Integriran pristop iskanja spojin vodnic naravnega izvora z uporabo eksperimentalnih in računalniško podprtih metod Integrated approach in the search of novel natural products as lead compounds using experimental and computer-based approaches Marko Jukič, Andrej Perdih, Tomaž Šolmajer Povzetek: Spojine naravnega izvora predstavljajo zgodovinsko najpomembnejši vir zdravilnih učinkovin, ki jih zajema sodobna materia medica. V zadnjih letih so na področju iskanja spojin vodnic naravnega izvora pričeli uspešno uporabljati sodobne integrirane pristope, ki združujejo eksperimentalne metode separacije, identifikacije in bioloških testiranj z računalniško podprtimi metodami načrtovanja in virtualnega rešetanja. Prispevek se osredotoča na predstavitev vloge računalniško podprtih metod v tem pristopu, poleg tega pa predstavlja tudi nekaj uspešnih primerov uporabe integriranega pristopa pri iskanju spojin vodnic naravnega izvora. Ključne besede: spojine naravnega izvora, spojine vodnice, knjižnice spojin, integrirani interdisciplinarni pristopi, računalniška kemija Abstract: Natural products are one of the most important sources of drug molecules now present in modern materia medica. Recently, when searching for novel lead compounds of natural origin, new integrated approaches were introduced that merge modern methods of separation, identification and biological assays with computer-assisted methods of drug design and virtual screening. This review is focused predominantly on the introduction of the computer-based approaches in this field. In addition, selected successful applications of the integrated approach in identifying novel natural products as lead compounds are presented. Keywords: natural products, lead compounds, libraries of natural products, integrated approaches, computer-aided drug design 1 Naravne spojine kot zgodovinsko pomemben vir spojin vodnic Skozi celotno zgodovino medicine zdravila naravnega izvora ostajajo ključnega pomena. Uporabljajo se lahko kot ekstrakti oz. kompleksne zmesi učinkovin ali kot izolirane zdravilne učinkovine naravnega izvora. Spojine naravnega izvora najdemo v mnogih zdravilih brez recepta, predstavljajo pa tudi enega izmed pomembnejših virov spojin vodnic, ki vodijo do zdravilnih učinkovin. Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) ocenjuje, da približno 80 odstotkov svetovne populacije pri zdravljenju uporablja izključno zdravila naravnega izvora (1). Pri 974 novih učinkovinah, uvedenih med letoma 1981 in 2006, jih je bilo 60 odstotkov razvitih iz spojin naravnega izvora, če pa se omejimo samo na protibakterijske ter citotoksične spojine, je delež med 70 in 80 odstotki (2). Zdravilne učinkovine, razvite iz spojin naravnega izvora, v velikem številu nastopajo tudi na seznamih najbolje prodajanih zdravil (npr. skupina statinov, penicilinski in makrolidni antibiotiki, ciklosporin itd). V začetku 19. stoletja je bilo izoliranih nekaj ključnih spojin naravnega izvora. Leta 1804 je Sertürner izoliral morfin, med leti 1817 in 1821 so Pelletier, Magendie in Caventou izolirali emetin, strihnin, kinin in kofein, deset let kasneje, leta 1831, pa Mein še atropin. Učinkovine rastlinskega izvora so pripomogle k napredku farmakologije, farmacije, razvoja zdravil ter vplivale tudi na razvoj sintezne organske kemije (npr. Willstätterjeva sinteza atropina leta 1901) (3). Po letu 1928, ko je Fleming odkril penicilin, so sledila številna rešetanja spojin naravnega izvora s ciljem iskanja protimikrobnih učinkovin. V sredini 20. stoletja so poleg rastlin pričeli raziskovati tudi druge naravne vire ter odkrili vrsto novih antibiotičnih učinkovin. Odkritju streptomicina, kloramfenikola in tetraciklinov iz aktinobakterij v 50-ih letih 20. stoletja je sledilo odkritje vankomicina ter cefalosporina C iz gliv. Kasneje so odkrili tudi kolhicin, izolirali vinka-alkaloide iz zimzelena ter taksol iz severnoameriške oz. grmaste tise. Poleg odkritih antibiotikov ter citostatikov lahko omenimo še antimalarike (artemisinin), imunosupresive (ciklosporin) ter antihiperlipidemike (npr. skupina statinov). Strukture nekaterih naštetih predstavnikov, tako že dolgo poznanih kot tudi novejših spojin, so predstavljene na sliki 1 (1,2,3). Marko Jukič, mag. farm. Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana doc. dr. Andrej Perdih, mag. farm. Kemijski inštitut, Hajdrihova 19, lOoi Ljubljana prof. dr. Tomaž Šolmajer, univ. dipl. fiz. Kemijski inštitut, Hajdrihova 19, lOoi Ljubljana Slika 1: Kemijske strukture morfina in penicilina G, skeleti terapevtskih skupin tetraciklinov in taksanov (npr. larotaksel) - pomembnih antibiotikov in protitumornih učinkovin in diskodermolid, aktualna spojina vodnica pri raziskavah protitumornih učinkovin, izolirana iz globokomorske spužve Discodermia dissoluta. Figure 1: Chemical structures of morphine and penicillin G as classic drugs of natural origin, structures of tetracycline and taxane therapeutic groups (e.g. larotaxel) - important antibiotic and chemotherapeutic agents and discodermolide structure - lead compound in the research of novel chemotherapeutic agents isolated from marine sponge Discodermia dissoluta. Kljub pomembni vlogi spojin naravnega izvora pri iskanju spojin vodnic ter razvoju zdravil, je v zadnjih desetletjih farmacevtska industrija zmanjšala obseg iskanja spojin vodnic med spojinami naravnega izvora in se bolj osredotočila na rešetanje knjižnic majhnih sinteznih molekul kot primarnega vira izhodnih spojin (4). Zato obstaja več razlogov. Spojine naravnega izvora so zaradi svoje kompleksne kemijske strukture težje sintezno dostopne v večjih količinah. Razvoj kombinatorične kemije in tehnologija rešetanja visokih zmogljivosti HTS (high-throughput screening) sta omogočili uporabo velikih sinteznih knjižnic za rešetanje več milijonov sintezno dostopnih molekul. Nekoliko zmanjšan pa je bil tudi obseg raziskav rešetanja spojin naravnega izvora, ki po kompleksnih protokolih ekstrakcije-separacije-izolacije-identifikacije vodijo do dostopnih naravnih spojin (5). Težavo pri rešetanju spojin naravnega izvora predstavljajo predvsem sinergistični učinki spojin v začetnih grobih ekstraktih in so velik izziv za natančno identifikacijo in biološko ovrednotenje posameznih aktivnih spojin (5). 2 Spojine naravnega izvora kot vir vodnic Spojine naravnega izvora (npr. biosintetizirani primarni/sekundarni metaboliti) imajo veliko prednosti pred sinteznimi molekulami. Opisujejo širši in bogatejši kemijski prostor v primerjavi s popolnoma sinteznimi knjižnicami spojin, imajo ugodnejše farmakokinetične lastnosti in so pogosto primernejše za nadaljnjo optimizacijo do spojin vodic. Navedene lastnosti spojin naravnega izvora, opazen upad števila novih kemijskih entitet na tržišču in težave pri iskanju novih kemijskih razredov spojin so pomembno prispevali k ponovnemu velikemu zanimanju farmacevtske industrije za spojine naravnega izvora kot vira pri iskanju in načrtovanju izhodnih spojin vodnic (7). Slednje poleg širokega spektra farmakoloških učinkov pogosto izkazujejo tudi ugodne fizikalno-kemijske lastnosti, saj izhajajo direktno iz različnih bioloških sistemov, kjer igrajo ključno vlogo Preglednica 1: Spojine naravnega izvora v različnih stopnjah razvoja zdravilnih učinkovin (povzeto po (11)). Table 1: Natural products in various research stages of drug development (based on (11)). Faza razvoja Rastline Bakterije Glive Živali Semisintezne spojine Skupaj Predklinična testiranja 46 12 7 7 27 99 Klinična faza I 14 5 0 3 8 30 Klinična faza II 41 4 0 10 11 66 Klinična faza III 5 4 0 4 13 26 Pred-registracija 2 0 0 0 2 4 Skupaj 108 25 7 24 61 225 v