ERK'2021, Portorož, 423-426 423 Stroboskopski sistem za zajem slik fosfolipidnih veziklov za doloˇ canje mehanskih lastnosti Nejc Klanjˇ sˇ cek 1 , Samo Peniˇ c 1 1 Laboratorij za fiziko, Fakulteta za Elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Trˇ zaˇ ska cesta 25, SI-1000 Ljubljana E-poˇ sta: samo.penic@fe.uni-lj.si Stroboscopic image capture system to determine mechanical properties of phospholipid vesicles The biological cell is the basic building block of all life on Earth, so research into cell function involves a mul- titude of research. The membrane consists mainly of a phospholipid bilayer, which contains additions of other lipids, proteins and other molecules that significantly af- fect cell function [1]. For research purposes, we often use the simplification of the cell membrane - vesicles, which consist only of a phospholipid double layer and any con- trolled additives that are the subject of investigations. An important physical property that strongly influences cell function is the elasticity of the membrane that surrounds it. In this paper, we will present the process of making a stroboscopic illumination of a sample containing a quasi- spherical giant unilamellar vesicle, which is part of a sys- tem for the analysis of thermal fluctuations with a phase contrast microscope. The improved stroboscopic light- ing system enables the capture of sharper shots, because instead of the usual integration time of the camera, the image is captured only during the duration of the light pulse of the stroboscopic lamp. Due to less blurred im- ages due to thermal fluctuations, the bending constant of the membrane can be determined more precisely. 1 Uvod Bioloˇ ska celica predstavlja osnovni gradnik vsega ˇ zivlje- nja na Zemlji, zato se z raziskovanjem delovanja celice ukvarja mnoˇ zica raziskav. Kljub raznolikosti celic, ki jih najdemo v bioloˇ skih sistemih, so osnovni gradniki in nji- hova kemijska sestava veˇ cine celic enaki [2, 3, 4]. Celico obdaja membrana, ki loˇ cuje njeno notranjost od zunanjo- sti ter dovoljuje le izmenjavo doloˇ cenih snovi med celico in medceliˇ cnino. Membrana je sestavljena v veˇ cji meri iz fosfolipidne dvojne plasti, v kateri so primesi drugih lipi- dov, proteinov in ostalih molekul, ki pomembno vplivajo na delovanje celice [1]. V raziskovalne namene pogosto uporabljamo poeno- stavitev celiˇ cne membrane – vezikle, ki so sestavljeni le iz fosfolipidne dvojne plasti in morebitnih kontroliranih primesi, ki so predmet preiskav. Pomembna fizikalna lastnost, ki moˇ cno vpliva delovanje celice je elastiˇ cnost membrane, ki jo obdaja. Fosfolipidno dvojno plast lahko obravnavamo kot dvo- dimenzionalno tekoˇ cino, ker je izjemno mehka, same mo- lekule fosfolipidov pa v membrani difundirajo – se pre- mikajo lateralno po povrˇ sini dvojne plasti; ter se celo se- lijo med slojema (t.i. flip-flop efekt) [5]. Molekule okoli celice se gibljejo zaradi Brownovega gibanja, ki je soraz- merno s temperaturo. Ker so membrane tako mehke, so podvrˇ zene termiˇ cnim fluktuacijam zaradi trkov teh mole- kul (najveˇ ckrat se omenjajo kar molekule vode) ob dvo- sloj. Migetanje (utripanje) rdeˇ cih krvnih celic je zaznal ˇ ze Browicz v poznem 19. stoletju z uporabo optiˇ cnega mikroskopa. Danes lahko fluktuacije lipidne dvojne pla- sti opazujemo