Ajda ULČNIK*, Lucija ZUPANČIC-KRALj Črtomir TAVzES***, Franc POHLEVEN*
udk 630*844.2
mikoremediacja lindana v tekočih kulturah gliv pleurotus ostreatus hypoxylon fragiforme
Mycoremediation of lindane in liquid cultures of Pleurotus ostreatus and Hypoxylon fragiforme
Izvleček: Mehanizem, s katerim glive bele trohnobe razgrajujejo lignin, omogoča tudi razgradnjo izjemno širokega spektra okoljskih onesnaževal. V raziskavi smo proučevali razgradnjo kloriranega organskega insekticida lindana z dvema vrstama gliv bele trohnobe, bukovim ostrigarjem (Pleurotus ostreatus) in ogljeno kroglico (Hypoxylon fragiforme). Kulture gliv so različno dolgo rasle v tekočem gojišču z dodanim lindanom. Lindan smo iz tekočih kultur gliv ekstrahirali z dvema različnima metodama ter ga določali s plinsko kromatografijo. Koncentracija lindana je s časom izpostavitve kulturam gliv padala. Največjo razgradnjo lindana (več kot 90 %) smo pri obeh vrstah ugotovili po 21 dneh izpostavitve lindana kulturi gliv. Odstranitev lindana iz tekočih kultur gliv se je najverjetneje zgodila zaradi razgradnje lindana z glivnimi encimi, do adsorpcije lindana na biomaso pa pri teh vrstah gliv verjetno ni prišlo.
Ključne besede: mikoremediacija, lindan, lesne glive, glive bele trohnobe, P. ostreatus, H. fragiforme, adsorpcija, plinska kromatografija
Abstract: White rot fungi have the ability to completely degrade lignin. The same mechanism enables them to biodegrade a wide variety of environmental pollutants. The ability of two white-rot fungi (Pleurotus ostreatus and Hypoxylon fragiforme) to degrade an organochlorine insecticide, lindane, in liquid cultures was studied. Lindane was exposed to fungal liquid cultures for various time intervals and its extraction was done by using two different methods. The residual content determination of lindane was done by gas chromatography. The rate of degradation increased with the incubation period of lindane in fungal liquid cultures. The highest rate of degradation with both fungi was measured after 21 days of incubation. Lindane removal from the culture media presumably occurred due to degradation and not via adsorption onto the fungal mycelium.
Keywords: mycoremediation, lindane, white rot fungi, P. ostreatus, H. fragiforme, adsorption, gas chromatography
uvod
Zaradi človekove dejavnosti ter pretirane in nepravilne uporabe je v okolju prisotnih več deset tisoč različnih sintetičnih kemikalij. Snovi, ki so v okolju prisotne v mnogo
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za lesarstvo, Jamnikarjeva 101, 1000 Ljubljana, e-pošta: ajda.ulcnik@bf.uni-lj.si
s Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Aškerčeva cesta 5, 1000 Ljubljana
''* Inštitut za lesarstvo in trajnostni razvoj, raziskovanje, razvoj, svetovanje in izobraževanje d.o.o, Celovška cesta 268, 1000 Ljubljana
višjih koncentracijah od običajnih ali pa so tuje celotnemu biološkemu sistemu in v naravi niso obstajale, preden jih je sintetiziral človek, imenujemo ksenobiotiki. Od teh so mnogi toksični, nekateri pa lahko takšni postanejo kot posledica biotransformacije. Za mnoge ksenobiotike učinki na zdravje ljudi še niso raziskani.
V okolju so organske kemikalije izpostavljene encimatskim in neencimatskim reakcijam. Abiotski dejavniki zelo redko povzročijo spremembe v kemijski strukturi onesnaževala. Nasprotno pa se lahko mnogi ksenobiotiki v naravi razgra-

dijo s pomočjo mikroorganizmov in gliv. Uporabo bioloških sistemov ali organizmov za razgradnjo ali odstranitev onesnaževal iz okolja imenujemo bioremediacija. Pri tem biotehnološkem procesu organizem (mikroorganizem, gliva, rastlina ali njihovi encimi) onesnaževalo porablja kot vir hrane, ga kometabolizira ali pa kopiči (Alexander, 1981).
