UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Dina RAMIĆ OBVLADOVANJE BIOFILMA BAKTERIJ Campylobacter jejuni Z ZAVIRANJEM MEDCELIČNE KOMUNIKACIJE DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Dina RAMIĆ OBVLADOVANJE BIOFILMA BAKTERIJ Campylobacter jejuni Z ZAVIRANJEM MEDCELIČNE KOMUNIKACIJE DOKTORSKA DISERTACIJA CONTROL OF Campylobacter jejuni BIOFILM BY INHIBITION OF CELL-TO-CELL COMMUNICATION DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2022 Posvećeno mom Taji… "The greatest glory in living lies not in never falling, but in rising every time we fall." - Nelson Mandela - Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. II Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani in po sklepu senata Biotehniške fakultete ter sklepu Komisije za doktorski študij Bioznanosti Univerze v Ljubljani z dne 18. 5. 2021 je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Bioznanosti, znanstveno področje Agroživilska mikrobiologija. Za mentorico je imenovana prof. dr. Sonja Smole Možina. Za somentorja je imenovan doc. dr. Iztok Dogša. Delo je bilo opravljeno v Laboratoriju za živilsko mikrobiologijo, Katedre za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil, Oddelka za živilstvo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani, v Laboratoriju za mikrobno ekologijo in fiziologijo, Oddelka za mikrobiologijo na Biotehniški fakulteti Univerze v Ljubljani, in na Oddelku za farmakognozijo, Fakultete za farmacijo (Univerza v Gradcu, Gradec, Avstrija). Mentorica: prof. dr. Sonja SMOLE MOŽINA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Somentor: doc. dr. Iztok DOGŠA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za mikrobiologijo Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: prof. dr. Ines MANDIĆ MULEC Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za mikrobiologijo Članica: prof. dr. Kristina SEPČIĆ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Članica: prof. dr. Maja ABRAM Sveučilište u Rijeci, Medicinski fakultet Datum zagovora: Dina Ramić Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. III Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 579.22/.26:579.67:547.9(043)=163.6 KG Campylobacter jejuni, sivka, medcelična komunikacija, biofilm AV RAMIĆ, Dina, mag. mikrobiol. SA SMOLE MOŽINA, Sonja (mentorica), DOGŠA, Iztok (somentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Bioznanosti, znanstveno področje agroživilska mikrobiologija LI 2022 IN OBVLADOVANJE BIOFILMA BAKTERIJ Campylobacter jejuni Z ZAVIRANJEM MEDCELIČNE KOMUNIKACIJE TD Doktorska disertacija OP XI, 93 str., 2 pregl., 6 sl., 2 pril., 128 vir. IJ sl JI sl/en AI Novi pristopi obvladovanja bakterij Campylobacter jejuni v živilski industriji so predmet številnih raziskav. Rastlinski izvlečki predstavljajo obetavne alternativne protimikrobne učinkovine za nadzor biofilma. V tej doktorski nalogi smo pripravili in testirali različne pripravke sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia proti filmotvornosti bakterij C. jejuni na abiotskih površinah. S filmotvornostjo smo se spoprijeli preko tarč, kot so gibljivost, pritrjevanje in medcelična komunikacija bakterij C. jejuni. Optimizirali smo metodo gojenja in preučevanja biofilma bakterij C. jejuni na abiotski površini in sicer na interfazi trdna površina/tekočina s konfokalno vrstično lasersko mikroskopijo. Poleg vpeljave visoko tlačne tekočinske kromatografije v kombinaciji s fluorescenčnim detektorjem (HPLC-FLD) smo razvili, optimizirali in nadgradili metodo preučevanja medcelične komunikacije bakterij C. jejuni z biosenzorjem V. harveyi MM30. Nova metoda je v primerjavi s HPLC-FLD natančnejša in občutljivejša. Vsi pripravki sivke so uspešno odstranili zreli biofilm bakterij C. jejuni z abiotske površine. Prav tako so vsi pripravki sivke uspešno zavrli gibljivost, pritrjevanje bakterij C. jejuni na abiotske površine in filmotvornost. Pripravki sivke niso značilno znižali koncentracije signalnih molekul avtoinduktor-2 (AI-2) v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni. Rezultati metode rtPCR niso pokazali vpliva eteričnega olja sivke na izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni. Transkriptomska analiza planktonske kulture bakterij C. jejuni po izpostavljenosti eteričnemu olju sivke je pokazala spremembo izražanja številnih genov, pomembnih za gibljivost, filmotvornost, metabolizem železa in stresni odziv bakterij C. jejuni. Te lastnosti predstavljajo nove, obetavne tarče za obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni v živilski industriji . Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. IV Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORDS DOCUMENTATION ND Dd DC UDC 579.22/.26:579.67:547.9(043)=163.6 CX Campylobacter jejuni, lavandula, cell-to-cell communication, biofilm AU RAMIĆ, Dina AA SMOLE MOŽINA, Sonja (supervisor), DOGŠA, Iztok (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, Scientific Field Agrifood Microbiology PY 2022 TI CONTROL OF Campylobacter jejuni BIOFILM BY INHIBITION OF CELL-TO-CELL COMMUNICATION DT Doctoral dissertation NO XI, 93 p., 2 tab., 6 fig., 2 ann., 128 ref. LA sl AL sl/en AB New approaches are being studied intensively to control Campylobacter jejuni in the food industry. Plant extracts represent promising alternative antimicrobial agents for biofilm control. In this doctoral thesis, we prepared and tested different preparations of Lavandula angustifolia and L. x intermedia against biofilm formation of C. jejuni on abiotic surfaces. Biofilm formation was challenged through targets such as motility, attachment and intercellular communication of C. jejuni. We optimized the method of culturing and studying the biofilm of C. jejuni on an abiotic surface, specifically at the solid/liquid interface, using confocal laser scanning microscopy. We developed, optimized and upgraded a method for studying the intercellular communication of C. jejuni with the V. harveyi MM30 biosensor strain, which proved to be accurate and more sensitive compared to the high pressure liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) method. All lavender preparations successfully removed the mature biofilm of C. jejuni from the abiotic surface. Likewise, all lavender preparations successfully inhibited the motility, attachment of C. jejuni to abiotic surfaces and biofilm formation of C. jejuni. Lavander preparations did not lower significantly the concentration of autoinducer-2 (AI-2) signalling molecules in the spent medium of C. jejuni. The rt-PCR did not show the significant effect of lavender essential oil on the expression of the luxS gene in C. jejuni. Transcriptomic analysis of the planktonic culture of C. jejuni after exposure to lavender essential oil showed that the expression of many genes important for motility, biofilm formation, iron metabolism and stress response of C. jejuni has been changed. These traits represent new, promising targets for C. jejuni biofilm control. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. V Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III KEY WORDS DOCUMENTATION IV KAZALO VSEBINE V KAZALO ZNANSTVENIH DEL VII KAZALO PREGLEDNIC VIII KAZALO SLIK IX KAZALO PRILOG X OKRAJŠAVE IN SIMBOLI XI 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ 1 1.1 UVOD 1 1.1.1 Rod Campylobacter 1 1.1.2 Biofilmi – neizčrpen vir bakterijskih kontaminacij v živilski verigi 3 1.1.2.1 Metode obvladovanja filmotvornosti v živilski verigi 4 1.1.2.2 Metode preučevanja filmotvornosti 5 1.1.3 Medcelična komunikacija pri bakterijah 6 1.1.3.1 Medcelična komunikacija pri bakterijah C. jejuni 8 1.1.3.2 Metode preučevanja bakterijske medcelične komunikacije 9 1.1.4 Rastlinski pripravki kot obetavne bioaktivne učinkovine za obvladovanje bakterijske filmotvornosti 10 1.2 NAMEN DOKTORSKE NALOGE 12 1.3 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 13 2 ZNANSTVENA DELA 14 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 14 2.1.1 Protifilmotvorni učinek pripravkov sivke vrste Lavandula angustifolia proti bakteriji Campylobacter jejuni 14 2.1.2 Pojasnitev komunikacijskega sistema AI-2 bakterij Campylobacter jejuni s kvantitativno biosenzorsko metodo 33 2.1.3 Kontrola filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni z eteričnimi olji in etanolnimi izvlečki iz odpadnega materiala sivke vrste Lavandula x intermedia (lavandin) 42 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. VI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 OSTALO POVEZOVALNO DELO 61 2.2.1 Določanje koncentracije signalnih molekul AI-2 in izražanja gena luxS pri bakterijah Campylobacter jejuni po tretiranju s pripravki sivke 61 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 70 3.1 RAZPRAVA 70 3.2 SKLEPI 76 4 POVZETEK (SUMMARY) 78 4.1 POVZETEK 78 4.2 SUMMARY 80 5 VIRI 84 ZAHVALA PRILOGE Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. VII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO ZNANSTVENIH DEL 1. Ramić D., Bucar F., Kunej U., Dogša I., Klančnik A., Smole Možina S. 2021. Antibiofilm potential of Lavandula preparations against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology, 87: e01099-21, doi: 10.1128/AEM.01099-21: 18 str. 15 2. Ramić D., Klančnik A., Smole Možina S., Dogša I. 2022. Elucidation of the AI-2 communication system in the food-borne pathogen Campylobacter jejuni by whole-cell-based biosensor quantification. Biosensors and Bioelectronics, 212: 114439, doi: 10.1016/j.bios.2022.114439: 8 str. 34 3. Ramić D., Ogrizek J., Bucar F., Jeršek B., Jeršek M., Smole Možina S. 2022. Campylobacter jejuni biofilm control with lavandin essential oils and by-products. Antibiotics, 11: 854, doi: 10.3390/antibiotics11070854: 18 str. 43 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. VIII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov. ....................................... 64 Preglednica 2: Pogoji pomnoževanja na rtPCR. ................................................................ 65 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. IX Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Shematski prikaz ravoja bakterijskega biofilma (Hassan in sod., 2020). 3 Slika 2: Shematski prikaz medceličnega signaliziranja pri bakterijah V. harveyi (Waters in Bassler, 2006) . 8 Slika 3: Bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. havreyi MM30, ki jo spodbudi dodatek IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez (kontrola) ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia [EO (eterično olje), EI (etanolni izvleček)] ali čistih spojin (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). 66 Slika 4: Kromatogrami izrabljenih gojišč: bakterijski sev C. jejuni NCTC 11168, gojen v tekočem gojišču MH (A), bakterijski sev C. jejuni 11168Δ luxS ,gojen v tekočem gojišču MH (B), bakterijski sev C. jejuni NCTC 11168, gojen v tekočem gojišču MH z dodatkom eteričnega olja sivke vrste L. angustifolia v subinhibitorni koncentraciji (C), bakterijski sev C. jejuni 11168Δ luxS, gojen v tekočem gojišču MH z dodatkom eteričnega olja sivke vrste L. angustifolia v subinhibitorni koncentraciji (D). 67 Slika 5: Koncentracija signalnih molekul AI-2 v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 gojenih brez (kontrola) ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia [EO (eterično olje), EI (etanolni izvleček)] ali čistih spojin (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). 68 Slika 6: Normalizirano izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni NCTC 11168 po tretiranju z eteričnim oljem (EO) sivke vrste L. angustifolia, linalolom in linalil acetatom v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). 69 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. X Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PRILOG Priloga A: Dovoljenje založnika revije »Applied and Environmnetal Microbiology« za objavo članka z naslovom »Antibiofilm potential of Lavandula preparations against Campylobacter jejuni« Priloga B: Pokritost steklene površine (po globini) z biofilmom bakterij C. jejuni NCTC 11168 (Ramić in sod., 2021) Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. XI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI AHL acil-homoserin lakton, signalna molekula AI-2 avtoinduktor-2, signalna molekula CFU enote, ki tvorijo kolonije (angl. Colony Forming Units) CLSM vrstična konfokalno laserska mikroskopija (angl. Confocal Laser Scanning Microscopy) DMSO dimetil sulfoksid DNK deoksiribonukleinska kislina eDNK zunajcelična deoksiribonukleinska kislina EI etanolni izvleček EO eterično olje EU Evropska Unija GC-MS plinska kromatografija v kombinaciji z masno spektrometrijo GRAS na splošno priznan kot varen (angl . Generally Recognized As Safe) HPLC-FLD visokotlačna tekočinska kromatografija v kombinaciji s fluorescenčnim detektorjem (angl. High Pressure Liquid Chromatography with FLuorescence Detector) IG izrabljeno gojišče LC-MS tekočinska kromatografija v kombinaciji z masno spektrometrijo (angl. Liquid Chromatography – Mass Spectrometry) luxS gen, ki sproži sintezo proteina LuxS MH Müller-Hinton MIK minimalna inhibitorna koncentracija NCTC Nacionalna zbirka tipskih kultur (angl. The National Collection of Type Cultures) OD optična gostota (angl. Optical Density) RNK ribonukleinska kislina rt-PCR verižna reakcija s polimerazo v realnem času RLE relativne luminiscenčne enote VBNC živo, vendar ne kultivabilno (angl. Viable But Not Culturable) Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 1 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ 1.1 UVOD 1.1.1 Rod Campylobacter Kampilobaktre je prvič opisal leta 1886 nemško-avstrijski pediater Theodor Escherich, ki je v vzorcu blata opazil spiralno zvite, ne-kultivabilne bakterije. Na začetku so jih klasificirali v rod Vibrio oz. Helicobacter in sicer zaradi izredne morfološke podobnosti. Leta 1963 sta Sebald in Véron na podlagi manjšega genoma, ne-fermentativnega metabolizma, ter mikroaerofilnih zahtev gojenja ločila rod Campylobacter od rodu Vibrio. Posebno pozornost so kampilobaktri pritegnili v sedemdesetih letih, ko so bili izolirani iz blata otrok in odraslih, prvič na selektivnem gojišču za gojenje bakterij rodu Campylobacter. To je bil temelj za začetek raziskovanja teh bakterij. V tem obdobju so zaznali kampilobaktre kot pomembne povzročitelje črevesnih okužb pri ljudeh, a niso vedeli, da se ta bakterija prenaša s kontaminirano hrano. Kljub temu je število raziskav te bakterije začelo hitro naraščati (On, 2001; Silva in sod., 2011). Rod Campylobacter se danes uvršča v družino Campylobacteriaceae, red Campylobacterales, razred proteobakterij Epsilonproteobacteria . Rod Campylobacter sestavlja 41 vrst (Parte in sod., 2020). Večinoma gre za gibljive, mikroaerofilne (85 % N2, 5-10 % O2 in 3-5 % CO2), po Gramu negativne, tanke, spiralno zvite celice, velikosti od 0,5 do 5 µm, široke od 0,2 do 0,8 µm (Kreling in sod., 2020). Veljajo za občutljive bakterije, ki za svojo rast potrebujejo gojišča z dodatkom aminokislin (serin, aspartat, asparagin in glutamat), piruvata in laktata, saj jih večina ne uporablja sladkorjev kot vir ogljika. So termofilni mikroorganizmi, ki za svojo optimalno rast potrebujejo temperaturo med 37 °C in 42 °C. Ne rastejo pod 30 °C, ker ne vsebujejo beljakovin, ki jih ščitijo pred hladnim šokom (angl . Cold Shock Proteins). Vsebujejo encim oksidazo, ki jih ščiti pred kisikovimi radikali (Facciolà in sod., 2017). Znano je, da kampilobaktri v neugodnih razmerah zelo hitro preidejo v ne-kultivabilno stanje (angl. Viable But Not Culturable; VBNC), zaradi česar jih je težje izolirati in identificirati (Kassem in sod., 2013). Bakterije rodu Campylobacter veljajo danes za enega od najpogostejših povzročiteljev črevesnih okužb pri ljudeh, ki se prenašajo preko kontaminirane hrane ali vode. Zoonoza, ki jo povzročajo, se imenuje kampilobakterioza, z najpogostejšimi simptomi kot so akutna driska, trebušni krči in visoka vročina. Možni so tudi zapleti, ki vključujejo endokarditis, pljučnico, sepso, ter nevrološke izpade kot je Guillain-Barré sindrom (Igwaran in Okoh, 2019). Njihovi naravni gostitelji so domače rejne živali, predvsem perutnina (piščanci in purani), manj govedo, prašiči, ali ovce. Najdemo jih v prebavilih živali, pri katerih ne povzročajo bolezenskega stanja (Kreling in sod., 2020). Zanimivo je, da piščanci starosti do 7 dni v svojem črevesju ne vsebujejo kampilobaktrov. Še vedno ni znano, kdaj in kako se piščanci okužijo. Predvideva se, da bakterijo lahko prenašajo okužene muhe, ptice ali Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 2 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 glodavci, ter osebje z onesnaženimi, čevlji, orodjem ipd. Ko je piščanec okužen, nadaljnji prenos poteka po fekalno-oralni poti znotraj jate (Agunos in sod., 2014; Cawthraw in Newell, 2010; Gill in sod., 2017; Rukambile in sod., 2019). Kampilobaktri najpogosteje vstopijo v živilsko proizvodno-oskrbovalno (v nad. živilsko) verigo pri zakolu perutnine. Takrat lahko kontaminirajo abiotske površine, ki pridejo v stik z živilskimi izdelki, ter na njih ustvarjajo biofilme ali kolonizirajo že obstoječe biofilme. Odstotek okuženih piščančjih trupov je dokaj visok in se razlikuje v odvisnosti od letnega časa. Slaba higienska praksa, navzkrižna kontaminacija perutninskega mesa in termično neobdelano perutninsko meso so najpogostejše poti, ki pripeljejo do okužbe človeka (Gölz in sod., 2018; Powell in sod., 2012). Izrazito povečano število kampilobakterioz se beleži že od leta 2005. Leta 2020 je bil Campylobacter najpogostejši povzročitelj črevesnih okužb pri ljudeh v Evropski Uniji (EU). Predstavljal je več kot 60 % vseh prijavljenih zoonoz, ki se prenašajo s kontaminirano hrano. Med 2011 in 2020 je število potrjenih primerov kampilobakterioz, prijavljenih v EU, pokazalo jasen sezonski trend, ki je dosegel vrhunec v poletnih mesecih. Večinoma se pri bolnikih izolirajo C. jejuni (88,1 %), sledijo mu C. coli (10,6 %), C. fetus (0,16 %), C. upsaliensis (0,11 %) in C. lari (0,09 %). V večini primerov je šlo za samolimitirajoče okužbe ljudi, redki so potrebovali hospitalizacijo. Kljub temu je hospitalizacija zaradi kampilobakterioz najpogostejša med zoonozami, ki se prenašajo preko kontaminirane hrane. Najpogostejši vir sporadičnih okužb je bilo perutninsko meso, sledita mu mleko in voda, ki sta pomemben vir izbruhov (EFSA/ECDC, 2021). Zaskrbljujoče je tudi hitro naraščajoče število proti antibiotikom odpornih sevov, izoliranih večinoma iz perutnine. Največ izolatov je odpornih proti fluorokinolonom, eritromicinu in tetraciklinom. Trend naraščanja odpornosti je predvsem viden v državah južne in vzhodne Evrope, kar vključuje tudi Slovenijo. Značilni so tudi večkratno odporni sevi proti antibiotikom, kar vključuje kombinirano odpornost proti fluorokinolonom, eritromicinu in tetraciklinom (Rozman in sod., 2018). Mnogo izolatov je odpornih tudi proti razkužilom, ki se največkrat uporabljajo v prehranski industriji, kot so triklosan, trinatrijev fosfat, klorheksidinijev diacetat, benzalkonijev klorid in cetilpiridinijev klorid. Odpornost proti razkužilom je v nekaterih primerih lahko povezana tudi z navzkrižno odpornostjo proti antibiotikom, saj Campylobacter pogostokrat uporablja izlivne črpalke CmeABC za črpanje protimikrobnih snovi iz celice (Mavri in sod., 2016). Potrebno je poiskati nove načine obvladovanja kampilobaktra, kar vključuje uporabo alternativnih učinkovin, kot so rastlinski pripravki, ter nove celične tarče, preko katerih bi uspešno zavrli prisotnost te bakterije v živilski verigi. Kljub celovitemu nadzoru v večini držav članic EU, se predvideva, da je število prijavljenih in potrjenih primerov kampilobakterioz podcenjeno. Čeprav se prisotnost bakterij Campylobacter preverja v celotni živilski verigi, kar vključuje primarno proizvodnjo, zakol, predelavo ter prodajo, je število kampilobaktrioz še vedno izrazito visoko (Teunis in sod., Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 3 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2013; EFSA/ECDC, 2021). Campylobacter »paradoks« je v raziskovalnem svetu zelo dobro znan. Čeprav je izrazito občutljiv in zahteven za gojenje, Campylobacter še vedno povzroča številne težave v celotni živilski verigi, posledično tudi v javnem zdravstvu. Pereče vprašanje številnih raziskav je, kako zmanjšati prisotnost kampilobaktra v celotni živilski verigi ter s tem preprečiti nevarnost, ki jo ta bakterija predstavlja za javno zdravstvo. 