Molekularne metode za tipizacijo glive Aspergillusfumigatus in njihova uporaba
MoLecuLar methods for typing of Aspergillusfumigatus and their use
Tjaša Cerar, romina kofol, Tadeja Matos
Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
doc. dr. Tadeja Matos, dr. med. spec. klin. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta v Ljubljani, Zaloška 4, 1000 Ljubljana, tel.: 01-543-74-22, e-mail: tadeja.matos@ mf.uni-lj.si
Ključne besede:
A^. fumigatus, tipizacija, razlikovalna moč, kratka ponavljajoča se zaporedja DNK, epidemiologija
Key words:
A.. fumigatus, typing, discriminatory power, microsatellites, epidemiology
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2011; 80: 586-92
Prispelo: 31. avg. 2010, Sprejeto: 12. apr. 2011
Izvleček
Aspergillus _fumigatus je povsod prisoten (ubi-kvitaren) mikroorganizem. Spore se nahajajo v zraku, prsti, vodi in na razpadajočem organskem materialu. Povzroča težke okužbe, ki lahko ogrozijo življenje, posebno pri imunsko oslabelih bolnikih. Označuje ga izredna pestrost genotipov. S tipizacijskimi metodami lahko pridobimo pomembne epidemiološke podatke o raznolikosti in pogostosti pojavljanja posameznih sevov, kar nam lahko pomaga pri iskanju vira okužbe pri izbruhih bolezni in pri načrtovanju načinov za njihovo preprečevanje. V prispevku navajamo najpogostejše metode, ki jih uporabljamo za ge-notipizacijo glive A. fumigatus. Opisujemo njihove prednosti in slabosti ter izsledke novejših genotipizacijskih raziskav.
Abstract
Aspergillus fumigatus is a ubiquitous microorganism. Spores can be found in the air, soil, water and decomposing organic material. It causes severe life-threatening infections especially in im-munocompromised patients. Great diversity of genotypes is characteristic for this microorganism. Using typing methods, relevant epidemio-logical data regarding the diversity and frequency of the strains can be obtained, which can be useful for determining the source of infection in outbreaks and ways for its prevention. This paper presents the most frequently used methods for genotyping of A. fumigatus, pointing out their advantages and disadvantages with a review of recent study results.
Uvod
Aspergillus fumigatus je saprofitna gliva, ki se nahaja v zemlji, vodi, razpadajočem rastlinju in organskem materialu. Spore asper-gilusa se razširjajo z zrakom, zato so jim ljudje nenehno izpostavljeni. Vdihovanje spor lahko vodi do nastanka različnih oblik alergijskih odzivov, posebno so jim izpostavljeni ljudje z bronhialno astmo in s cistično fibrozo. Plesen lahko kolonizira dihalne poti ali zunanji sluhovod in povzroči kronično vnetje. V obliki aspergiloma se lahko naseli v obnosnih sinusih ali že obstoječih votlinah v pljučih. Najtežje oblike okužb povzroča pri hudo imunsko oslabelih osebah; najbolj ogrožene skupine so nevtropenični bolniki po presaditivi krvotvornih matičnih celic in drugih čvrstih organov, posebno jeter, pljuč in srca. Invazivna aspergiloza se redkeje lahko razvije tudi pri nenevtropeničnih
bolnikih, posebno pri tistih, ki se zdravijo v enotah za intenzivno zdravljenje in imajo pogosto prisotnih več dejavnikov tveganja za nastanek oportunističnih okužb.
Kljub temu, da so aspergiloze pomemben del mikoz (5-10 % pri hematoloških bolnikih po neobjavljenih podatkih), objavljenih podatkov za Slovenijo ni.
Za A. fumigatus je značilna izredna pestrost genotipov, ki nam včasih onemogoča razumevanje poti širjenja in iskanja virov okužbe. To je še posebej težavno, saj ne vemo, ali predhodna kolonizacija dihalne sluznice vpliva na pojav invazivne bolezni ob padcu imunske odpornosti in v kolikšni meri.
Tipizacija izolatov A. fumigatus je pomembna za pridobitev epidemioloških podatkov o različnosti in pogostosti patogenih genotipov in pri določevanju vira okužbe pri izbruhih bolezni. S tipizacijo izolatov
lahko izboljšamo razumevanje genetskih in epidemioloških povezav med okoljskimi in kliničnimi izolati ter tako predvidimo poti širjenja. Poznavanje poti širjenja pa je pomembno pri načrtovanju načinov preprečevanja okužb.
