UDK 547:620.1:61
Original scientific article/Izvirni znanstveni članek
ISSN 1580-2949 MTAEC9, 42(4)179(2008)
PRIPRAVA NANOKOMPOZITA ZA BIOMEDICINSKE
APLIKACIJE
PREPARATION OF NANO-COMPOSITES FOR BIOMEDICAL
APPLICATIONS
Stanislav Campelj1, Darko Makovec1, Luka Skrlep2, Miha Drofenik1'3
1Odsek za sintezo materialov, Institut "Jožef Stefan", Jamova 39, SI-1000 Ljubljana, Slovenija 2Zavod za gradbeništvo Slovenije, Dimičeva 12, 1000 Ljubljana, Slovenija 3Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Mariboru, Smetanova ul. 17, SI-2000 Maribor, Slovenija
stanislav.campelj@ijs.si
Prejem rokopisa — received: 2007-11-23; sprejem za objavo - accepted for publication: 2008-04-24
Kompozitni nanodelci, ki vsebujejo superparamagnetno maghemitno jedro, prevlečeno s tanko plastjo amorfnega silicijevega oksida so zelo obetaven material za uporabo v biomedicini. Magnetno jedro omogoča manipulacijo z delci z zunanjim magnetnim poljem, medtem ko plašč amorfnega silicijevega oksida omogoča vezavo različnih molekul na njihovo površino. Vezava različnih organskih molekul, na primer zdravilnih učinkovin, zahteva pripravo nanodelcev, ki imajo na površini sloj funkcionalizacijskih molekul z različnimi funkcionalnimi skupinami.
Funkcionalizacijo nanodelcev smo dosegli s kovalentno vezavo različnih silanskih molekul: (3-aminopropil)trietoksisilan (APS) in viniltrietoksisilan (VTS), na njihovo površino. Reakcija je potekla v mešanici etanola, v katerem je bila predhodno raztopljena izbrana silanska molekula, in stabilne vodne suspenzije kompozitnih nanodelcev. Vezavo različnih silanskih molekul na površino nanodelcev smo spremljali z elektrokinetičnimi meritvami in s konduktometrično meritvijo koncentracije molekul na njihovi površini. Izkazalo se je, da lahko vežemo na delce molekule APS v površinski koncentraciji, ki se sklada s koncentracijo silanolnih skupin na površini amorfnega silicijevega oksida. Ključne besede: nanodelci, nanokompoziti, silani, zeta-potencial, funkcionalizacija
Composite nano-particles of superparamagnetic maghemite particles coated with a thin layer of silica are very promising material for biomedical applications. The magnetic core of the composite nano-particles allows manipulation of particles with external magnetic field while the silica shell allows additional bonding of molecules to the surface. Different organic molecules, such as medical drugs, require nano-particles with a layer of functionalization molecules with different functional groups.
The functionalization of nano-particles was achieved with covalent bonding of different silanol molecules: (3-aminopropyl) triethoksysilane (APS) and vinyltriethoksysilane (VTS) to their surface. Reaction took place in a mixture of ethanol with previously dissolved silane and stable aqueous suspension of composite nano-particles. The bonding of different silanol molecules was monitored with electro-kinetic measurements and with conductometric measurements of molecules on the surface. The concentration of APS molecules which can be bondend to the surface of the composite nano-particles is in accordance with the concentration of silanol groups on the surface of silica.