obrambnih, zaščitnih, signalnih, razmnoževalnih ter drugih pomembnih vlogah (7). Trenutne raziskave se poslužujejo tako dobro poznanih kot tudi še neraziskanih rastlinskih in mikrobioloških virov spojin, saj je bilo po trenutnih ocenah z biološkim testiranjem ovrednotenih manj kot 15 odstotkov višjih rastlinskih vrst, v širšem pomenu pa je eksperimentalno opisan le odstotek na zemlji prisotne biodiverzitete (8). Velik potencial kažejo tudi spojine, ki jih proizvajajo organizmi, ki jih podrobneje spoznavamo v zadnjem času, kot so npr. različni ekstremofili (organizmi, ki uspevajo v fizikalnih in geokemičnih pogojih, ki so škodljivi za večino drugih živih bitij), endofiti (v širši definiciji vsi organizmi, ki so prisotni v notranjosti rastline) ter številni morski organizmi (9). V zadnjem času so odkrili nove razrede zdravilnih učinkovin in spojin iz različnih naravnih virov, ki so trenutno v kliničnih testiranjih. Okarakterizirali so zanimivo skupino epotilonov, izoliranih iz proteobakterij, ki predstavlja alternativo taksanskim protitumornim učinkovinam. Diskodermolid iz morske spužve Discodermia dissoluta je izhodišče mnogih vodnic v raziskavah protitumornih učinkovin (slika 1). Konotoksin zikonotid iz morskih polžev Conus magnus se že uporablja pri novih pristopih terapije kronične bolečine (10). Trenutno se izvajajo raziskave identifikacije novih spojin vodnic naravnega izvora kot potencialnih zdravilnih učinkovin v preko 200 velikih raziskovalnih programih, ki se nahajajo v različnih stopnjah razvoja (11). Kot prikazuje preglednica 1, so to spojine naravnega izvora, pridobljene iz različnih virov, prevladujejo pa bakterijski in rastlinski viri. Dobra polovica spojin je še v predkliničnih raziskavah, toda tudi delež spojin, ki bodo kmalu vstopile v klinično uporabo, ni zanemarljiv. Natančnejši pregled usmeritev raziskav po terapevtskih področjih, predstavljen v preglednici 2, pokaže, da so raziskovalni programi najbolj osredotočeni na iskanje novih protitumornih in protimikrobnih učinkovin, saj med 225 opisanimi raziskovalnimi programi prvo skupino zavzema 86, drugo pa 40 predstavnikov. Sledijo jim učinkovine z delovanjem na živčevje (22 preiskovanih molekul), gastrointestinalne (GI) in v kardiovaskularnem sistemu delujoče učinkovine (20 preiskovanih molekul), protivnetne biološko aktivne spojine ter druge. Iz pregleda preostalih raziskovanih aplikacij vidimo, da so spojine naravnega izvora uporabne praktično na vseh terapevtskih področjih (11). Uporaba spojin naravnega izvora lahko predstavlja tudi nevaren poseg v naravno biodiverziteto (npr. ogrožanje posamezne rastlinske vrste, potrebne za izolacijo aktivne spojine), zato velja omeniti nujno skrb za preprečevanje okoljskih sprememb (12). Osnovni dokument zaščite predstavlja na Svetovni skupščini v Riu de Janeiru leta 1992 sprejet mednarodni pravno zavezujoči sporazum o biodiverziteti (Convention on Biological Diversity - CBD), ki postavlja v ospredje tri cilje: ohranitev prisotne biodiverzitete, samozadostno izkoriščanje naravnih virov in enakomerno razdelitev le-teh. V ta namen so Združeni narodi poimenovali obdobje med leti 2011 in 2020 »Desetletje biotske raznovrstnosti« (13). Raziskave spojin naravnega izvora bodo v prihodnje vedno bolj sklopljene z že sedaj prisotnimi biotehnološkimi raziskavami (npr. biotehnološke metode omogočajo boljšo ekspresijo in produkcijo izhodnih spojin), proteomiko in genomiko. Velik pomen pa bodo prispevale tudi nove učinkovite separacijske in analitske tehnike ter razvoj informacijskih orodij, ki omogočajo obdelavo velikih količin pridobljenih podatkov (10, 11, 14). Iskanje vodnic med spojinami naravnega izvora je iz začetnih naključnih odkritij, temelječih na pomembnem znanju tradicionalne medicine tehnološko izredno napredovalo. Sodobni interdisciplinarni