Z bioremediacijo količino onesnaževal znižamo na nezaznavno, netoksično ali sprejemljivo vrednost. Namen bioremediacije je popolna razgradnja (mineralizacija) organskih onesnaževal do CO2 ter v primeru kovin transformacija v manj toksične oblike ali njihova odstranitev s sorpcijo (Pointing, 2001). Pri razgradnji onesnaževal navadno pride do razstrupljanja, lahko pa nastanejo tudi strupeni razgradni produkti.
Bioremediacijo lahko izvajamo z različnimi organizmi (Hamby, 1996; Pointing, 2001). Poleg bakterij in rastlin (fi-toremediacija) lahko pri čiščenju okolja zelo uspešno uporabljamo tudi glive (mikoremediacija). Lesne glive imajo namreč veliko sposobnost razgradnje izjemno širokega nabora ksenobiotikov.
Glede na poškodbe lesa delimo lesne glive na glive bele in rjave trohnobe. Glive rjave trohnobe so sposobne razgrajevati le polisaharide v oleseneli celični steni, pri čemer se lignin le delno modificira. Glive bele trohnobe pa lahko razgradijo vse glavne komponente lesa - celulozo, he-micelulozo ter tudi lignin, ki je sicer izjemno odporen na biološko in kemično razgradnjo. Glive bele trohnobe razgrajujejo lignin selektivno ali pa simultano. Selektivne de-lignifikatorke naprej razgrajujejo lignin in hemicelulozo ter šele nato tudi celulozo, simultane delignifikatorke pa hkrati razgrajujejo vse tri glavne komponente rastlinske celične stene (Zabel in Morell, 1992; Martfnez in sod., 2005). Poleg razgradnje lignina so glive bele trohnobe sposobne razgradnje organskih ksenobiotikov, ki so strukturno podobni ligninu (Bumpus in sod., 1985; Hammel, 1995; Reddy, 1995).
RAZGRADNJA LIGNINA
Lignin je kompleksen heteropolimer, sestavljen iz treh osnovnih fenilpropanskih podenot, kumaril, koniferil in sinapil alkohola. Raznolikost ligninskih podenot in vezi med njimi zahteva dokaj nespecifičen sistem razgradnje, ki ga povzročajo glive bele trohnobe. Razgradnja lignina z glivami bele trohnobe je oksidativen aeroben proces. Ker je polimer lignina prevelik za endocitozo, je njegova razgradnja zunajcelična (Aust, 1995; Hammel, 1995).
Glive bele trohnobe razgrajujejo lignin z zunajceličnimi encimi, od katerih so najpomembnejši lignin peroksidaze (LiP), od mangana odvisne peroksidaze (MnP) in lakaze (Lac). Razgradnja lignina poteka z oksidacijo, ki jo katalizira-jo omenjeni encimi, pri čemer nastajajo kationski prosti ra-
Slika 1. Katalični cikel LiP (Aust, 1995).
dikali ligninskih podenot (Kirk in Farrel, 1987; Hammel, 1995; Reddy, 1995). Ti so nestabilni in reaktivni ter povzročijo številne spontane cepitve ligninske makromolekule v manjše enote. Mehanizem oksidacije z lignin peroksidazami je prikazan na sliki 1. Podoben mehanizem, ki vključuje dve eno-elektronski oksidaciji substrata, ustreza tudi delovanju MnP, lakaze pa katalizirajo enoelektronsko oksidacijo substrata.