Key words: nanoparticles, nanocomposites, silanes, zeta potential, fuctionalisation
1 UVOD
V zadnjih letih se veliko pozornosti namenja uporabi magnetnih nanodelcev v medicini. Magnetizem delcev nam omogoča, da lahko z njmi na daljavo manipuliramo z zunanjim magnetnim poljem, spremljamo njihov položaj ali jih segrevamo. Uporabljamo jih tako v diagnostične namene, kot je na primer za povečevanje kontrasta pri slikanju z NMR-tehniko, kot tudi v terapevtske namene, kot sta na primer magnetna hipertermija in ciljni vnos zdravilnih učinkovin. Primeren magnetni material za uporabo v medicini je maghemit (y-Fe2O3), ki velja za nestrupen material12. Pogoj za uporabo nanodelcev v medicini je poleg majhne velikosti in zadovoljivih magnetnih lastnosti tudi njihova nestrupenost in specifične površinske lastnosti. Če želimo, da je magnetni nanokompozit primeren za uporabo v medicini, je treba na njegovo površino vezati različne biološke učinkovine. Vezavo učinkovin na površino nanokompozita dosežemo s funkcionali-
zacijskim slojem molekul, ki so vezane na njegovo površino. Ta sloj molekul zagotavlja funkcionalne skupine za kemijsko vezavo različnih učinkovin, hkrati pa preprečuje aglomeracijo nanodelcev med uporabo. Narava funkcionalizacijskih molekul določa tudi površinske lastnosti delcev (površinski naboj, polarnost) in s tem njihovo združljivost z biološkimi sistemi3.
Za različne biološke uporabe je treba na površino delcev vezati različne biološke molekule, kot so na primer proteini, antigeni ali deli DNA-molekule, kar zahteva plast molekul z različnimi funkcionalnimi skupinami. Pomembno je, da so molekule močno vezane na površino delcev4,5,6. Ker je površina železovega oksida relativno inertna, ne omogoča močne vezave molekul. Močno kovalentno vezavo različnih molekul na površini delcev omogočimo, če oksidne delce pre-vlečemo z amorfnim silicijevim oksidom. Silicijev oksid ima namreč na površini močno vezane silanolne OH-skupine. Na površinske OH-skupine lahko nadalje kovalentno vežemo različne funkcionalizacijske mole-
Materiali in tehnologije / Materials and technology 42 (2008) 786, 131-133
131
S. ČAMPELJ ET AL.: PRIPRAVA NANOKOMPOZITA ZA BIOMEDICINSKE APLIKACIJE
kule. Plast silicijevega oksida na oksidnih delcih mora biti neprekinjena in homogena. Debelina plasti mora biti dovolj debela, da za{~iti magnetno jedro nanokompozita, hkrati pa dovolj tanka, da bistveno ne poslab{a njegovih magnetnih lastnosti.
Silanolne skupine na povr{ini amorfnega silicijevega oksida niso primerne za vezavo vseh biolo{ko aktivnih molekul. Tako so za vezavo razli~nih molekul potrebne razli~ne skupine, kot sta na primer aminoskupina (NH2) ali karboksilna skupina (COOH). V tem primeru lahko vežemo na površinske silanolne skupine silane, ki nosijo želeno funkcionalno skupino. Silani so molekule, ki temeljijo na spojini silan, SiH4. Navadno imajo na Si-atom vezane tri etoksidne skupine in eno alkilno verigo, ki se kon~a s funkcionalno skupino. Silani v vodi hidrolizirajo in reagirajo s površinskimi silanolnimi skupinami ter tako tvorijo mo~no Si-O-Si-vez s površino silicijevega oksida7,8,9 še za APS.
Pri tem delu smo sistemati~no raziskovali vezavo razli~no funkcionaliziranih silanskih molekul (APS, VTS) na površino kompozitnih nanodelcev iz maghemit-nega jedra in tanke prevleke silicijevega oksida.
2 EKSPERIMENTALNO DELO
2.1	Priprava nanokompozita
Sintezni postopek za pripravo kompozitnih nano-delcev je podrobno opisan drugje10. Nanodelce maghemita smo sintetizirali s koprecipitacijo ionov Fe2+ in Fe3+ v vodni raztopini s koncentrirano raztopino amonijaka. Sintetizirane nanodelce smo sprali z amonija-kalno raztopino (pH > 10,5). Na delce smo v naslednji stopnji adsorbirali citronsko kislino. Ta deluje kot surfaktant in prepre~i njihovo aglomeracijo. Prekrivanje delcev s silicijevim oksidom je potekalo s hidrolizo tetra-etoksisilana (TEOS). V etanolu raztopljen TEOS smo dodali v stabilno suspenzijo maghemitnih nanodelcev. V suspenziji nastane hidroliza TEOS-a in nukleacije silicijevega oksida na površni maghemitnih nanodelcev. Pomembno je, da v suspenziji ni aglomeratov nano-delcev, saj bi v tem primeru prekrili s silicijevim oksidom aglomerate, in ne posameznih nanodelcev. Tako pripravljene kompozitne nanodelce smo sprali in dispergirali v vodi.
