Radiol Oncol 1.999; 33(5uppl 1): 564-568.
Ocena rezultatov vakcinacije z dendritičnimi celicami pri zdravljenju raka pri ljudeh
Critical issues regarding dendritic cell vaccination for
human cancer
Frank O. Nestle
Department ofDermatology, University ofZurich Medical School, Zurich, Switzerland
Povzetek: Melanom je imunogeni tumor z znanimi tumorskimi antigeni. Pomemben terapevtski cilj je indukcija specifičnih citotoksičnih T limfocitov (CTL) proti melanomu. Dendritične celice (DC) so se v večjih mišjih modelih pokazale kot primerne za indukcijo specifičnih CTL proti melanomu. Razpravljali bomo o trenutnih rezultatih pri uporabi DC za zdravljenje raka pri ljudeh, kot je pridobivanje in uporaba humanih DC, uporaba nadomestnih helperskih antigenov, različnih metodah za odkrivanje za antigen specifičnih imunskih odzivov. Predstavili bomo tudi nekaj naših kliničnih ugotovitev, ki obravnavajo vakcinacijo bolnikov z melanomom v IV stadiju in razpravljali o vzrokih za neodzivnost na zdravljenje. Ključne besede: melanom - zdravljenje, imunologija; dendritične celice; T-limfociti citotoksični; novotvorbe, vakcine
Abstract: Melanoma is an immunogenic tumor with defined tumor antigens. An important therapoeutic aim is the induction of anti-melanoma specific cytotoxic T-lymphocytes (CTL). Dendritic cells (DC) as natur's adjuvant have proven to be suitable for the induction ofanti- melanoma specific CTL in several murine models. We will discuss current issues in the use of DC for treatment ofhuman cancer such as the generation and application of human DC, use of surrogate helper antigens, various methods to detect antigen-specific immune response and briefly touch on some of our clinical data relating to vaccination of stage IV melanoma patients. Finally, we will propose reasons for missing response to DC therapy. Key words: melanoma - therapy - immunology; dendritic cells; T-lymphocytes, cytotoxic; cancer vaccines
Uvod
Dendritične celice (DC) ščitijo imunski sistem in predstavljajo antigen perifernih tkiv, kot je koža, sekundarnim limfatičnim organom, kot so bezgavke.'1 So visoko specializirane anti-
Naslov avtorja: Frank O. Nestle, M.D., Department of Dermatology, University of Zurich Medical School, Gloriastrasse 31, 8091 Zurich, Switzerland. Tel: +41 1 255 2550; Fax: +41 1 225 4403; E-mail: nestle@derm.unizh.ch
gen-prezentirajoče celice (APC) za aktivacijo za antigen specifičnih efektorskih T celic, ki recirkulirajo v sekundarnih limfatičnih organih. V zadnjih desetih letih je porast razumevanja biologije DC odprl nove možnosti za aplikacijo teh celic v imunoterapiji raka. Predstavili bomo zadnje izsledke pridobivanja in aplikacije DC, uporabo nadomestnih helper-skih antigenov, različne metode za odkrivanje za antigen specifičnih imunskih odgovorov,
Nestle PO / Vakcinacija bolnikov z melanomom
S65
na kratko bomo predstavili nekaj naših kliničnih izsledkov o vakcinaciji bolnikov z me-lanomom v IV stadiju, s pulzom DC, povzročenim z antigenom. Nazadnje bomo predlagali razloge za neodzivnost odgovora na terapijo z DC.
Pridobivanje DC
Še pred nekaj leti je bila izolacija in pridobivanje DC časovno zamudna in komplicirana, kar je uspelo le nekaterim raziskovalnim skupinam. Z možnostjo diferencijacije DC, v prisotnosti nekaterih citokinov, npr. IL-4 in GM-CSF, od plastičnih adherentnih prekursorjev monocitov, se je povečalo število raziskav DC in možne terapevtske aplikacije le teh.2'3 Istočasno so prenehali veljati kriteriji, ki so pred tem zadostovali za definicijo DC.
