Gensko spremenjene mlečnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila Gensko spremenjene mleonokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biolooka zdravila Genetically modified lactic acid bacteria as delivery systems for biopharmaceuticals Aleš Berlec, Borut Štrukelj Povzetek: Mleonokislinske bakterije so ae stoletja sestavni del oloveoke prehrane, zato je njihova varnost sploono priznana. Poleg tega so se v novejoem oasu visoko razvile tehnike, ki omogooajo rekombinantno izraaanje proteinov tudi v mleonokislinskih bakterijah. Zaradi teh razlogov imajo velik potencial kot poceni in uoinkoviti dostavni sistemi za dostavo rekombinantnih proteinov na telesne sluznice, predvsem v prebavnem traktu. V razvoju in otudijah na aivalih so sistemi za dostavo antigenov (cepiv), dostavo proteinov s fiziolooko funkcijo in dostavo DNA z namenom cepljenja. Dostava interlevkina IL-10 pri kronioni vnetni orevesni bolezni se je izkazala za najbolj obetavno in je bila uspeono testirana v 1. fazi klinione otudije na ljudeh. Pred sploono uporabo bo potrebno odgovoriti na vpraoanja o varnosti vnosa genskega materiala, ker gre za gensko spremenjene organizme, ki ne uaivajo podpore javnosti Kljuone besede: mleonokislinske bakterije, Lactooccus lactis, rekombinantno izraaanje, dostavni sistem, cepivo, IL-10, gensko spremenjeni organizmi Abstract: Lactic acid bacteria have been a part of human diet for centuries and their safety is therefore generally recognised. Apart from that, the techniques that enable recombinant protein expression in lactic acid bacteria have recently developed. This is why lactic acid bacteria could serve as a cheap and efficient delivery system for recombinant protein delivery to body mucosa, especially in gastrointestinal tract. Systems for antigen (vaccine) delivery, delivery of proteins with physiological function and for DNA delivery are under development and in animal testing. The delivery of interleukin IL-10 in inflammatory bowel disease is the most promising and was successfully tested in phase I human clinical trial. Before the widespread use, questions regarding safety of genetic material introduction will have to be answered, since these are genetically modified organisms, which are not well accepted by the general public. Key words: lactic acid bacteria, Lactococcus lactis, recombinant expression, delivery system, vaccine, IL-10, genetically modified organisms. 1 Mleonokislinske bakterije in rekombinantno izraaanje proteinov Mleonokislinske bakterije v fermentiranih mleonih, rastlinskih in mesnih izdelkih ae stoletja predstavljajo normalno sestavino oloveoke prehrane in so poleg kvasovk (Saccharomyces cerevisiae) industrijsko najpomembnejoi mikroorganizmi (1). Zaradi dolgotrajne dokumentirane varne uporabe imajo status GRAS (»sploono priznani kot varni«). Poleg tega otevilna porooila potrjujejo njihovo dobrodejno delovanje v prebavnem traktu, zato se pogosto dodajajo hrani kot pro-biotiki. Med mleonokislinske bakterije uvrooamo rodove Lactobacillus, Leuco nostoc, Pediococcus, Lactococcus in Streptococcus ter neko-iko bolj obrobne Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus in Weisella (2). Po fiziolookih znaoilnostih lahko mednje uvrstimo tudi rod Bifidobacterium, ki je sicer genetsko nesoroden. V naravi jih pogosto najdemo na razpadajooih rastlinah ali v prebavilih aivali. Mleonokislinske bakterije spadajo v skupino gram pozitivnih bakterij So anaerobni ali mikroaerofilni koki ali bacili in ne