Analiza kompozitnih nanodelcev je pokazala, da so iz magnetnega maghemitnega jedra s premerom (13,7 ± 2,9) nm in iz plasti amorfnega silicijevega dioksida z debelino okoli 2 nm. Izra~unana masna ploš~ina nanokompozita je 94,4 m2/g. Iz magnetnih meritev je razvidno, da kažejo kompozitni nanodelci superpara-magnetizem ob relativno visoki nasi~eni magnetizaciji 35 ■ 10-4 T/g.
2.2	Vezava silanskih molekul na površino kompozitnih
nanodelcev
Na površino kompozitnih nanodelcev smo vezali naslednje silanske molekule: (3-aminopropil) trietoksi-
APS	VTS
Slika 1: Shematski prikaz molekul APS in VTS Figure 1: Schematic presentation of APS and VTS molecules
silan, (CH3CH2O)3Si(CH2)3NH2 (APS) in viniltrietoksi-silan, (CH3CH2O)3SiCHCH2 (VTS) (slika 1). Vezava molekul je potekla v vodem mediju pri temperaturi 50 °C. Stabilni vodni suspenziji (20 mL) z masnim deležem 0,5 % kompozitnih nanodelcev smo dodali etanol (25 mL), v katerem smo predhodno raztopili silan ( 0,02 mol). Izra~unan dodatek silana na površino nanokom-pozita je bil v vseh primerih 2 mmol/m2.
Za spremljanje prekrivanja površine kompozitnih delcev in dolo~itev koli~ine silana, ki je potrebna za popolno prekritje površine nanokompozita pri prej omenjenih pogojih, smo uporabili APS. Pri tem smo dodatek APS spreminjali od 1 pmol/m2 do 2 mmol/m2.
Po 5 h smo delce magnetno lo~ili in jih temeljito sprali z destilirano vodo. Uspešnost prekritja nanokompozita s silani smo spremljali z elektrokineti~nimi meritvami, ki so bile opravljene z zetametrom (Brook-haven Instruments Corp., ZetaPALS).
Površinsko koncentracijo aminoskupin na površini kompozitnih nanodelcev smo dolo~ali s kondukto-metri~no titracijo. Suspenzijo spranih kompozitnih nanodelcev, prevle~enih z APS v vodi, smo titrirali z razred~eno raztopino klorovodikove kisline (HCl). Prevodnost suspenzije je odvisna od koli~ine raztopljenih ionov v nosilni teko~ini (vodi). Na za~etku imamo v raztopini le -NH3+ vezane na površini delcev in ione OH- v vodi. Lastni pH suspenzije je 9. Med titracijo pote~e reakcija med klorovodikovo kislino in aminoskupino. Pri tem nastaja nedisociirana molekula vode, ki ne prispeva k prevodnosti raztopine, zato se le-ta bistveno ne spremeni. Ko v raztopini ni ve~ površinskih aminoskupin, ki bi bile na voljo za reakcijo s klorovodikovo kislino, se koli~ina ionov z vsakim dodatkom kisline zelo pove~a. Posledica je povišana prevodnost raztopine. Ekvivalentna to~ka se dolo~i iz ostre spremembe v naklonu premice odvisnosti prevodnosti od koncentracije dodane HCl. Prevodnost suspenzije smo merili s konduktometrom (Radiometer analytical IONcheck30).