1.1.2 Biofilmi – neizčrpen vir bakterijskih kontaminacij v živilski verigi Bakterijske biofilme lahko definiramo kot eno- ali večvrstne strukturirane skupnosti bakterij, pogostokrat obdane s polimernim matriksom, ki ga bakterije same proizvajajo in je sestavljen iz polisaharidov, beljakovin, maščob in zunajcelične DNK (eDNK). Celice so znotraj biofilma pritrjene ena na drugo in/ali na različne površine (Flemming in sod., 2016). Razlikujemo pet faz razvoja biofilma (Slika 1). Prva faza vključuje fazo reverzibilnega pritrjevanja planktonskih celic na površine. Pri tej fazi je izrednega pomena medcelična komunikacija s signalnimi molekulami, ki je bolj podrobno opisana v nadaljevanju te naloge. Druga faza je ireverzibilno pritrjevanje in namnoževanje celic na površinah, kateri sledi faza zorenja biofilma, ki se konča z razvojem zrelega biofilma obdanega z debelim polimernim matriksom. V končni fazi, ki pomeni propad biofilma, pride do razprševanja oz. disperzije posameznih celic iz biofilma (Hassan in sod., 2020). Biofilmi so najbolj razširjena in uspešna oblika življenja na Zemlji, znotraj katere mikroorganizmi kooperativno sodelujejo, izmenjujejo genetsko informacijo, vključno z geni za rezistenco, ter delijo skupne dobrine. Biofilm nudi celicam večjo zaščito pred različnimi okoljskimi stresnimi dejavniki, vključno s protimikrobnimi sredstvi (Flemming in sod., 2016). Slika 1: Shematski prikaz ravoja bakterijskega biofilma (Prirejeno po Hassan in sod., 2020). Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 4 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V živilski verigi lahko mikroorganizmi tvorijo biofilme na kontaktnih površinah s hrano (npr. nerjaveče jeklo, steklo, guma, les, različni plastični materiali) in posledično navzkrižno kontaminirajo živilske izdelke, ki so namenjeni končnemu potrošniku. Poleg tega njihov nadzor predstavlja resen izziv, saj povzročajo velike gospodarske in energetske izgube, poškodujejo površine in opremo ter vodijo do stalne kontaminacije živilskih izdelkov (Galié in sod., 2018). Značilni problem živilske verige so patogeni mikroorganizmi, ki predstavljajo veliko tveganje za javno zdravstvo, saj tudi oni lahko ustvarjajo eno- ali večvrstne biofilme na abiotskih površinah ter posledično navzkrižno kontaminirajo živilske izdelke. S tem pa zmanjšujejo kakovost, varnost in obstojnost živilskih izdelkov. Ocenjuje se, da so biofilmi povezani z več kot 65 % okužb ter da njihovo zdravljenje presega milijardo dolarjev letno (Satpathy in sod., 2016). Filmotvornost je ključna za preživetje bakterij C. jejuni izven njihovega naravnega okolja, t.j. črevesa . Lahko tvorijo biofilme na različnih površinah v živilski verigi, kot so nerjaveče jeklo, plastika, steklo in nitrocelulozne membrane. Biofilme kampilobaktrov najdemo tudi v napajalnih sistemih kokošnjakov (Tram in sod., 2020). Stradanje, aerobni stres, prisotnost eDNK, žolčnih soli in mesnega soka povečuje filmotvornost bakterij C. jejuni, medtem ko jo osmotski stres močno zmanjšuje. Našteti zunanji dejavniki sprožijo pri tej bakteriji prilagoditvene mehanizme, ki omogočajo izražanje genov, potrebnih za sintezo beljakovin, vključenih v tvorbo površinskih struktur pomembnih za gibljivost, pritrjevanje, virulenco, stresni odziv in protimikrobno odpornost (Püning in sod., 2021). Za filmotvornost bakterij C. jejuni se predvideva, da je izrednega pomena tudi medcelično signaliziranje, ki ga omogočajo signalne molekule avtoinduktorji-2 (AI-2), produkti prepisovanja gena luxS (več v poglavju 1.1.3) (Plummer, 2012). Ker so bakterije C. jejuni mikroaerofilni mikroorganizmi, jih v naravi najpogosteje najdemo znotraj večvrstnih biofilmov, kjer se preživetje tega patogena izboljša. Znotraj biofilmov lahko pride do razvoja lokalnega okolja z gradientom kisika in hranil, kar vpliva na heterogenost celične populacije. Specifično mikrookolje znotraj obstoječega biofilma je lahko odlična niša za mikroorganizme, ki potrebujejo posebne razmere, kot je npr. mikroaerofilna atmosfera (Bridier in sod., 2015). Znano je, da bakterije C. jejuni lahko kolonizirajo že obstoječe biofilme ter da v večvrstnih biofilmih z bakterijami Escherichia coli, ginosa, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica in Staphylococcus simulans preživijo dlje časa in proizvedejo več biomase (Feng in sod., 2018; Indikova in sod., 2015; Teh in sod., 2010; Teh in sod., 2019; Zhong in sod., 2020). 1.1.2.1 Metode obvladovanja filmotvornosti v živilski verigi Živilska industrija običajno uporablja stroškovno učinkovite kemijske (raztopine natrijevega hidroksida ali natrijevega hipoklorita) in fizikalne metode (vroča vodna para in ozon) za odstranjevanje biofilmov (Galié in sod., 2018). Uporabljajo se tudi mehanske tehnike za fizično odstranjevanje ali preprečevanje razvoja biofilma znotraj cevi in na površinah. Kljub temu se filmotvornost s stroškovno učinkovitimi metodami na določenih predelih in pri metodah pakiranja ne da popolnoma kontrolirati. Zato se uporabljajo tudi druge metode, ki Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 5 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 vključujejo uporabo detergentov z vsebnostjo encimov, kot so proteaze, glikozidaze in Dnaze. Površine lahko obdelujemo tudi z različnimi premazi, kot so Ag+, Cu2+ ali Zn2+ nanodelci ali s protifilmotvornimi polimeri, ki vsebujejo lizocime ali bakteriocine (Galié in sod., 2018). Nobena od naštetih metod ni popolnoma učinkovita pri preprečevanju razvoja oz. odstranjevanju biofilma. Hkrati je zaskrbljujoče naraščanje odpornosti proti različnim komercialnim antibiotikom in razkuževalnim sredstvom. Zato se danes raziskujejo nove metode preprečevanja razvoja in odstranjevanja biofilma. Vse bolj popularne so t.i. zelene tehnologije, ki so pri potrošnikih bolj priljubljene v primerjavi s sintetičnimi razkužili, ki se pogostokrat uporabljajo v živilski verigi in lahko povečajo količino nepotrebnih kemikalij v okolju (Bridier in sod., 2015). Raziskuje se uporaba bakteriofagov, ki lahko naravno okužijo bakterije in zagotovijo zelo specifično, nestrupeno nadzorovanje biološkega obraščanja različnih mikroorganizmov (Ferriol-González in Domingo-Calap, 2020). Encimi (α- amilaze, β-glukanaze in protezae), ki jih proizvajajo različne probiotične bakterije ( Lactobacillus bulgaricus, Lactococcus lactis, Streptococcus termophilus) so se pokazali kot učinkovita sredstva za odstranjevanje biofilmskega polimernega matriksa (Borges in sod., 2020). Probiotične bakterije, kot je Bacillus subtilis, kažejo tudi na močno delovanje proti razvoju in za odstranjevanje biofilma bakterij C. jejuni z abiotskih površin (Erega in sod., 2021; Šimunović in sod., 2022). Številne raziskave testirajo rastlinske pripravke, ki so priznani kot varni (angl . Generally Recognized As Safe, GRAS) in imajo širok spekter protimikrobnega delovanja, vključno s preprečevanjem medcelične komunikacije, pritrjevanja in filmotvornosti (Khameneh in sod., 2019; Klančnik in sod., 2021). V naših raziskavah smo uporabili različne pripravke sivke z namenom odstranjevanja in preprečevanja razvoja biofilma bakterij C. jejuni. 1.1.2.2 Metode preučevanja filmotvornosti Pri preučevanju biofilmov najpogosteje določamo število živih bakterijskih celic znotraj biofilma, pokritost površine z biomaso, ter opisujemo strukturo in sestavo biofilma. Za določanje skupne količine biomase najpogosteje uporabljamo posredne metode barvanja, kot je barvanje s kristal vijoličnim barvilom. Za določanje števila živih bakterijskih celic lahko uporabljamo direktne metode, kot so gojitvene metode (določanje števila kolonij) in bolj sodobne metode, kot je pretočna citometrija (Alves in sod., 2020; Azeredo in sod., 2016; Franklin in sod., 2015). Lahko uporabljamo tudi različne tipe mikroskopije. Vrstična elektronska mikroskopija nam omogoča vpogled v strukturo in površino biofilma, prostorsko porazdelitev celic ter lokalizacijo izbranih makromolekul v biofilmu, poda nam lahko tudi informacijo o kemijski sestavi. Konfokalna mikroskopija nam omogoča vpogled v prostorsko strukturo biofilma, kot tudi ločevanje živih od mrtvih celic, ob uporabi specifičnih, fluorescenčnih barvil. Ima sicer slabšo ločljivost od elektronske mikroskopije, a večje vidno polje in omogoča opazovanje nativnih vzorcev. Lahko merimo tudi metabolično Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 6 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 aktivnost bakterij znotraj biofilma s kolorimetričnim določanjem pretvorbe tetrazolijevih soli v formazan (Carrascosa in sod., 2021; Püning in sod., 2021; Relucenti in sod., 2021). Izbrana tehnika preučevanja biofilma je odvisna od zastavljenih ciljev oz. od tega, kaj želimo pri biofilmu preučevati. Nekatere metode so bolj primerne za kvantifikacijo biomase, medtem ko nam druge lahko podajo tudi podatek o količini živih oz. mrtvih celic. Glede na to, da so bakterije C. jejuni izredno zahtevne za gojenje, smo v naših raziskavah morali optimizirati metodo gojenja in preučevanja biofilma bakterij C. jejuni. Zato smo uporabili sodobno mikroskopsko tehniko, kot je vrstična konfokalno laserska mikroskopija, ki nam je omogočila vrednotenje živosti celic z metodo barvanja živo/mrtvo (angl. LIVE/DEAD) ter vpogled v prostorsko strukturo biofilma. Za analizo slik se pogostokrat uporablja program Fiji ImageJ (NIH, ZDA), s katerim lahko ugotavljamo delež pokritosti abiotske površine na interfazi trda površina/tekočina in razmerje med živimi in mrtvimi celicami (Hympanova in sod., 2020; Terlep in sod., 2022). 1.1.3 Medcelična komunikacija pri bakterijah Mnogo let se je verjelo, da so bakterije enocelični organizmi, ki se kot posamezniki nepovezano nahajajo v okolju, a v zadnjem desetletju številne raziskave potrjujejo nasprotno. Mikroorganizmi so bitja, ki lahko med seboj komunicirajo, izmenjujejo informacije in ustvarjajo večcelične entitete (Diggle in sod., 2007; Dogša in sod., 2014; Štefanič in sod., 2015; Xavier in sod., 2011). Danes vemo, da so bakterije zmožne sintetizirati, pošiljati, sprejemati in procesirati informacije, ki so podane v obliki različnih signalnih molekul. Naraščanje bakterijske gostote vodi h kopičenju signalnih molekul, ta pa k spremembi obnašanja populacije (Antunes in Ferreira, 2009; Boyer in Wisniewski-Dyé, 2009; Camilli in Bassler, 2006). Ko je ustrezna koncentracija signalnih molekul dosežena, bakterije začnejo koordinirano izločati javne dobrine, kot so zunajcelične beljakovine, polimeri, encimi, eDNK, bakteriocini, ki so dostopne vsem v populaciji. Izločanje javnih dobrin izboljša fitnes oziroma preživetje in razmnoževanje bakterij. Sprememba izražanja genov vpliva tudi na izražanje različnih bakterijskih lastnosti (adaptacij), kot so bioluminiscenca, sporulacija, kompetenca, proizvodnja antibiotikov, filmotvornost in izločanje virulentnih dejavnikov. Bakterijska komunikacija uravnava interferenčno kompeticijo. Naštete lastnosti kažejo na socialno obnašanje bakterij (Michie in sod., 2016; Rutherford in Bassler, 2012; Whiteley in sod., 2017). Najbolj raziskana skupina signalnih molekul so acil-homoserin laktoni (AHL), ki jih proizvajajo po Gramu negativne bakterije in so jih prvič zaznali pri bakteriji Vibrio fischeri (Boyer in Wisniewski-Dyé, 2009; Eberhard in sod., 1981; Hanzelka in Greenberg, 1996). Razlikujejo se po dolžini ogljikove verige, ki lahko vsebuje od 4 do 18 C atomov, kot tudi po položaju acilne skupine. Vse signalne molekule AHL imajo podobno homoserin lakton obročasto strukturo (Steindler in Venturi, 2007). Po Gramu negativne bakterije običajno vsebujejo encim LuxI, ki omogoča sintezo signalne molekule AHL iz S-adenozilmetionina Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 7 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (SAM). Receptorski encim LuxR omogoča detekcijo signalnih molekul AHL. Visoka koncentracija signalnih molekul AHL pripelje do konformacijske spremembe receptorskega encima LuxR, ki gre v kompleks s signalno molekulo AHL in vpliva na spremembo izražanja tarčnih genov (Ampomah-Wireko in sod., 2021). Mnoge po Gramu negativne bakterije uporabljajo analogne sisteme LuxI/LuxR, ki vplivajo na izražanje različnih tarčnih genov (Li in Nair, 2012). Za razliko od po Gramu negativnih bakterij, po Gramu pozitivne bakterije proizvajajo signalne molekule, ki so tipično peptidi. Sinteza signalnih peptidov poteka na ribosomih in so naprej podvrženi različnim spremembam, ki so pomembne za dozorevanje teh signalov (Abisado in sod., 2018). Signalne molekule, ki jih bakterije uporabljajo za med- in znotraj vrstno komunikacijo, se imenujejo avtoinduktorji-2 (AI-2). Lahko jih uporabljajo po Gramu pozitivne in po Gramu negativne bakterije. Encim LuxS, ki je produkt gena luxS, je odgovoren za biosintezo signalne molekule AI-2. Prvič so encim LuxS in signalno molekulo AI-2 zaznali pri bakteriji V. harveyi. Danes je prisotnost encima LuxS potrjena pri več kot 70 bakterijskih vrstah (Galloway in sod., 2011; Xu in sod., 2017). Encim LuxS iz S-ribozil homocisteina (SRH), ki je stranski produkt molekule SAM, sintetizira S-4,5-dihidroksi-2,3-pentandion [(S)- DPD], ki je prekurzor signalne molekule AI-2 (pro-AI-2). Spontana ciklizacija in hidratacija pro-AI-2 vodi k oblikovanju različnih variacij signalne molekule AI-2, od katerih sta najbolj poznani dve obliki: (2S, 4S)-2-metil-2,3,3,4-tetrahidroksi-tetrahidrofuranborat (S-THMF-borat, BAI-2) in (2R, 4S)-2-metil-2,3,3,4-tetrahidroksitetrahidrofuran (R-THMF, AI-2). Možno je, tudi da se signal AI-2, ki ga proizvaja ena bakterijska vrsta, modificira v signal AI-2, ki ga zaznava druga bakterijska vrsta (Chen in sod., 2002; Federle, 2009; Plummer, 2012; Semmelhack in sod., 2005; Thiel in sod., 2009; Zhao in sod., 2018). Ker je encim LuxS del centralnega metabolizma, vpliva tudi na izražanje različnih genov, ki so vključeni v preživetje, patogenost, gibljivost, filmotvornost, kemotakso, sporulacijo. Pri različnih bakterijah, kot so Bacillus cereus, Borrelia burgdoferi, Streptococcus pneumoniae, S. aureus, H. pylori, E. coli in S. enterica so dokazali, da medcelična komunikacija s signalno molekulo AI-2 močno vpliva na filmotvornost, proizvodnjo zunajceličnih polimerov, gibljivost in odpornost proti antibiotikom (Pereira in sod., 2013). Pri mutantah luxS se spremeni izražanje v povprečju od 1 do 10 % genov celotnega genoma. Prav tako pride do spremembe izražanja prekurzorjev (SAM, SAH, SRH), ki so potrebni za sintezo signalne molekule AI-2. Zmanjša se tudi patogenost, virulenca, gibljivost, pritrjevanje, filmotvornost, ter kemotaksa pri mnogih po Gramu negativnih bakterijah (Papenfort in Bassler, 2016). Bakterijske vrste V. harveyi uporabljajo beljakovinski kompleks LuxP/LuxO za zaznavanje signalnih molekul AI-2. Vezava signalne molekule AI-2 na receptor LuxP pripelje do njegove konformacijske spremembe, kar omogoči nastanek asimetričnega dimera, ki je sestavljen iz dveh monomerov LuxPQp (LuxPQp-LuxP'Qp') in vpliva na inaktivacijo kinazne aktivnosti beljakovine LuxO. Ko je kinaza LuxO aktivna, dodaja fosfate na beljakovino LuxU, ko je neaktivna, pa jih odceplja (Bassler in sod., 1997; Bassler in Freeman, 1999; Lilley in Bassler, 2000; Waters in Bassler, 2006). Zanimivo je, da bakterije E. coli in S. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 8 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 typhimurium uporabljajo receptorsko beljakovino LsrB za zaznavanje signalnih molekul AI-2 (R-THMF), ki se po strukturi razlikuje od signalne molekule AI-2 (S-THMF), ki jo zaznava bakterija V. harveyi preko receptorske beljakovine LuxP (Surette in sod., 1999). Pokazali so tudi, da je podobnost sekvenc beljakovin LuxP in LsrB izredno majhna (11% podobnost). Prav tako signalna molekula AI-2 uravnava prepis operona lsrACDBFGE, ki ga vsebujeta bakteriji E. coli in S. typhimurium. Ko enkrat beljakovina LsrB zazna signalno molekulo AI-2, jo transportni sistem Lsr ABC takoj vnese v celico, kjer pride do njene fosforilacije. Fosforilirana signalna molekula AI-2 se veže na beljakovino LsrR, ki naprej uravnava izražanje operona lsr (Federle, 2009). Slika 2: Shematski prikaz medceličnega signaliziranja pri bakterijah V. harveyi. Bakterije V. harveyi uporabljajo 3 različne signalne molekule za komunikacijo. Signalni molekuli HAI-1 in CAI-1 sta vrstno specifični, medtem ko je signalna molekula AI-2 medvrstna komunikacijska signalna molekula (Prirejeno po Waters in Bassler, 2006). 