z izboljˇ sanim faznokontrastnim mikrosko- pom ter s spektralno analizo teh fluktuacij neinvazivno merimo nekatere kljuˇ cne lastnosti bioloˇ skih celic [6, 7, 8, 9]. Teoretiˇ cne temelje za spektralno analizo termiˇ cnih fluk- tuacij sta razviva Milner in Safran [6]. Njune izpeljave apliciramo tako na opazovanje tridimenzionalnih oblik veziklov, ki jih pridelamo npr. iz raˇ cunalniˇ skih simula- cij Monte Carlo [10] ali na obdelavo slik pridobljenih z uporabo kamere prikljuˇ cene na fazno–kontrastni mikro- skop. Pri slikah z mikroskopa, opazujemo le ekvatorialni presek vezikla in uporabimo dodatno statistiˇ cno obdelavo oblik. Teoretiˇ cni model Milnerja in Safrana za doloˇ canje ela- stiˇ cnih lastnosti bioloˇ skih membran z analizo njihovih termiˇ cnih fluktuacij [6] temelji na Helfrichovem modelu upogibne energije membrane [11] in vsebuje implicitno predpostavko, da pri termiˇ cnih fluktuacijah lipidne dvojne plasti upogibna in natezna deformacija membrane nista sklopljeni in lahko uporabimo pribliˇ zek t.i. povpreˇ cnega polja [12]. Rezultat dela Milnerja in Safrana je sistem enaˇ cb, ki povezuje vrste koeficientov krogelnih funkcij z upogibno konstanto membrane ju m l j 2 = kT K c 1 (l 1)(l + 2)( +l(l + 1)) : V enaˇ cbi je T absolutna temperatura, k Boltzmann- ova konstanta,K c upogibna konstanta membrane, pov- preˇ cna lateralna napetost inu m l koeficienti v razvoju oblike membrane po krogelnih funkcijah stopnje l in reda m. Stopnja krogelnih funkcij l v zgornji enaˇ cbi mora biti veˇ cja od 1 (l > 1), red m pa je znotraj intervala [ l;l] 424 [6]. Predeterminiran sistem enaˇ cb uporabimo za izraˇ cun najboljˇ sega prileganja parametrovK c in . Iz slik ekvatorialnega preseka vezikla, uporabljamo algoritem, ki izraˇ cuna upogibno konstanto K c . Najprej sledimo robu vezikla in doloˇ cimo lokalni radij v ekvatori- alni ravniniR(= 2;’;t), ki je odvisnen od kota’ zaradi nepravilne oblike vezikla. V nadaljevanju izraˇ cunamo relativen odmik r(= 2;’;t) vezikla od polmera R 0 , ki bi ga imel krog z enako povrˇ sino kot ekvatorialni presek vezikla ter izraˇ cunamo avtokorelacijo relativnega odmika (;t ) po kotu . (;t ) = 1 2 Z 2 0 r (= 2;’+;t )r(= 2;’+;t )d’ ; ˇ Casovno povpreˇ cje (povpreˇ cje prek veˇ cih slik posa- meznega vezikla) avtokorelacijske funkcije lahko pove- ˇ zemo s koeficienti krogelnih funkciju l preko zveze ( ) = X l 2l + 1 4 ju l j 2 P l (cos( )) ; kjer v izrazu nastopajo Legendrovi polinomiP l (cos( )). Parameter l je stopnja polinoma, in ima enako vrednost kot stopnja krogelnih funkcij. Upogibno konstanto do- bimo enako kot v primeru simulacij z zvezo stopnje kro- gelnih funkcij in koeficientov krogelnih funkcij 2l + 1 4 ju l j 2 = kT K c 1 (l 1)(l + 2)( +l(l + 1)) : Za dosego natanˇ cnejˇ sih rezultatov potrebujemo ostre posnetke vezikla. S tem dobimo uporabne rezultate tudi do stopnjel = 21. V prispevku bomo predstavili postopek izdelave stro- boskopske osvetlitve vzorca, ki vsebuje kvazisferiˇ cne or- jaˇ ske fosfolipidne vezikle (angl. giant unilamellar vesicle ali GUV), ki je del sistem za analizo termiˇ cnih fluktuacij s faznokontrastnim mikroskopom. Konˇ cni cilj tega razvoja je celostno raˇ cunalniˇ sko krmiljeno eksperimentalno oko- lje primerno za raziskovalce s podroˇ cja bioloˇ skih znano- sti. Predstavljena reˇ sitev je uporabna