Za genotipizacijo A. fumigatus so na voljo številne metode, ki se razlikujejo v hitrosti, enostavnosti izvedbe, ponovljivosti, tolmačenju rezultatov in sposobnosti metode, da z njo določimo genotip vsakega seva. Zelo pomemben dejavnik je razlikovalna moč. Z njo ocenimo, v kolikšni meri tipiza-cijska metoda lahko razlikuje med preiskovanimi izolati. Razlikovalna moč tipizacijske metode predstavlja verjetnost, da bosta dva naključno izbrana nesorodna izolata, izbrana iz testne populacije, določena kot različna. Izračunamo jo z uporabo Simpsonovega indeksa različnosti (angl. diversity, D); vrednost D 1,0 pomeni, da je s tipizacijsko metodo možno razlikovati med vsemi izolati, vrednost 0,0 pa, da so vsi izolati identičnega tipa.1
Trenutno smernice za opredelitev genotipa še niso izoblikovane, zato je tolmačenje rezultatov subjektivno in lahko privede do napak pri določitvi genotipa. Subjektivno tolmačenje rezultatov je pogosto pri tehnikah, ki vključujejo analizo fragmentov (RAPD, RFLP, AFLP), pri katerih ni natančno določeno, kakšna razlika v vzorcu pomeni nov podtip in kakšna nov tip. Z uporabo natančnih genotipizacijskih tehnik (MLST, StrAf), pri katerih je tarča natančno določena in so tako začetniki zelo specifični, se tako lahko delno izognemo subjektivni razlagi. Dodatna prednost analize kratkih ponavljajočih se zaporedij DNK, ki je v zadnjem času ena izmed najbolj uporabljenih metod, je visoka ponovljivost. Ta omogoča epidemiološko analizo velikega števila izola-tov v daljšem časovnem obdobju.
Naključno pomnožena polimorfna DNK (angl. random amplification of polymorphic DNA, RAPD)
Pri tej molekularni metodi uporabljamo oligonukleotidni začetnik dolžine 8 do 20
baznih parov z naključnim nukleotidnim zaporedjem ter nizko temperaturo prilega-nja. Pod temi pogoji se lahko oligonukleo-tidni začetnik nespecifično veže na številne dele genoma. Pomnožene dele genoma ločimo z gelsko elektroforezo, pri kateri dobimo večje število fragmentov različnih velikosti. Nesorodni izolati se razlikujejo v številu in velikosti pomnoženih fragmentov genoma.^ Če se profili izolatov razlikujejo v enem fragmentu, jih uvrstimo v različne geno-tipe.3 Glavne prednosti metode so hitra in enostavna izvedba, nizka cena ter pomno-ževanje tarče, za katero ne poznamo nu-kleotidnega zaporedja. Slabosti metode so omejena razlikovalna moč in ponovljivost ter težave pri tolmačenju in medlaboratorij-ski izmenjavi rezultatov. ^
V raziskavah so za določanje različnosti med sevi A. fumigatus uporabili številne oli-gonukleotidne začetnike (R151, NS3, R108, UBC69, RP4-2 in UBC90), med katerimi so z R108 dosegli najvišjo razlikovalno moč.^-^^
Tehnika RAPD je ena izmed najbolj uporabljenih, predvsem zaradi hitre in enostavne izvedbe, vendar se je potrebno zavedati njene majhne razlikovalne moči in slabe ponovljivosti.