protokoli ekstrakcije in rešetanja spojin vodnic naravnega izvora temeljijo pretežno na kombinacijah različnih eksperimentalnih tehnik. Protokole v grobem delimo na začetno fazo pridobivanja grobih ekstraktov iz naravnih virov, kompleksno separacijo, ki ji sledi identifikacija, ter karakterizacija posameznih spojin. (leva stran slike 2). Ekstraktom s pomočjo bioloških testov na eni ali več sorodnih tarčah določajo biološko aktivnost (15). Na preiskovanih tarčah ovrednotijo tudi biološko aktivnost posameznih izoliranih in identificiranih spojin. V procesu zelo pogosto uporabljajo sklopljene separacijsko-analitske metode tekočinske kromatografije (LC), masno spektroskopijo (MS) in jedrsko magnetno resonanco (NMR). To so na primer sodobni separacijski sistemi, označeni s kraticami: LC-MS-MS in LC-MS-NMR, ki omogočajo hkratno separacijo in identifikacijo posameznih spojin iz začetnih ekstraktov. Nadaljnje sintezne ali polsintezne optimizacije lahko vodijo do spojin z optimalnimi lastnostmi. V preglednici 3 je prikazanih več uspešnih raziskovalnih programov, katerih ciljane učinkovine so trenutno v kliničnih študijah, nekatere pa so že vpeljane v terapijo (10, 11, 14). Raziskave spojin naravnega izvora danes uspešno dopolnjujejo tudi računalniško podprti »in silico« pristopi načrtovanja in iskanja spojin vodnic. Ti pristopi so že dolgo uveljavljeni pri iskanju spojin vodnic iz knjižnic sintezno pridobljenih molekul (16). Integracijo teh metod z eksperimentalnimi metodami pri raziskavah spojin naravnega izvora shematsko predstavlja slika 2 (17, 18). Uporabo takšnega kombiniranega Preglednica 2: Terapevtske indikacije preiskovanih spojin naravnega izvora na različnih stopnjah razvoja zdravilnih učinkovin (povzeto po (11)). Table 2: Therapeutic areas of current natural product drug discovery programmes at various stages of drug development (based on (11)). Faza razvoja Predklinična testiranja Klinična faza I Klinična faza II Klinična faza III Predregistracija Skupaj 1. Protitumorne učinkovine 34 15 26 9 2 86 2. Protimikrobne učinkovine 25 4 7 2 2 40 3. Učinkovine delujoče na živčevje 6 3 9 4 0 22 4. Učinkovine delujoče v kardiovaskularnem in GI sistemu 9 0 5 6 0 20 5. Protivnetne učinkovine 6 2 9 1 0 18 6. Učinkovine za bolezni presnove 7 3 6 1 0 17 7. Učinkovine za zdravljenje bolezni kože 7 1 2 0 0 10 8. Hormonsko delujoče učinkovine 3 0 2 1 0 6 9. Imunosupresivi 2 2 0 2 0 6 Skupaj 99 30 66 26 4 225 Preglednica 3: Primeri učinkovin iz naravnih produktov in derivatov, ki so trenutno v kliničnih testiranjih (povzeto po (10, 14)). Table 3: Examples of natural product compounds and derivatives in various stages of clinical trials (based on (10, 14)). Ime spojine INN Vrsta spojine Naravni vir Klinična testiranja Preiskovana indikacija Zikonotid sintezni analog izhodne spojine naravnega izvora Conus magnus Faza III analgetična učinkovina Rubitecan polsintezna spojina Camptotheca acuminata Faza III protitumorna učinkovina Anidulafungin polsintezna spojina Aspergillus rugulosus V terapiji protiglivna učinkovina Everolimus polsintezna spojina Streptomyces hygroscopicus V terapiji imunosupresiv Huperzin-A naravna spojina Huperzia serrata Faza II učinkovina za zdravljenje Alzheimerjeve bolezen Epotiloni naravne spojine, polsintezne spojine, sintezni analogi izhodne spojine naravnega izvora Sorangium cellulosum Faza I - III protitumorne učinkovina Salinosporamid A spojina naravnega izvora Salinispora tropica Faza I protitumorna učinkovina Criptoficin spojina naravnega izvora Nostoc sp. Faza I protitumorna učinkovina Dolastatin 10 spojina naravnega izvora Cyanobacterium Symploca Faza II protitumorna učinkovina Dalbavancin polsintezna spojina Nonomuraea sp. Faza III protibakterijska učinkovina Slika 2: Integracija eksperimentalnih in računalniško podprtih metod iskanja