena določitev števila Tr, obsežen klinič- ni pregled, analiza razmaza periferne krvi, preiskave za izključitev sekundarne trombocitopenije in ocena od- govora na začetno zdravljenje. Laboratorijska potrditev prisotnosti in specifičnosti aPt, ki je sorazmerno hitra in poceni, lahko tako bistveno pospeši klinično diagnosti- ciranje in omogoči optimalno zdravljenje ITP. Izjava o navzkrižju interesov Avtorji nimamo navzkrižja interesov. Literatura 1. Mititelu A, Onisâi MC, Roșca A, Vlădăreanu AM. Current Understanding of Immune Thrombocytopenia: A Review of Pathogenesis and Treatment Options. Int J Mol Sci. 2024;25(4):2163. DOI: 10.3390/ijms25042163 PMID: 38396839 2. Rodeghiero F, Stasi R, Gernsheimer T, Michel M, Provan D, Arnold DM, et al. Standardization of terminology, definitions and outcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children: report from an international working group. Blood. 2009;113(11):2386-93. DOI: 10.1182/blood-2008-07-162503 PMID: 19005182 3. Mahamad S, Modi D, Al-Samkari H, Cuker A, Despotovic JM, Italiano JE, et al. Proceedings of the immune thrombocytopenia summit: new concepts in mechanisms, diagnosis, and management. Res Pract Thromb Haemost. 2023;7(2):100097. DOI: 10.1016/j.rpth.2023.100097 PMID: 37063755 4. Allegra A, Cicero N, Mirabile G, Giorgianni CM, Gangemi S. Novel biomarkers for diagnosis and monitoring of immune thrombocytopenia. Int J Mol Sci. 2023;24(5):4438. DOI: 10.3390/ijms24054438 PMID: 36901864 427 STROKOVNI ČLANEK Določanje trombocitnih protiteles pri diagnosticiranju imunske trombocitopenije 5. Porcelijn L, Schmidt DE, Oldert G, Hofstede-van Egmond S, Kapur R, Zwaginga JJ, et al. Evolution and utility of antiplatelet autoantibody testing in patients with immune thrombocytopenia. Transfus Med Rev. 2020;34(4):258-69. DOI: 10.1016/j.tmrv.2020.09.003 PMID: 33046350 6. von dem Borne AE, Verheugt FW, Oosterhof F, von Riesz E, de la Rivière AB, Engelfriet CP. A simple immunofluorescence test for the detection of platelet antibodies. Br J Haematol. 1978;39(2):195-207. DOI: 10.1111/ j.1365-2141.1978.tb01089.x PMID: 354684 7. Santoso S, Kiefel V. Human platelet-specific alloantigens: update. Vox Sang. 1998;74(S2):249-53. DOI: 10.1111/j.1423-0410.1998.tb05427.x PMID: 9704452 8. Curtis BR, McFarland JG. Human platelet antigens - 2013. Vox Sang. 2014;106(2):93-102. DOI: 10.1111/vox.12085 PMID: 24102564 9. Porcelijn L, Huiskes E, de Haas M. Progress and development of platelet antibody detection. Transfus Apher Sci. 2020;59(1). DOI: 10.1016/j. transci.2019.102705 PMID: 31911048 10. Sachs UJ. Diagnosing immune thrombocytopenia. Hamostaseologie. 2019;39(3):250-8. DOI: 10.1055/s-0039-1678739 PMID: 30763966 11. Tărniceriu CC, Hurjui LL, Florea ID, Hurjui I, Gradinaru I, Tanase DM, et al. Immune Thrombocytopenic Purpura as a Hemorrhagic Versus Thrombotic Disease: An Updated Insight into Pathophysiological Mechanisms. Medicina (Kaunas). 2022;58(2):211. DOI: 10.3390/ medicina58020211 PMID: 35208534 12. Van Loghem Jj J, Dorfmeijer H, Van Hart M, Schreuder F. Serological and genetical studies on a platelet antigen (Zw). Vox Sang. 1959;4(2):161-9. DOI: 10.1111/j.1423-0410.1959.tb04032.x PMID: 13669430 13. Mueller-Eckhardt C, Mahn I, Schulz G, Mueller-Eckhardt G. Detection of platelet autoantibodies by a radioactive anti-immunoglobulin test. Vox Sang. 1978;35(6):357-65. PMID: 570759 14. Schneider W, Schnaidt M. The platelet adhesion immunofluorescence test: a modification of the platelet suspension immunofluorescence test. Blut. 1981;43(6):389-92. DOI: 10.1007/BF00320318 PMID: 7037075 15. Shibata Y, Juji T, Nishizawa Y, Sakamoto H, Ozawa N. Detection of platelet antibodies by a newly developed mixed agglutination with platelets. Vox Sang. 1981;41(1):25-31. DOI: 10.1111/j.1423-0410.1981.tb01007.x PMID: 7324440 16. Kiefel V. Platelet antibodies in immune thrombocytopenia and related conditions. J Lab Med. 2020;44(5):273-84. DOI: 10.1515/ labmed-2020-0012 17. Matsuhashi M, Tsuno NH. Laboratory testing for the diagnosis of immune- mediated thrombocytopenia. Ann Blood. 