Ligninolitični encimi gliv bele trohnobe nastajajo v sekundarnem metabolizmu ob pomanjkanju hranil, predvsem dušika in ogljika (Bumpus in sod., 1985). Novejše raziskave kažejo, da lahko pride do izražanja ligninolitičnih encimov tudi v začetni fazi glivne okužbe lesa, ko ima gliva na voljo še dovolj hranil (Janse in sod., 1998; Messner in sod., 1998; Pointing, 2001).
Oksidaze, ki katalizirajo razgradnjo lignina, so prevelike za prehajanje v olesenelo celično steno, zaradi česar delujejo predvsem na njeni površini. Ker pa naj bi razgradnja lignina v notranjosti celične stene potekala tudi v primerih, ko celična stena še ni razgrajena do te mere, da bi vanjo lahko vstopali encimi, je Hammel (1997) predlagal posredno delovanje peroksidaz preko oksidacij substratov z majhno relativno molekulsko maso. Ti substrati naj bi delovali kot mediatorji med encimi in njihovimi substrati (Candeias in Harvey, 1995). Eden izmed možnih kandidatov za takšne substrate je veratril alkohol (3,4-dimetoksibenzil alkohol), ki je sekundarni metabolit glive in ga glive proizvajajo ob pomanjkanju hranil.
Z glivami bele trohnobe so v številnih raziskavah uspešno razgradili različna sintetična barvila, klorirane fenole, klorirane pesticide, policiklične aromatske ogljikovodike, poli-klorirane bifenile ter druge kemijsko podobne snovi (Reddy, 1995; Gadd, 2001; Singh, 2006; Quintero in sod., 2008).
LINDAN
Lindan (1a,2a,3ß,4a,5a,6ß-heksaklorocikloheksan, y-HCH) (slika 2) je kloriran organski insekticid, ki se je v preteklosti
uporabljal za zatiranje škodljivcev v kmetijstvu ter konzer-vatorstvu, kot zaščitno sredstvo za les ter za odpravljanje parazitov pri ljudeh in živalih. Uvrščamo ga med obstojna organska onesnaževala, za katera so značilni zelo dolgo zadrževanje v okolju, prenašanje na velike razdalje, bio-akumulacija v živih organizmih ter škodljivi učinki za ljudi in živali (UNEP, 2010). Lindan se v organizmih zaradi nepolarnosti akumulira predvsem v maščobnem tkivu (UNEP, 2007; Zucchini in sod., 2009), deluje pa kot živčni strup. Pri ljudeh povzroča nevrološke bolezni, pri laboratorijskih živalih pa povzroča napake v razvoju ter raka na jetrih (Siddique in sod., 2002). Uporaba lindana je danes v mnogih državah prepovedana, maja 2009 pa je bil lindan dodan na seznam prepovedanih kemikalij, ki so zajete v Stockholmski konvenciji o obstojnih organskih onesnaže-valih. Stockholmsko konvencijo, katere cilj je prepovedati ali omejiti proizvodnjo ali uporabo obstojnih organskih onesnaževal, je leta 2004 podpisala tudi Republika Slovenija (Urad RS za kemikalije, 2010).
Slika 2. Lindan (y -heksaklorocikloheksan, y-HCH).
Glive bele trohnobe so v mnogih raziskavah uspešno razgradile različna obstojna organska onesnaževala, vključno z lindanom. Razgradnja ksenobiotikov z glivami bele trohnobe je bila najbolj preučevana z glivo Phane-rochaete chrysosporium, za katero so Bumpus in sodelavci (1985) poročali o več kot 90 % razgradnji lindana v tekočih kulturah. Pri mikoremediaciji organskih pesticidov se sicer pojavlja vprašanje, ali med postopkom resnično pride do razgradnje pesticida ali je njegova zmanjšana koncentracija v mediju le posledica adsorpcije na različne površine, predvsem na micelij oziroma biomaso.