spojin vodnic iz spojin naravnega izvora (povzeto po (17, 18)). Figure 2: Integration of experimental and computer-assisted methods in the identification of lead compounds from natural sources (based on (18)). pristopa so omogočili v zadnjih letih dostopne zbirke podatkov o spojinah naravnega izvora, zbrane v različnih kemijskih knjižnicah, in razvoj orodij računalniško podprtega načrtovanja in virtualnega rešetanja, s katerimi lahko preiskujemo te knjižnice. Tako knjižnice kot orodja virtualnega rešetanja podrobno predstavljamo v naslednjih razdelkih. Izolirane spojine naravnega izvora in dostopni eksperimentalni podatki predstavljajo najpomembnejše robne pogoje za učinkovito uporabo računalniško podprtih metod (17). 3 Knjižnice spojin naravnega izvora Kljub širokemu biološkemu in kemijskemu prostoru, ki ga pokrivajo spojine naravnega izvora, je bila njihova uporaba pri racionalnem računalniško podprtem načrtovanju spojin vodnic do nedavnega relativno omejena. To lahko pripišemo omejenemu dostopu do knjižnic okarakteriziranih in/ali biološko testiranih spojin naravnega izvora, ki bi se lahko uporabljale v eksperimentih virtualnega rešetanja. Šele v zadnjih letih se poleg knjižnic sinteznih molekul pojavljajo tako javno dostopni viri kot komercialni ponudniki knjižnic spojin, ki omogočajo dostop do specializiranih knjižnic spojin naravnega izvora. Z razvojem informacijske tehnologije je postala možna tudi obdelava velike količine podatkov, ki jih najdemo v takšnih knjižnicah. Knjižnice spojin ne vsebujejo le pregleda spojin in njihovih struktur, ampak tudi podatke o fizikalno-kemijskih lastnostih in eksperimentalne podatke o biološki aktivnosti na različnih sistemih skupaj s pripadajočimi referencami do strokovne ali patentne literature (19). 3.1 Javno dostopne knjižnice in zbirke spojin naravnega izvora Javno dostopne knjižnice spojin naravnega izvora preko svetovnega spleta omogočajo vpogled v zbirke spojin, njihove kemijsko-fizikalne lastnosti ter morebitne reference do primarne ali patentne literature. Nekatere najpomembnejše knjižnice tega tipa so zbrane v preglednici 4. DIOS knjižnica ima 9.676 vnosov ter je osnovana na zgodovinskem viru De materia medica, ki ga je zbral Pedanius Dioscorides v 1. stoletju. Knjižnica vsebuje naravne spojine iz preko 800 višjih rastlinskih vrst, ki so prisotne na področju Evrope. ChEBI (The Chemical Entities of Biological Interest) je knjižnica Evropskega inštituta za bioinformatiko ter vsebuje preko 6.000 spojin naravnega ter tudi sinteznega izvora. V NPD - Natural products database (del večje knjižnice spojin za virtualno rešetanje Zinc) je trenutno shranjenih preko 90.000 vnosov iz najrazličnejših naravnih virov. ChemBank, knjižnica National Cancer Institute's Initiative for Chemical Genetics, vsebuje 1,1 milijona malih molekul, med njimi tudi mnoge spojine naravnega izvora. Knjižnica omogoča tudi komercialni dostop do dela spojin ter vsebuje odsek s preko 6.000 biološko aktivnih spojinami naravnega izvora ter dostopnost do podatkov izvedenih bioloških testiranj. ChemID, knjižnica spojin s preko 350.000 vnosi ameriške National Library of Medicine, omogoča vpogled v prek 250.000 spojin s pripadajočimi fizikalno-kemijskimi parametri in referenčnimi podatki. NCI knjižnica, ki jo zastopa The National Cancer Institute, združuje več knjižnic podatkov in nudi prost dostop do prek 250.000 spojin s pripadajočimi fizikalno-kemijskimi lastnostmi. Prav tako je združenih več knjižnic v portalu PubChem, ki jih ureja ameriški National Institutes of Health (NIH), kjer lahko najdemo podatke za prek 2 milijona struktur malih molekul. Omeniti velja tudi združeno knjižnico SuperNatural s 50.000 spojinami naravnega izvora. Le-ta poleg vpogleda v lastnosti spojin in referenčno literaturo omogoča tudi komercialen dostop do vsakega vnosa v knjižnici (19). 