Kratka ponavljajoča se DNK zaporedja pri A.fumigatus (angl. short tandem repeats for A.fumigatus, test StrAf)
Kratka ponavljajoča se DNK zaporedja pogosto najdemo v genomih evkariontov, včasih pa tudi pri prokariontih.^^ Kratka zaporedja z 2 do 4 bazami so zaporedno ponovljena 10- do 100-krat. Izolate razlikujemo glede na število ponovitev kratkega zaporedja. Kratka ponavljajoča se zaporedja pomnožimo z verižno reakcijo s polimerazo. Oligonukleotidni začetniki vsebujejo zaporedja obrobnih delov kratkih ponavljajočih se zaporedji DNK. Eden od oligonukleoti-dnih začetnikov je označen s fluorescentnim barvilom. Po končanem pomnoževanju produkte ločujemo s kapilarno elektroforezo, za katero sta značilni visoka ločljivost in občutljivost. Omogoča namreč ločevanje odsekov, ki se med seboj v dolžini razlikujejo le
Tabela i: PregLed Lastnosti tipizacijskih metod.®
Tipizacijska metoda	Razlikovalna moč	Ponovljivost	Zahtevnost	Vrstna specifičnost	Tolmačenje
RAPD	omejena	omejena	enostavna	ne	srednja
Kratka ponavljajoča se zaporedja DnK	visoka	odlična	srednja	da	Lahka
RFLP brez hibridizacije	omejena	omejena	srednja	ne	težavna
Afutl-RFLP	visoka	dobra	težavna	da	težavna
MLST	dobra	odlična	srednja	da	Lahka
AFLP	visoka	dobra	srednja	ne	težavna
za en nukleotid. Rezultate podajamo v obliki elektroferograma, iz katerega razberemo velikost in relativno koncentracijo analiziranih alelov. Iz velikosti odsekov lahko izpeljemo število ponovitev, ki predstavljajo genotip posameznega izolata. V raziskavi Bart-Dela-besse in sod. so analizirali 4 različna kratka ponavljajoča se zaporedja DNK (A, B, C in D). Kratko ponavljajoče se zaporedje DNK A dolžine 108-158 bp je lahko vsebovalo 16-41 ponovitev zaporedja CA, kratko ponavljajoče se zaporedje DNK B dolžine 102134 bp, 9-25 ponovitev zaporedja CA, kratka ponavljajoča se zaporedja DNK C (165-183 bp) in D (76-134 bp) pa 7-16 oziroma 7-36 ponovite zaporedja CA.^^ Skupna razlikovalna moč med 100 izolati plesni A. fumi-gatus z uporabo vseh štirih ponavljajočih se zaporedji DNK je dosegla 0,994.1^
De Valk in sod. so določali 9 različnih ponavljajočih se zaporedij DNK, po tri z dvonukleotidnimi ponovitvami, trinukle-otidnimi in štirinukleotidnimi ponovitva-mi.i5 Analizirali so 100 izolatov A. fumiga-tus. Z analizo rezultatov, pridobljenih na vseh 9 odsekih, so dosegli razlikovalno moč
0,9994.15
Metoda ima visoko moč razlikovanja, je dobro ponovljiva, srednje zahtevna za izvedbo ter vrstno specifična. i^
Polimorfizem dolžin restrikcijskih fragmentov (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP), določen s elektroforezo v utripajočem električnem polju
Pri metodi RFLP uporabljamo restrikcij-ske encime, ki cepijo celokupno genomsko DNK izolata s prepoznavanjem zaporedja velikosti 6 baznih parov. Prednost imajo encimi, ki prepoznajo malo restrikcijskih mest. Z rezanjem genoma A. fumigatus lahko pridobimo do 10.000 odsekov, odvisno od re-strikcijskega encima. Pri analizi se omejimo na odseke velikosti 10-50 kilobaznih parov, ker manjših od 10 kilobaznih parov ne zmoremo ločiti med sabo. Izolati A. fumigatus se razlikujejo v restrikcijskih vzorcih. Razlike so posledica zamenjave, vstavitve ali delecije nukleotidov v prepoznavnem zaporedju en-cima.i3
V raziskavi Denning in sod. so preizkusili številne restrikcijske encime, med katerimi sta encima XhoI in SaZI izkazala najvišjo stopnjo razlikovanja.16
Različica metode je RFLP s hibridizacijo, pri kateri ločene odseke prenesemo na naj-lonsko membrano po t. i. postopku southern blot. Na specifične odseke nato hibridizira-mo označene lovke. S tem analiziramo le specifično podskupino restrikcijskih fragmentov. Ponavljajoče se sekvence DNK, ki jih uporabljajo kot lovke, predstavljajo eno izmed boljših orodij za tipizacijo sevov. Med temi so se za tipizacijo A. fumigatus izkazale za najustreznejše naslednje lovke: Afut1,
Afut 2, Af4, Af4A in Tafi. Te hibridizirajo z restrikcijskimi fragmenti, ki vsebujejo ponavljajočo DNK.17 Za razlikovanje izolatov A. fumigatus so uporabili številne kombinacije restrikcijskih encimov in lovk. Najpogosteje uporabljena kombinacija je restrikcijski encim £coR1 ter lovka imenovana Afut1.18 Metoda ima visoko moč razlikovanja, je ponovljiva, vrstno specifična, vendar sta izvedba metode in tolmačenje rezultatov težavna.^^
Omenjeno metodo so v raziskavi uporabili Lasker in sod.^ V raziskavi so tipizirali 49 izolatov A. fumigatus, ki so jih pridobili v štirih bolnišničnih izbruhih. Z metodo Aful RFLP so določili 40 tipov, metoda pa je imela v primerjavi s klasično RFLP analizo višjo razlikovalno moč in ponovljivost.