V pričujoči raziskavi smo proučevali sposobnost dveh vrst gliv bele trohnobe za mikoremediacijo lindana v odvisnosti od časa izpostavitve lindana tekočim kulturam gliv. Na podlagi primerjav izmerjenih deležev razgrajenega lindana, pridobljenih z dvema metodama ekstrakcije lindana iz tekočih glivnih kultur, smo ugotavljali, ali je odstranitev lindana posledica adsorpcije ali razgradnje z ligninolitič-nimi encimi.
materiali in metode
Lindan smo za različno dolga časovna obdobja izpostavili bukovemu ostrigarju (Pleurotus ostreatus, Plo5, sev
izoliran iz hloda smreke 1998, Ljubljana) in ogljeni kroglici (Hypoxylon fragiforme, ZIM L108). Glivo bele trohnobe H. fragiforme uvrščamo v skupino zaprtotrosnic (Ascomyco-tina), gliva P. ostreatus pa spada v skupino prostotrosnic (Basidiomycotina). Kulture micelija smo vzeli iz Zbirke industrijskih organizmov (ZIM), ki jo hranimo na Oddelku za lesarstvo Biotehniške fakultete Univerze v Ljubljani v Delovni skupini za patologijo in zaščito lesa (Raspor in sod., 1995). Kulture gliv smo gojili v tristomililitrskih erlenmajeri-cah, napolnjenih s 50 ml tekočega gojišča po Hadarju (Ha-dar in Cohen-Arazi, 1986), ki smo mu dodali MnSO4^H2O (2 mM), pH gojišča pa smo umerili na 4,5 (Vidic in sod., 2008). Štiri dni pred dodatkom lindana smo v gojišče dodali veratril alkohol (koncentracija v gojišču 2 mM), s čimer smo vzpodbudili izražanje ligninolitičnih encimov (Faison in Kirk, 1985; Faison in sod., 1986; Jaouani in sod., 2006).
Inokulat za tekoča gojišča smo vzgojili na krompirjevem dekstroznem agarju (PDA) (DIFCO Laboratories, ZDA), iz katerega smo s plutovrtom (premer 9 mm) izrezali vcepke iz sedem dni starega micelija. Tekoča gojišča smo inokuli-rali s po tremi vcepki micelija iz gojišča PDA. Tekoče kulture gliv smo gojili 26 dni v temi na horizontalnem stresalni-ku (100 min-1, 25 °C, 60 % RH).
Raztopino lindana (97 % y-HCH, Merck) smo pripravili v acetonu. Tekočim kulturam gliv smo 100 |l raztopine lindana dodali za 21 dni, tri dni, en dan, šest ur, dve uri ali deset minut (lindan smo tekočim kulturam gliv dodali pet dni, 23 dni, 25 dni ali 26 dni po inokulaciji). Časovni potek poskusa je prikazan na sliki 3. Po dodatku raztopine lindana tekočim kulturam gliv je bila koncentracija lindana v gojišču 30 |M. Pri negativnih kontrolah smo namesto lindana tekočim kulturam gliv dodali 100 |l acetona. Za pozitivne kontrole smo uporabili tekoče gojišče, ki ga nismo inokulirali z micelijem in v katerega smo za deset minut oziroma 21 dni dodali 100 |l raztopine lindana. Tekočim kulturam gliv, ki jim je bil lindan izpostavljen 21 dni, ter vsem kontrolam, smo veratril alkohol dodali ob inokulaciji
Slika 3. dodajanje lindana tekočim glivnim kulturam. Puščice označujejo dodatek lindana, čas izpostavitve lindana tekočim glivnim kulturam je zapisan nad puščicami.
oziroma ob dodatku lindana ali acetona. Vse poskuse smo izvajali v šestih ponovitvah.
Iz tekočih glivnih kultur in kontrol smo lindan ekstrahirali s heksanom na dva načina. Iz polovice paralelnih ponovitev, kjer je bil lindan kulturi glive izpostavljen za enako obdobje, smo lindan ekstrahirali iz filtratov, iz druge polovice pa iz homogenatov tekočih glivnih kultur.