3.2 Komercialne knjižnice in zbirke spojin naravnega izvora Velik izbor spojin naravnega izvora nudijo tudi komercialne podatkovne zbirke (preglednica 4). Najpomembnejša vira podatkov o spojinah sta knjižnici CAS - Chemical Abstracts Service in Beilstein Database. Obe spremljata strokovno ter patentno literaturo od 19. stoletja do danes ter omogočata vpogled v prek 25 milijonov spojin. Spojine spremljajo ustrezne reference ter opisi fizikalno-kemijskih, analitskih in bioloških lastnosti. The Merck Index je prav tako pomembna referenčna enciklopedija z 11.000 monografijami, ki med drugim vsebujejo informacije o naravnih spojinah ter njihovih lastnostih, terapevtski in komercialni uporabi. Več knjižnic spojin obravnava tradicionalne kitajske zdravilne rastline, in sicer CHMD - Chinese Herbal Medicines Database, TCMD - Traditional Chinese Medicines Database, CHCD - Chinese Herbal Constituents Database. Knjižnice vsebujejo od 7.000 do 10.000 vnosov s strukturnimi, farmakološkimi in botaničnimi referencami. BPCD - Bioactive Plants Compound Database ponuja 2.597 naravnih spojin različnih virov ter podatke o aktivnosti na 78 terapevtskih tarčah. AntiBase knjižnica Univerze v Gottingenu ponuja prek 30.000 spojin, izoliranih iz mikroorganizmov ter gliv. MNPD - Marine natural products database vsebuje 6.000 vnosov naravnih spojin iz okoli 10.000 morskih organizmov. The DNP - Dictionary of Natural Products, del knjižnice The Chapman & Hall/CRC Chemical Database, ponuja podatke o preko 200.000 spojin naravnega izvora, ki so strukturno klasificirane in vsebujejo reference, fizikalno-kemijske ter biološke podatke. ROMPP Natural products je prav tako del kemijsko širše zastavljene knjižnice Thieme ROMPP. Tu najdemo 6.000 spojin naravnega izvora s pripadajočimi strukturnimi in analitskimi informacijami. (20) 4 Uporaba računalniške (računske) kemije za iskanje spojin vodnic med spojinami naravnega izvora V akademskih raziskavah in v farmacevtski industriji se računalniško podprte metode iskanja spojin vodnic danes rutinsko uporabljajo. Virtualno rešetanje je krovni pojem za skupine metod, ki jih uporabljamo Preglednica 4: Javno dostopne knjižnice spojin, ki vsebujejo podatke o spojinah naravnega izvora (povzeto po (17-20)). Table 4: Public databases containing collections of natural products (based on (17-20)). Ime knjižnice Dostop na svetovnem spletu Celotno število spojin Število spojin naravnega izvora ChEBI www.ebi.ac.uk/chebi/ > 6.000 -3.500 NPD (Zinc) zinc.docking.org/ > 90.000 -90.000 ChemBank chembank.broadinstitute.org/ > 1.100.000 n.p. ChemID chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/ > 350.000 -2.000 NCI cactus.nci.nih.gov/ > 250.000 n.p. PubChem pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ > 2.000.000 n.p. SuperNatural bioinformatics.charite.de/supernatural/ > 50.000 -50.000 n.p - trenutno ni dostopnega točnega podatka Ime knjižnice Dostop na svetovnem spletu Celotno število spojin Število spojin naravnega izvora CAS www.cas.org/expertise/cascontent/index.html > 25.000.000 n.p. Beilstein www.reaxys.com/ > 10.000.000 > 150.000 The Merck Index library.dialog.com/bluesheets/html/bl0304.html > 10.000 n.p. TCMD www.cintcm.com/index.htm > 7.000 > 7.000 AntiBase www.wiley-vch.de/stmdata/antibase2011.php > 30.000 > 30.000 DNP dnp.chemnetbase.com/ > 200.000 > 200.000 ROMPP www.roempp.com/de/formate/encyclopedias/roempp.html > 6.000 > 6.000 n.p - trenutno ni dostopnega točnega podatka Preglednica 5: Komercialne knjižnice spojin, ki vsebujejo podatke o spojinah naravnega izvora (povzeto po (17-20)). Table 5: Commercially available databases containing collections of natural products (based on (17-20)). Slika 3: Podrobnejša predstavitev integracije računalniško podprtih metod v raziskavah spojin vodnic naravnega