Nekatera ključna vprašanja pri trenutnih raziskav DC so: je plastična adherentna celica, ki je pridobljena iz krvnih monocitov v mediju brez seruma in v prosotnosti IL-4 in GM-CSF, v sedmih dnevih, resnična DC? Kako stabilen je fenotip omenjene celice in koliko je zrela? Je potreben dodaten maturacijski stimulus za stabilni fenotip omenjene celice in za bolj potentno T-celično stimulativno kapaciteto? Kakšna je migratorna kapaciteta različnih tipov DC? Katera DC je bolj primerna za specifični T-celični odgovor in vivo proti tu-morskemu antigenu, nezrela ali zrela?
Ker dihotomnost nezrele in zrele DC ni zlahka prenosljiva iz človeka na miš, so odgovori na takšna vprašanja težka, pri modelih z glodalci. Obsežne raznolike klinične pilotne študije, s skrbno načrtovanimi in izvedenimi sistemi interpretacije rezultatov, nam bodo dale odgovor za optimalno metodo priprave DC. V času začetka klinične aplikacije DC je bila edina tehnika pridobivanja DC v telečjem serumu (FSC) z IL-4 in z granulocitnim/ma-krofagnim stimulacijskim faktorjem kolonije (GM-CSF). FCS-DC nosijo veliko količino MHC molekul in kostimulatornih molekul na
svoji površini in so potentni stimulatorji T celic. Od svojih dvojnikov, ki so pridobljeni v mediju brez seruma, se razlikujejo z večjo ekspresijo kostimulatornih molekul in z boljšo T celično stimulatorno kapaciteto. Rajši uporabljamo DC, ki so pridobljene brez seruma. Zadovoljiva maturacijska stimulanta bi bila LPS in CD40L, vendar nista na voljo v zadostni količini za klinično uporabo. Za indukcijo maturacije DC smo pričeli uporabljati monoci-tni supernatant, ki se je izkazal kot primeren.4'5 Kjub temu ima supernatant slabost, namreč induktorji maturacije,citokini, se lahko spreminjajo od pripravka do pripravka. Zaradi tega uporablajmo kot maturacijske stimu-luse mešanico citokinov IL-1, IL-6, TNF-cx +/-PGE2.6 Takšna mešanica zagotavlja zanesljivo maturacijo DC in stabilen fenotip s potentno T celično stimulatorno kapaciteto. Za kontrolo kvalitete uporabljamo markerje vezane na funkcijo CD, kot so CD 80, CD 86, CD 40 in HLA-DR. Nadomestni markerji zrelih DC, kot je CD 83, so lahko koristni, vendar korelacija ekspresije CD 83 z imunološko in klinično učinkovitostjo še ni dokazana.
Uporaba DC
Vnos DC v bolnika je pomembnejše vprašanje, kot je pridobivanje DC. Možnih je več načinov, kot so intravenozni, intradermalni, subkutani ali intranodalni. Več raziskovalnih skupin uporablja intravenozni način vnosa. Injicirane DC se sprva transportirajo do pljuč, kar vodi do razpada DC antigenskih kompleksov in to je lahko zaskrbljujoče. Prosti dise-minirani antigeni lahko v telesu sprožijo napačen imunološki odziv, kar lahko privede do tolerance, namesto do imunološke aktivacije. Za pridobivanje zadostnih DC prekurzorjev se uporablja intravenska aplikacija velikega števila DC, kar zahteva levkoferezo; slednja je za bolnika naporen in neprijeten postopek. Če ekstrapoliramo podatke, ki so dobljeni iz živalskih modelov, se zdi intradermalna apli-
Radiol Oncol 1999; 33(Suppl 1): S64-S68.
S66
Nestle PO / Vakcinacija bolnikov z melammont
kacija vnosa DC primerna. Domneva se, da intradermalno vnesene DC migrirajo iz afe-rentnih limfnih vodov do bezgavk. Dosedanje študije niso z zanesljivostjo potrdile migrator-no kapaciteto in vivo vnesenih DC. Migrator-na kapaciteta in število DC, ki se transportira-jo do bezgavk, sta ključni vprašanji nadaljnjih študij.