Tipizacija na osnovi multilokusnih zaporedij (angl. multilocus sequence typing, MLST)
Metoda MLST primerja nukleotidni po-limorfizem med regijami s petimi do sedmimi geni (navadno vzdrževalnimi; angl. house-keeping), ki se zaradi svoje pomembne funkcije v času le malo spreminjajo. ^^ Metoda vključuje pomnoževanje teh genov (navadno sedmih), ki jim zatem določimo nukleotidno zaporedje. Po določitvi nu-kleotidnega zaporedja dobimo alelni profil izolata, ki predstavlja kombinacijo alelnih različic sekveniranih genov. Iz alelnega profila določimo sekvenčni tip izolata. Polimor-fizmi, ki vodijo v nastanek alelnih različic, so shranjeni v bazo podatkov in tvorijo se-kvenčni tip izolata (angl. sequence type, ST). Sheme MLST številnih mikroorganizmov so dostopne na spletu (http://www.mlst.net). Metoda ima dobro razlikovalno moč, je ponovljiva, primerljiva med laboratoriji, srednje zahtevna ter vrstno specifična.^^
Razmerje med izolati določamo s primerjavo alelnih profilov: sorodni izolati imajo enake oziroma podobne ST, nesoro-dni pa različne ST.
V raziskavi so Bain in sod. določali nukleotidno zaporedje 7 delov različnih genov A. fumigatus (ANXC4, BGT1, CAT1, LIP, MATI-2, sodb in ZRF2). Podrobnosti sis-
tema MLST so na voljo na spletu (http://pu-bmlst.org/afumigatus). Z opisano metodo so med 100 izolati določili 30 ST in dosegli razlikovalno moč 0,93.2®
Metoda MLST ni uporabna za tipizacijo A. fumigatus med preiskavami izbruhov, temveč za sledenje sorodnosti med genotipi.
Polimorfizem dolžin pomnoženih fragmentov (angl. amplified fragment length polymorphism, AFLP)
Za razlikovanje med sevi A. fumigatus uporabljamo tudi novejšo metodo, ki temelji na določanju polimorfizma dolžin pomnoženih fragmentov. Metoda vključuje rezanje celokupne genomske DNK z dvema restrik-cijskima encimoma, med katerima eden reže s povprečno, drugi pa z visoko frekvenco. Na lepljive konce restrikcijskih fragmentov vežemo adapterje. Restrikcijske fragmente pomnožimo z verižno reakcijo s polimera-zo; eden od oligonukleotidnih začetnikov je označen s fluorescentnim barvilom. Pridelke ločimo s kapilarno elektroforezo.21 Tako dobimo visoko informativni skupek fragmentov DNK, velikostnega razreda 50 do 500 baznih parov. Razlike med različnimi izolati izhajajo iz razlik v številu in mestu prepoznavnih mest restrikcijskih encimov v genomu.