3 REZULTATI IN DISKUSIJA
Slika 2 prikazuje elektrokineti~ne meritve za kom-pozitne nanodelce, funkcionalizirane z razli~nimi silani. Sami kompozitni nanodelci kažejo v nevtralnem mo~no negativen zeta- potencial, ki je posledica negativno
182
Materiali in tehnologije / Materials and technology 42 (2008) 4, 179-182
S. ČAMPELJ ET AL.: PRIPRAVA NANOKOMPOZITA ZA BIOMEDICINSKE APLIKACIJE
Slika 2: Graf elektrokinetičnih meritev za nanokompozitne delce (polna linija), nanokompozitne delce, funkcionalizirane z APS (pik~asta linija) in nanokompozinte delce, funkcionalizirane z VTS (~rtkana linija)
Figure 2: Graph of electro kinetics measurements for nano-composite particles (full line), nano-composite particles functionalized with APS (dotted line) and nano-composite particles functionalized with VTS (dashed line)
nabitih silanolnih OH-skupin na povr{ini. Tako imajo izoelektrično točko (IEP) pri kisli pH-vrednosti okoli 2,5. Iz elektrokinetičnih meritev je razvidno, daje v vseh primerih funkcionalizacije pri{lo do sprememb na povr{ini delcev, kar gre pripisati uspe{ni vezavi silanov na njihovo povr{ino. Po pričakovanju je sprememba najbolj očitna, če na povr{ino delcev vežemo APS. Opazen je premik IEP od pH = 2,5 na pH = 9,5. APS ima na koncu alkilne verige aminoskupino, ki je po naravi bazična. To pomeni, da je v območju visokih pH-vrednosti nedisociirana in ima negativen naboj. Ko se pH-vrednost medija premakne na področje nizkih pH-vrednosti, se aminoskupina protonira in posledično dobimo pozitivno nabito skupino na koncu alkilne verige -NH3+.
V primeru vezave VTS na povr{ino nanodelcev se IEP ne spremeni, pač pa se poveča negativni naboj. Vinilna skupina ima zaradi dvojne vezi povečano elektronsko gostoto in posledično višji negativni naboj.
V kislem območju pH-vrednosti poteče reakcija med dvojno vezjo in vodo, pri čemer nastane alkohol. Hidroksilna skupina na koncu alkilne verige je po svojih kemijskih lastnostih podobna silanolnim OH-skupinam, zato se IEP ne premakne.
Slika 3 prikazuje elektrokinetične meritve za različne dodatke APS, uporabljene v procesu vezave na površino kompozitnih nanodelcev. Množina dodanega APS k nanodelcem je izražena v mikromolih APS na kvadratni meter površine nanodelcev. Z višanjem dodatka APS se viša koncentracija APS, vezana na površini nanodelcev, zato se IEP suspenzije postopno povečuje. Končno pH-vrednost IEP dosežemo pri dodatku APS enakem ali večjem od 20 pmol/m2. Sklepamo, da je v tem primeru površina nanodelcev nasičena z vezanimi molekulami.
Rezultati elektrokemičnih meritev se skladajo s kon-duktometričnimi meritvami koncentracije aminoskupin na površini nanodelcev (Tabela 1). Z večanjem količine dodanega APS se veča tudi izmerjena koncentracija APS na površini nanodelcev. Pri dodatku 20 pmol APS na kvadratni meter površine nanodelcev, se je na površino vezal APS v površinski koncentraciji (8,1 ± 0,8) pmol /m2 oziroma 4,8 ± 0,5 molekul APS na kvadratni nanometer površine nanodelcev. Vrednost se dobro ujema s številom silicijevih atomov oziroma silanolnih OH-skupin na površini amorfnega silicijevega oksida, ki je 4,55 molekul OH na kvadratni nanometer silicijevega oksida11. Na vsako od površinskih silanolnih skupin se namreč lahko veže po ena molekula APS. Pri višjih dodatkih APS je izmerjeno število aminoskupin na površini večje od teoretično možnega. Vzrok za to je verjetno nastanek polimernih molekul med hidrolizo APS zaradi relativno visoke koncentracije APS v suspenziji. Pri tem nastanejo polimerne molekule nižjih molekulskih mas, ki se med seboj povezujejo in pri tem nastajajo polimerne molekule višjih molekulskih mas. Teh z izpiranjem delcev po funkcionalizaciji verjetno nismo popolnoma izločili. Znano je, da ta proces nastane, ko koncentracija silana preseže vrednost 3 mmol/L. V primeru dodatka 500 pmol APS na kvadratni meter nanodelcev je bila koncentracija silana v vodni fazi suspenzije 86 mmol/L.