tudi za mikroskope, ki ne podpirajo veˇ c kanalov osvetlitve. Tak primer je bil mikroskop Nikon Eclipse TE2000-S, za katerega smo naˇ crtali in izdelali modul, ki je mikroskop razˇ siril za do- daten kanal osvetlitve. Nanj smo poleg obstojeˇ ce osvetli- tve s halogensko ˇ zarnico pritrdili nosilec za dodatno stro- boskopsko luˇ c. Uporabljen sistem stroboskopske osve- tlitve podjetja Hamamatsu je sestavljen iz 4 modulov: stroboskopske luˇ ci L7684 nameˇ sceni v montaˇ zno-hladil- ni enoti, krmilnika stroboskopske luˇ ci C6096, zunanje vi- sokonapetostne kondenzatorske baterije E7289. Dodatno smo uporabili obiˇ cajni stikalni napajalnik za pretvorbo napetosti 230 V na 24 V z najveˇ cjo tokovno zmoglji- vostjo 3 A in elektroniko za raˇ cunalniˇ sko krmiljenje in sinhronizacijo stroboskopske luˇ ci s kamero na osnovi ra- zvojnega sistema Arduino (slika 1). Tako izboljˇ san sistem osvetlitve vzorca s stroboskop- sko luˇ cjo omogoˇ ca zajem ostrejˇ sih posnetkov, saj name- sto obiˇ cajnega integracijskega ˇ casa kamere, sliko zaja- memo le v ˇ casu trajanja svetlobnega impulza stroboskop- ske ˇ zarnice. Zaradi manj zabrisanih slik zaradi termiˇ cnih fluktuacij lahko natanˇ cneje doloˇ cimo upogibno konstanto membrane. Enostaven uporabniˇ ski vmesnik je pripomo- ˇ cek, ki avtomatizirano krmili stroboskopsko osvetlitev, medtem ko se lahko izvajalec meritev osredotoˇ ci na “lo- vljenje” vezikla v vidnem polju mikroskopa. 2 Metode izdelave Za izdelavo sestavnih delov modula smo se morali po- sluˇ ziti razliˇ cnih naˇ cinov obdelave materiala t.i. aditivnih in subtraktivnih metod. Pri aditivnih metodah material dodajamo konˇ cnemu modelu (izdelku), v tem ko pri sub- traktivnih metodah material odvzemamo. Med aditivne metode spada 3D tisk, medtem ko pod izraz substraktivne metode uvrˇ sˇ camo rezkanje, struˇ zenje, bruˇ senje ... 2.1 Metoda 3D Tiska Pod izraz “3D tisk” uvrˇ sˇ camo razliˇ cne tehnologije do- dajanja materiala. Med najbolj poznanimi metodami se uvrˇ sˇ cata metoda “Fused deposition Modelling” ali FDM in “Stereolitografija” ali SLA. FDM 3D tiskalnik deluje tako, da segreta kovinska glava ekstruderja stali plastiko v filamentu in jo naloˇ zi v Slika 1: Elektriˇ cna blok shema aplikacije 425 plasteh tankih kolobarjev na model. Mobilna miza se pre- mika v dveh ali treh oseh in s tem omogoˇ ca oblikovanje strukture. Princip delovanja SLA tiskalnika je precej drugaˇ cen kot pri FDM tiskalniku. Sestavljen je iz visoko-resolu- cijskega LCD ekrana z UV osvetlitvijo, ki osvetljuje foto- obˇ cutljivo tekoˇ cino, katera se strdi ko nanjo padejo UV ˇ zarki. Mobilna miza se dviguje ter spuˇ sˇ ca, pravokotno na LCD zaslon plast za plastjo dokler ne dobimo konˇ cnega izdelka. Prednost SLA tiskalnika je ta, da kvaliteto tiska doloˇ ca visoka resolucija LCD zaslona, v tem ko kvaliteto tiska pri FDM tiskalniku doloˇ cajo koraˇ cni motorji, ohlapnost vodil in sam korak koraˇ cnih motorjev. SLA tiskalniki so poˇ casnejˇ si in izdelki so cenovno draˇ zji kot pri FDM ti- skalnikih. Veˇ cina plastiˇ cnih sestavnih delov je bila izde- lana na FDM tiskalniku, izjema je bilo le drˇ zalo za ogle- dlo, kjer je bila potrebna precizna izdelava, zaradi kom- pleksne izvedbe. 