2018;3:3. DOI: 10.21037/ aob.2018.09.02 18. Phillips DR, Agin PP. Platelet plasma membrane glycoproteins. Evidence for the presence of nonequivalent disulfide bonds using nonreduced-reduced two-dimensional gel electrophoresis. J Biol Chem. 1977;252(6):2121-6. DOI: 10.1016/S0021-9258(18)71874-7 PMID: 845165 19. Tanford C, Reynolds JA. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-. Reviews on Biomembranes. 1976;457(2):133-70. 20. Woods VJ, Oh EH, Mason D, McMillan R. Autoantibodies against the platelet glycoprotein IIb/IIIa complex in patients with chronic ITP. Blood. 1984;63(2):368-75. PMID: 6229297 21. Furihata K, Nugent DJ, Bissonette A, Aster RH, Kunicki TJ. On the association of the platelet-specific alloantigen, Pena, with glycoprotein IIIa. Evidence for heterogeneity of glycoprotein IIIa. J Clin Invest. 1987;80(6):1624-30. DOI: 10.1172/JCI113250 PMID: 2445781 22. Nguyen XD, Dugrillon A, Beck C, Kerowgan M, Klüter H. A novel method for simultaneous analysis of specific platelet antibodies: SASPA. Br J Haematol. 2004;127(5):552-60. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2004.05233.x PMID: 15566358 23. Menitove JE, Pereira J, Hoffman R, Anderson T, Fried W, Aster RH. Cyclic thrombocytopenia of apparent autoimmune etiology. Blood. 1989;73(6):1561-9. PMID: 2713494 24. Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mueller-Eckhardt C. Monoclonal antibody- -specific immobilization of platelet antigens (MAIPA): a new tool for the identification of platelet-reactive antibodies. Blood. 1987;70(6):1722-6. PMID: 2445398 25. Dutra VF, Costa TH, Santos LD, Sirianni MF, Aravechia MG, Kutner JM, et al. Platelet antibodies identification: comparison between two laboratory tests. Hematol Transfus Cell Ther. 2022;44(3):365-8. DOI: 10.1016/j. htct.2020.12.008 PMID: 33814346 26. Moulis G, Comont T, Adoue D. [New insights into the epidemiology of immune thrombocytopenia in adult patients: impact for clinical practice]. Rev Med Interne. 2021;42(1):11-5. DOI: 10.1016/j.revmed.2020.05.018 PMID: 32798089 27. Fujiwara K, Shimano K, Tanaka H, Sekine M, Kashiwase K, Uchikawa M, et al. Application of bead array technology to simultaneous detection of human leucocyte antigen and human platelet antigen antibodies. Vox Sang. 2009;96(3):244-51. DOI: 10.1111/j.1423-0410.2008.01140.x PMID: 19207165 28. Stafford P, Ghevaert C, Campbell K, Proulx C, Smith G, Williamson LM, et al. Immunologic and structural analysis of eight novel domain-deletion β3 integrin peptides designed for detection of HPA-1 antibodies. J Thromb Haemost. 2008;6(2):366-75. DOI: 10.1111/j.1538-7836.2008.02858.x PMID: 18045240 29. Chong W, Turro E, Metcalfe P, Yusuf R, Mérieux Y, Rigal D, et al. A multicenter validation of recombinant β3 integrin-coupled beads to detect human platelet antigen-1 alloantibodies in 498 cases of fetomaternal alloimmune thrombocytopenia. Transfusion. 2015;55(11):2742-51. DOI: 10.1111/trf.13222 PMID: 26173471 30. Zhai J, Ding M, Yang T, Zuo B, Weng Z, Zhao Y, et al. Flow cytometric immunobead assay for quantitative detection of platelet autoantibodies in immune thrombocytopenia patients. J Transl Med. 2017;15(1):214. DOI: 10.1186/s12967-017-1317-2 PMID: 29061180 31. Visweshwar N, Ayala I, Jaglal M, Killeen R, Sokol L, Laber DA, et al. Primary immune thrombocytopenia: a ‘diagnosis of exclusion’? Blood Coagul Fibrinolysis. 2022;33(6):289-94. DOI: 10.1097/MBC.0000000000001144 PMID: 35867940 32. Blair TA, Michelson AD, Frelinger AL. Mass cytometry reveals distinct platelet subtypes in healthy subjects and novel alterations in surface glycoproteins in Glanzmann thrombasthenia. Sci Rep. 2018;8(1):10300. DOI: 10.1038/s41598-018-28211-5 PMID: 29985398 33. Vrbensky JR, Moore JE, Arnold DM, Smith JW, Kelton JG, Nazy I. The sensitivity and specificity of platelet autoantibody testing in immune thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis of a diagnostic test. J Thromb Haemost. 2019;17(5):787-94. DOI: 10.1111/ jth.14419 PMID: 30801909