EKSTRAKCIJA LINDANA IZ FILTRATOV TEKOČIH KULTUR GLIV
Po koncu izpostavitve lindana kulturam gliv smo v er-lenmajerice z gojiščem in glivno biomaso dodali 50 ml heksana ter vsebino dobro premešali. Biomaso gliv smo od mešanice heksana in gojišča ločili s filtracijo skozi grobi filtrirni papir (Sartorius Stedim Biotech, 84 g m-2, grade 388) z uporabo vodne črpalke. Po filtraciji smo zgornjo nepolarno fazo filtrata previdno odpipetirali v stekleno epruveto. Za popolno odstranitev vode smo ekstraktom dodali Na2SO4 ter jih shranili v zamrzovalni skrinji (-20 °C).
EKSTRAKCIJA LINDANA IZ HOMOGENATOV TEKOČIH KULTUR GLIV
Vsebino erlenmajeric smo po koncu izpostavitve lindana tekočim kulturam gliv prelili v centrifugirke. Prazne er-lenmajerice smo dobro sprali s 50 ml heksana, ki smo ga nato dodali v centrifugirke. Vsebino centrifugirk smo homogenizirali z napravo Ika T25 Digital Ultra-Turrax (11000 obratov min-1, 30 s). Po homogenizaciji smo nepolarno fazo z ekstrahiranim lindanom ločili od polarne faze s cen-trifugiranjem (centrifuga Tehtnica LC 321, Tehtnica Železniki, Slovenija) (4000 obratov min-1, 5 min). Zgornjo nepolarno fazo smo ločili od spodnje polarne faze in ekstraktom pred shranjevanjem v zamrzovalni skrinji dodali Na2SO4.
Lindan smo v ekstraktih določali z uporabo plinske kro-matografije (GC; angl. gas chromatography). Pri tej analizi lindan vnesemo v sistem v organskem topilu (heksan). Uporabili smo plinski kromatograf (Hewlett Packard 6890 Series, ZDA) z detektorjem za zajetje elektronov (ECD) in kolono RTX-5MS (dolžina 60 m, premer 250 |im, debelina stacionarne faze 0,50 |m). Analizni pogoji: temperatura injektorja 250 °C, temperatura detektorja 320 °C, nosilni plin dušik (pretok 2 ml min-1), temperaturni program: 70 °C do 300 °C, 30 °C min-1, zadrževalni čas 1 minuta pri 70 °C in 5 minut pri 300 °C. Na kolono smo nanašali desetkratne razredčine ekstraktov (redčenje s heksanom). Volumen vbrizganega vzorca je bil 1 |l.
rezultati in razprava
Razgradnja lindana s testiranima vrstama gliv je bila določena s plinsko kromatografijo in izračunana s pri-
merjanjem ploščin kromatografskih vrhov lindana v eksperimentalnih vzorcih in pozitivni kontroli, ki ni bila ino-kulirana z micelijem. Rezultati so povprečje meritev treh paralelnih vzorcev z navedenimi pripadajočimi standardnimi odkloni. Na sliki 4 je prikazana primerjava kromatografskih vrhov ekstrakta iz kulture glive P. ostreatus, v katerem je bil lindan prisoten 21 dni, in kontrole, v kateri je bil lindan v tekočem gojišču prisoten 21 dni. Velika razlika ploščin obeh kromatografskih vrhov nakazuje visoko stopnjo razgradnje lindana.
Stopnja razgradnje lindana z obema glivama bele trohno-be je s časom naraščala (slika 5). Količine lindana, ki smo jih določili po desetih minutah in dveh urah delovanja kultur glive na lindan, imajo prevelike pripadajoče standardne odklone, da bi lahko sklepali na znatno razgradnjo lindana. Pri glivi P. ostreatus smo v teh vzorcih določili celo nekoliko večjo količino lindana kot v pozitivnih kontrolah, kar pripisujemo merskim napakam.