Metoda ima veliko moč razlikovanja, je ponovljiva, srednje zahtevna za izvedbo, vendar je tolmačenje rezultatov zahtevno in tudi ni vrstno specifično.^^
Uporaba molekularnih tipizacijskih metod
Genotipska raznolikost
Spore aspergilov predstavljajo 0,1- do 22,0-odstotni delež vseh spor v zraku. Koncentracije nihajo glede na vremenske razmere in lokalne dejavnike. Koncentracije spor A. fumigatus se gibljejo od približno 5/m3 do več kot 30/m3.22 obsežnost genetske raznolikosti so dokazali z analizo Afuti-RFLP približno 900 kliničnih in okoljskih izolatov A. fumigatus. Opredelili so kar 424 različnih
genotipov in iz različnih geografskih področij dokazali le 14 identičnih sevov. Med genotipi in geografskimi področji niso ugotovili nobene povezanosti.^^ V drugi raziskavi so analizirali 700 izolatov iz bolnišničnega okolja, med katerimi se je 85 »/o genotipov pojavilo samo enkrat, 15 % genotipov pa je bilo v bolnišničnem okolju prisotnih dlje.^^ Dokazali so, da lahko obstanejo v bolnišničnem okolju tudi več mesecev. Tako se lahko bolniki iz različnih delov bolnišnice okužijo z istim sevom. Lee in sodelavci so dokazali, da notranje okolje nudi ugodnejše razmere za preživetje spor v zraku v primerjavi zunanjim okoljem.25
Tudi z analizo RFLP niso ugotovili razlik med kliničnimi in okoljskimi izolati A. fu-migatus, kar kaže na to, da je lahko pogojno patogen vsak sev.^®
Viri okužbe
Glavni viri spor aspergilov v zraku so lončnice, razpadajoče rastlinje, drugi organski material in gradbišča. Od tu se v okolico sprošča veliko spor, ki jih vdihavamo.27'28 Poleg spor aspergilov v zraku so se kot pomemben vir bolnišničnih okužb z aspergili izkazali tudi aerosoli vode. V raziskavi so Warris in sodelavci preiskovali 96 kliničnih in okoljskih izolatov A. fumigatus. Genom so rezali z restrikcijskima encimoma EcoRI in Msel. Glede na rezultate so okoljske izo-late razvrstili v dve skupini, ki sta vsebovali izolate iz vode in zraka. Genetska sorodnost kliničnih in okoljskih izolatov nakazuje, da so bili bolniki z invazivno aspergilozo okuženi s sevi iz vode in tudi iz zraka.^^
Z molekularnimi genotipizacijskimi metodami lahko ugotovimo, ali se je bolnik okužil v bolnišnici ali zunaj nje. Ujemanje genotipov iz okolja, kjer je bil bolnik ho-spitaliziran, in iz kliničnih vzorcev bolnika kaže na možnost bolnišnične okužbe. Ker je raznolikost genotipov A. fumigatus velika, je verjetnost, da je bolnik okužen z istim genotipom, kot ga najdemo v domnevnem viru, majhna.30 Chalazet in sodelavci so pri 30 od 73 bolnikov z invazivno aspergilozo dokazali bolnišnični vir okužbe. Pri njih so namreč dokazali identični sev iz kliničnih vzorcev dveh bolnikov ali iz kliničnega vzorca bol-
nika in bolnišničnega okolja.^^ V literaturi najdemo tudi številne druge raziskave, ki skušajo pojasniti bolnišnični vir okužbe z A. fumigatus. Uporabljamo različne metode, kot so analiza kratkih ponavljajočih se zaporedij DNK, RAPD, RAPD, kombinirana z analizo SSDP, ali SSDP in MLEE.^^-^^
Klinično-epidemiološke raziskave
Tipizacija kliničnih izolatov nam lahko daje tudi vpogled v raznolikost sevov A. fumigatus pri različnih skupinah bolnikov. Bolniki s cistično fibrozo so stalno kolonizirani z več genotipi A. fumigatus hkrati. V raziskavi so Cimon in sodelavci pokazali, da lahko pri pred kratkim koloniziranih bolnikih s cistično fibrozo najdemo več različnih genotipov kot pri bolnikih, ki so kronično kolonizirani in pri katerih lahko osamimo le omejeno število genotipov, med katerimi prevladuje en genotip. Tudi bolniki z inva-zivno aspergilozo so pogosto okuženi z več genotipi. Chalazet in sodelavci so pri 27 od 73 bolnikov z invazivno aspergilozo osamili številne izolate (od dva do šest), ki so pripadali različnim genotipom.^^
Tipizacijske metode omogočajo prepoznavanje novih vrst, ki do sedaj še niso bile opisane. Novo opisana patogena vrsta je Aspergillus lentulus, ki je morfološko podobna A. fumigatus in so jo na novo opisali z uporabo sekvenčne analize in analize RFLP mitohondrijske DNK.^^-^^ Osamili so jo iz različnih geografskih področij. Kasneje so ugotovili, da se od A. fumigatus sensu stricto loči po tem, da ni sposobna rasti na 48 °C in ima različne profile sekundarnih metabo-litov. To je klinično pomembno predvsem zato, ker so vsi doslej osamljeni izolati A. lentulus in vitro slabše občutljivi za antimi-kotike kot A. fumigatus.