V času naše raziskave še niso bili na voljo zadovoljujoči podatki o migratorni kapaciteti humanih DC, zato smo se odločili, da bomo injicirali DC v ingvinalne bezgavke pod kontrolo ultrazvoka. Kot smo že povedali, je bezgavka primerno mesto, kjer komunicirata DC in T celice in je tako, gledano teoretično, zaželjeno mesto iniciranja z antigeni vezane DC. Injicirali smo lx106 DC v 500 |il fosfatnega pufra (PBS). Injiciranje je potekalo pod kontrolo z ultrazvokom. Porast hipoehogene-ga območja v bezgavki je odgovarjalo injicira-nemu mediju z DC. Uspešnost injiciranja je zelo visoka in reproducibilna.
Hemocianin (KLH) kot nadomestni helperski antigeni
Peptidno pulziranje DC bo verjetno generira-lo samo nekaj specifičnih kompleksov pepti-dov z MHC, tako da bodo tekmovali z nizko vezavno afiniteto lastnih peptidov in z označevanjem nekaterih »praznih« MHC površinskih molekul razreda I. Pod temi pogoji obstaja majhna verjetnost za nastanek ci-totoksičnih T celic (CTL), brez dodatnih signalov. Šibki antigeni, kot so tumorski antigeni, sami po sebi niso učinkoviti za tvorbo učinkovitih specifičnih CTL, kar je bilo dokazano na večih živalskih modelih. Takšen dodaten signal zagotavljajo citokini ali posebni helperski T limfociti. Sklepali smo, da bi nadomestni helperski antigen generiral zadostne helperske signale. Izbrali smo hemocia-nin (KLH), neoantigen z visoko potentno imunostimulatorno kapaciteto, ki je pridobljen iz polžev. Takšen antigen nam dopušča
Radiol Oncol 1999; 33(Suppl 1): S64-S68.
(i) kontrolo indukcije odgovora CD 4 pozitivnih helperskih T celic in (ii) predstavitev po-tentnega T celičnega odgovora na mestu akti-vacije T celic, torej v injicirani bezgavki. KLH je prinešen k DC eksogeno, preko antigenske predstavitve in po intranodalnem injiciranju inducira zelo močen KLH specifični spominski odgovor in vivo. Mnogo KLH specifičnih spominskih T celic v injiciranih bezgavkah prispeva k maturaciji in indukciji produkcije DC s pomočjo IL-12, preko CD 40/ CD 40 L signaliziranja in tudi vodi do nastanka »super aktiviranih« DC, ki so sposobne aktivirati ubijalske T celice brez prisotnosti pomagalk.7'8
Zaznavanje od antigena specifičnega imunskega odgovora
Zaznavanje od antigena specifičnega imunskega odgovora je pomemben nadomestni marker kon trole za učinkovitost strategije vakcinacije, čeprav bo korelacija s kliničnim odgovorom najpomembnejše vprašanje. Klasična pot detekcije aktivnosti CTL je merjenje litične aktivnosti označenih tarčnih celic s 51Cr. Ker je pogostotst prekurzorjev nizka, je za zadostno detekcijo CTL s citotoksičnimi analizami potrebna dva do trikratna in vitro restimulacija. Takšne tehnike so časovno zamudne in lahko privedejo do artefakta, ki omejuje kvantitativne analize. Ta metoda je navkljub vsemu zlati standard za merjenje li-tične aktivnosti efektorskih celic, torej tiste funkcionalne aktivnosti, ki jo želimo inducirati in vivo. Nedavno so predstavljene metode, ki merijo sproščanje citokinov iz CTL, po stiku z antigenom. Citokine je mogoče izmeriti z ELISA-o (ELISPORT), ali jih intracelular-no kvantificirati s pretočno citometrijo, po predhodnem barvanju. Težave z ELISPORT metodo je nizka reproducibilnost, zaradi različne individualne subjektivne ocene rezultatov. Druga težava je v tem, da detekcija sproščanja citokinov ne korelira nujno z cito-litično aktivnostjo določene celice. Mi smo
Nest/c PO / Vnkcinncijn bolnikov z melanomom
S67
izvedli dodatno metodo testiranja specifičnih imunskih odgovorov na peptid, zakasnele hi-persenzitivnosti (DTH). Sam peptid ali DC s peptidom so bili injicirani intradermalno, na mestu katere se je pojavila induracija in eri-tem po 48 urah. Pri vseh naših bolnikih smo dobili zelo dobro korelacijo med pozitivnim DTH odgovorom in kliničnim odzivom. Ta tehnika je pomembna tako za bolnike kot za zdravnike, ker slednji lahko nemudoma opazujejo morebitno pojavnost ali odsotnost imu-noreaktivnosti. DTH testiranje s peptidom je bilo uspešno uporabljeno v različnih mišjih modelih.9 Pri ljudeh smo opazili tudi pojav specifičnih T celic proti peptidu, na mestu injiciranja.10
Trenutno potekajo razprave o uporabi HLA-peptidnih tetramernih kompleksov.11-13 Po biotinilaciji smo pripravili tetramerno strukturo z dodanim streptavidinom, ki je bil fluorescentno označen. Takšni kompleksi se vežejo na specifične T celice, ki se lahko odkrivajo s pretočno citometrijo. Pomanjkljivost je nizka senzitivnost, ki je pogosto potrebna za pri in vitro restimulaciji T celic za specifični antigen. S tetrameri ne moremo odkriti T celic s spreminjajočo se ali z nizko afiniteto, ki pa so pomembne predvsem pri vakcinaciji proti lastnim antigenom (diferenciacijski antigeni pri melanomu).