tvorijo spor. Ker zasedajo isto ekolooko nioo, so razvile nekatere skupne metabolne in fiziolooke znaoilnosti. Pomembna znaoilnost, po kateri so dobile ime je, da kot kononi produkt fermentacije ogljikovih hidratov tvorijo mleono kislino. Glede na kononi produkt metabolizma jih razdelimo v dve skupini. Homofermentativne mleonokislinske bakterije tvorijo mleono kislino kot edini ali glavni produkt metabolizma glukoze. Heterofermentativne tvorijo enako mnoaino mleone kisline, ogljikovega dioksida in etanola. Med fermentacijo pH gojiooa zaradi tvorbe mleone kisline pada. Mleonokislinske bakterije so relativno odporne dr. Aleš Berlec,/nag. farm., Institut »Jožef Stefan«, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija Prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija; Institut »Jožef Stefan«, Jamova 39, 1000 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2008; 59 115 Pregledni znanstveni olanki - Review Scientific Articles na rast v gojišču s kislim pH. Pri večini vrst se rast ustavi pri pH 4,5. Imajo tudi podobno temperaturno toleranco in ne preživijo pri temperaturi višji od 45 °C. So avksotrofne za številne aminokisline, ki jih morajo zato pridobiti iz okolja. Mlečnokislinske bakterije pogosto proizvajajo antibakterijske peptide bakteriocine, ki predstavljajo prednost pred ostalimi mikroorganizmi, saj so bakterije proizvajalke nanje imune, hkrati pa so toksični za kompetitivne bakterije. Skupna značilnost je tudi, da imajo v nukleotidnem zaporedju genomov nizek delež gvaninov in citozinov (GC), za razliko od nekaterih gram negativnih bakterij (E. coli), kar je pomembno pri heterolognem izražanju genov. Lactococcus lactis je splošno priznan kot modelna mlečnokislinska bakterija. Zanj obstajajo dobro razvita orodja za gensko manipulacijo (3). V laboratoriju se najpogosteje uporabljata seva L. lactis subsp. cremoris MG1363 in L. lactis subsp. lactis IL1403, ki imata tudi določen genom (4, 5). L. lactis je tudi industrijsko pomemben mikroorganizem, zlasti je pomemben v sirarstvu Za rekombinantno izražanje proteinov v mlečnokislinskih bakterijah se uporabljajo različni sistemi. Heterologni geni se nahajajo bodisi na plazmidih bodisi so vstavljeni v bakterijski kromosom in so pod nadzorom konstitutivnih ali inducibilnih promotorjev. Konstitutivni promo-torji zagotavljajo enakomerno izražanje daljši čas, a običajno v manjših količinah. Pri inducibilnih promotorjih lahko izražanje nadzorujemo in je običajno močnejše. Izražanje lahko sprožimo z ogljikovimi hidrati, fagno infekcijo, bakteriocini, toplotno ali pH- spremembo (1) Najpogosteje uporabljan in najbolj proučen sistem je z nizinom nadzorovan ekspresijski sistem NICE (6), kjer se izražanje inducira z dodatkom bakteriocina nižina. Razviti so tudi sistemi, ki omogočajo usmerjanje proteinov v bakterijah (ciljanje). Za izločanje proteinov v gojišče se tako najpogosteje uporablja zaporedje Usp45, za pritrditev proteinov na površino bakterij (celično steno) pa C-terminalno zaporedje avtolizina AcmA (1). 