V Tabeli 1 združeno prikazujemo značilnosti posameznih tipizacijskih metod. ^^
Zaključek
Tipizacija izolatov je pokazala veliko genetsko raznolikost sevov A. fumigatus, zato moramo pri tipizaciji uporabljati metode z visoko razlikovalno močjo, kot sta metodi
RFLP - Afuti in AFLP ter analiza kratkih ponavljajočih se zaporedij DNK.i^
Literatura
1.	Hunter PR, Gaston MA. Numerical index of the discriminatory ability of typing systems: an application of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol 1988; 26: 2465-6.
2.	Welsh J, McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res 1990; 18: 7213-8.
3.	Verweij PE, Meis JF, Sarfati J, Hoogkamp-Kor-stanje JA, Latge JP, Melchers WJ. Genotypic characterization of sequential Aspergillus fumigatus isolates from patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol 1996; 34: 2595-7.
4.	Lasker BA. Evaluation of performance of four genotypic methods for studying the genetic epidemiology of Aspergillus fumigatus isolates. J Clin Microbiol 2002; 40: 2886-92.
5.	Raclasky V, Trtkova J, Ruskova L, Buchta V, Bole-hovska R, Vackova M, et al. Primer R108 performs best in the RAPD strain typing of three Aspergil-lus species frequently isolated from patients. Folia Microbiol (Praha) 2006; 51: 136-40.
6.	Baddley JW, Pappas PG, Smith AC, Moser SA. Epidemiology of Aspergillus terreus at a university hospital. J Clin Microbiol 2003; 41: 5525-9.
7.	Lass-Florl C, Grif K, Kontoyiannis DP. Molecular typing of Aspergillus terreus isolates collected in Houston, Texas, and Innsbruck, Austria: evidence of great genetic diversity. J Clin Microbiol 2007; 45: 2686-90.
8.	Rath PM, Petermeier K, Verweij PE, Ansorg R. Differentiation of Aspergillus ustus strains by random amplification of polymorphic DNA. J Clin Microbiol 2002; 40: 2231-3.
9.	Rodriguez E, Symoens F, Mondon P, MaHie M, Piens MA, Lebeau B, et al. Combination of three typing methods for the molecular epidemiology of Aspergillus fumigatus infections. European Research Group on Biotype and Genotype of Aspergil-lus. J Med Microbiol 1999; 48: 181-94.
10.	Aufauvre-Brown A, Cohen J, Holden DW. Use of randomly amplified polymorphic DNA markers to distinguish isolates of Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol 1992; 30: 2991-3.
11.	Hong SB, Kim DH, Park IC, Choi YJ, Shin HD, Samson R. Re-identification of Aspergillus fumigatus sensu lato based on a new concept of species delimitation. J Microbiol 2010; 48: 607-15.
12.	Vanhee LM, Symoens F, Jacobsen MD, Nelis HJ, Coenye T. Comparison of multiple typing methods for Aspergillus fumigatus. Clin Microbiol Infect 2009; 15: 643-50.
13.	de Valk HA, Klaassen CH, Meis JF. Molecular typing of Aspergillus species. Mycoses 2008; 51:
463-76.
14.	Bart-Delabesse E, Humbert JF, Delabesse E, Bretagne S. Microsatellite markers for typing Asper-gillus fumigatus isolates. J Clin Microbiol 1998; 36: 2413-8.
15.	de Valk HA, Meis JF, Curfs IM, Muehlethaler K, Mouton JW, Klaassen CH. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-re-
solution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. J Clin Microbiol 2005; 43: 4112-20.
16.	Denning DW, Clemons KV, Hanson LH, Stevens DA. Restriction endonuclease analysis of total cellular DNA of Aspergillus fumigatus isolates of geographically and epidemiologically diverse origin. J Infect Dis 1990; 162: 1151-8.
17.	Varga J. Molecular typing of aspergilli: Recent developments and outcomes. Medical Mycology 2006; 44: 149-161.
18.	Girardin H, Latge JP, Srikantha T, Morrow B, Soll DR. Development of DNA probes for fingerprinting Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol 1993;
31: 1547-54.