Stranski učinki
Pri zdravljenju 30 bolnikov z napredovalim melanomom, s peptidom ali z lizatom pulznih DC, nismo zaznali pomembnih stranskih učinkov. Pri nekaj bolnikih smo zaznali blag porast telesne temperature po vakcinaciji ali boleče bezgavke. Ker smo uporabili peptidne antigene, ki smo jih pridobili iz melanocitnih diferencijacijskih antigenov, se lahko pojavijo avtoimunim podobne reakcije. V času vakci-nacije se lahko pojavi progresivni vitiligo ali depigmentacija melanocitnih nevusov. Težjih destruktivnih avtoimunih reakcij nismo zaznali, razen indukcijo protiteles proti ščit-
mcmm receptorjem, proti jedrnih protiteles in revmatoidnega faktorja, pri nekaterih bolnikih.
Klinični rezultati
Čeprav je indukcija specifičnega imunskega odziva proti antigenu pomemben dejavnik kontrole uspešne vakcinacije, je bil naš cilj re-gresija tumorskih lezij. Za evaluacijo bolnikov, ki so se odzvali na terapijo, smo oblikovali natančen kriterij. Poseben pomen smo pripisali objektivni hitrosti odziva (tako popolnega kot delnega ), trajanje odziva, kot tudi lokaciji metastaz, ki so regrediirale. Pri več kot 30 zdravljenih bolnikih so objektivne hitrosti odziva v skladju s predhodno objavljenimi raziskavami. Trenutno potekajo tudi mnoge multicen-trične študije, v katerih se obravnavajo različni režimi zdravljenja napredovalega melanoma z DC vakcinacijo in rezultati bi morali pokazati dejansko klinično učinkovitost DC vakcinacije. Obstaja več zanimivih kliničnih opažanj, o katerih lahko razpravljamo. Tako je večkrat opisan popoln odziv na terapijo, ki je trajal 2 leti; to kaže na dolgotrajni anti tumorski učinek. Rezultati neobjavljenih preliminarnih študij kažejo na to, da bi morda bila ponovljena vakcinacija potrebna za vzdrževanje učinka terapije. Tumorska regresija se pojavi v različnih organih, kot so pljuča, žlezi slinavki, bezgavkah in v koži. Obstaja zelo dobra kore-med odgovorom na terapijo in imunskim odzivom. Ponavljajoča se vakcinacija je morebiti koristna za bolnike in odgovor na vakcinacije korelira z imunskim odzivom. Pri vseh bolnikih, razen pri enemu, ki so bili vključeni v naše prejšnje raziskave, je bila s 4h-kromom dokazana indukcija od peptida specifičnih CTL. Ena od dogem imunoterapije je bila, da samo bolniki z majhnim tumorjem lahko odreagirajo na terapijo z DC vakcinaci-jo. Dokazali smo, da lahko tudi bolniki z obsežnim tumorjem odreagirajo na vakcinacijo z DC; odgovor je v veliki meri odvisen od eks-
Rudiol Oncol 1999; 33(5uppl 1): 564-568.