2 Dostava biološko aktivnih makromolekul Zaradi varnega statusa in zaupanja, ki ga uživajo mlečnokislinske bakterije, predstavljajo privlačen vektor za dostavo bioloških makromolekul v organizem. Cilji njihovega delovanja so sluznice, najpogosteje v prebavnem traktu, kot je shematsko prikazano na sliki 1 Delujejo lokalno, lahko pa povzročijo tudi sistemske učinke. Način aplikacije je ponavadi peroralni ali nazalni, možen pa je tudi vaginalni. Laktokoki in laktobacili preživijo prehod skozi prebavni trakt, nekateri laktobacili pa so ga sposobni tudi kolonizirati. Sposobnost preživetja v prebavnem traktu je pomemben dejavnik, saj peroralna aplikacija proteina ni mogoča predvsem zaradi razgradnje v kislem želodčnem okolju. Dodatna prednost dostave s pomočjo bakterij je, da nista potrebni draga izolacija in čiščenje proteinov. Sistemi dostave biološko aktivnih makromolekul se zaenkrat večinoma testirajo na živalskih modelih, kjer se dosegajo spodbudni rezultati. Znan je en primer klinične študije na ljudeh, ki bo opisan v nadaljevanju Dostavo biološko aktivnih makromolekul lahko po načinu uporabe razdelimo na dostavo cepiv (antigenov), dostavo proteinov s fiziološko vlogo in dostavo DNA. 116 farm vestn 2008; 59 Slika 1: Gensko spremenjene mleonokislinske bakterije v prebavnem traktu lahko izlooajo heterologne proteine ali pa jih predstavljajo na povroini. Figure 1: Genetically modified lactic acid bacteria can secrete heterologous proteins or present them on the surface in the instestinal tract. 2.1 Dostava cepiv Peroralna dostava cepiv (antigenov) je zaželena zaradi prijetnejšega načina aplikacije v primerjavi s parenteralnim. Poleg tega bi peroralna dostava poceni cepiv pomenila veliko prednost zlasti v manj razvitih deželah. Mlečnokislinske bakterije predstavljajo ugoden vektor za dostavo cepiv, ker (7): • imajo status GRAS, • lahko delujejo kot adjuvans, • so sposobne adhezije na mukozo, • imajo nizko intrinzično imunogenost. Zaradi velikosti se proteinske molekule načeloma ne absorbirajo in ne prehajajo v krvni obtok. Vendar pa črevesno limfoidno tkivo, ki je del mukoznega imunskega sistema, omogoča prehod preko specializiranih M celic na Peyerjevih ploščah in predstavitev antigenov bazalno ležečim imunskim celicam. To posledično sproži izločanje IgA, glavnega razreda protiteles iz epitelija, v lumen prebavnega trakta in s tem lokalni imunski odziv (8). Hkrati lahko takšen vnos antigenov sproži tudi sistemski imunski odziv in pojav IgG v krvi. Različne vrste antigenov, ki so bili predstavljeni s pomočjo mlečnokislinskih bakterij, so predstavljeni v preglednici 1 Cepiva so usmerjena proti bakterijskim in virusnim patogenom, pa tudi praživalim (Plasmodium falciparum). Največ študij je bilo opravljenih na fragmentu C tetanus toksina (10), ki zaradi močne imunogenosti služi tudi kot modelni antigen. Večina študij je bila opravljenih na miših. Običajno so opazili zvečan lokalni imunski odziv in izločanje IgA, pa tudi zvečan sistemski imunski odziv. Kar nekaj študij je uspelo dokazati klinično uspešnost cepljenja, saj se po izpostavitvi patogenu bolezen ni razvila npr. v primeru cepiva proti človeškemu papilomavirusu, ki povzroča raka materničnega vratu (19) ali v primeru cepiva proti enterotoksigeni E. coli (7). Učinkovitost Gensko spremenjene mlečnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila Preglednica 1: Primeri uporabe mlečnokislinskih bakterij pri dostavi antigenov. Table 1: Example of usage of lactic acid bacteria in antigen delivery. PATOGEN DOSTAVLJENI ANTIGEN MLEONOKISLINSKA BAKTERIJA REF. Bakterije Streptococcus mutans (karies) Površinski protein PAc L. lactis (9) Clostridium tetani (tetanus) Fragment C tetanus toksina L. lactis, Lb. plantarum (10), (11) Streptococccus pneumoniae Kapsulami polisaharid tipa 3 PsaA, PspA L. lactis, Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. helcveticus (12) Helicobacter pylori UreB, Cag12 L. lactis, Lb. plantarum (13) Brucella abortus L7/L12 