2.2 Metoda CNC Rezkanja Glavna prednost aditivnih metod je enostavna izdelava kompleksnejˇ sih oz. nemogoˇ cih modelov za subtraktivne metode kot so rezkanje oz. struˇ zenje. FDM in SLA ti- skalniki imajo ˇ zal omejen izbor materialov za tiskanje. Pri naˇ sem modulu je bilo bistveno togo, moˇ cno, nosilno ogrodje in to je bilo teˇ zko doseˇ zeno z PLA oz. ABS 3D tiskano plastiko, zato smo se odloˇ cili za alumij. Obde- lovali smo ga z CNC ali “Computer numerical control ” rezkarjem, ki deluje tako da vrteˇ ca se glava z vpetim rezkarjem potuje po zastavljeni konturi in z rezkanjem odstranjuje material. Konturo zgenerira CAM ali “Com- puter aided manufacturing” program in jo zakodira v G- kodo, primerno za CNC rezkar. 3 Naˇ crtovanje in izdelovanje Za naˇ crtovanje in izdelavo 3D modela smo uporabili pro- gramsko opremo Solidworks 2021 podjetja Dassault Sy- stemes. Na Sliki 2 je prikazan 3D pogled na sestavljen stroboskopski osvetljevalni modul. Princip delovanja mo- dula je da lahko s pomoˇ cjo ogledala, ki je pozicionirano 45°na osnovnico; doloˇ camo kakˇ sen vir je vklopjen. Dva vira,ki jih uporabljamo sta halogenska ˇ zarnica; za kontu- inoirano delovanje in stroboskop; za pulzno delovanje. Stroboskopu je bila dodana ˇ se zbiralna in koliminarna leˇ ca za ˇ cim veˇ cjo efektivnost padle svetlobe na naˇ s objekt (celico). Notranjost modula in drˇ zalo modula je nati- snjeno iz ABS plastike, ki je odpornejˇ sa na viˇ sje tem- perature. Pri naˇ crtovanju modula smo upoˇ stevali, da je najveˇ cja dodatna obremenitev mikroskopovega stojala 5 kg. Konˇ cna izvedenka modula skupaj s stroboskopsko luˇ cjo je tehtala okrog 3kg. Cilinder, ki je pritrjen na ˇ celni ploˇ sˇ ci je bil del luˇ ci ki je predhodno bila vir osvetlitve mikroskopa. Ko je bil celoten fantom naˇ crtovan smo lahko zaˇ celi z izdelavo se- stavnih delov. Za 3D natisnjene dele smo generirali STL model, za katerega je raˇ cunalnik avtomatsko generiral G- kodo. Slika 2: 3D model modula. Modul postavimo na vhod osve- tlive mikroskopa (sprednji del). Z zadnje strani prikljuˇ cimo ob- stojeˇ co halogensko osvetlitev, z zgornje strani pa ima modul integrirano stroboskopsko osvetlitev. Z izvleˇ cnim zrcalom izbi- ramo tip osvetlitve, s katerim ˇ zelimo osvetljevati vzorec. Za prenos 3D modelov vseh alumijastih komponent v proizvodnjo smo uporabili program HSM Inventor 2018, podjetja Autodesk. V program smo uvozili 3D model ˇ zelenega modela, povedali hitrosti obdelave, hitrost vrte- nja rezkarja in debelino rezkarja. Nato smo oznaˇ cili kon- ture po katerih smo ˇ zeleli da se rezkar premika. Program je nato zgeneriral G-kodo, ki smo jo naloˇ zili na CNC rez- kar. Pri obdelavi smo morali rezkar konstantno hladiti in podmazovati, da se ta nebi zlomil. Ko smo imeli vse dele izdelane smo jih sestavili v celoto in montirali na stojalo mikroskopa. Slika 3: Modul pritrjen na mikroskop 426 4 Razprava in zakljuˇ cek Z uporabo metode 3D tiskanja in CNC obdelave smo iz- delali modul za zajem ostrejˇ sih posnetkov. Uspeˇ sno smo zajeli fotografije in generirali video premikov celice vi- dne na Sliki 4. Sekvenca ˇ stirih fotografij prikazuje gi- banje orjaˇ skega fosfolipidnega vezikla (oz. njegov ek- vatorialni presek) v vidnem polju faznokontrastnega mi- kroskopa pri 100-kratni poveˇ cavi. Fotografije so zajete znotraj intervala 2 s. Na vsaki izmed fotografij je raz- vidna trenutna oblika vezikla, vkljuˇ cno z odstopanji od idealne