S68
Nestle PO / Vakcinacija bolnikov z iiielaiioiiioiii
presije tarčnih antigenov na tumorskih celicah in ne od velikosti tumorja.
Razlogi za neodzivnost na zdravljenje
Medtem ko obstaja zmerni optimizem in čedalje več dokazov, da lahko DC vakcinacija zelo dobro inducira imunski odziv na specifični antigen in posledično na klinični odziv obolelih za rakom, pa je malo znanega, zakaj se nekateri bolniki na zdravljenje ne odzivajo. Predpogoj za uspešno uničevanje celic je ekspresija peptidov/MHC na površini melanom-skih celic, ki jih lahko prepoznavajo ubijalski T limfociti. Najbolj sposobne celice ubijalke, ki so inducirane s super aktiviranimi DC, ne morejo uničevati tarčnih celic, če tarčni kompleksi niso izraženi na tarčni celici. Tumorski antigen se mora izraziti na površini tumorske celice. Večina proteinov se v proteasomih razcepi v manjše peptide. Slednji se transportira-jo v endoplazemski retikulum, kjer se vežejo z MHC kompleksi. Kompleksi peptidov/MHC se končno izrazijo na celični površini, kjer jih prepoznavajo T celice ubijalke. Na sveže eks-cidiranih metastazah in situ smo proučevali ekspresijo različnih proteinov, ki so bili potrebni za antigensko procesiranje in za izražanje na celični površini. Pri vseh bolnikih, ki se na terapijo z DC niso odzivali, smo opazili poškodbe in izgube različnih molekul, ki so potrebne za procesiranje antigenov in za njihovo izražanje na celični površini. Zaključimo lahko, da tudi pri najboljšem režimu vakcina-cije bolnikov z napredovalim melanomom ne moremo zaznati kliničnega odgovora v visokem odstotku. Tako bi s pre-screeningom v primerih imunskega pobega lahko zagotovili večji uspeh terapije z vakcinacijo
Literatura
1. Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells in the control of immunity. Nature 1998; 392: 245-52.
2.	Sallusto F, Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained bygranulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and do-wnregulated by tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med 1994; 179: 1109-18.
3.	Romani N, Gruner S, Ksmpgen E, Lenz A, Trockenbacher B, Konwalinka G, et al. Proliferating dendritic celi progenitors in human blood. J Exp Med 1994; 180: 83-93.
4.	Romani N, Reider D, Heuer M, Ebner S, Kampgen E, Eibl B, et al. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol Methods 1996; 196: 137-51.
5.	Bender A, Sapp M, Schuler G, Steinmann RM, Bhardwaj N. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood. J Immunol Methods 1996; 196: 121-35.
6.	Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, Steinbrink K, Para-gnik L, Schmitt E, et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol 1997; 27: 3135-42.
7.	Lanzavecchia A. License to kill.. Nature 1998; 393: 413-4.
8.	Ridge JP, di Rosa F, Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ t-helper and a T-killer cell. Nature 1998; 393: 474-7.
9.	Puccetti P, Bianchi R, Fioretti MC, Ayroldi E, Uy-ttenhove C, Peel AV, et al. Use of a skin test to determine tumor-specific CD8+ T cel reactivity. Eurj /»(»»¡/10/1994; 24: 1446-52.
10.	Nestle FO, Lijagic S, Gilliet M, Sun Y, Grabbe S, Dummer R, et al. Vaccination of melanoma patients with peptide or tumor lysate pulsed dendritic cells. Nature Med 1998; 4: 328-32.
11.	Ogg GS, McMichael AJ. HLA-peptide tetrameric complex. Curr Opiii Immunol 1998; 10: 393-6.
12.	Dunbar PR, Ogg GS, Chen J, Rust N, van der Brug-gen P, Cerundo V. Direct isolation, phenotyping and cloning of low-frequency antigen-specific cytotoxic T lymphocytes from peripheral blood. Curr Biol 1998; 8: 413-6.
13.	Altrnan JD, Moss PAH, Goulder PJR, Barouch DH, Mc Heyzer WMG, et al. Phenotyping analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 1996; 274: 94-6.
Radiol 0ticol 1999; 33(Suppl 1): S64-S68.