19.	Taylor JW, Fisher MC. Fungal multilocus sequence typing—it's not just for bacteria. Curr Opin Microbiol 2003; 6: 351-6.
20.	Bain JM, Tavanti A, Davidson AD, Jacobsen MD, Shaw D, Gow NA, et al. Multilocus sequence typing of the pathogenic fungus Aspergillus fumigatus. J Clin Microbiol 2007; 45: 1469-77.
21.	Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res 1995; 23:
4407-14.
22.	Mullins J, Harvey R, Seaton A. Sources and incidence of airborne Aspergillus fumigatus (Fres). Clin Allergy 1976; 6: 209-17.
23.	Debeaupuis JP, Sarfati J, Chazalet V, Latge JP. Genetic diversity among clinical and environmental isolates of Aspergillus fumigatus. Infect Immun
1997; 65: 3080-5.
24.	Chazalet V, Debeaupuis JP, Sarfati J, Lorthola-ry J, Ribaud P, Shah P, et al. Molecular typing of environmental and patient isolates of Aspergillus fumigatus from various hospital settings. J Clin Microbiol 1998; 36: 1494-500.
25.	Lee T, Grinshpun SA, Martuzevicius D, Adhikari A, Crawford CM, Reponen T. Culturability and concentration of indoor and outdoor airborne fungi in six single-family homes. Atmos Environ 2006; 40: 2902-2910.
26.	Bart-Delabesse E, Latge JP. Ecology and genetics diversity of Aspergillus fumigatus. In: JE D, GS K, eds. The Mycota. Xii. Human Fungal Pathogens. Heidelberg: Springer-Verlag; 2003. p. 23-36.
27.	Warris A, Voss A, Verweij PE. Hospital sources of Aspergillus: New routes of transmission? Rev Ibe-roam Micol 2001; 18: 156-62.
28.	Woodcock AA, Steel N, Moore CB, Howard SJ, Custovic A, Denning DW. Fungal contamination of bedding. Allergy 2006; 61: 140-2.
29.	Warris A, Klaassen CH, Meis JF, De Ruiter MT, De Valk HA, Abrahamsen TG, et al. Molecular epidemiology of Aspergillus fumigatus isolates recovered from water, air, and patients shows two clusters of genetically distinct strains. J Clin Microbiol 2003; 41: 4101-6.
30.	Symoens F, Burnod J, Lebeau B, Viviani MA, Pi-ens MA, Tortorano AM, et al. Hospital-acquired Aspergillus fumigatus infection: can molecular typing methods identify an environmental source? J Hosp Infect 2002; 52: 60-7.
31.	Guarro J, Sole M, Castany R, Cano J, Teixido A, Pujol I, et al. Use of random amplified microsatel-lites to type isolates from an outbreak of nosoco-
mial aspergillosis in a general medical ward. Med Mycol 2005; 43: 365-71.
32.	Menotti J, Waller J, Meunier O, Letscher-Bru V, Herbrecht R, Candolfi E. Epidemiological study of invasive pulmonary aspergillosis in a haematolo-gy unit by molecular typing of environmental and patient isolates of Aspergillus fumigatus. J Hosp Infect 2005; 60: 61-8.
33.	Cimon B, Symoens F, Zouhair R, Chabasse D, No-lard N, Defontaine A, et al. Molecular epidemiology of airway colonisation by Aspergillus fumi-gatus in cystic fibrosis patients. J Med Microbiol
2001; 50: 367-74.
34.	Varga J, Vida Z, Toth B, Debets F, Horie Y. Phylo-genetic analysis of newly described Neosartorya species. Antonie Van Leeuwenhoek 2000; 77:
235-9.
35.	Varga J, Toth B, Rigo K, Debets F, Kozakiewicz Z. Genetic variability within the Aspergillus viridi-nutans species. Folia Microbiol (Praha) 2000; 45:
423-8.
36.	Balajee SA, Gribskov JL, Hanley E, Nickle D, Marr KA. Aspergillus lentulus sp. nov., a new sibling species of A. fumigatus. Eukaryot Cell 2005; 4: 625-32.
37.	Larsen TO, Smedsgaard J, Nielsen KF, Hansen MA, Samson RA, Frisvad JC. Production of myco-toxins by Aspergillus lentulus and other medically important and closely related species in section Fumigati. Med Mycol 2007; 45: 225-32.