V tekočih kulturah glive P. ostreatus smo po 21 dneh izpostavitve lindana v vseh vzorcih, ne glede na vrsto uporabljene ekstrakcije, določili več kot 90 % razgradnjo. Zaradi velikih standardnih odklonov pri vzorcih z manj kot enodnevno izpostavitvijo lindana kulturi glive ne moremo govoriti o razgradnji. Intenzivno razgradnjo lindana smo nedvoumno določili po enem dnevu izpostavitve lindana kulturam glive. Po 21 dneh prisotnosti lindana v tekočih kulturah je gliva P. ostreatus razgradila skoraj vso količino dodanega lindana. Razen pri vzorcih, kjer smo razgradnjo lindana določali po 21 dneh izpostavitve lindana kulturam glive, so vidne razlike med načinoma ekstrakcije lindana iz tekočih kultur. Večjo razgradnjo smo določili z ekstrakcijo
Slika 4. Določitev lindana z GC: primerjava kromatografskih vrhov lindana, prisotnega 21 dni v tekočem gojišču (debela črta) in v tekoči kulturi glive p. ostreatus (tanka črta). oba vzorca sta bila pripravljena z ekstrakcijo iz homogenata tekoče kulture.
lindana iz filtratov tekočih kultur glive, vendar pa so bile razlike zaradi velikih standardnih odklonov neznačilne.
Pri vzorcih, kjer smo razgradnjo lindana določevali po krajšem času inkubacije lindana v tekočih kulturah glive H. fra-giforme, je izmerjeni delež razgradnje glede na kontrolo v vseh primerih večji pri ekstrakciji lindana iz filtratov tekočih glivnih kultur. Precej veliko razgradnjo smo s tem načinom ekstrakcije določili po desetih minutah izpostavitve onesnaževala kulturam glive, pa tudi po dveh urah in enem dnevu delovanja kulture H. fragiforme na lindan. Ti rezultati nakazujejo, da je izračunana razgradnja lindana odvisna od načina ekstrakcije lindana iz tekočih kultur, vendar pa rezultati ostalih vzorcev, predvsem po 3 dneh in 21 dneh izpostavitve lindana glivam, tega ne podpirajo. Razgradnja lindana je s časom inkubacije naraščala, glede na rezultate pa sklepamo, da se je intenzivna razgradnja lindana z glivo H. fragiforme v tekoči kulturi pričela med šestimi urami in enim dnevom izpostavitve lindana tekoči kulturi glive.
Ker se lindan lahko adsorbira na površino glivnega mice-lija in tudi na steklo (Young in Banks, 1998; Ghosh in sod., 2009), je lahko zaradi tega količina preostalega (ekstrahi-ranega) lindana v glivnih kulturah manjša, rezultat pa napačno interpretiramo ter sklepamo na razgradnjo lindana. Zaradi tega smo pri poskusu uporabili dva različna načina ekstrakcije lindana iz tekočih glivnih kultur. Iz vzorcev, ki smo jih pripravili s homogenizacijo tekočih kultur gliv, naj bi ekstrahirali tudi lindan, ki bi se lahko adsorbiral na površino micelija ali steno erlenmajerice. Pri vzorcih, pripravljenih z ekstrakcijo lindana iz filtratov tekočih glivnih
kultur, pa naj bi določili le preostanek lindana v tekočih kulturah, ki se ni vezal na prej omenjene površine. Izrazitih razlik v količini razgrajenega lindana glede na uporabljeno ekstrakcijo nismo opazili pri nobeni vrsti gliv. Sklepamo, da sta obe metodi, ki smo ju uporabili za ekstrakcijo lindana iz tekočih kultur teh dveh gliv, primerni za določanje količine lindana in da sta ga glivi s svojimi encimi najverjetneje razgradili, saj adsorpcije z uporabljenimi metodami nismo dokazali. Čeprav eno od gliv uvrščamo med zaprtotrosnice, drugo pa med prostotrosnice, je bila razgradnja lindana z obema glivama podobna, saj bistvenih razlik v količini razgrajenega lindana ni bilo.