ribosomalni protein GroEL protein topotnega šoka L. lactis (14) Streptococcus pyrogenes (faringealna infekcija) Območje C-ponovitve M proteina L. lactis (15) Proteus mirabilis MrpA fimbrijski protein L. lactis (16) enterotoksigena Escherichia coll Toplotno stabilni enterotoksin in toplotno labilni enterotoksin B Lb. reuteri (17) streptokoki (širokospektralno) GBS pilus (iz skupine B streptokokov) L. lactis (18) Virusi človeški papilomavirus tip 16 (rak materničnega vratu) Protein E7, protein L1 L. lactis, Lb. plantarum, Lb. casei (19), (20) HIV Ovojni protein L. lactis (21) SARS-koronavirus Nukleokapsidni protein peplomerni protein - segmenta SA and SB L. lactis, Lb. casei (22) Rotavirus VP7 protein iz zunanjega plašča L. lactis (23) Koronavirus (prenosni gastroenteritis) Peplomerni glikoprotein S Lb. casei (24) Praživali Plasmodium falciparium (malarija) Fuzijski protein GLURP-MSP3, MSP1 MSA2 L. lactis (25) Preglednica 2: Primeri uporabe mlečnokislinkih bakterij pri dostavi proteinov s fiziološko vlogo. Table 2: Example of usage of lactic acid bacteria in delivery of proteins with physiological function. OBOLENJE / MOTNJA DOSTAVLJENI PROTEIN MLEONOKISLINSKA BAKTERIJA REF. Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) IL-10 L. lactis (27), (28) Ulcerozni kolitis mTFF (triperesni (trefoil) faktor) L. lactis (29) Ulcerozni kolitis LcrV iz Yersinia pseudotuberculosis -stimulacija izločanja IL-10 L. lactis (30) Ulcerozni kolitis MnSOD iz Streptococcus thermophilus Lb. gasseri (31) HIV Cianovirin iz Nostoc elipsosporum L. lactis, Lb. plantarum, Lb. jensenii (32) Modulacija alergijskega imunskega odziva Bet v 1 antigen iz brezovega peloda L. lactis, Lb. plantarum (33) Modulacija alergijskega imunskega odziva Anti-idiotipski scFv ali IgE mimotop Lb. johnsonii (34) Karies scFv proti S. mutans (antigen l/ll) Lb. zeae (35) Pomanjkanje lipaze pri pankreasni insuficienc Lipaza iz Staphylococcus hyicus L. lactis (36) farm vestn 2008; 59 117 Pregledni znanstveni olanki - Review Scientific Articles predstavitve antigena so v nekaj primerih povečali s hkratno dostavo interlevkinov (IL-2, IL-6) (26). Mlečnokislinske bakterije, ki predstavljajo antigene, naj ne bi kolonizirale prebavnega trakta, saj bi to lahko vodilo k toleranci do antigena. L. lactis je zato najugodnejši in najpogostejši kandidat za peroralno cepivo, čeprav so se laktobacil nekajkrat izkazali za učinkovitejše (11). Klinične študije na ljudeh še niso bile opravljene. 2.2 Dostava proteinov s fiziolooko vlogo Poleg dostave antigenov je mlečnokislinske bakterije moč uporabiti tudi kot vektor za dostavo proteinov, ki delujejo lokalno v prebavnem traktu. Na ta način dostavljeni proteini so predstavljeni v preglednici 2. Iz preglednice 2 je razvidno, da je najpogostejša tarča dostave proteinov v prebavni trakt kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB), kamor uvrščamo ulcerozni kolitis in Crohnovo bolezen. Dokazano je, da interlevkin IL-10 igra pomembno vlogo pri regulaciji vnetnih kaskad in da njegovo pomanjkanje vodi v razvoj kolitisa. Dostava IL-10 lahko omili simptome in predstavlja najuspešnejši primer dostave proteinov z mlečnokislinskimi bakterijami. Uspešno so jo testirali na mišjem modelu kolitisa (27). Sledil je razvoj seva L. lactis z okvarjeno timidilat sintazo, ki je zato odvisen od zunanjih virov timidina ali timi-na, kar preprečuje preživetje gensko spremenjenega seva v naravi (37). To je omogočilo uporabo v 1. fazi klinične študije na 10 ljudeh za zdravljenje