izvora. Figure 3: Detailed representation of the integration of computer-based methods in the natural products drug design research process. pri avtomatiziranem računalniško podprtem preiskovanju velikih knjižnic spojin s ciljem iskanja novih spojin vodnic (16, 21). Z vse večjo dostopnostjo računalniške tehnologije se je danes ta metodološki pristop pospešeno uveljavil tudi pri rešetanju spojin naravnega izvora, saj omogoča racionalno načrtovanje in usmeritev eksperimentalnega dela na izbrane nize spojin, ki zadostijo pogojem rešetanja (slika 3) (16). Tak pristop je tudi ekonomsko in časovno učinkovitejši. Računalniška tehnologija tudi omogoča, da izračunamo fizikalno-kemijske lastnosti in ocenimo nekatere farmakokinetične in toksikološke parametre preiskovanih spojin (21). Najbolj pogosto uporabljamo pristope virtualnega rešetanja, ki temeljijo na strukturi ligandov, ali makromolekulske tarče, paralelno virtualno rešetanje in iz njega izpeljano metodo lovljenja tarč. Vsi računalniški pristopi morajo v vseh fazah upoštevati dostopne eksperimentalne podatke, pridobljene v različnih fazah raziskav spojin naravnega izvora (22). 4.1 Virtualno rešetanje, ki temelji na strukturi liganda S pomočjo znane kemijske strukture liganda z določeno biološko aktivnostjo na preiskovani tarči lahko iščemo kemijsko in biološko sorodne spojine. Uporabljamo lahko zelo enostavne dvodimenzionalne pristope, kjer primerjamo atome in vezi v molekulah iz preiskovanih knjižnic z referenčno molekulo. Metode rešetanja lahko primerjajo obliko in volumen posameznih struktur in njihovo podobnost. Pogosto pa molekule med seboj primerjamo na osnovi zgrajenega farmakofornega modela (slika 3). Farmakoforni model opišemo kot zbirko steričnih in elektronskih lastnosti, ki so potrebne za zagotovitev optimalnih medmolekulskih interakcij s specifično biološko tarčo, ki vodijo do biološkega odziva. Tu ne govorimo o zbirki konkretnih funkcionalnih skupin, ampak ključne lastnosti molekule opišemo z bolj splošnimi farmakofornimi elementi (npr. ionski center, hidrofobna interakcija, sterična omejitev, aromatski obroč itd.). Izdelani farmakoforni model je nekakšen skupni imenovalec bioaktivnih ligandov, ki ga uporabimo kot virtualno sito na preiskovani knjižnici spojin (16, 21). 4.2 Virtualno rešetanje, ki temelji na strukturi tarče Vse več bioloških makromolekul, ki predstavljajo tarče za razvoj zdravilnih učinkovin, ima določeno tudi svojo tridimenzionalno strukturo. V tem primeru je največkrat uporabljena metoda virtualnega rešetanja sidranje molekul preiskovane knjižnice v aktivno mesto receptorja in ocena vezavne afinitete sidranih konformacij (slika 3). Poleg opisa struktur molekul v knjižnici in definiranega aktivnega mesta je zelo pomemben učinkovit iskalni algoritem programa za sidranje, ki pravilno umesti preiskovane ligande v aktivno mesto, in robustna cenilna funkcija za razvrstitev izračunanih kompleksov po energiji interakcije liganda s tarčo (23). Druga možnost virtualnega rešetanja je uporaba na strukturi temelječih farmakofornih modelov. V tem primeru farmakoforni model zgradimo na osnovi strukture kompleksa med ligandom naravnega izvora in tarčo, na kateri identificiramo ključne farmakoforme elemente, ki opisujejo interakcije spojine s tarčo. Z uporabo steričnih omejitev, ki jih izpeljemo iz strukturnih podatkov, pa med virtualnim rešetanjem upoštevamo tudi prostorske omejitve preiskovanega aktivnega mesta tarče (20). 4.3 Paralelno virtualno rešetanje in lovljenje tarč Tehnologija paralelnega virtualnega rešetanja uporablja zgoraj opisani metodologiji za rešetanje ligandov na več tarčah hkrati (24). Na eni strani je tehnologija primerna za iskanje ligandov, kjer iščemo spojine, ki naj delujejo na več tarčah hkrati, še večkrat pa se tak pristop uporablja za NH 1 O. H O ^-^ O