sklep
Razgradnja lindana v tekočih glivnih kulturah je odvisna od časa izpostavitve lindana tekočim kulturam gliv ter vrste glive. V tekočih kulturah gliv obeh vrst smo z obema načinoma ekstrakcije lindana določili primerljive razgradnje lindana. Po 21 dneh smo z glivama P. ostreatus in H. fragiforme razgradili več kot 90 % lindana. Domnevamo, da se je odstranitev lindana iz tekočih glivnih kultur zgodila zaradi razgradnje z glivnimi encimi in ni bila posledica adsorpcije lindana na hife micelija.
zahvala
Zahvaljujemo se Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije za finančno podporo v okviru programa P4-0015-0481 ter dr. Ireni Kralj Cigić za pomoč pri delu s plinskim kromatografom.
Slika 5. Povprečni deleži razgrajenega lindana s pripadajočimi standardnimi odkloni v odvisnosti od časa izpostavitve lindana kulturam gliv P. ostreatus (rdeča barva) in H. fragiforme (modra barva). Delež razgradnje lindana smo določali v ekstraktih, pripravljenih iz filtratov (šrafirani stolpci) in homogenatov (polni stolpci) tekočih glivnih kultur.
literatura
i.
2
3.
4
5.
6.
7.
8.
9.
10
11.
Alexander M. (1981) Biodegradation of chemicals of environmental concern. Science, 211, 4478: 132-138 Aust S.D. (1995) Mechanisms of degradation by white rot fungi. Environmental Health Perspectives, 103 (Suppl 5): 59-61 Bumpus J.A., tien M., Wright d., Aust S.d. (1985) Oxidation of persistent environmental pollutants by a white rot fungus. Science, 228: 1434-1436
Candeias L.P., Harvey P.J. (1995) Lifetime and reactivity of the veratryl alcohol radical cation. Journal of Biological Chemistry, 270: 16745-16748
Faison B.D., Kirk T.K. (1985) Factors involved in the regulation of a ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology, 49, 2: 299-304 Faison B.D., Kirk K., Farrel R.A. (1986) Role of veratryl alcohol in regulating ligninase activity in Phanerochaete chrysosporium. Applied and Environmental Microbiology, 52, 2: 251-254 Gadd G.M. (2001) Fungi in bioremediation. Cambridge University Press, Cambridge, 481
Ghosh S., Das S. K., Guha A.K., Sanyal A.K. (2009) Adsorption behavior of lindane on Rhizopus oryzae biomass: physico-chemical studies. Journal of Hazardous Materials 172, 485-490 Hadar Y., Cohen-Arazi E. (1986) Chemical composition of the edible mushroom Pleurotus ostreatus produced by fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 51, 6: 1352-1354 Hamby D.M. (1996) Site remediation techniques supporting environmental restoration activities- a review. The Science of the Total Environment, 191, 201-224
Hammel K.E. (1995) Organopollutant degradation by ligninolytic fungi. V: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals. Young LY (Ur.), Cerniglia CE (Ur.), Wiley-Liss, New York, 331-346
12.	Hammel K.E. (1997) Fungal degradation of lignin. V: Driven by Nature: Plant Litter Quality and Decomposition. Cadisch G (Ur.), Giller KE (Ur.), CAB International, Madison (MI), 33-45
13.	Janse B.J.H., Gaskell J., Akhtar M., Cullen D. (1998) Expression