kroˇ zne oblike ekvatorialnega preseka. Fotogra- fije sluˇ zijo kot vhodni podatek v algoritem za zaznavanje konture in izraˇ cun Fourierove transformacije oblike ter nadaljno spektralno analizo. Za obˇ cutek ˇ casovne dimenzije je na sliki (na vsaki fotografiji, spodaj desno) vidna tudi bakterija, ki se je na- kljuˇ cno prikradla v vidno polje mikroskopa. Bakterija se giblje hitreje kot vezikel, vendar je sluˇ cajno ob trenutkih zajema slike ostala pribliˇ zno na istem mestu. Slika 4: Zajete slike s pomoˇ cjo stroboskopske osvetlitve. Sooˇ cili smo se z problemi povezanimi z samo meha- niko (ohlajanje stroboskopa, velikost stroboskopa, masa modula). Problemov bi se izoognili z nakupom hitre ka- mere, kateri glavni problem je visoka cena. Cenejˇ sa, a teˇ zje izvedljiva reˇ sitev je naˇ crtovanje LED luˇ ci z hitrimi preklopi. Ta bi zagotavljala prilagajanje intezivnost osve- tlitve in ˇ cas preklopov glede na dane potrebe. Za upra- vljanje LED luˇ ci bi bilo potrebno napisati programsko opremo, v katero bi prek raˇ cunalnika vnesli ˇ cas in moˇ c osvetlitve. Poleg tega bi software potreboval ˇ se druge funkcionalnosti, kot so avtomatsko zaznavanje konture membrane in izraˇ cun spektralne analize termiˇ cnih fluk- tuacij in tako bi to postalo uporabno orodje za podroˇ cje raziskovanja delovanja same celice. Literatura [1] B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. r. Raff, K. Ro- berts, and P. Walter, Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 4 ed., 2002. [2] D. Boal, Mechanics of the Cell. Cambridge Univ Pr, 2002. [3] R. Phillips, J. Kondev, J. Theriot, N. Orme, and H. . Garcia, Physical biology of the cell. Garland Sci- ence New York, 2009. [4] L. V odovnik, D. Miklavˇ ciˇ c, and T. Kotnik, Bioloˇ ski sistemi. Ljubljana: Zaloˇ zba FE in FRI, 1998. [5] G. M. Cooper, The Cell - A Molecular Approach 2nd Edition. Sunderland (MA): Sinauer Associates, 2 ed., 2000. [6] S. T. Milner and S. A. Safran, “Dynamical fluctuati- ons of droplet microemulsions and vesicles,” Physi- cal Review A, vol. 36, pp. 4371–4379, Nov 1987. [7] P. Meleard, C. Gerbeaud, T. Pott, L. Fernandez- Puente, I. Bivas, M. Mitov, J. Dufourcq, and P. Bo- thorel, “Bending elasticities of model membranes: influences of temperature and sterol content,” Bi- ophysical journal, vol. 72, no. 6, pp. 2616–2629, 1997. [8] J. P´ ecr´ eaux, H.-G. D¨ obereiner, J. Prost, J.-F. Joanny, and P. Bassereau, “Refined contour analysis of giant unilamellar vesicles,” The European Physical Jour- nal E: Soft Matter and Biological Physics, vol. 13, no. 3, pp. 277–290, 2004. [9] P. Usenik, T. Vrtovec, F. Pernuˇ s, and B. Likar, “Au- tomated tracking and analysis of phospholipid vesi- cle contours in phase contrast microscopy images,” Medical and Biological Engineering and Compu- ting, pp. 1–10, 2011. [10] S. Peniˇ c, A. Igliˇ c, I. Bivas, and M. Foˇ snariˇ c, “Ben- ding elasticity of vesicle membranes studied by Monte Carlo simulations of vesicle thermal shape fluctuations,” Soft Matter, Apr. 2015. [11] W. Helfrich et al., “Elastic properties of lipid bila- yers: theory and possible experiments,” Zeitschrift f¨ ur Naturforschung, vol. 28, no. 11, pp. 693–703, 1973. [12] I. Bivas, “Shape fluctuations of nearly spherical li- pid vesicles and emulsion droplets,” Physical Re- view E, vol. 81, June 2010.