Crohnove bolezni (28). Študija je bila uspešna z minimalnimi stranskimi učinki in z olajšanjem simptomov bolezni. Podobne učinke so na živalskih študijah dosegli z uporabo triperesnih faktorjev (29) in dostavo proteina LcrV (30) iz Y. pseudotuberculosis, ki stimulira izločanje IL-10. Drugačen pristop predstavlja intestinalno izločanje superoksidne dismutaze (MnSOD), ki nastopa kot lovilec reaktivnih kisikovih spojin, ki prispevajo k vnetnemu delovanju (31). Mlečnokislinske bakterije bi se lahko uporabljale za dostavo prebavnih encimov pri določenih anomalijah npr. pankreasni insuficienci. Tako je bil razvit sistem za dostavo lipaze (36). Na podoben način, kot je bilo v prejšnjem poglavju opisano za dostavo antigenov z namenom spodbujanja imunskega odziv, bi se mlečnokislinske bakterije lahko uporabljale tudi za modulacijo imunskega odziva. Tako so s senzitizacijo zmanjšali imunski odziv na antigen iz brezovega peloda (33). Drugačen pristop predstavlja dostava fragmenta variabilne regije protitelesa (scFv) proti IgE, ki so odgovorni za pretiran imunski odziv, ali IgE mimotopov, ki stimulirajo tvorbo IgG proti IgE (34). Tudi fragmenti variabilne regije protitelesa scFv, usmerjeni proti S. mutans, so bili dostavljeni s pomočjo mlečnokislinskih bakterij in uporabljeni za oralno zdravljenje kariesa (35) Poleg uporabe v prebavnem traktu, je mlečnokislinske bakterije mogoče uporabiti tudi na drugih sluznicah, npr. vaginalni. Razvit je sistem izražanja močnega protivirusnega proteina cianovirina v mlečnokislinskih bakterijah, ki kolonizirajo vagino, kar predstavlja način za zmanjšanje možnosti okužbe s HIV predvsem na ogroženih manj razvitih območjih. 2.3 Dostava DNA Dostava DNA z namenom cepljenja (DNA cepivo) je najnovejši način uporabe mlečnokislinskih bakterij in zato zaenkrat najmanj razvit. Dostavljena DNA izkoristi celične mehanizme za prepis v protein, ki potem služi kot antigen. Prednost DNA cepiva je zmožnost aktivacije celične imunosti in ne samo humoralne, kar posledično omogoča tudi zdravljenje kroničnih bolezni in zahtevnih virusnih infekcij, težava pa je uspešen vnos DNA v celice. Z mlečnokislinskimi bakterijami so uspeli dokazati vnos DNA v sesalske celice s pomočjo proteina inter-nalina (38, 39), ki poveča prepustnost celic za L. lactis. Dosegli so tudi aktivacijo imunskega odziva pri miših po vnosu gena Vp1 virusa slinavke in parkljevke (40). Primeri so prikazani v preglednici 3. 3 Prednosti in slabosti Mlečnokislinske bakterije so že stoletja sestavni del človeške prehrane, zato njihova varnost ni vprašljiva. Možnost sistemske okužbe z mlečnokislinskimi bakterijami obstaja le pri močno imunokomprimitiranih posameznikih. Dostava rekombinantnih proteinov na sluznice oz. predvsem v prebavni trakt s pomočjo mlečnokislinskih bakterij pomeni relativno poceni način dostave biološko aktivnih makromolekul v organizem, saj odpade potreba po nadaljnji izolaciji in čiščenju. To je pomembno predvsem v manj razvitih deželah, kjer je cena glavna ovira za npr. množično cepljenje. Prednost mlečnokislinskih bakterij pri dostavi cepiv je tudi, da posnemajo pot vnosa številnih patogenov v organizem in imajo lahko intrinzične lastnosti adjuvansa. Vnos fiziološko aktivnih proteinov v npr. prebavni trakt pomeni prednost predvsem pri lokalnih obolenjih, saj pri sistemski aplikaciji proteinov le majhen del dospe do želenega mesta delovanja, povečana pa je tudi možnost stranskih učinkov. Med slabosti lahko uvrstimo težave z natančnim odmerjanjem, v primeru