Tabela 1: Rezultati konduktometričnih meritev površinske koncentracije aminoskupin na površini nanodelcev v odvisnosti od dodatka APS uporabljenega v procesu funkcionalizacije. Table 1: Results of conductometric titration measurements for the nano-composite functionalized with different amounts of APS
Slika 3: Graf elektrokinetičnih meritev za nanokompozit, funkcionali-ziran z različnimi dodatki APS
Figure 3: Graph of electro kinetics measurements for nano-composite functionalized with different amounts of APS
Dodatek APS na površini delcev |imol/m2	1	3	5	20	500
Izmerjena površinska koncentracija amino-skupin, Carnino/(|imol/m2)	3,2 ± 1,5	3,7 ± 1	2,4 ± 1	8,1 ± 0,8	11,0 ± 1
Koncentracija molekul APS na površini delcev, c/nm2	1,9 ± 0,9	2,2 ± 0,6	1,4 ± 0,6	4,8 ± 0,5	6,6 ± 0,6
Materiali in tehnologije / Materials and technology 42 (2008) 4, 179-182
181
S. ČAMPELJ ET AL.: PRIPRAVA NANOKOMPOZITA ZA BIOMEDICINSKE APLIKACIJE
4 SKLEP
Povr{ino magnetnih nanodelcev smo funkcionalizi-rali z vezavo razli~nih silanskih molekul ((3-amino-propil)trietoksisilan (APS) in viniltrietoksisilan (VTS)) na njihovo povr{ino preko vmesne tanke plasti amorf-nega silicijevaga oksida. Slednji omogo~i s svojimi povr{inskimi silanolnimi OH-skupinami mo~no kova-lentno Si-O-Si-vez silana s povr{ino delcev. Povr{inska koncentracija silanskih molekul. vezanih na povr{ini nanodelcev, se sklada s koncentracijo silanolnih skupin na povr{ini amorfnega silicijevega oksida.
5 LITERATURA
1	Q. A. Pankhurst, J. Connolly, S. K. Jones, J. Dobson, J. Phys. D: Appl. Phys. 36 (2003), R167-R181
2	R. Hiergeist, W. Andrä, N. Buske, R. Hergt, I. Hilger, U. Richter, W. Kaiser, J. Magn. Magn. Mater., 201 (1999), 420-422
3	C. C. Berry, A. S. G. Curtis, J. Phys. D, 36 (2003), R198-R206
4	A. K. Gupta, M. Gupta, Biomaterials, 26 (2005), 3995-4021
5	Y. Ichiyanagi, S. Moritake, S. Taira, M. Setou, J. Magn. Magn. Mater., 310 (2007), 2877-2879
6	M. E. Park, J. H. Chang, Mat. Sci. Eng. C, 27 (2007), 1232-1235
7	Z. Ma, Y. Guan, H. Liu, J. Magn. Magn. Mater. 301 (2006), 469-477 8X. Liu, J. Xing, Y. Guan, G. Shan, H. Liu, Colloids Surf A, 238
(2004), 127-131
9	K. Woo, J. Hong, J. P. Ahn, J. Magn. Magn. Mater., 293 (2005), 177-181
10	S. Čampelj, D. Makovec, M. Bele, M. Drofenik, J. Jamnik, Mater. Tehnol., 41 (2007), 103-107
11	R. K. Iler, The chemistry of silica, John Wiley & Sons, New York 1979, 637
182
Materiali in tehnologije / Materials and technology 42 (2008) 4, 179-182