of Phanerochaete chrysosporium genes encoding lignin peroxida-ses, manganese peroxidases and glyoxal oxidase in wood. Applied and Environmental Microbiology, 64: 3536-3538 Jaouani A., Tabka M.G., Penninckx M.J. (2006) Lignin modifying enzymes of Coriolopsispolyzona and their role in olive oil mill wastewaters decolourisation. Chemosphere, 62: 1421-1430 Kirk KT, Farrell R.L. (1987) Enzymatic »combustion«: the microbial degradation of lignin. Annual Review of Microbiology, 41: 465505
16. Martfnez A. T., Speranza M., Ruiz-Duenas F.J., Ferreira P., Ca-marero S., Guillén F., Martfnez M.J., Gutiérres A., del Rfo J.C. (2005) Biodegradation of lignocellulosics: microbial, chemical, and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin. International Microbiology, 8: 195-204
Messner K., Koller K., Wall M.B., Akhtar M., Scott G.M. (1998)
Fungal treatment of wood chips for chemical pulping. V: Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry. Young RA (Ur.), Akhtar MJ (Ur.), Wiley & Sons Inc, New York, 385-419 Pointing S.B. (2001) Feasibility of bioremediation by white-rot fungi. Applied Microbiology and Biotechnology, 57, 1-2: 20-33
19.	Raspor P., Smole-Možina S., Podjavoršek J., Pohleven F., Go-gala N., Nekrep F.V., Rogelj I., Hacin J. (1995) ZIM: zbirka industrijskih mikroorganizmov. Katalog biokultur. Biotehniška fakulteta, Katedra za biotehnologijo, Ljubljana, 98
20.	Quintero J.C., Moreira M.T., Feijoo G., Lema J.M. (2008) Screening of white rot fungal species for theis capacity to degrade lindane and other isomers of hexachlorocyclohexane (HCH). Ciencia
14
15
17.
18.
e Investigation Agraria, 35, 2: 123-132
21.	Reddy A.C. (1995) The potential for white-rot fungi in the treatment of pollutants. Current Opinion in Biotechnology, 6: 320-328
22.	Siddique T., Okeke B.C., Arshad M., Frankenberger W.T. (2002) Temperature and pH effects on biodegradation of hexachlorocyclohexane isomers in water and a soil slurry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 5070-5076
23.	Singh H. (2006) Mycoremediation: fungal bioremediation. John Wiley and Sons, New Jersey, 592
24.	UNEP (2007) Lindane: Risk Management Evaluation. Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, Persistent Organic Pollutants Review Committee, Third meeting. Geneva, 18
25.	UNEP (2010) Stockholm Convention On Persistent Organic Pollutants (POPs). http://chm.pops.int/Convention/ThePOPs/ta-bid/673/language/en-US/Default.aspx (marec 2010)
26.	Urad Republike Slovenije za kemikalije. (2010) Stockholmska konvencija o obstojnih organskih onesnaževalih. http://www. uk.gov.si/si/delovna_podrocja/obstojna_organska_onesnazeva-la/stockholmska_konvencija_o_obstojnih_organskih_onesnaze-valih/ (marec, 2010)
27.	Vidic I., Zupančič-Kralj L., Sepčić K., Pohleven F. (2008) Degradation of polychlorinated organic biocides by the wood decaying fungi. V: International Research Group on Wood Preservation. IRG Documents IRG 39, Istanbul, maj 25-29: str. 1-13
28.	Young E., Banks C.J. (1998) The removal of lindane from aqueous solution using a fungal biosorbent: the influence of pH, temperature, biomass concentration and culture age. Environmental Technology 19, 619-625
29.	Zabel R.A., Morrell J.J. (1992) Wood Microbiology: Decay and Its Prevention. Academic Press, New York, 476
30.	Zucchini-Pascal N., de Sousa G., Rahmani R. (2009) Lindane and cell death: At the crossroads between apoptosis, necrosis and autophagy. Toxicology, 256, 1-2: 32-41