da prihaja do izražanja proteina na mestu delovanja (in ne že pred vnosom v organizem) in pa nejasne posledice ob morebitni kolonizaciji prebavnega trakta. Glavna šibka točka uporabe mlečnokislinskih bakterij pa je v tem, da gre za gensko spremenjene orga- Preglednica 3: Primeri uporabe mleonokislinkih bakterij pri dostavi DNA. Table 3: : Example of usage of lactic acid bacteria in DNA delivery. CILJ TERAPIJE DOSTAVLJENI GEN MLEONOKISL. BAKTERIJA REF. Vnos gena proti modelnemu proteinu gfp (zeleni fluorescentni protein) L. lactis (38) Vnos gena proti modelnemu proteinu blg (beta-laktoglobulin) L. lactis (39) Cepivo proti virusu slinavke in parkljevke (FMDV) vp1 Lb. acidophilus (40) 118 farm vestn 2008; 59 Gensko spremenjene mlečnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila nizme, ki so v javnosti deleani izrazito odklonilnega odnosa. Pred dejansko uporabo bi bilo zato potrebno odgovoriti na otevilna vpraoanja, povezana s sproooanjem rekombinantnih organizmov v okolje (41, 42). Prvi sklop vpraoanj je povezan s samim rekombinant-nim sevom in moanostjo njegovega preaivetja v naravi. To je v veliki meri moo odpraviti z uporabo metabolnih mutant, ki onemogooajo preaivetje brez dolooenih hranil, kar je bilo ae uspeono prikazano na primeru seva L. lactis z odstranjenim genom za timidilat sintazo (37). Drugi sklop vpraoanj je povezan z vnesenim proteinom in njegovo potencialno alergenostjo in toksionostjo. Tretji sklop vpraoanj pa se nanaoa na sam genski material. Potrebno je prepreoiti horizontalen prenos genskega materiala v ostale, komenzalne bakterije. To je zlasti pomembno pri uporabi plazmidov, pri oemer je potrebno uporabljati replikacijske elemente, ki so omejeni na gostitelja. Popolnoma se je potrebno izogniti antibiotionim oznaoevalcem. Potrebno je tudi izkljuoiti vkljuoevanje DNA v genom gostitelja in morebitno onkogeno delovanje. Mleonokislinske bakterije imajo velik potencial kot vektorji za dostavo biolooko aktivnih makromolekul. Pred uporabo bo potrebno razreoiti odnos do gensko spremenjenih organizmov, katerim javno mnenje ni naklonjeno in zaradi katerega je tudi odnos industrije zadraan. Res pa je, da je uporaba gensko spremenjenih organizmov v terapevtske namene sprejemljivejoa od npr. uporabe v prehrani. Tveganje, ki smo ga namreo pripravljeni sprejeti, je povezano s koristjo, ki jo dobimo. Ta pa je veoja v primeru resne ali teako ozdravljive bolezni 4 Literatura 1. de Vos WM. Gene expression systems for lactic acid bacteria. Curr Opin Microbiol 1999; 2: 289-295. 2. Stiles ME, Holzapfel WH. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int J Food Microbiol 1997; 36: 1-29. 3. van Hylckama Vlieg JE, Rademaker JL, Bachmann H et al. Natural diversity and adaptive responses of Lactococcus lactis. Curr Opin Biotechnol 2006; 17: 183-190. 4. Bolotin A, Wincker P, Mauger S et al. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res 2001; 11: 731-753. 5. Wegmann U, O'Connell-Motherway M, Zomer A et al. Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. J Bacteriol 2007; 189: 3256-3270. 6. Mierau I, Kleerebezem M. 10 years of the nisin-controlled gene expression system (NICE) in Lactococcus lactis. Appl Microbiol Biotechnol 2005; 68: 705-717. 7. Pouwels PH, Leer RJ, Shaw M et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. International Journal of Food Microbiology 1998; 41: 155-167. 8. Nouaille S, Ribeiro LA, Miyoshi A et al. Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis. Genet Mol Res 2003; 2: 102-111 9. Iwaki M, Okahashi N, Takahashi I et al. Oral immunization with recombinant Streptococcus lactis carrying the Streptococcus mutans surface protein antigen gene. Infect Immun 1990; 58: 2929-2934. 10. Robinson K, Chamberlain LM, Schofield KM et al. Oral vaccination of mice against tetanus with recombinant Lactococcus lactis. Nat Biotechnol 1997; 15: 653-657. 11. Grangette C, Muller-Alouf H, Geoffroy M et al. Protection against tetanus toxin after intragastric administration of two recombinant lactic acid bacteria: impact of strain viability and in vivo persistence. Vaccine 2002; 20: 3304-3309. 12. Oliveira ML, Areas AP, Campos IB et al. Induction of systemic and mucosal immune response and decrease in Streptococcus pneumoniae colonization by nasal inoculation of mice with recombinant lactic acid bacteria expressing pneumococcal surface antigen A. Microbes Infect 2006; 8: 1016-1024. 13. Lee MH, Roussel Y, Wilks M et al. Expression of Helicobacter pylori urease subunit B gene in Lactococcus lactis MG1363 and its use as a vaccine delivery system against H. pylori infection in mice. Vaccine 2001; 19: 3927-3935. 14. Pontes DS, Dorella FA, Ribeiro LA et al. Induction of partial protection in mice after oral administration of Lactococcus lactis producing Brucella abortus L7/L12 antigen. J Drug Target 2003; 11: 489-493. 15. Mannam P, Jones KF, Geller BL. Mucosal vaccine made from ive, recombinant Lactococcus lactis protects mice against pharyngeal infection with Streptococcus pyogenes. Infect Immun 2004; 72: 3444-3450. 16. Scavone P, Miyoshi A, Rial A et al. Intranasal immunisation with recombinant Lactococcus lactis displaying either anchored or secreted forms of Proteus mirabilis MrpA fimbrial protein confers specific immune response and induces a significant reduction of kidney bacterial colonisation in mice. Microbes Infect 2007; 9: 821-828. 17. Wu CM, Chung TC. Mice protected by oral immunization with Lactobacillus reuteri secreting fusion protein of Escherichia col enterotoxin subunit protein. FEMS Immunol Med Microbiol 2007; 50: 354-365. 18. Buccato S, Maione D, Rinaudo CD et al. Use of Lactococcus lactis expressing pili from group B Streptococcus as a broad-coverage vaccine against streptococcal disease. J Infect Dis 2006; 194: 331-340. 19. Bermudez-Humaran LG, Cortes-Perez NG, Lefevre F et al. A novel mucosal vaccine based on live Lactococci expressing E7 antigen and IL-12 induces systemic and mucosal immune responses and protects mice against human papillomavirus type 16-induced tumors. J Immunol 2005; 175: 7297-7302. 20. Poo H, Pyo HM, Lee TY et al. Oral administration of human papillomavirus type 16 E7 displayed on Lactobacillus casei induces E7-specific antitumor effects in C57/BL6 mice. Int J Cancer 2006; 119: 1702-1709. 21. Xin KQ, Hoshino Y, Toda Y et al. Immunogenicity and protective efficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactis expressing surface-bound HIV Env. Blood 2003; 102: 223-228. 22. Lee JS, Poo H, Han DP et al. Mucosal immunization with surface-displayed severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein on Lactobacillus casei induces neutralizing antibodies in mice. J Virol 2006; 80: 4079-4087. farm vestn 2008; 59 1191 Pregledni znanstveni olanki - Review Scientific Articles 23. Perez CA, Eichwald C, Burrone O et al. Rotavirus vp7 antigen produced by Lactococcus lactis induces neutralizing antibodies in mice. J Appl Microbiol 2005; 99: 1158-1164. 24. Ho PS, Kwang J, Lee YK. Intragastric administration of Lactobacillus casei expressing transmissible gastroentritis coronavirus spike glycoprotein induced specific antibody production. Vaccine 2005; 23: 1335-1342. 25. Ramasamy R, Yasawardena S, Zomer A et al. Immunogenicity of a malaria parasite antigen displayed by Lactococcus lactis in oral immunisations. Vaccine 2006; 24: 3900-3908. 26. Steidler L, Robinson K, Chamberlain L et al. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect Immun 1998; 66: 3183-3189. 27. Steidler L, Hans W, Schotte L et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science 2000; 289: 1352-1355. 28. Braat H, Rottiers P, Hommes DW et al. A phase I trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn's disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2006; 4: 754-759. 29. Vandenbroucke K, Hans W, Van Huysse J et al. Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice. Gastroenterology 2004; 127: 502-513. 30. Foligne B, Dessein R, Marceau M et al. Prevention and treatment of colitis with Lactococcus lactis secreting the immunomodulatory Yersinia LcrV protein. Gastroenterology 2007; 133: 862-874. 31. Carroll IM, Andrus JM, Bruno-Barcena JM et al. Anti-inflammatory properties of Lactobacillus gasseri expressing manganese superoxide dismutase using the interleukin 10-deficient mouse model of colitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2007; 293: G729-738. 32. Liu X, Lagenaur LA, Simpson DA et al. Engineered vaginal lactobacillus strain for mucosal delivery of the human immunodeficiency virus inhibitor cyanovirin-N. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 3250-3259. 33. Daniel C, Repa A, Wild C et al. Modulation of allergic immune responses by mucosal application of recombinant lactic acid bacteria producing the major birch pollen allergen Bet v 1 Allergy 2006; 61: 812-819. 34. Scheppler L, Vogel M, Marti P et al. Intranasal immunisation using recombinant Lactobacillus johnsonii as a new strategy to prevent allergic disease. Vaccine 2005; 23: 1126-1134. 35. Kruger C, Hultberg A, van Dollenweerd C et al. Passive immunization by lactobacilli expressing single-chain antibodies against Streptococcus mutans. Mol Biotechnol 2005; 31: 221-231 36. Drouault S, Juste C, Marteau P et al. Oral treatment with Lactococcus lactis expressing Staphylococcus hyicus lipase enhances lipid digestion in pigs with induced pancreatic insufficiency. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 3166-3168. 37. Steidler L, Neirynck S, Huyghebaert N et al. Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10. Nat Biotechnol 2003; 21: 785-789. 38. Guimaraes VD, Gabriel JE, Lefevre F et al. Internalin-expressing Lactococcus lactis is able to invade small intestine of guinea pigs and deliver DNA into mammalian epithelial cells. Microbes nfect 2005; 7: 836-844. 39. Guimaraes VD, Innocentin S, Lefevre F et al. Use of native lactococci as vehicles for delivery of DNA into mammalian epithelial cells. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 7091-7097. 40. Li YG, Tian FL, Gao FS et al. Immune responses generated by Lactobacillus as a carrier in DNA immunization against foot-and-mouth disease virus. Vaccine 2007; 25: 902-911 41. Detmer A, Glenting J. Live bacterial vaccines--a review and identification of potential hazards. Microb Cell Fact 2006; 5: 23. 42. Renault P. Genetically modified lactic acid bacteria: applications to food or health and risk assessment. Biochimie 2002; 84: 1073-1087. 120 farm vestn 2008; 59