1.1.3.1 Medcelična komunikacija pri bakterijah C. jejuni Čeprav obstajajo številne raziskave na področju medcelične komunikacije različnih bakterij, so informacije glede medcelične komunikacije bakterij rodu Campylobacter še vedno izredno omejene. Znano je, da sta Elvers in Park leta 2002 potrdila prisotnost homolognega gena luxS pri bakteriji C. jejuni, kot tudi aktivno proizvodnjo signalne molekule AI-2 (Elvers in Park, 2002). Za aktivno izločanje signalnih molekul AI-2 iz celice, bakterije običajno uporabljajo transportne sisteme. Pri bakteriji C. jejuni je pokazano, da je transport signalne molekule AI-2 deloma odvisen od ne-kodirajoče RNK (CjNC110). V primeru delecije sekvence CjNC110 je bil opažen zmanjšan odziv poročevalskega seva na zunajcelične Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 9 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 signalne molekule AI-2, a povišen odziv poročevalskega seva na znotrajcelične signalne molekule AI-2, kar nakazuje, da je sekvenca CjNC110 potrebna za transport signalne molekule AI-2 čez celično membrano (Kreuder in sod., 2020). Zaenkrat ni znana receptorska beljakovina za signalno molekulo AI-2 pri bakterijah rodu Campylobacter. Predvideva se, da bakterije C. jejuni uporabljajo dvokomponentni sistem za zaznavanje signalnih molekul AI-2 (Adler in sod., 2015). Točna koncentracija signalnih molekul AI-2, ki jih tekom rasti proizvajajo bakterije C. jejuni ni bila znana in smo jo v tem doktorskem delu uspešno določili z uporabo analitske in biološke metode. Ker celotnega mehanizma medcelične komunikacije pri bakteriji C. jejuni ne poznamo, vpliv signalne molekule AI-2 na fenotip teh bakterij načeloma preučujemo preko delecije gena luxS, preko vpliva različnih protimikrobnih snovi na izražanje gena luxS ali preko vpliva na sam signal AI-2. Zaenkrat morfoloških sprememb pri mutantah luxS niso zaznali (Jeon in sod., 2003; Mou in Plummer, 2016). Hitrost rasti mutante luxS načeloma ni različna v primerjavi z divjim tipom (Holmes in sod., 2009; Elvers in Park, 2002). Prisotne pa so fenotipske razlike pri mutantah luxS, kar vključuje zmanjšano gibljivost, pritrjevanje, filmotvornost, invazijo in kolonizacijo celičnih kultur, ter oksidativni stres (Kim in sod., 2021; Elvers in Park, 2002; Plummer in sod., 2012; Quiñones in sod., 2009; Reeser in sod., 2007; Šimunović in sod., 2020), medtem ko je kemotaksa proti aminokislinam povečana (Tram et al., 2020). Potrebno je poudariti, da so vse spremembe specifične za posamezne seve ter so možne variacije zaradi samega seva, pogojev gojenja, uporabljene metode preučevanja ali vrste mutageneze (Püning in sod., 2021). 1.1.3.2 Metode preučevanja bakterijske medcelične komunikacije Za preučevanje medcelične komunikacije bakterij običajno uporabljamo klasične analitske metode ter biološke metode. Klasične analitske metode najpogosteje temeljijo na uporabi kolorimetričnih ter kromatografskih metod, kot so tankoplastna kromatografija, tekočinska in plinska kromatografija brez ali v kombinaciji z masno spektrometrijo, visokotlačna tekočinska kromatografija brez ali v kombinaciji s fluorescenčnim detektorjem. Pri klasičnih analitskih metodah sta pomembna dva ključna koraka in sicer ekstrakcija in detekcija signalnih molekul. Sama priprava vzorca za analitske analize je zahtevna, draga in dolgotrajna, zagotavljajo pa zelo natančne, ponovljive in zanesljive rezultate (Turan in sod., 2017). Biološke metode temeljijo na uporabi bakterijskih biosenzorskih sevov, ki zelo hitro in z visoko občutljivostjo ugotavljajo prisotnost signalnih molekul. Sama priprava vzorca za biosenzorske metode je hitrejša, cenejša in enostavnejša v primerjavi z analitskimi metodami. Ko biosenzorskem sevu dodamo zunajcelično signalno molekulo, jo biosenzor zazna in spremeni izražanje genov, ki vodijo k spremembi fenotipa, kot je npr. proizvodnja pigmenta violaceina, izražanje luminiscence, fluorescence ali β-galaktozidaze (Delle Side in sod., 2015; Turan in sod., 2017). Bakterija Vibrio harveyi predstavlja enega od najpogostejše Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 10 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 uporabljenih bakterijskih biosenzorskih sevov, ki naravno vsebuje sistem medceličnega signaliziranja. Lahko zazna kar tri različne signalne molekule (HAI-1, CAI-1 in AI-2). Ko bakterije V. harveyi zaznajo signalne molekule, pride do izražanja luciferaze, encima, ki je odgovoren za emitiranje luminiscence. Za merjenje luminiscence uporabljamo luminometer (Nackerdien in sod., 2008; Zhao in sod., 2018). Pri preučevanju medcelične komunikacije moramo poznati sistem medceličnega signaliziranja preučevane bakterije oz. signalno molekulo, ki jo tarčna bakterija proizvaja. Potrebno je izbrati ustrezno metodo, s katero bomo zanesljivo zaznali in natančno določili koncentracijo signalne molekule. Ker bakterija C. jejuni aktivno proizvaja signalno molekulo AI-2, je najprej potrebno izbrati metodo, ki bo omogočila zaznavanje in merjenje koncentracije teh signalih molekul z visoko občutljivostjo in natančnostjo. V tej doktorski nalogi smo želeli razviti, optimizirati in nadgraditi biosenzorsko metodo detekcije in kvantifikacije signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni. Vpeljali smo tudi direktno, kemijsko-analitsko metodo in sicer visoko tlačno tekočinsko kromatografijo (HPLC) v kombinaciji s fluorescenčnim detektorjem (FLD), s katero smo ovrednotili točnost kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo. 1.1.4 Rastlinski pripravki kot obetavne bioaktivne učinkovine za obvladovanje bakterijske filmotvornosti Rastlinski pripravki imajo pomembno vlogo v tradicionalni medicini že od antičnih časov. Danes postajajo vse bolj priljubljeni zaradi prepoznavnosti kot varni izdelki za človeka in okolje. Stopnjuje se negativni odnos potrošnikov do uporabe kemično sintetiziranih spojin v živilski verigi. Zato znanstveniki v rastlinskih pripravkih danes vidijo obetaven vir številnih bioaktivnih učinkovin za boj proti različnim škodljivim mikroorganizmom (Afonso in sod., 2022; Mishra in sod., 2020; Negi, 2012). Moderne tehnologije omogočajo varno in učinkovito ekstrakcijo fitofarmacevtskih učinkovin iz rastlin. Uporabljajo se ekstrakti cvetov, listov, celih zeli, korenin in odpadnega rastlinskega materiala po npr. destilaciji eteričnega olja, kot tudi čiste spojine, ki se izolirajo iz rastlinskih pripravkov (Das in sod., 2010; Khan in sod., 2013). Večina raziskav temelji na določanju protimikrobnega učinka rastlinskih pripravkov v planktonskih kulturah. Nujno je raziskave usmeriti na raziskovanje učinka proti biofilmom, ki so najbolj razširjena in uspešna bakterijska oblika življenja na Zemlji (Flemming in Wuertz, 2019). Razvoj biofilma vključuje pet glavnih faz, ki so bile opisane v poglavju 1.1.2. Rastlinske pripravke lahko uporabimo za obvladovanje vseh pet faz razvoja biofilma, med katerimi sta najbolj kritična faza pritrjevanja bakterijskih celic na abiotske oz. biotske površine, in faza zorenja biofilma, kjer se razvija njegova struktura. Obetavna tarča, s katero bi lahko zavrli filmotvornost, je sistem medcelične komunikacije, ki v splošnem spodbuja in koordinira razvoj biofilma (Klančnik in sod., 2021; Machado in sod., 2020). Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 11 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Protimikrobnost rastlinskim pripravkom dajejo sekundarni metaboliti, ki jih lahko razdelimo na fenole, terpene, spojine, ki vsebujejo dušik (alkaloidi, cianogeni glukozidi, kanavanin) ter spojine, ki vsebujejo žveplo (glutation, glukozinolati, fitoaleksini, tionini, defenzini, aliin) (Jamwal in sod., 2018). V tej doktorski nalogi smo se osredotočili na etanolne izvlečke in eterična olja, ki so večinoma sestavljena iz fenolov. Fenoli so velika skupina spojin, ki vključujejo fenolne kisline, kinone, flavonoide, flavone, flavonone, tanine in kumarine (Alara in sod., 2021). Njihov glavni protibakterijski učinek temelji na omejevanju dostopnosti hranil, poškodovanju membrane in DNK, ter vezavi na adhezine, celično steno in beljakovine. Delujejo tudi kot inhibitorji efluksnih črpalk, zmanjšujejo proizvodnjo zunajceličnega polisaharidnega matriksa, ter zmanjšujejo izražanje genov, ki so pomembni za sintezo bičkov, pilov in fimbrijev (Mishra in sod., 2020; Vaou in sod., 2021). Za eterična olja je pokazano, da modificirajo celično steno in membrano, kar povzroča izgubo znotraj celičnih molekul kot so nukelinske kisline in beljakovine. To posledično lahko vpliva na funkcionalnost respiratorne verige in sinteze adenozintrifosfata (ATP) (Angane in sod., 2022). Eterična olja motijo in zavirajo sistem medcelične komunikacije z inhibicijo sinteze signalnih molekul in vezave na receptorje signalnih molekul, z razgradnjo signalnih molekul in s preprečevanjem izločanja signalnih molekul (El-Tarabily in sod., 2021). Posebno bogate s fenolnimi spojinami in eteričnimi olji so rastline družine Lamiaceae. V družino Lamiaceae spadajo mnogi rodovi rastlin, znani po številnih bioaktivnih snoveh, kot so npr. Lavandula, Thymus, Origanum, Rosmarinus, Mentha, Ocimum, Salvia in Clinopodium (Saleem in sod., 2009). Vse so znane tudi po protibakterijskem učinku proti različnim po Gramu pozitivnim ( Streptococcus pyogenes, S. aureus, Listeria monocytogenes) in po Gramu negativnim bakterijam ( E. coli, Salmonella typhimurium, Legionella pneumophila) (Chassagne in sod., 2021). Močan protifilmotvorni učinek proti bakterijam S. aureus, Streptoccocus epidermidis, P. aeruginosa, Pseudomonas florescens, B. cereus in B. subtilis so pokazali rastlinski pripravki vste Rosmarinus officinalis L. Prav tako so rastlinski pripravki vrste Thymus vulgaris L. pokazali močan učinek na gibljivost, medcelično komunikacijo, filmotvornost in izražanje genov, pomembnih za sintezo bičkov pri bakterijah P. flourescens in Chromobacterium violaceum. Protifilmotvoren učinek proti številnim bakterijam so pokazale tudi čiste spojine karvakrol, eugenol, timol, linalol, cinamilaldehid, ki so glavne komponente eteričnih olj omenjenih rastlin (Ćirić in sod., 2019). Protibakterijski kot tudi protifilmotvorni učinek proti bakteriji C. jejuni so pokazali rastlinski pripravki različnih vrst ( Achillea millefolium, Coriandrum sativum, Euodia ruticarpa, Juniperus communis, Lavandula hybrida, Olea europaea, Origanum vulgare, R. officinalis, T. vulgaris), kot tudi čiste spojine, ki jih najdemo v teh pripravkih (karvakrol, tran-cinamaldehid, eugenol, linalol, resveratrol, γ-terpinen) (Bezek in sod., 2016; Duarte in sod., 2016; Šimunović in sod., 2020; Wagle in sod., 2019). Med njimi so tudi pripravki, ki so vplivali na sistem medcelične komunikacije bakterij C. jejuni. Nobena raziskava ni podala odgovora, ali rastlinski pripravki delujejo na znižanje koncentracije signalnih molekul, na Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 12 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izražanje gena luxS ali na receptor za zaznavanje signalnih molekul. Študija, ki so jo izvedli Šimunović in sod. (2020), nam je služila kot izhodišče, ki nas je usmerila v nadaljne raziskave na področju preučevanja vpliva rastlinskih pripravkov na filmotvornost in medcelično komunikacijo bakterij C. jejuni. Med številnimi rastlinskimi pripravki, ki so jih Šimunović in sod. (2020) testirali, se je sivka izkazala kot obetavno protibakterijsko sredstvo z učinkom proti medcelični komunikaciji bakterij C. jejuni. Zato smo v tej doktorski nalogi uporabili pripravke sivke vrst Lavandula angustifolia in Lavandula x intermedi a in jih testirali proti biofilmu bakterij C. jejuni. 1.2 NAMEN DOKTORSKE NALOGE Namen doktorske naloge je bil določiti učinek rastlinskih pripravkov sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia v subinhibitornih koncentracijah na medcelično komunikacijo, pritrjevanje, filmotvornost in odstranjevanje biofilma bakterij C. jejuni z abiotskih površin, kot tudi njihovo medsebojno povezanost. S tem namenom smo iz cvetov sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia pripravili eterična olja in etanolne izvlečke ter jim določili kemijski profil z uporabo tekočinske (LC) in plinske kromatografije (GC) v kombinaciji z masno spektrometrijo (MS). Posebno pozornost smo posvetili odpadnemu materialu, ki preostane po destilaciji eteričnega olja sivke in še vedno vsebuje bioaktivne spojine. Zato smo tudi odpadni material uporabili za pripravo etanolnih izvlečkov. Recikliranje odpadnega materiala združuje ekonomičnost in okoljevarstvo, dva vidika, ki sta izrednega pomena za prihodnost. Glede na ugotovljen kemijski profil pripravljenega materiala smo izbrali glavne čiste spojine, ki smo jih uporabili v bioloških poskusih. Ker je končni cilj zavreti filmotvornost bakterij C. jejuni, je potrebno raziskati mehanizme, ki so v filmotvornost bakterij vpleteni. To so mehanizmi medcelične komunikacije, gibljivosti in začetnega pritrjevanja, brez katerih je razvoj biofilma okrnjen. Namen dela je torej spremljati filmotvornost bakterij C. jejuni ob dodatku rastlinskih pripravkov sivke do 72 h. Za obvladovanje filmotvornih lastnosti smo uporabili subinhibitorne koncentracije rastlinskih pripravkov, saj ne želimo vplivati na rast bakterij, ampak samo na njihove filmotvorne lastnosti. Za odstranjevanje zrelih biofilmov smo uporabili različne koncentracije rastlinskih pripravkov sivke, saj je znano, da so biofilmske celice kar 1000-krat bolj odporne proti protimikrobnem sredstvom v primerjavi s planktonskimi celicami. Campylobacter jejuni je zahtevna bakterija za laboratorijsko gojenje. Prav tako je zelo zahtevno gojenje biofilma teh bakterij. Zato smo najprej optimizirali metodo gojenja in preučevanja biofilma bakterij C. jejuni na interfazi tekočina/trda površina z vrstično konfokalno lasersko mikroskopijo. Želeli smo zagotoviti tudi ustrezno preučevanje sistema medcelične komunikacije bakterij C. jejuni. Iz tega razloga smo razvili, optimizirali in nadgradili metodo detekcije in kvantifikacije signalnih molekul AI-2, ki jih proizvaja Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 13 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bakterija C. jejuni s posredno, biosenzorsko metodo in z direktno, kemijsko-analitsko metodo, HPLC-FLD. 1.3 RAZISKOVALNE HIPOTEZE Raziskovalne hipoteze, ki smo jih postavili pred začetkom eksperimentalnega dela, so bile naslednje: • Rastlinski pripravki sivke in njihove izbrane čiste spojine v subinhibitornih koncentracijah zmanjšujejo koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni. • Zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni je posledica učinka rastlinskih pripravkov sivke na izražanje gena luxS. • Zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2 korelira z zaviranjem pritrjevanja C. jejuni na abiotske površine z rastlinskimi pripravki sivke. • Zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2 korelira z učinkovitostjo odstranjevanja zrelega biofilma C. jejuni z abiotskih površin z rastlinskimi pripravki sivke. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 14 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 ZNANSTVENA DELA 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1.1 Protifilmotvorni učinek pripravkov sivke vrste Lavandula angustifolia proti bakteriji Campylobacter jejuni Ramić D., Bucar F., Kunej U., Dogša I., Klančnik A., Smole Možina S. 2021. Antibiofilm potential of Lavandula preparations against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology, 87: e01099-21, doi: 10.1128/AEM.01099-21: 18 str. Raziskovalci intenzivno proučujejo nove pristope obvladovanja filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni v živilski industriji. Naravni pripravki, posebej rastlinski izvlečki, predstavljajo obetavne alternativne protimikrobne učinkovine za nadzor biofilma. Posušene cvetove sivke vrste Lavandula angustifolia smo uporabili za proizvodnjo eteričnega olja (LEO) in etanolnega izvlečka (LEF), kot tudi za proizvodnjo etanolnega izvlečka iz odpadnega materiala, pridobljenega po destilaciji eteričnega olja (LEW). Za nadaljnje testiranje smo uporabili tudi sedem glavnih čistih spojin, ki smo jih s kemijsko karakterizacijo določili v teh pripravkih. Pripravke sivke smo uporabili za odstranjevanje biofilma bakterij C. jejuni z abiotske površine. Za preučevanje molekularnih mehanizmov, na katerih temelji delovanje pripravka LEO proti pritrjevanju in gibljivosti bakterij C. jejuni, smo uporabili sekvenciranje naslednje generacije. Kemijska analiza pripravka LEO je pokazala, da so 1,8-cineol, linalol in linalil acetat njegove glavne spojine. Glavne sestavine pripravkov LEF in LEW so bili glikozidi fenolnih kislin, flavonoidi so bili redko prisotni. Minimalne inhibitorne koncentracije pripravkov sivke in čistih spojin proti bakteriji C. jejuni so znašale med 0,2 mg/mL in 1 mg/mL. Pripravek LEO je imel najmočnejši učinek na odstranjevanje biofilma bakterij C. jejuni. Učinek pripravkov sivke na zmanjšanje pritrjevanja bakterij C. jejuni je bil okoli 1 log10 CFU/ml, kar je v skladu s priporočili Evropske agencije za varnost hrane. Pripravki sivke so zmanjšali gibljivost bakterij C. jejuni za skoraj 50 %, kar posledično lahko vpliva na filmotvornost. Pridobljeni podatki so bili v skladu z analizo transkriptoma bakterij C. jejuni, ki je pokazala, da je pripravek LEO znižal izražanje genov, pomembnih za filmotvornost. Tudi pripravek LEW je pokazal dober protibakterijski učinek in učinek proti biofilmu, zlasti proti mehanizmom pritrjevanja in gibljivosti. Ta raziskava predstavlja inovativen pristop za boj proti biofilmom bakterij C. jejuni z uporabo alternativnih strategij in s tem potencial za razvoj novih učinkovitih sredstev, ki omogočajo preprečevanje in odstranjevanje biofilma. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 15 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 16 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 17 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 18 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 19 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 20 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 21 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 22 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 23 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 24 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 25 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 26 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 27 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 28 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 29 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 30 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 31 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 32 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 33 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.2 Pojasnitev komunikacijskega sistema AI-2 bakterij Campylobacter jejuni s kvantitativno biosenzorsko metodo Ramić D., Klančnik A., Smole Možina S., Dogša I. 2022. Elucidation of the AI-2 communication system in the food-borne pathogen Campylobacter jejuni by whole-cell-based biosensor quantification. Biosensors and Bioelectronics, 212: 114439, doi: 10.1016/j.bios.2022.114439: 8 str. S hrano prenosljiva, patogena bakterija Campylobacter jejuni proizvaja medvrstno signalno molekulo avtoinduktor-2 (AI-2). Signalna molekula AI-2 lahko sproži povečano kolonizacijo in filmotvornost, kar predstavlja resno tveganje za javno zdravstvo. Do danes je komunikacijski sistem bakterij C. jejuni le delno raziskan, saj je detekcijo in kvantifikacijo avtoinduktorskih signalnih molekul AI-2 v kompleksnih gojiščih zelo težko izvesti. V tej raziskavi smo razvili biosenzorsko metodo, ki vključuje biosenzorski sev Vibrio harveyi za natančno kvantifikacijo in spremljanje proizvodnje signalih molekul AI-2 bakterije C. jejuni 81-176 v definiranem rastnem gojišču in v modelnem živilskem matriksu (5 % piščančji sok). Testiranih je bilo več biosenzorskih sevov V. harveyi, vendar je najobčutljivejši odziv na signalne molekule AI-2 imel biosenzorski sev V. harveyi MM30, zaradi sposobnosti samoojačanja odziva. Koncentracije signalnih molekul AI-2, izmerjene z razvito biosenzorsko metodo, smo potrdili z neodvisno analitsko metodo HPLC-FLD, ki smo jo prvič vpeljali za analizo signalnih molekul bakterij Campylobacter. Koncentracija AI-2, ki jo proizvaja C. jejuni 81-176 v modelnem živilskem matriksu, je bila približno 5-krat višja kot v definiranem rastnem gojišču, pri enaki gostoti celic. Tudi naraščanje koncentracije signalnih molekul AI-2 pri bakteriji C. jejuni je linearno z gostoto celic, kar nakazuje na to, da signalne molekule AI-2 predstavljajo metabolne stranske produkte pri bakterijah C. jejuni in ne prave molekule za zaznavanje kvoruma. Razvita biosenzorska metoda je zelo občutljiva, kar dokazuje zmanjšana meje detekcije (za faktor 100) v primerjavi z metodo HPLC-FLD in omogoča kvantifikacijo signalnih molekul AI-2 v kompleksnih gojiščih, kot je hrana. Nova spoznanja bodo pripomogla izboljšati kakovost in varnost proizvodnje hrane. To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Deljenje pod enakimi pogoji 4.0 International licenco Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 34 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 35 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 36 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 37 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 38 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 39 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 40 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 41 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 42 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.3 Kontrola filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni z eteričnimi olji in etanolnimi izvlečki iz odpadnega materiala sivke vrste Lavandula x intermedia (lavandin) Ramić D., Ogrizek J., Bucar F., Jeršek B., Jeršek M., Smole Možina S. 2022. Campylobacter jejuni biofilm control with lavandin essential oils and by-products. Antibiotics, 11: 854, doi: 10.3390/antibiotics11070854: 18 str. Živilska industrija se nenehno spopada z izrazito razširjeno, s hrano prenosljivo, filmotvorno bakterijo Campylobacter jejuni. Za nadzor biofilmov v celotni živilski industriji se uporabljajo različni pristopi, vendar nobeden ni popolnoma učinkovit. V tej študiji smo pripravili in določili kemijski profil eteričnih olj (EO), etanolnih izvlečkov cvetov pred destilacijo (EF) in etanolnih izvlečkov odpadnega materiala pridobljenega po destilaciji eteričnega olja (EWM) iz sivke vrste Lavandula × intermedia, podvrste 'Bila', 'Budrovka' St Nicholas in 'Budrovka', ki so bili nadalje uporabljeni za zmanjšanje medcelične signalizacije, pritrjevanja in filmotvornosti bakterij C. jejuni ter za testiranje njihovega antioksidativnega učinka. Glikozidi hidroksicimetne kisline so bili glavne spojine obeh vrst etanolnih izvlečkov lavandina, medtem ko so bili linalol, linalil acetat, 1,8-cineol in kamfor glavne spojine EO lavandina. Testirana EO so pokazala najmočnejše protibakterijsko delovanje z minimalno inhibitorno koncentracijo 0,25 mg/mL. Pripravki EF so se izkazali kot bolj učinkoviti pri zmanjševanju medcelične signalizacije in pritrjevanja bakterij C. jejuni v primerjavi s pripravki EO in EWM, medtem ko so EO pokazala nekoliko boljši učinek proti filmotvornosti. Zanimivo je, da smo največjo antioksidativno aktivnost ugotovili pri pripravkih EWM. Potrdili smo pozitivno in zmerno korelacijo med zmanjšanjem medcelične signalizacije in pritrjevanjem bakterij C. jejuni, ter med pritrjevanjem in filmotvornostjo. Rezultati nakazujejo, da so nove bakterijske tarče zanimive za nadzor filmotvornosti z alternativnimi naravnimi sredstvi v celotni živilski industriji. To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Deljenje pod enakimi pogoji 4.0 International licenco Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 43 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 44 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 45 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 46 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 47 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 48 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 49 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 50 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 51 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 52 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 53 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 54 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 55 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 56 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 57 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 58 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 59 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 60 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 61 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 OSTALO POVEZOVALNO DELO 2.2.1 Določanje koncentracije signalnih molekul AI-2 in izražanja gena luxS pri bakterijah Campylobacter jejuni po tretiranju s pripravki sivke Bakterije C. jejuni so zmožne medcelične komunikacije preko signalnih molekul AI-2, ki jih pri tej bakteriji sintetizira gen luxS (Plummer, 2012). Signalne molekule AI-2 so pomembne za medvrstno komunikacijo med bakterijami (Federle, 2009). Mnoge raziskave so pokazale, da delecija gena luxS pri bakteriji C. jejuni vpliva na različne fenotipske lastnosti, med katerimi so gibljivost, pritrjevanje na abiotske in biotske povšine, filmotvornost, kemotaksa, virulenca in patogenost (Kim in sod., 2021; Elvers in Park, 2002; Plummer in sod., 2012; Quiñones in sod., 2009; Reeser in sod., 2007; Šimunović in sod., 2020). Zaradi teh lastnosti bakterije C. jejuni predstavljajo resno težavo v živilski industriji in javnem zdravstvu. Pomembno je poiskati načine modulacije gena luxS, saj predvidevamo, da bi z moduliranjem gena luxS lahko zmanjšali filmotvornost bakterij C. jejuni in s tem posledično nevarnost, ki jo ta bakterija predstavlja za živilsko industrijo in javno zdravstvo. Rastlinski pripravki veljajo za obetavne alternativne, protimikrobne učinkovine, ki se lahko uporabljajo za moduliranje medcelične komunikacije pri različnih bakterijah. Številne raziskave so pokazale, da rastlinski pripravki zmanjšujejo medcelično signaliziranje bakterij P. aeuruginosa, E. coli, S. typhimurium, L. monocytogenes, S. aureus (Guglielmi in sod., 2020). Pripravki različnih rastlinskih vrst, kot so A. millefolium, C. sativum, E. ruticarpa, J. communis, L. hybrida, O. europaea, O. vulgare, R. officinalis in T. vulgaris vplivajo na sistem medcelične komunikacije bakterij C. jejuni (Bezek in sod., 2016; Duarte in sod., 2016; Šimunović in sod., 2020; Wagle in sod., 2019). Obstaja tudi korelacija med zmanjšanjem odziva poročevalskega seva V. harveyi na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni gojenih z rastlinskimi pripravki in zmanjšanjem gibljivosti in pritrjevanjem bakterij C. jejuni na abiotske površine po tretiranju z rastlinskimi pripravki (Šimunović in sod., 2020). Pri tem ni jasno ali delujejo pripravki na znižanje koncentracije signalnih molekul AI-2, na izražanje gena luxS ali na receptor za zaznavanje signalnih molekul AI-2. Zanimalo nas je, ali rastlinski pripravki sivke vplivajo na zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni, kot tudi ali vplivajo na izražanje gena luxS pri bakteriji C. jejuni. Določili smo koncentracijo signalnih molekul v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni brez in s tretiranjem s pripravki sivke (eterično olje, etanolni izvlečki iz cvetov in odpadka: čisti spojini linalol in linalil acetat), kot tudi učinek eteričnega olja sivke, linalola in linalil acetata na izražanje gena luxS To nam je pomagalo razumeti mehanizem delovanja sivke na medcelično komunikacijo bakterij C. jejuni. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 62 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Material in metode Pripravki sivke V poskusih smo uporabili pripravke sivke vrste L. angustifolia in sicer eterično olje (EO) sivke, etanolni izvleček (EI) iz cvetov sivke, etanolni izvleček (EI) iz odpadnega materiala (odpadek), ki preostane po destilaciji eteričnega olja, kot tudi čisti spojini, linalol in linalil acetat, ki sta glavni sestavini eteričnega olja sivke. Postopek priprave eteričnega olja in etanolnih izvlečkov, kot tudi kemijska karakterizacija pripravkov sivke sta opisana v članku »Protifilmotvorni učinek pripravkov sivke vrste Lavandula angustifolia proti bakteriji Campylobacter jejuni«, ki je del te doktorske disertacije. Bakterijski sevi V poskusih smo uporabljali bakterijske seve C. jejuni NCTC 11168 (referenčni sev), C. jejuni 11168Δ luxS (mutanta, ki ne proizvaja signalne molekule AI-2; negativna kontrola) in poročevalski sev V. harveyi MM30. Pogoji gojenja naštetih bakterijskih sevov so opisani v člankih »Razjasnitev komunikacijskega sistema patogenih, s hrano prenosljivih bakterij Campylobacter jejuni preko kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo« in »Kontrola filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni z eteričnimi olji in etanolnimi izvlečki iz odpadnega materiala sivke vrste Lavandula x intermedia (lavandin)«, ki sta del te doktorske disertacije. Merjenje odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, gojenega s pripravki sivke in čistimi spojinami v subinhibitornih koncentracijah Merjenje bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi se običajno uporablja kot posredna metoda za preučevanje medcelične komunikacije drugih bakterij (Zhao in sod., 2018). Zato smo vpliv pripravkov sivke na medcelično komunikacijo bakterij C. jejuni najprej ovrednotili preko merjenja bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 na čitalcu mikrotitrskih plošč (Varioskan Lux, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Poročevalskemu sevu V. harveyi MM30 smo dodali izrabljeno gojišče (IG) bakterij C. jejuni NCTC 11168 in bakterij C. jejuni 11168Δ luxS, ki so bili gojeni z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia (EO in EI) in čistimi spojinami (linalol in linalil acetat). Postopka gojenja in priprave IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 in bakterij C. jejuni 11168Δ luxS, kot tudi postopek merjenja odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 in C. jejuni 11168Δ luxS sta opisana v člankih »Razjasnitev komunikacijskega sistema patogenih, s hrano prenosljivih bakterij Campylobacter jejuni preko kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo« in »Kontrola filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni z eteričnimi olji in etanolnimi izvlečki iz odpadnega materiala sivke vrste Lavandula x intermedia (lavandin)«, ki sta del te doktorske disertacije. Ker nismo želeli vplivati na rast bakterij C. jejuni, ampak samo na Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 63 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 njihove fenotipske lastnosti, smo uporabljali subinhibitorne koncentracije pripravkov sivke in čistih spojin v koncentraciji 1/4 minimalne inhibitorne koncentracije (MIK). Postopek določanja minimalne inhibitorne koncentracije, kot tudi vrednosti koncentracij MIK za testirane pripravke sta navedeni v članku »Protifilmotvorni učinek pripravkov sivke vrste Lavandula angustifolia proti bakteriji Campylobacter jejuni«, ki je del te doktorske disertacije. Poskusi so bili narejeni v treh bioloških ponovitvah. Določanje vpliva pripravkov sivke in čistih spojin na koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni z metodo HPLC-FLD Vpliv pripravkov sivke vrste L. angustifolia (EO in EI) in čistih spojin (linaol in linalil acetat) na koncentracijo signalnih molekul AI-2 smo določili pri bakterijah C. jejuni NCTC 11168. Za negativno kontrolo smo uporabili mutanto C. jejuni 11168Δ luxS, saj ta ne proizvaja signalne molekule AI-2. Najprej smo pripravili IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 in C. jejuni 11168Δ luxS, ki smo jih 24 h gojili z dodatkom pripravkov sivke in čistih spojin v subinhibitornih koncentracijah. Postopka gojenja in pripave IG bakterij C. jejuni sta opisana v člankih »Razjasnitev komunikacijskega sistema patogenih, s hrano prenosljivih bakterij Campylobacter jejuni preko kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo« in »Kontrola filmotvornosti bakterij Campylobacter jejuni z eteričnimi olji in etanolnimi izvlečki iz odpadnega materiala sivke vrste Lavandula x intermedia (lavandin)«, ki sta del te doktorske disertacije. Z metodo visoko tlačne tekočinske kromatografije v kombinaciji s fluorescenčnim detektrojem (HPLC-FLD) smo določili koncentracijo signalnih molekul AI-2 v IG bakterij C. jejuni, netretiranih in tretiranih s pripravki sivke in čistimi spojinami. Za pripravo umeritvne krivulje smo uporabili standardno molekulo DPD [(S)-4,5-dihidrksi-2,3-pentandion] (Carbosynth, Velika Britanija), ki je prekurzor signalne molekule AI-2. Protokol, ki smo ga uporabljali pri izvedbi metode HPLC-FLD, je opisan v članku »Razjasnitev komunikacijskega sistema patogenih, s hrano prenosljivih bakterij Campylobacter jejuni preko kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo«, ki je del te doktorske disertacije. Poskusi so bili narejeni v treh bioloških ponovitvah. Določanje vpliva eteričnega olja sivke, linalola in linalil acetata na izražanje gena luxS z metodo PCR v realnem času (rtPCR) Izražanje gena luxS smo določali v planktonski kulturi bakterij C. jejuni NCTC 11168 s pomočjo metode PCR (verižna rekacija s polimerazo) v realnem času (rtPCR) na sistemu rtPCR (ViiA 7 Real-Time PCR System, Thermo Fisher Scinetific, Applied Biosystems, CA, ZDA). Bakterije C. jejuni smo gojili 16 h v tekočem gojišču Mueller Hinton (MH; Oxoid, Velika Britanija), pri temperaturi 42 °C, v mikroaerofilni atmosferi (5 % O2, 10 % CO2 in 85 % N2). Po 16-ih urah smo bakterijskim kulturam dodali EO sivke vrste L. angustifolia, linalol ali linalil acetat v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK) in nadaljevali z gojenjem 30 minut v zgoraj navedenih pogojih. Kot negativno kontrolo smo uporabili bakterijsko kulturo C. jejuni, ki je bila gojena 30 min z dodatkom 1 % raztopine dimetil sulfoksid Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 64 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (DMSO; Merck, Nemčija), saj so bile založne raztopine izbranih pripravkov pripravljene v raztopini DMSO. Koncentracija raztopine DMSO v bakterijskih kulturah, kjer smo dodali izbrane pripravke, ni presegala 1 %. Po 30 minutni inkubaciji smo celice koncentrirali s centrifugiranjem pri pogojih 5000 x g, 5 min, 4 °C, ter smo jih resuspendirali v 1 mL tekočega gojišča MH do koncentracije celic 109 CFU/mL. Izolacijo in čiščenje celokupne RNK smo izvedli z uporabo reagenta TRIzol (Sigma Aldrich, ZDA) in kompleta PureLink RNA mini kit (Thermo Fisher Scientific, ZDA) po navodilih proizvajalcev. Encim DNazo smo uporabili za čiščenje izolirane RNK od genomske DNK in sicer ob uporabi kita PureLink DNase (Thermo Fisher Scientific, ZDA) po navodilih proizvajalca. Kvantifikacijo RNK smo izvedli s fluorometrijo na fluorometru Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific, Applied Biosystems, CA, ZDA) ob uporabi kita Qubit RNA HS (Thermo Fisher Scientific, ZDA) po navodilih proizvajalca. Z uporabo magnetnih kroglic NEXTflex PolyA (Perkin Elmer, ZDA) smo iz celokupne RNK izolirali mRNK po navodilih proizvajalca. Za izvedbo metode rtPCR smo najprej konstruirali unikatne začetne oligonukleotide ter sondo FAM-MGB (TaqMAN, Thermo Fisher Scientific, ZDA) (Preglednica 1) s programom BLAST® (National Center for Biotechnology Information, ZDA). Referenčne gene, s katerimi smo izvedli normalizacijo podatkov, smo izbrali na podlagi rezultatov sekveniranja RNK, opisanih v članku »Protifilmotvorni učinek pripravkov sivke vrste Lavandula angustifolia proti bakteriji Campylobacter jejuni«, ki je del te doktorske disertacije. Izbrali smo gena, ki nista kazala sprememb na nivoju diferencialnega izraženja genov, to sta bila gena ilvC in rpoA. Preglednica 1: Seznam uporabljenih začetnih oligonukleotidov. Ime gena F začetni oligonukleotid R začetni oligonukleotid Sonda CATCGCTTTTTTAGTCTCT CAGGGCCAAAG ilvC TGCAGAATACGGCGATTACATCA TCAGTG ATTAT AAGCCCTGCAAGTTCACTT CTCATCAAAGC rpoA GTCTTGAAAAAGCAGGAGTGGTTT ACA AAGCTC AGGATTTATGAGAGATCATCTTAAT CAATACTTTTCTCATCAGG ACCCGTGCGAC luxS TCAAATTCAGTT TGTTCCAAT AACC Za pripravo reakcijske mešanice, ki smo jo uporabili pri izvedbi metode rtPCR, smo izbrali mešanico komponent TaqMan universal master mix II with UNG (Thermo Fisher Scientific, ZDA). Reakcijsko mešanico smo pripravili po navodilih proizvajalca. Pogoji pomnoževanja, ki smo jih izbrali za izvedbo rtPCR, so podani v preglednici 2. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 65 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 2: Pogoji pomnoževanja na rtPCR. Korak Temperatura [°C] Čas [min:s] Št. ciklov Inkubacija UNG 50 2:0 1 Encimska aktivacija 95 10:0 1 Denaturacija 95 0:15 40 Prileganje 60 1:0 Učinkovitost pomnoževanja smo preračunali na podlagi umeritvene krivulje, za katero smo naredili redčitveno vrsto in sicer za vse vzorce. Po analizi podatkov, pridobljenih z rtPCR, smo ustreznost referenčnih genov preverili z uporabo programa Reffinder (Xie in sod., 2012). Za določanje sprememb v izražanju genov smo uporabili metodo Pfaffl (Pfaffl, 2001). Normalizacijo podatkov smo izvedli, kot jo opisujejo Vandesompele in sod. (2002). Poskusi so bili narejeni v treh bioloških ponovitvah. Rezultati Odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, gojenih s pripravki sivke in čistimi spojinami v subinhibitornih koncentracijah Vpliv pripravkov sivke vrste L. angustifolia (EO in EI) ter čistih spojin (linalol in linalil acetat) na medcelično komunikacijo bakterij C. jejuni smo najprej ovrednotili preko uporabe posredne metode merjenja bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 na IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene z dodatkom izbranih pripravkov v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). V teh koncentracijah pripravki sivke in čiste spojine ne vplivajo na rast bakterij C. jejuni, kar smo preverili z določanjem CFU/mL. Vplivajo na fenotipske lastnosti, ki jih te bakterije izražajo. Na sliki 2 lahko opazimo, da je bil bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 manjši po dodatku vseh IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, gojenih z dodatkom pripravkov sivke ali čistih spojin v primerjavi z bioluminiscenčnim odzivom poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, gojenih brez dodatka pripravkov sivke ali čistih spojin (kontrola) (p < 0,05). Najmočnejši učinek je imela čista spojina linalol. Predvidevali smo, da so pripravki sivke in čiste spojine vplivali na zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2, ki jih bakterije C. jejuni proizvajajo v času svoje rasti. Predvidevali smo tudi, da pripravki sivke in čiste spojine vplivajo na izražanje gena luxS pri bakteriji C. jejuni, kar lahko posledično vpliva na zmanjšanje koncentracije signalnih molekul AI-2. Zato smo v nadaljnjih poskusih določili koncentracijo signalnih molekul AI-2 z metodo HPLC-FLD v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez ali z dodatkom subinhibitornih koncentracij pripravkov sivke in čistih spojin. Preverili smo tudi vpliv eteričnega olja sivke, linalola in linalil acetata v subinhibitornih koncentracijah na izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni NCTC 11168 z metodo rt-PCR. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 66 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 3: Bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. havreyi MM30, ki jo spodbudi dodatek IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez (kontrola) ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia [EO (eterično olje), EI (etanolni izvleček)] ali čistih spojin (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). Prikazane so normalizirane povprečne vrednosti bioluminiscence v relativnih luminiscenčnih enotah [RLE] deljene z optično gostoto [OD600], ki je bila izmerjena za vsak vzorec ± standardni odklon. Od vrednosti bioluminiscence V. harveyi MM30, ki jo spodbudi IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez ali z dodatkom pripravkov sivke ali čistih spojin v subinhibitornih koncentracijah smo odšteli vrednosti bioluminiscence V. harveyi MM30, ki jo spodbudi IG bakterij C. jejuni 11168Δ luxS, ki so bile gojene brez ali z dodatkom pripravkov sivke ali čistih spojin v subinhibitornih koncentracijah. Vpliv pripravkov sivke in čistih spojin na koncentracijo signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni Koncentracijo signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni NCTC 11168 smo določili z metodo HPLC-FLD. Koncentracijo signalnih molekul AI-2 smo merili v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia (EO in EI) in čistih spojin (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). Kot negativno kontrolo smo uporabili IG bakterij C. jejuni 11168Δ luxS, ki ne proizvajajo signalne molekule AI-2. Tudi bakterije C. jejuni 11168Δ luxS smo gojili brez ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia ali čistih spojin v subinihibitornih koncentracijah (1/4 MIK). Na sliki 3 so prikazani tipični kromatogrami IG Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 67 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bakterij C. jejuni NCTC 11168 in C. jejuni 11168Δ luxS, gojenih v tekočem gojišču MH, kot tudi kromatogrami IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 in C. jejuni 11168Δ luxS, gojenih v tekočem gojišču MH z dodatkom eteričnega olja sivke v subinhibitorni koncentraciji. Slika 4: Kromatogrami izrabljenih gojišč: bakterijski sev C. jejuni NCTC 11168, gojen v tekočem gojišču MH (A), bakterijski sev C. jejuni 11168Δ luxS , gojen v tekočem gojišču MH (B), bakterijski sev C. jejuni NCTC 11168, gojen v tekočem gojišču MH z dodatkom eteričnega olja sivke vrste L. angustifolia v subinhibitorni koncentraciji (C), bakterijski sev C. jejuni 11168Δ luxS, gojen v tekočem gojišču MH z dodatkom eteričnega olja sivke vrste L. angustifolia v subinhibitorni koncentraciji (D). Rdeča puščica prikazuje retencijski čas signalne molekule AI-2 (7,9 min kot smo opisali v članku »Razjasnitev komunikacijskega sistema patogenih, s hrano prenosljivih bakterij Campylobacter jejuni preko kvantifikacije signalnih molekul AI-2 z biosenzorsko metodo«, ki je tel te doktorske disertacije), ki jo proizvajajo bakterije C. jejuni NCTC 11168 (A in C) oz. odsotnost signalne molekule AI-2 pri bakteriji C. jejuni 11168Δ luxS (B in D). Pri določanju koncentracije signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni NCTC 11168 z metodo HPLC-FLD smo ugotovili, da se koncentracija signalnih molekul AI-2 v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene brez pripravkov sivke (kontrola) in čistih spojin statistično ne razlikuje od koncentracije signalnih molekul AI-2 v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168, ki so bile gojene z dodatkom pripravkov sivke ali čistih spojin v subinhibitornih koncentracijah (p > 0,05) (Slika 3). Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 68 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 5: Koncentracija signalnih molekul AI-2 v IG bakterij C. jejuni NCTC 11168 gojenih brez (kontrola) ali z dodatkom pripravkov sivke vrste L. angustifolia [EO (eterično olje), EI (etanolni izvleček)] ali čistih spojin (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). Koncentracija signalnih molekul AI-2 je določena z metodo HPLC-FLD. Prikazane so povprečne vrednosti v µM ±standardni odklon. Izražanje gena luxS pri bakteriji C. jejuni po dodatku eteričnega olja sivke, linalola in linalil acetata v subinhibitornih koncentracijah Izražanje gena luxS pri bakteriji C. jejuni NCTC 11168 po dodatku eteričnega olja sivke vrste L. angustifolia, linalola in linalil acetata v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK) smo določili z metodo rt-PCR. Slika 5 prikazuje diferencialno izražanje gena luxS po dodatku eteričnega olja sivke, linalola in linalil acetata v subinhibitornih koncentracijah. Lahko sklepamo, da nobeno tretiranje ni statistično značilno vplivalo na diferencialno izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni NCTC 11168 (p > 0,05). Primerjava je narejena na izražanje gena luxS pri negativni kontroli, ki je v tem primeru bila planktonska kultura bakterij C. jejuni NCTC 11168 tretirana z 1 % raztopino DMSO. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 69 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 6: Normalizirano izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni NCTC 11168 po tretiranju z eteričnim oljem (EO) sivke vrste L. angustifolia, linalolom in linalil acetatom v subinhibitornih koncentracijah (1/4 MIK). Za določanje sprememb v izražanju genov smo uporabili metodo Pfaffl (Pfaffl, 2001). Normalizacijo podatkov smo izvedli, kot jo opisujejo Vandesompele in sod. (2002). Prikazne so povprečne vrednosti izražanja gena luxS ± standardni odklon. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 70 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 3.1 RAZPRAVA Bakterije C. jejuni veljajo za izredno občutljive bakterije, a so kljub temu ena izmed najbolj razširjenih patogenih bakterijskih vrst v celotni živilski verigi. Izrazito razširjenost jim med drugim omogočajo tudi biofilmi, ki predstavljajo edinstveno strategijo preživetja mikroorganizmov zaradi zaščite pred neugodnimi okoljskimi stresnimi dejavniki (EFSA/ECDC, 2020; Klančnik in sod., 2021). Campylobacter jejuni je zaradi lastnosti kot so medcelična komunikacija, gibljivost, kemotaksa ter pritrjevanje na različne površine zmožen tvoriti enovrstne, kot tudi večvrstne biofilme na različnih abiotskih površinah, ki jih najdemo v industrijskem okolju. Zmožen je tudi kolonizirati že obstoječe biofilme (Teh in sod., 2010; Tram in sod., 2020). Filmotvornost bakterij je tesno povezana tudi z razvojem odpornosti proti antibiotikom in biocidom, saj znotraj biofilma prihaja do pogostejše izmenjave genetskega materiala, kar vključuje tudi gene za odpornost proti antibiotikom. Poleg tega, antibiotiki in biocidi počasneje prodirajo v biofilm, zaradi česar subletalne koncentracije antibiotikov in biocidov upočasnjujejo rast biofilmskih celic ter spodbujajo mutacije, prenos in izražanje genov za odpornost (Klančnik in sod., 2021). Prevalenca proti antibiotikom in biocidom odpornih sevov bakterij C. jejuni, izoliranih predvsem iz perutnine, je visoka in še narašča, kar predstavlja globalni problem (EFSA/ECDC, 2021; Mavri in Smole Možina, 2013; Rozman in sod., 2018). Nujno je poiskati učinkovit pristop za obvladovanje kampilobaktrov v živilski verigi, kot tudi izbrati alternativne učinkovine s potencialnim protifilmotvornim učinkom. Ta je lahko kurativni, kar pomeni, da odstranjujemo že obstoječi biofilm ali preventivni, kjer poskušamo omejiti začetno pritrjevanje bakterij kot predstopnjo filmotvornosti, in nadaljnjo rast biofilma. S tem preprečimo prilagajanje bakterij in nadaljnje razmnoževanje in širjenje v živilski verigi. Prvi cilj te doktorske naloge je bila optimizacija metode gojenja biofilmov bakterij C. jejuni na abiotskih površinah. Kljub temu, da je C. jejuni filmotvorna bakterija, je zaradi njenih posebnih gojitvenih zahtev težko nagojiti zrel biofilm. Zato smo biofilme bakterij C. jejuni gojili na interfazi trdna površina/tekočina, kjer je zrastlo največ biomase (Priloga D). Na interfazi trdna površina/tekočina je koncentracija O2 za rast bakterij C. jejuni optimalna, saj koncentracija O2 z globino upada, kar ustreza bakterijam C. jejuni, ki so mikroaerofilne bakterije (Stewart, 2012). Za preučevanje biofilmov smo uporabili konfokalno vrstično lasersko mikroskopijo, katera nam je omogočila vpogled v prostorsko strukturo biofilma, kot tudi ovrednotenje živosti celic ob uporabi metode barvanja živo/mrtvo (angl. LIVE/DEAD). Prednost te metode je zaznavanje tudi celic VBNC (živo, vendar ne kultivabilno), ki jih z gojitvenimi metodami ne moremo zaznati. Campylobacter jejuni pogostokrat v neugodnih, stresnih razmerah preide v stanje VBNC, a je še vedno prisoten in lahko naprej navzkrižno kontaminira površine in prehranske izdelke (Kim in sod., 2021). Zelo je pomembno pridobiti podatek o živosti celic, saj so žive celice problematične in se lahko naprej razmnožujejo ter širijo. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 71 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Ko smo metodo gojenja in preučevanja biofilma optimizirali, smo lahko opazovali tudi odstranjevalni učinek pripravkov sivke. Naši rezultati so pokazali, da je med testiranimi pripravki (eterično olje, etanolni izvlečki iz cvetov in odpadnega materiala) sivke vrste L. angustifolia, eterično olje najbolj učinkovalo na odstranjevaje zrelega biofilma bakterij C. jejuni z abiotske površine. Eterična olja so izrazito bogata s sekundarimi metaboliti, ki sinergistično prispevajo k protimikrobnem delovanju (Dorman in Deans, 2000). Wagle in sod. (2019) so pokazali, da trans-cinamaldehid, eugenol in karvakrol odstranjujejo zrele biofilme bakterij C. jejuni s površine polistirena in nerjavečega jekla na način, da razgrajujejo komponente zunajceličnega matriksa. Rastlinski sekundarni metaboliti lahko vplivajo tudi na proizvodnjo in aktivnost encimov, ki so pomembni za sintezo zunajceličnega matriksa. Hkrati pa lahko motijo vnos hranil, spreminjajo pH gradient celične citoplazme ter povzročajo celično smrt (Pisoschi in sod., 2018). Zanimivo je tudi, da smo pri pripravkom izpostavljenih vzorcih opazili, da je delež pritrjenih celic manjši ali enak kot 3 %, kar pomeni, da pripravki niso le uničili celic, ampak so jih tudi odstranili s površine. To je lahko posledica spremembe površinske napetosti samih celic in/ali površine, kot tudi vpliva na elektrostatske in van der Waalsove sile med celicam in površino (Roy in sod., 2018). Potrebno je poudariti, da je tudi odpadni material sivke pokazal odstranjevalni učinek, kar pomeni, da bi z optimizacijo postopka priprave izvlečkov iz odpadnega materiala lahko ponovno uporabili odpadek v industrijske namene ter s tem izboljšali ekonomičnost proizvodnje eteričnega olja. S tem bi tudi izboljšali ravnanje z odpadki, saj bi jih ponovno uporabili in s tem zagotovili okoljevarstvene izboljšave. Iz pridobljenih rezultatov je jasno, da rastlinski pripravki sivke odstranjujejo zrele biofilme bakterij C. jejuni, kar pomeni, da bi se lahko uporabljali kot alternativni, kurativni načini odstranjevanja biofilmov v živilski verigi. V nadaljnjih poskusih smo želeli preveriti, ali bi se lahko rastlinski pripravki sivke uporabljali za preventivne namene in sicer za preprečevanje ali zmanjševanje filmotvornosti bakterij C. jejuni. Da bi zmanjšali filmotvornost, je potrebno vplivati na ključne korake, ki do filmotvornosti vodijo, to so gibljivost, začetno pritrjevanje in sistem medcelične komunikacije. Gibljivost, ki jo pri bakterijah C. jejuni poganjata dva polarno nameščena bička, je nujna za začetno pritrjevanje in nadaljnjo filmotvornost (Guerry, 2007). Gibanje z bički omogoča bakterijam, da premagajo elektrostatične odbojne sile med celicami in površino (Gutman in sod., 2013). Že zmanjšana gibljivost lahko vodi k zmanjševanju pritrjevanja in filmotvornosti bakterij C. jejuni. Po izpostavljenosti bakterij C. jejuni subinhibitornim koncentracijam pripravkov sivke vrste L. angustifolia in čistim spojinam (linalol, linalil acetat, kamfor, borneol, 1,8-cineol, trans-ferulna kislina, p-kumarna kislina) smo ugotovili, da se gibljivost teh bakterij na poltrdnem gojišču značilno zmanjša (p < 0,05). Med testiranimi učinkovinami so pripravki sivke (eterično olje in etanolni izvlečki) imeli najmočnejši učinek na zmanjšanje gibljivosti, kar je lahko posledica sinergističnega delovanja sekundarnih metabolitov. Podobne rezultate so dobili Castillo in sod. (2014), ki so potrdili vpliv različnih citrusov na gibljivost bakterij C. jejuni. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 72 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Skladno s pričakovanji so pripravki sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia zmanjšali pritrjevanje bakterij C. jejuni na abiotske površine. Med delovanjem pripravkov eteričnih olj in etanolnih izvlečkov ni bilo bistvene razlike, kar potrjuje koristnost odpadnega materiala in potencial za ponovno uporabo v industrijske namene. Uporabnost odpadkov timijana in oljčnih listov proti pritrjevanju bakterij C. jejuni na abiotske površine so potrdili tudi Šikić Pogačar in sod. (2016). Šimunović in sod. (2020) so pokazali, da kar devet različnih rastlinskih pripravkov zmanjšuje pritrjevanje bakterij C. jejuni na abiotske površine. V naši raziskavi smo pokazali, da pripravki sivke vrste L. angustifolia zmanjšujejo pritrjevanje bakterij C. jejuni po 4, 8 in 24 h izpostavljenosti pripravkom ter da je njihov učinek močnejši v primerjavi s čistimi spojinami, kar ponovno nakazuje na pomemben sinergistični učinek čistih spojin v pripravkih. Enako so opazili Duarte in sod. (2016), ki so pokazali, da eterično olje koriandra močnejše zmanjšuje pritrjevanje bakterij C. jejuni in C. coli na abiotske površine v primerjavi z linalolom, ki je ena izmed glavnih spojin eteričnega olja sivke in koriandra. Prav tako so eterična olja in etanolni izvlečki sivke vrste L. x intermedia zavrli filmotvornost bakterij C. jejuni po 72 h, s čimer smo potrdili, da lahko pripravki sivke dlje časa omejujejo filmotvornost bakterij C. jejuni. S transkriptomsko analizo smo pokazali, da eterično olje sivke vrste L. angustifolia v subinhibitorni koncentraciji vpliva na spremembo izražanja kar 326 genov, od tega zmanjšuje izražanje 188 genov v primerjavi s kontrolo. Med temi geni je kar 24 genov vključenih v mehanizem gibljivosti in filmotvornosti bakterij C. jejuni. Kot že omenjeno, za pritrjevanje in nadaljnjo filmotvornost bakterije C. jejuni potrebujejo funkcionalne bičke, zato je zelo pomembno modulirati izražanje genov, ki so potrebni za sintezo in modifikacijo bičkov, če želimo zmanjšati filmotvornost teh bakterij. Opazili smo tudi zmanjšano izražanje genov, ki vplivajo na sintezo beljakovin in lipopolisaharidov zunanje bakterijske membrane, kot so kpsM, kpsS, bamD, waaC, in lgt. Vsi našteti geni so vključeni v proces pritrjevanja bakterij C. jejuni na abiotske površine (Naito in sod., 2010). Podatki, ki smo jih pridobili s sekvenciranjem RNK, kažejo tudi na to, da so bakterije C. jejuni ob dodatku eteričnega olja sivke L. angustifolia doživele kar obsežno transkriptomsko reprogramiranje, kar je posledica odziva bakterij na stres (Aseev in sod., 2016). Opazili smo povečano izražanje sistema črpalk CmeABC, ki jih bakterije C. jejuni uporabljajo za aktivno izločanje protimikrobnih snovi, kar potrjuje stresno stanje bakterij C. jejuni (Lin in sod., 2002). Mnogi geni za kodiranje transmembranskih beljakovin so se slabše izražali, vključno z geni, ki so pomembni za kodiranje beljakovin za vnos železa. Pokazano je, da je sistem za vnos železa pri kampilobaktru vpleten v kolonizacijo, filmotvornost in patogenost teh bakterij ter da se v stresnih razmerah izražanje sistema za vnos železa močno zmanjša (Asakura in sod., 2007; Miller in sod., 2009; Püning in sod., 2021). Tudi geni, ki so pomembni za stresni odziv ( cstA, pph, dcuA, hrcA) so se manj izražali, kar ima lahko za posledico zmanjšano filmotvornost bakterij C. jejuni (Drozd in sod., 2014; Kim in sod., 2021; Rasmussen in sod., 2013). Pridobljeni podatki transkriptomske analize nam dajejo vpogled v celoten prepis genov, ki jih v trenutku tretiranja z eteričnem oljem sivke vrste L. angustifolia bakterije C. jejuni Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 73 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izražajo ter nam odpirajo dodatne vidike in možnosti za raziskovanje novih tarč, ki bi nam pomagale pri nadzorovanju tega patogena v živilski industriji. Vodilno vprašanje te naloge je bilo ali je zmanjšanje filmotvornosti bakterij C. jejuni posledica vpliva rastlinskih pripravkov sivke na sistem medcelične komunikacije teh bakterij. Zanimalo nas je tudi ali lahko z zaviranjem medcelične komunikacije vplivamo na filmotvornost bakterij C. jejuni. Da bi odgovorili na ta vprašanja, smo najprej optimizirali metodo preučevanja medcelične komunikacije bakterij C. jejuni. Za preučevanje medcelične komunikacije s signalno molekulo AI-2 se običajno uporabljajo posredne metode oz. poročevalski sevi, najpogosteje V. harveyi BB170 (Zhao in sod., 2018). Vibrio harveyi BB170 je mutanta LuxN-, kar pomeni, da ne zaznava signalne molekule AHL. Proizvaja in zaznava signalne molekule AI-2 (Bassler in sod., 1997). Ker V. harveyi BB170 proizvaja in zaznava lastne signalne molekule AI-2, je velika možnost, da ob uporabi tega seva pri preučevanju medcelične komunikacije bakterij C. jejuni dobimo lažno pozitiven rezultat. Zato je bilo nujno poiskati optimalni sev, s katerim bomo lahko zaznavali signale molekule AI-2, ki jih proizvaja C. jejuni, in nam tako omogoči kvantifikacijo signalnih molekul. V naši raziskavi smo testirali štiri različne poročevalske seve V. harveyi, med katerimi se je V. harveyi MM30 pokazal kot najbolj občutljiv sev za zaznavanje signalnih molekul AI-2, ki jih proizvaja C. jejuni. Vibrio harveyi MM30 je mutanta LuxS-, kar pomeni, da ne proizvaja signalne molekule AI-2, jih pa zaznava. Proizvaja in zaznava tudi signalne molekule AHL, za katere smo pokazali, da morajo biti prisotne, če želimo, da se poročevalski sev V. harveyi MM30 močno odzove na signalne molekule AI-2. Z matematičnim modeliranjem bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. havreyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni smo uspeli kvantificirati signalne molekule AI-2. Točnost kvantifikacije signalnih molekul AI-2 s poročevalskim sevom smo preverili tudi z direktno, analitsko metodo HPLC-FLD, ki smo jo za bakterije C. jejuni prvič vpeljali. Pokazali smo, da je poročevalski sev V. harveyi MM30 bolj občutljiv kot analitska metoda HPLC-FLD in točen, saj statistično značilne razlike med pridobljenimi meritvami nismo zaznali. Rezultati tega doktorskega dela kažejo, da signalna molekula AI-2 predstavlja stranski produkt izražanja gena luxS, ki je sicer pomemben za centralni metabolizem bakterij C. jejuni, kar smo potrdili tudi v nedavni raziskavi (Ramić in sod., 2022). Delecija gena luxS pri bakteriji C. jejuni spremeni izražanje kar 765 genov v primerjavi z divjim tipom, od katerih je večina vključena v biološke procese, kot so Krebsov cikel, metabolizem piruvata, dušika in tiamina, ter sintezo lipopolisaharidov (Ramić in sod., 2022). Za signalno molekulo AI-2, ki jo proizvajajo bakterije C. jejuni, ne moremo trditi, da je del mehanizma zaznavanja kvoruma (angl . Quorum Sensing), saj se koncentracija AI-2 pri bakterijah C. jejuni linearno povečuje s povečanjem koncentracije celic, medtem ko pri zaznavanju kvoruma pride do t.i. »odziva stikala« (angl. Switch-Like Response) (Hense in Schuster, 2015). Dodatno smo opazili, da obstaja bistvena razlika v koncentraciji signalnih molekul AI-2 pri enaki celični gostoti bakterij C. jejuni v dveh različnih gojiščih, kar dodatno nakazuje, da signalne molekule AI-2 pri bakterijah C. jejuni niso komunikacijske molekule zaznavanja kvoruma. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 74 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Prav tako, ni poznan receptor za signalne molekule AI-2 pri bakterijah C. jejuni. Bioinformacijska analiza, ko so jo izvedli Parkhill in sod. (2000) ni pokazala, da obstajajo v genomu bakterij C. jejuni znani analogi receptorjev signalnih molekul AI-2. Glede na to, da je signalna molekula AI-2 medvrstna komunikacijska signalna molekula, je možno, da bakterije C. jejuni s svojimi signalnimi molekulami AI-2 spodbujajo filmotvornost drugih bakterij, ki potem proizvajajo zunajcelični matriks ter s tem zaščitijo kampilobaktra in mu omogočajo preživetje. Pokazano je bilo, da veliko število človeških oralnih komenzalnih bakterij proizvaja signalne molekule AI-2, ki so potrebne za tvorbo mešanega biofilma in razvoja zobnih oblog (Kikuchi in sod., 2005; McNab in sod., 2003; Rickard in sod., 2008). McNab in sod. (2003) so pokazali, da je signalna molekula AI-2 pomembna pri tvorbi mešanih biofilmov dveh pogostih oralnih bakterij, Porphyromonas gingivalis in Streptococcus gordonii. Med temi bakterijami se mešani biofilm ni razvil na polistirenski površini, ko sta obe vrsti bili brez gena luxS, ki je potreben za sintezo signalne molekule AI- 2. Ko so mutante gojili skupaj s heterolognim sevom divjega tipa, ki je vseboval funkcionalni gen luxS, se je mešani biofilm tvoril. Laganenka in Sourjik (2018) sta pokazala, da signalne molekule AI-2, ki jih proizvajajo bakterije Enterococcus faecalis, spodbujajo kolektivno obnašanje bakterij E. coli pri nizki celični gostoti. To posledično vodi k izboljšani avtoagregaciji bakterij E. coli, kot tudi h koagregaciji med temi dvemi vrstami. Prav tako sta Laganenka in Sourjik (2018) pokazala, da je preživetje bakterij E. faecalis in E. coli v stresnih razmerah boljše znotraj mešanega biofilma. Nove raziskave bi bilo potrebno usmeriti na mešane biofilme med kampilobaktrom in drugimi bakterijami, ki jih v živilski verigi pogostokrat zaznavamo ter preučiti vpliv medvrstne komunikacijske signalne molekule AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni na tvorbo mešanega biofilma. Vpliv rastlinskih pripravkov sivke na medcelično komunikacijo bakterij C. jejuni smo najprej želeli preveriti posredno preko bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene brez ali z rastlinskimi pripravki sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia v subinhibitornih koncentracijah. Pokazali smo, da se je bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z rastlinskimi pripravki sivke, zmanjšal v primerjavi z bioluminiscenčnim odzivom poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, ki so bile gojene brez dodatka rastlinskih pripravkov sivke. Opazili smo, da je bil bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z etanolnimi izvlečki iz cvetov in odpadnega materiala sivke vrste L. x intermedia, manjši v primerjavi z bioluminiscenčnim odzivom na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z eteričnimi olji sivke vrste L. x intermedia. To je lahko posledica vezave signalnih molekul AI-2 na oborine v vzorcih etanolnih izvlečkov, ki so bile odstranjene skupaj z bakterijami med filtracijo. Podoben rezultat so dobili Bezek in sod. (2016), ki so pokazali, da etanolni izvlečki rastline E. ruticarpa zmanjšujejo bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi za približno 90 %. Šimunović in sod. (2020) so pokazali, da eterično olje sivke vrste Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 75 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 L. hybrida zmanjšuje odziv poročevalskega seva V. harveyi za približno 66 %, kar je primerljivo z učinkom testiranih eteričnih olj sivke vrste L. angustifolia in L. x intermedia. Pri tem ni jasno ali rastlinski pripravki sivke vplivajo na koncentracijo signalnih molekul AI-2, izražanje gena luxS pri bakteriji C. jejuni ali celo na receptor poročevalskega seva, saj je mehanizem delovanja rastlinskih pripravkov na medcelično komunikacijo bakterij lahko različen in vključuje vpliv na zmanjšanje izražanja receptorskih beljakovin, zaviranje proizvodnje signalnih molekul, razgradnjo signalnih molekul kot tudi mimikrijo signalnih molekul (Kalia, 2013; Machado in sod., 2020). V okviru te doktorske naloge nas je zanimalo, ali rastlinski pripravki sivke zmanjšujejo koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni, zato smo točno koncentracijo signalnih molekul AI-2 določili z metodo HPLC-FLD. Ugotovili smo, da ni bilo statistično značilne razlike med koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni, ki so bile gojene brez ali z dodatkom rastlinskih pripravkov sivke (eterično olje, etanolna izvlečka) in čistih spojin (linalol in linalil acetat). Ta rezultat ne potrjuje prve hipoteze, ki pravi, da bodo rastlinski pripravki sivke in izbrane čiste spojine v subinhibitornih koncentracijah zmanjšale koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni. Ker prve hipoteze nismo potrdili, ne moremo potrditi tudi druge, tretje in četrte hipoteze te doktorske naloge, saj so vse vezane na znižanje koncentracije signalnih molekul AI-2, kot posledica vpliva rastlinskih pripravkov. Rezultati transkriptomske analize in rezultati, pridobljeni z metodo rt-PCR, kažejo na to, da eterično olje sivke kot tudi čisti spojini linalol in linalil acetat statistično značilno ne spreminjajo izražanje gena luxS pri bakterij C. jejuni, kar je lahko razlog, da se tudi koncentracija signalnih molekul AI-2 ni značilno spremenila v izrabljenih gojiščih bakterij C. jejuni. Skladno s tem so Wagle in sod. (2019) v svoji raziskavi pokazali, da čiste spojine trans- cinamaldehid in karvakrol celo zvišata izražanje gena luxS, medtem ko eugenol ne vpliva na spremembo izražanja gena luxS pri bakteriji C. jejuni. Signalna molekula AI-2 je medvrstna komunikacijska signalna molekula, ki lahko modulira filmotvornost različnih bakterij (Luo in sod., 2022). Opazili smo, da je bil bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 manjši po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z rastlinskimi pripravki sivke v primerjavi z bioluminiscenčnim odzivom na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene brez rastlinskih pripravkov sivke. To nam nakazuje, da je lahko tarča rastlinskih pripravkov receptorska beljakovina pri poročevalskem sevu, ampak za potrditev tega so potrebni dodatni poskusi. Rezultati sicer nakazujejo na to, da bi rastlinske pripravke lahko uporabljali za obvladovanje medvrstne komunikacije ter s tem zmanjšali filmotvornost, saj smo opazili zmerno in pozitivno korelacijo med zmanjšanjem odziva poročevalskega seva na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z dodatkom rastlinskih pripravkov sivke v subinhibitornih koncentracijah in zmanjšanjem pritrjevanja bakterij C. jejuni na abiotske površine. Podobno so zaznali Šimunović in sod. (2020), ki so tudi potrdili pozitivno korelacijo med zmanjšanjem odziva poročevalskega seva na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 76 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 gojene z dodatkom rastlinskih pripravkov v subinhibitornih koncentracijah in zmanjšanjem pritrjevanja bakterij C. jejuni na abiotske površine. Dodatno smo ugotovili, da obstaja zmerna in pozitivna korelacija med zmanjšanjem pritrjevanja in nadaljnjo filmotvornostjo bakterij C. jejuni. To podpirajo tudi rezultati transkriptomske analize, kjer smo opazili, da eterično olje sivke vrste L. angustifolia vpliva na izražanje različnih bioloških procesov, vpletenih v filmotvornost bakterij C. jejuni. Transkriptomska analiza nam je odprla možnosti iskanja novih tarč, ki bodo pomagale pri zmanjševanju filmotvornosti in tveganja, ki jo bakterije C. jejuni predstavljajo za živilsko verigo in javno zdravstvo. Zmanjšanje medvrstne komunikacije med bakterijami v kombinaciji z dodatnimi tarčami, kot so npr. geni, vključeni v gibljivost in filmotvornost, sistem vnosa železa ali stresni odziv predstavljajo zanimive in obetavne tarče za obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni v celotni živilski verigi. 3.2 SKLEPI Bakterije Campylobacter jejuni so ubikvitarne bakterije, ki že desetletja predstavljajo izrazito nevarnost za živilsko industrijo kot tudi za javno zdravstvo. Zmožne so filmotvornosti na abiotskih in biotskih površinah, kar jim omogoča boljše preživetje in razširjenost v celotni živilski verigi. Nujno je poiskati alternativne učinkovine, ki bodo pomagale pri odstranjevanju kampilobaktrov iz živilske verige. V tej doktorski nalogi smo bili osredotočeni na optimizacijo metode gojenja biofilmov bakterij C. jejuni na abiotskih površinah; razvoj, optimizacijo in nadgradnjo posredne metode zaznavanja in kvantifikacije signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni; ter na iskanje protibakterijskega in protifilmotvornega učinka rastlinskih pripravkov sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia proti bakteriji C. jejuni. Prišli smo do naslednjih ugotovitev: • Vibrio harveyi MM30 je optimalen sev za preučevanje medcelične komunikacije bakterij C. jejuni, saj je njegov odziv na signalne molekule AI-2, ki jih proizvaja C. jejuni najmočnejši in najbolj občutljiv v primerjavi z odzivom ostalih poročevalskih sevov V. harveyi. • Signalne molekule AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni, je možno zaznati in kvantificirati z direktno metodo, HPLC-FLD. • Koncentracijo signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni, je možno natančno in točno kvantificirati z uporabo poročevalskega seva V. harveyi MM30 in pri tem doseči 100-krat večjo občutljivost v primerjavi z metodo HPLC-FLD. • Naraščanje koncentracije signalnih molekul AI-2 je linearno z naraščanjem koncentracije celic bakterij C. jejuni in odvisno od vrste gojišča, zaradi česar sklepamo, da je signalna molekula AI-2 pri bakterijah C. jejuni stranski produkt centralnega metabolizma, v katerega je vključen gen luxS. • Bakterije C. jejuni proizvajajo največ biomase na interfazi trdna površina/tekočina. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 77 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 • Rastlinski pripravki sivke vrst L. angustifolia ter izbrane čiste spojine v subinhibitornih koncentracijah zmanjšujejo gibljivost bakterij C. jejuni na poltrdnem gojišču. • Rastlinski pripravki sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia ter izbrane čiste spojine v subinhibitornih koncentracijah zmanjšujejo pritrjevanje in filmotvornost bakterij C. jejuni na abiotske površine. • Rastlinski pripravki sivke vrste L. angustifolia uspešno odstranjujejo zrel biofilm bakterij C. jejuni z abiotske površine. • Rastlinski pripravki sivke vrste L. angustifolia in L. x intermedia ter izbrane čiste spojine v subinhibitornih koncentracijah zmanjšujejo bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 na signalno molekulo AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni. • Rastlinski pripravki sivke vrste L. angustifolia ter izbrane čiste spojine (linalol in linalil acetat) v subinhibitornih koncentracijah ne zmanjšujejo koncentracije signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni. • Eterično olje sivke vrste L. angustifolia, linalol in linalil acetat v subinhibitornih koncentracijah ne vplivajo na izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni. • Rastlinski pripravki sivke vrst L. angustifolia in L. x intermedia (eterična olja ter etanolni izvlečki iz cvetov in odpadnega materiala) imajo močnejši učinek na zmanjšanje bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z rastlinskimi pripravki sivke, gibljivost, pritrjevanje in filmotvornost bakterij C. jejuni v primerjavi s čistimi spojinami. • Obstaja pozitivna in zmerna korelacija med zmanjšanjem bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z rastlinskimi pripravki sivke ter zmanjšanjem pritrjevanja na abiotske površine po tretiranju z rastlinskimi pripravki sivke vrste L. angustifolia in L. x intermedia. • Obstaja pozitivna in zmerna korelacija med zmanjšanjem pritrjevanja in zmanjšanjem filmotvornosti bakterij C. jejuni na abiotske površine po tretiranju z rastlinskimi pripravki sivke vrste L. x intermedia. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 78 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 POVZETEK (SUMMARY) 4.1 POVZETEK Bakterije C. jejuni so vodeče povzročiteljice črevesnih okužb ljudi v EU že od leta 2005. Izrazito so razširjene v celotni živilski verigi zaradi svojih filmotvornih lastnosti, v kar štejemo tudi gibljivost, pritrjevanje in medcelično komunikacijo. Biofilmi omogočajo kampilobaktrom navzkrižno kontaminacijo različnih abiotskih površin in prehranskih izdelkov, kar povečuje tveganje za okužbo. Čeprav obstajajo različni načini obvladovanja bakterijskih biofilmov v živilski verigi, noben ni popolnoma zanesljiv in učinkovit. Zato je nujno potrebno poiskati nove načine obvladovanja bakterijskih biofilmov v živilski verigi, ki so lahko kurativni in preventivni. S kurativnimi načini odstranjujemo že obstoječe biofilme, medtem ko s preventivnimi načini preprečujemo filmotvornost. Poleg tega je potrebno poiskati alternativne pripravke, ki bi lahko pomagali v boju proti biofilmom, ki so vir patogenih in rezistentnih sevov. V tej doktorski nalogi smo testirali različne pripravke sivk vrst L. angustifolia in L. x intermedia za obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni na fiziološki in molekularni ravni. Iz cvetov sivk vrst L. angustifolia in L. x intermedia smo pripravili eterična olja in etanolne izvlečke. Iz odpadnega materiala, ki preostane po destilaciji eteričnega olja sivke, smo tudi pripravili etanolne izvlečke. Za vse pripravke smo naredili kemijsko karakterizacijo z GC-MS in LC-MS, katera nam je dala vpogled v kemijski profil pripravljenega materiala. Glede na kemijski profil eteričnih olj in etanolnih izvlečkov smo izbrali glavne čiste spojine (linalol, linalil acetat, kamfor, borneol, 1,8-cineol, p-kumarna kislina, trans-ferulna kislina), ki smo jih naprej uporabili v bioloških poskusih. Z obvladovanjem biofilma bakterij C. jejuni smo se spoprijeli na dva načina in sicer preko odstranjevanja zrelega biofilma in preko preprečevanja filmotvornosti. Za preprečevanje filmotvornosti smo uporabili tarče, ki so za filmotvornost bakterij C. jejuni izrednega pomena, in to so gibljivost, pritrjevanje in medcelična komunikacija. Glavni cilj te naloge je bil pokazati, če je mogoče biofilm bakterij C. jejuni obvladovati z zaviranjem medcelične komunikacije. Najprej smo optimizirali metodo gojenja in preučevanja biofilmov bakterij C. jejuni na abiotski površini. Biofilme bakterij C. jejuni smo preučevali na interfazi trdna površina/tekočina, kjer imajo kampilobaktri optimalne pogoje za svojo rast in razvoj (optimalna koncentracija O2). Za preučevanje smo uporabili konfokalno vrstično lasersko mikroskopijo, ki nam je omogočila vpogled v prostorsko strukturo biofilma, kot tudi ovrednotenje živosti celic ob uporabi metode barvanja živo/mrtvo (angl. LIVE/DEAD). Zrele biofilme bakterij C. jejuni smo odstranjevali z rastlinskimi pripravki sivke vrste L. angustifolia (eterično olje, etanolni izvleček iz cvetov in etanolni izvleček iz odpadnega materiala) ter ugotovili, da vsi pripravki odstranjujejo zrel biofilm bakterij C. jejuni. Med testiranimi pripravki je najboljši učinek na odstranjevanje zrelega biofilma bakterij C. jejuni Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 79 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 imelo eterično olje sivke vrste L. angustifolia, kar je lahko posledica vsebnosti številnih sekundarnih metabolitov. Za preprečevanje filmotvornosti bakterij C. jejuni smo uporabili različne pripravke sivk vrst L. angustifolia in L. x intermedia v subinhibitornih koncentracijah. Glavne tarče za preprečevanje filmotvornosti so bile gibljivost, pritrjevanje in medcelična komunikacija bakterij C. jejuni. Da bi preverili vpliv na medcelično komunikacijo, smo določili koncentracijo signalnih molekul v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni ter izražanje gena luxS pri bakterijah C. jejuni po tretiranju z rastlinskimi pripravki sivke. Za preučevanje medcelične komunikacije bakterij C. jejuni smo najprej morali razviti, optimizirati in nadgraditi metodo preučevanja. Najprej smo vpeljali metodo HPLC-FLD, s katero smo lahko izmerili koncetracijo signalnih molekul AI-2, ki jih proizvajajo bakterije C. jejuni. Za namen preučevanja izredno nizkih koncentracij signalnih molekul AI-2 smo v nadaljevanju razvili biosenzorsko metodo. Testirali smo različne poročevalske seve V. harveyi, med katerimi se je V. harveyi MM30 pokazal kot najbolj občutljiv sev za preučevanje medcelične komunikacije bakterij C. jejuni. Z matematičnem modeliranjem nam je uspelo tudi določiti koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenem gojišču bakterij C. jejuni ob uporabi novo razvite biosenzorske metode. Pridobljene rezultate smo potrdili z direktno, analitsko metodo HPLC-FLD in ugotovili, da je novo razvita biosenzorska metoda dovolj natančna in 100-krat bolj občutljiva v primerjavi z direktno, analitsko metodo HPLC-FLD. Pripravki sivk vrst L. angustifolia in L. x intermedia so se pokazali kot bolj učinkoviti pri zmanjševanju gibljivosti, pritrjevanja in filmotvornosti na abiotske površine v primerjavi s čistimi spojinami, ki jih v teh pripravkih najdemo. To je lahko posledica sinergističnega učinka čistih spojih v pripravkih sivke. Zanimivo je, da med testiranimi pripravki sivke (eterična olja, etanolni izvlečki iz cvetov in etanolni izvlečki iz odpadnega materiala) ni bilo bistvene razlike med učinkom na gibljivost, pritrjevanje in filmotvornost bakterij C. jejuni na abiotske površine, kar kaže na uporabnost odpadnega materiala. Bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene z dodatkom pripravkov sivk, je bil prav tako manjši v primerjavi z bioluminiscenčnim odzivom na izrabljeno gojišče bakterij C. jejuni, ki so bile gojene s čistimi spojinami. Ta rezultat spet nakazuje na sinergističen učinek čistih spojin v pripravkih sivke. Med koncentracijo signalnih molekul AI-2 v izrabljenih gojiščih bakterij C. jejuni, ki so bile gojene brez ali s pripravki sivke (eterično olje in etanola izvlečka) in čistimi spojinami (linaol in linalil acetat) nismo zaznali statistično značilne razlike. Prav tako eterično olje sivke, linalol in linalil acetat niso pokazali učinka na izražanje gena luxS, ki je odgovoren za sintezo signalnih molekul AI-2. Dodatno smo ugotovili, da je signalna molekula AI-2 verjetno pri bakterijah C. jejuni prej stranski produkt centralnega metabolizma, kot signalna molekula AI-2, ki je del mehanizma zaznavanja kvoruma. Koncentracija AI-2 pri bakterijah C. jejuni se linearno povečuje s povečanjem koncentracije celic, medtem ko pri zaznavanju kvoruma pride do t.i. »odziva Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 80 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 stikala«. Prav tako je bila koncetracija signalnih molekul AI-2 odvisna od sestave gojišča, čeprav je bila koncetracija celic enaka. Narejena transkriptomska analiza nam je omogočila vpogled v celoten prepis genov, ki se v trenutku tretiranja z eteričnim oljem sivke pri bakteriji C. jejuni izražajo in nam je podala nove tarče, ki se lahko uporabljajo v boju proti filmotvornosti bakterij C. jejuni. Te vključujejo gene, pomembne za mehanizem gibljivosti in filmotvornosti, sistem vnosa železa in stresni odziv bakterij C. jejuni. Signalna molekula AI-2 je medvrstna komunikacijska signalna molekula ter obstaja velika možnost, da bakterije C. jejuni s svojimi signalnimi molekulami AI-2 spodbujajo filmotvornost drugih bakterij, kar sproži proizvodnjo zunajceličnega matriksa in s tem zaščito kampilobaktra, kar mu omogoča preživetje v živilski verigi. Pripravki sivke ne zmanjšujejo koncentracije signalnih molekul AI-2 in ne zmanšujejo izražanja gena luxS, ampak vplivajo na bioluminiscenčni odziv poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, ki so bile gojene s pripravki sivke. To nakazuje na to, da pripravki sivke vplivajo na medvrstno komunikacijo. Določili smo zmerno in pozitivno korelacijo med zmanjšanjem bioluminiscenčnega odziva poročevalskega seva V. harveyi MM30 po dodatku izrabljenega gojišča bakterij C. jejuni, ki so bile gojene s pripravki sivke in zmanjšanjem pritrjevanja bakterij C. jejuni na abiotske površine. Določili smo tudi zmerno in pozitivno korelacijo med zmanjšanjem pritrjevanja bakterij C. jejuni na abiotske površine in zmanjšanjem nadaljnje filmotvornosti teh bakterij. Zmanjšanje medvrstne komunikacije med bakterijami v kombinaciji z dodatnimi tarčami, kot so npr. geni, vključeni v gibljivost in filmotvornost, sistem vnosa železa ali stresni odziv, predstavljajo zanimive tarče za obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni v celotni živilski verigi. 4.2 SUMMARY Campylobacter jejuni has been the leading cause of human gastrointestinal infections in the EU since 2005. These bacteria are widespread throughout the food production chain due to their biofilm forming properties, which also include motility, attachment and intercellular communication. Biofilms allow Campylobacter to cross-contaminate various abiotic surfaces and food products, increasing the risk of infection. Although there are various methods of controlling bacterial biofilms in the food production chain, none of them are completely reliable and effective. Therefore, it is urgently necessary to find new ways of controlling bacterial biofilms in the food prodution chain, which can be both curative and preventive. Curative methods remove already existing biofilms, while preventive methods prevent biofilm formation. In addition, it is necessary to find alternative preparations that could help in the fight against biofilms, which are the source of pathogenic and resistant strains. In this doctoral thesis, we tested different preparations of lavender species, L. angustifolia and L. x intermedia, for controlling the biofilm of C. jejuni at the physiological and molecular Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 81 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 level. Essential oils and ethanol extracts were prepared from lavender flowers of L. angustifolia and L. x intermedia species. Ethanol extracts were also prepared from the waste material remaining after the distillation of lavender essential oil. For all preparations, we performed chemical characterization with GC-MS and LC-MS, which gave us an insight into the chemical profile of the prepared material. Based on the chemical profile of the essential oils and ethanol extracts, we selected the main pure compounds (linalool, linalyl acetate, camphor, borneol, 1,8-cineole, p-coumaric acid, trans-ferulic acid), which we further used in biological experiments. Controlling the biofilm of C. jejuni was tackled in two ways, namely by removing the mature biofilm and by preventing biofilm formation. To prevent biofilm formation, we used targets that are extremely important for the biofilm formation of C. jejuni, namely motility, attachment and intercellular communication. The main goal of this work was to show if the biofilm of C. jejuni can be controlled by inhibiting intercellular communication. First, we optimized the method of culturing and studying biofilms of C. jejuni on an abiotic surface. Biofilms of C. jejuni were studied at the solid/liquid interface, where Campylobacter have optimal conditions for their growth and development (optimal O2 concentration). For the study, we used confocal laser scanning microscopy, which enabled us to gain an insight into the spatial structure of the biofilm as well as to evaluate the vitality of the cells using the LIVE/DEAD staining method. Mature biofilms of C. jejuni were removed with plant preparations of lavender species L. angustifolia (essential oil, ethanol extract from flowers and ethanol extract from waste material), and we found that all preparations remove mature biofilm of C. jejuni. Among the tested preparations, the essential oil of lavender had the best effect on removing the mature biofilm of C. jejuni, which may be due to the content of many secondary metabolites. To prevent biofilm formation of C. jejuni, we used different preparations of lavender species L. angustifolia and L. x intermedia in subinhibitory concentrations. The main targets for preventing biofilm formation were motility, attachment and intercellular communication of C. jejuni. In order to check the influence on intercellular communication, we determined the concentration of AI-2 signalling molecules in the spent medium of C. jejuni and the expression of the luxS gene in C. jejuni after the treatment with lavender preparations. To study the intercellular communication of C. jejuni, we first had to develop, optimize and upgrade the study method. First, we introduced the HPLC-FLD method with which we could measure the concentration of AI-2 signaling molecules of C. jejuni. In the following, we developed a biosensor method for the purpose of studying extremely low concentrations of AI-2 signalling molecules. We tested different V. harveyi reporter strains, among which V. harveyi MM30 proved to be the most sensitive strain for studying the intercellular communication of C. jejuni. Using mathematical modeling for biosensor method, we also managed to determine the concentration of AI-2 signalling molecules in the spent medium of C. jejuni. The obtained results were confirmed by the direct, analytical method, HPLC- Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 82 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 FLD, and we found that our developed biosensor method is sufficiently accurate and 100 times more sensitive compared to the direct, analytical method, HPLC-FLD. Preparations of lavender species L. angustifolia and L. x intermedia have shown to be more effective in reducing motility, attachment and biofilm formation on abiotic surfaces compared to the pure compounds found in these preparations. This may be due to the synergistic effect of the pure compounds in the lavender preparations. It is interesting that among the tested preparations of lavender (essential oils, ethanol extracts from flowers and ethanol extracts from waste material) there was no significant difference between the effect on the motility, attachment and biofilm formation of C. jejuni on abiotic surfaces, which confirms the good effect of the waste material as well. The bioluminescence response of the reporter strain V. harveyi MM30 to the spent medium of C. jejuni cultured with the addition of lavender preparations was also lower compared to the bioluminescence response to the spent medium of C. jejuni cultured with pure compounds. This result again suggests a synergistic effect of pure compounds in lavender preparations. We did not detect any statistically significant difference between the concentration of AI-2 signal molecules in the spent media of C. jejuni, which were grown without or with lavender preparations (essential oil and ethanol extract) and pure compounds (linaol and linalyl acetate). Likewise, lavender essential oil, linalool and linalyl acetate did not show effect on the expression of the luxS gene, which is responsible for the synthesis of AI-2 signalling molecules. Additionally, we found that the AI-2 signalling molecule in C. jejuni is probably a by-product of central metabolism, and we cannot directly claim that the AI-2 signalling molecule is part of the quorum sensing mechanism, since the concentration of AI-2 increases linearly with increasing cell concentration, while in quorum sensing it increases like "switch response". Also, the concentration of AI-2 signalling molecules depended on the composition of the culture medium, although the concentration of the cells was the same. The transcriptomic analysis gave us the insight into the entire transcript of genes that are expressed at the time of treatment with lavender essential oil in C. jejuni and gave us new targets that can be used in the fight against the biofilm formation of C. jejuni. These include genes important for the mechanism of motility and biofilm formation, the iron uptake system and the stress response of C. jejuni. The AI-2 signalling molecule is an interspecies communication signalling molecule, and there is a great possibility that AI-2 signalling molecules produced by C. jejuni stimulate the biofilm formation of other bacteria, which then produce an extracellular matrix and thereby protect Campylobacter and enable them to survive in the food chain. Lavender preparations do not reduce the concentration of AI-2 signalling molecules and do not decrease the expression of the luxS gene, but they affect the bioluminescence response of the reporter strain V. harveyi MM30 after the addition of the spent medium of C. jejuni that were grown with lavender preparations. This suggests that lavender preparations affect interspecies communication. We determined a moderate and positive correlation between the reduction Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 83 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 of the bioluminescence response of the reporter strain V. harveyi MM30 after the addition of the spent medium of C. jejuni grown with lavender preparations and the reduction of the attachment of C. jejuni to abiotic surface. We also determined a moderate and positive correlation between the reduction of the attachment of C. jejuni to abiotic surface and the reduction of further biofilm formation of these bacteria. Reduction of interspecies communication between bacteria in combination with additional targets such as genes involved in motility and biofilm formation, the iron uptake system or the stress response represent interesting targets for managing the biofilm of C. jejuni throughout the whole food chain. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 84 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 VIRI Abisado R. G., Benomar S., Klaus J. R., Dandekar A. A., Chandler J. R. 2018. Bacterial quorum sensing and microbial community interactions. mBio, 9, 3: e02331-17, doi:10.1128/MBIO.02331-17: 13 str. Adler L., Alter T., Sharbati S., Gölz G. 2015. The signalling molecule autoinducer-2 is not internalised in Campylobacter jejuni. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift, 128, 3-4: 111–116 Afonso A. C., Sousa M., Simões L. C., Simões M. 2022. Phytochemicals against drug-resistant bacterial biofilms and use of green extraction solvents to increase their bioactivity. Advances in Experimental Medicine and Biology, doi:10.1007/5584_2022_723: 18 str. (v tisku) Agunos A., Waddell L., Léger D., Taboada E. 2014. A systematic review characterizing on-farm sources of Campylobacter spp. for broiler chickens. PLOS ONE, 9, 8: e104905, doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0104905: 20 str. Alara O. R., Abdurahman N. H., Ukaegbu C. I. 2021. Extraction of phenolic compounds: A review. Current Research in Food Science, 4: 200–214 Ampomah-Wireko M., Luo C., Cao Y., Wang H., Nininahazwe L., Wu C. 2021. Chemical probe of AHL modulators on quorum sensing in Gram-negative bacteria and as antiproliferative agents: A review. European Journal of Medicinal Chemistry, 226: 113864, doi:10.1016/J.EJMECH.2021.113864: 25 str. Angane M., Swift S., Huang K., Butts C. A., Quek S. Y. 2022. Essential oils and their major components: An updated review on antimicrobial activities, mechanism of action and their potential application in the food industry. Foods, 11, 3: 464, doi:10.3390/FOODS11030464: 26 str. Antunes L. C. M., Ferreira R. B. R. 2009. Intercellular communication in bacteria. Critical Reviews in Microbiology, 35, 2: 69–80 Aseev L. V., Koledinskaya L. S., Boni I. V. 2016. Regulation of ribosomal protein operons rplM-rpsI, rpmB-rpmG, and rplU-rpmA at the transcriptional and translational levels. Journal of Bacteriology, 198, 18: 2494–2502 Azeredo J., Azevedo N. F., Briandet R., Cerca N., Coenye T., Costa A. R., Desvaux M., Di Bonaventura G., Hébraud M., Jaglic Z., Kačániová M., Knøchel S., Lourenço A., Mergulhão F., Meyer R. L., Nychas G., Simões M., Tresse O., Sternberg C. 2016. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology, 43, 3: 313–351 Bassler B. L., Greenberg E. P., Stevens A. M. 1997. Cross-species induction of luminescence in the quorum-sensing bacterium Vibrio harveyi. Journal of Bacteriology, 179, 12: 4043–4045 Bezek K., Kurinčič M., Knauder E., Klančnik A., Raspor P., Bucar F., Smole Možina S. 2016. Attenuation of adhesion, biofilm formation and quorum sensing of Campylobacter jejuni by Euodia ruticarpa. Phytotherapy Research, 30, 9: 1527–1532 Borges A., Meireles A., Mergulhão F., Melo L., Simões M. 2020. Biofilm control with Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 85 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 enzymes. V: Recent trends in biofilm science and technology. Simoes M., Borges A., Chaves Simoes L. (ur.). Amsterdam, Academic Press: 249–271 Boyer M., Wisniewski-Dyé F. 2009. Cell–cell signalling in bacteria: not simply a matter of quorum. FEMS Microbiology Ecology, 70, 1: 1–19 Bridier A., Sanchez-Vizuete P., Guilbaud M., Piard J. C., Naïtali M., Briandet R. 2015. Biofilm-associated persistence of food-borne pathogens. Food Microbiology, 45: 167– 178 Camilli A., Bassler B. L. 2006. Bacterial small-molecule signaling pathways. Science, 311, 5764: 1113-1116 Carrascosa C., Raheem D., Ramos F., Saraiva A., Raposo A. 2021. Microbial biofilms in the food industry-A comprehensive review. International Journal of Environmental Research and Public Health, 18, 4: 2014, doi:10.3390/ijerph18042014: 31 str. Castillo S., Heredia N., Arechiga-Carvajal E., García S. 2014. Citrus extracts as inhibitors of quorum sensing, biofilm formation and motility of Campylobacter jejuni. Food Biotechnology, 28, 2: 106–122 Cawthraw S. A., Newell D. G. 2010. Investigation of the presence and protective effects of maternal antibodies against Campylobacter jejuni in chickens. Avian Diseases, 54, 1: 86–93 Chassagne F., Samarakoon T., Porras G., Lyles J. T., Dettweiler M., Marquez L., Salam A. M., Shabih S., Raschid Farrokhi D., Quave C. L., Echeverria J., Joy McGaw L., Urzua A. 2021. A systematic review of plants with antibacterial activities: A taxonomic and phylogenetic perspective. Frontiers in Pharmacology, 11: 586548, doi:10.3389/fphar.2020.586548: 29 str. Costa Vasconcelos Alves A. M., Salles de Brito E. H., Glauber Peixoto Ferreira F., Jales de Hollanda Celestino J. 2020. Methods for studying microbial biofilm. International Journal of Development Research, 10, 12: 43100-43104 Ćirić A. D., Petrović J. D., Glamočlija J. M., Smiljković M. S., Nikolić M. M., Stojković D. S., Soković M. D. 2019. Natural products as biofilm formation antagonists and regulators of quorum sensing functions: A comprehensive review update and future trends. South African Journal of Botany, 120: 65–80 Das K., Tiwari R. K. S., Shrivastava D. K. 2010. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agents: Current methods and future trends. Journal of Medicinal Plants Research, 4, 2: 104–111 Delle Side D., Giuffreda E., Tredici S. M., Talà A., Pennetta C., Alifano P. 2015. Quorum sensing: Complexity in the bacterial world. Chaos, Solitons and Fractals, 81: 551–555 Diggle S. P., Griffin A. S., Campbell G. S., West S. A. 2007. Cooperation and conflict in quorum-sensing bacterial populations. Nature , 450, 7168: 411–414 Dogsa I., Oslizlo A, Stefanic P., Mandic-Mulec I. 2014. Social interactions and biofilm formation in Bacillus subtilis. Food Technology and Biotechnology, 52, 2: 149-157 Dorman H. J. D., Deans S. G. 2000. Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88, 2: 308–316 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 86 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Drozd M., Chandrashekhar K., Rajashekara G. 2014. Polyphosphate-mediated modulation of Campylobacter jejuni biofilm growth and stability. Virulence, 5, 6: 680–690 Duarte A., Luís Â., Oleastro M., Domingues F. C. 2016. Antioxidant properties of coriander essential oil and linalool and their potential to control Campylobacter spp. Food Control, 61: 115–122 Eberhard A., Burlingame A. L., Eberhard C., Kenyon G. L., Nealson K. H., Oppenheimer N. J. 1981. Structural identification of autoinducer of Photobacterium fischeri luciferase. Biochemistry, 20, 9: 2444–2449 EFSA/ECDC. 2021. The European Union One Health 2020 Zoonoses Report. EFSA Journal, 19, 12: 6971, doi:10.2903/j.efsa.2021.6971: 324 str. El-Tarabily K. A., El-Saadony M. T., Alagawany M., Arif M., Batiha G. E., Khafaga A. F., Elwan H. A. M., Elnesr S. S., Abd El-Hack M. 2021. Using essential oils to overcome bacterial biofilm formation and their antimicrobial resistance. Saudi Journal of Biological Sciences, 28, 9: 5145–5156 Elvers K.T., Park S.F. 2002. Quorum sensing in Campylobacter jejuni: detection of a luxS encoded signalling molecule. Microbiology, 148, 5: 1475–1481 Erega A., Stefanic P., Dogsa I., Danevčič T., Simunovic K., Klančnik A., Možina S. S., Mandic-Mulec I.. 2021. Bacillaene mediates the inhibitory effect of Bacillus subtilis on Campylobacter jejuni biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 87, 12: e02955-20, doi:10.1128/AEM.02955-20: 14 str. Facciolà A., Riso R., Avventuroso E., Visalli G., Delia S. A., Laganà P. 2017. Campylobacter: from microbiology to prevention. Journal of Preventive Medicine and Hygiene, 58: 79–92 Federle M. J. 2009. Autoinducer-2-based chemical communication in bacteria: complexities of interspecies signaling. Contributions to Microbiology, 16: 18–32 Feng J., Ma L., Nie J., Konkel M. E., Lu X. 2018. Environmental stress-induced bacterial lysis and extracellular DNA release contribute to Campylobacter jejuni biofilm formation. Applied and Environmental Microbiology, 84, 5: e02068-17, doi:10.1128/AEM.02068-17: 18 str. Ferriol-González C., Domingo-Calap P. 2020. Phages for biofilm removal. Antibiotics, 9, 5: 268, doi:10.3390/ANTIBIOTICS9050268: 16 str. Flemming H.-C., Wingender J., Szewzyk U., Steinberg P., Rice S. A., Kjelleberg S. 2016. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature Reviews Microbiology, 14: 563– 575 Flemming H.-C., Wuertz S. 2019. Bacteria and archaea on Earth and their abundance in biofilm. Nature Reviews Microbiology, 17: 247–260 Franklin M. J., Chang C., Akiyama T., Bothner B. 2015. New technologies for studying biofilms. Microbiology Spectrum, 3, 4: MB-0016-2014, doi:10.1128/microbiolspec.MB-0016-2014: 23 str. Galié S., García-Gutiérrez C., Miguélez E. M., Villar C. J., Lombó F. 2018. Biofilms in the food industry: Health aspects and control methods. Frontiers in Microbiology, 9: 898, Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 87 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 doi:10.3389/fmicb.2018.00898: 18 str. Gill C., Bahrndorff S., Lowenberger C. 2017. Campylobacter jejuni in Musca domestica: An examination of survival and transmission potential in light of the innate immune responses of the house flies. Insect Science, 24, 4: 584–598 Gölz G., Kittler S., Malakauskas M., Alter T. 2018. Survival of Campylobacter in the food chain and the environment. Current Clinical Microbiology Reports, 5, 2: 126–134 Guerry P. 2007. Campylobacter flagella: not just for motility. Trends in Microbiology, 15, 10: 456–461 Guglielmi P., Pontecorvi V., Rotondi G. 2020. Natural compounds and extracts as novel antimicrobial agents. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 30, 12: 949–962 Gutman J., Walker S. L., Freger V., Herzberg M. 2013. Bacterial attachment and viscoelasticity: Physicochemical and motility effects analyzed using quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D). Environmental Science and Technology, 47, 1: 398–404 Hanzelka B. L., Greenberg E. P. 1996. Quorum sensing in Vibrio fischeri: evidence that S-adenosylmethionine is the amino acid substrate for autoinducer synthesis. Journal of Bacteriology, 178, 17: 5291–5294 Hassan M. M., Lawan I. A., Fan X., Guo Y., Yu Y., Jin X., Qiu J., Guan X., Tianpei H. 2020. Beyond risk: Bacterial biofilms and their regulating approaches. Froniters in Microbiology, 11: 928, doi:10.3389/fmicb.2020.00928: 20 str. Hense B. A., Schuster M. 2015. Core principles of bacterial autoinducer systems. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 79, 1: 153–169 Holmes K., Tavender T. J., Winzer K., Wells J. M., Hardie K. R. 2009. AI-2 does not function as a quorum sensing molecule in Campylobacter jejuni during exponential growth in vitro. BMC Microbiology, 9: 214, doi: 10.1186/1471-2180-9-214: 11 str. Hympanova M., Terlep S., Markova A., Prchal L., Dogsa I., Pulkrabkova L., Benkova M., Marek J., Stopar D. 2020. The antibacterial effects of new N-alkylpyridinium salts on planktonic and biofilm bacteria. Frontiers in Microbiology, 11: 573951, doi:10.3389/FMICB.2020.573951: 12 str. Igwaran A., Okoh A. I. 2019. Human campylobacteriosis: A public health concern of global importance. Heliyon, 5, 11: e02814, doi:10.1016/J.HELIYON.2019.E02814: 14 str. Indikova I., Humphrey T. J., Hilbert F. 2015. Survival with a helping hand: Campylobacter and microbiota. Frontiers in Microbiology, 6: 1266, doi: 10.3389/FMICB.2015.01266: 6 str. Freeman J.A., Bassler B. L. 1999. A genetic analysis of the function of LuxO, a two-component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi. Molecular Microbiology, 31, 2: 665–677 Jamwal K., Bhattacharya S., Puri S. 2018. Plant growth regulator mediated consequences of secondary metabolites in medicinal plants. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants, 9: 26–38 Jeon B., Itoh K., Misawa N., Ryu S. 2003. Effects of quorum sensing on flaA transcription Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 88 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 and autoagglutination in Campylobacter jejuni. Microbiology and Immunology, 47, 11: 833–839 Kalia V. C. 2013. Quorum sensing inhibitors: An overview. Biotechnology Advances, 31, 2: 224–245 Kassem I. I., Chandrashekhar K., Rajashekara G. 2013. Of energy and survival incognito: A relationship between viable but non-culturable cells formation and inorganic polyphosphate and formate metabolism in Campylobacter jejuni. Frontiers in Microbiology, 4: 183, doi:10.3389/FMICB.2013.00183: 8 str. Khameneh B., Iranshahy M., Soheili V., Fazly Bazzaz B. S. 2019. Review on plant antimicrobials: a mechanistic viewpoint. Antimicrobial Resistance and Infection Control, 8: 118, doi: 10.1186/s13756-019-0559-6: 28 str. Khan U. A., Rahman H., Niaz Z., Qasim M., Khan J., Tayyaba, Rehman B. 2013. Antibacterial activity of some medicinal plants against selectedhuman pathogenic bacteria. European Journal of Microbiology and Immunology, 3, 4: 272-274 Kikuchi T., Mizunoe Y., Takade A., Naito S., Yoshida S. I. 2005. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology, 49, 9: 875–884 Kim S. H., Chelliah R., Ramakrishnan S. R., Perumal A. S., Bang W. S., Rubab M., Daliri E. B. M., Barathikannan K., Elahi F., Park E., Jo H. Y., Hwang S. B., Oh D. H. 2021. Review on stress tolerance in Campylobacter jejuni. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 10: 596570, doi:10.3389/FCIMB.2020.596570: 17 str. Klančnik A., Šimunović K., Sterniša M., Ramić D., Smole Možina S., Bucar F. 2021. Anti-adhesion activity of phytochemicals to prevent Campylobacter jejuni biofilm formation on abiotic surfaces. Phytochemistry Reviews, 20, 1: 55–84 Kreling V., Falcone F. H., Kehrenberg C., Hensel A. 2020. Campylobacter sp.: Pathogenicity factors and prevention methods—new molecular targets for innovative antivirulence drugs? Applied Microbiology and Biotechnology, 104, 24: 10409–10436 Kreuder A. J., Ruddell B., Mou K., Hassall A., Zhang Q., Plummera P. J. 2020. Small noncoding RNA cjnc110 influences motility, autoagglutination, AI-2 localization, hydrogen peroxide sensitivity, and chicken colonization in Campylobacter jejuni. Infection and Immunity, 88, 7: e00245-20, doi:10.1128/IAI.00245-20: 26 str. Laganenka L., Sourjik V. 2018. Autoinducer 2 dependent Escherichia coli biofilm formation is enhanced in a dual-species coculture. Applied and Environmental Microbiology, 84, 5: e02638-17, doi:10.1128/AEM.02638-17: 15 str. Li Z., Nair S. K. 2012. Quorum sensing: How bacteria can coordinate activity and synchronize their response to external signals? Protein Science, 21, 10: 1403-1417 Lilley B. N., Bassler B. L. 2000. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and Sigma-54. Molecular Microbiology, 36, 4: 940–954 Lin J., Overbye Michel L., Zhang Q. 2002. CmeABC Functions as a multidrug efflux System in Campylobacter jejuni. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 46, 7: 2124-2131 Luo A., Wang F., Sun D., Liu X., Xin B. 2022. Formation, development, and cross-species Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 89 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 interactions in biofilms. Frontiers in Microbiology, 12: 757327, doi:10.3389/FMICB.2021.757327: 12 str. Machado I., Silva L. R., Giaouris E. D., G., Melo L. F, Simões M. 2020. Quorum sensing in food spoilage and natural-based strategies for its inhibition. Food Research International, 127: 108754, doi:10.1016/J.FOODRES.2019.108754: 12 str. Mavri A., Ribič U., Smole Možina S. 2016. The biocide and antibiotic resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. V: Emerging and traditional technologies for safe, healthy and quality food. Nedović V., Raspor P., Lević J., Tumbas Šaponjac V., Barbosa-Cánovas G. (ur.). Cham, Springer: 269–283 Mavri A., Smole Možina S. 2013. Development of antimicrobial resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli adapted to biocides. International Journal of Food Microbiology, 160, 3: 304–312 McNab R., Ford S. K., El-Sabaeny A., Barbieri B., Cook G. S., Lamont R. J. 2003. LuxS-based signaling in Streptococcus gordonii: Autoinducer 2 controls carbohydrate metabolism and biofilm formation with Porphyromonas gingivalis. Journal of Bacteriology, 185, 1: 274–284 Michie K. L., Cornforth D. M., Whiteley M. 2016. Bacterial tweets and podcasts #signaling#eavesdropping#microbialfightclub. Molecular and Biochemical Parasitology, 208, 1: 41–48 Miller C. E., Williams P. H., Ketley J. M. 2009. Pumping iron: Mechanisms for iron uptake by Campylobacter. Microbiology, 155, 10: 3157–3165 Mishra R., Kumari Panda A., De Mandal S., Shakeel M., Singh Bisht S., Khan J. 2020. Natural anti-biofilm agents: Strategies to control biofilm-forming pathogens. Frontiers in Microbiology, 11: 566325, doi:10.3389/fmicb.2020.566325: 23 str. Mou K. T., Plummer P. J. 2016. The impact of the LuxS mutation on phenotypic expression of factors critical for Campylobacter jejuni colonization. Veterinary Microbiology, 192: 43–51 Naito M., Frirdich E., Fields J. A., Pryjma M., Li J., Cameron A., Gilbert M., Thompson S. A., Gaynor E. C. 2010. Effects of sequential Campylobacter jejuni 81-176 lipooligosaccharide core truncations on biofilm formation, stress survival, and pathogenesis. Journal of Bacteriology, 192, 8: 2182–2192 Negi P. S. 2012. Plant extracts for the control of bacterial growth: Efficacy, stability and safety issues for food application. International Journal of Food Microbiology, 156, 1: 7–17 On S. L. W. 2001. Taxonomy of Campylobacter, Arcobacter, Helicobacter and related bacteria: Current status, future prospects and immediate concerns. Journal of Applied Microbiology, 90, 30: 1-14 Papenfort P., Bassler B.L. 2016. Quorum sensing signal-response systems in Gram-negative bacteria. Nature Reviews Microbiology, 14, 9: 576–588 Parkhill J., Wren B. W., Mungall K., Ketley J. M., Churcher C., Basham D., Chillingworth T., Davies R. M., Feltwell T., Holroyd S., Jagles K., Karlyshev A. V., Moule S., Pallen Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 90 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 M. J., Penn C. W., Quail M. A., Rajandream M. A., Rutherford K. M., van Vliet A. H., Whitehead S., Varrell B. G. 2000. The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature, 403, 6770: 665-668 Parte A. C., Sardà Carbasse J., Meier-Kolthoff J. P., Reimer L. C., Göker M. 2020. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 70: 5607–5612 Pereira C. S., Thompson J. A, Xavier K. B. 2013. AI-2-mediated signalling in bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 37, 2: 156–181 Pfaffl M. W. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT– PCR. Nucleic Acids Research, 29, 9: e45, doi:10.1093/NAR/29.9.E45: 6 str. Pisoschi A. M., Pop A., Georgescu C., Turcuş V., Olah N. K., Mathe E. 2018. An overview of natural antimicrobials role in food. European Journal of Medicinal Chemistry, 143: 922–935 Plummer P. J. 2012. LuxS and quorum-sensing in Campylobacter. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2: 22, doi:10.3389/FCIMB.2012.00022: 9 str. Plummer P., Sahin O., Burrough E., Sippy R., Mou K., Rabenold J., Yaeger M., Zhang Q. 2012. Critical role of LuxS in the virulence of Campylobacter jejuni in a guinea pig model of abortion. Infection and Immunity, 80, 2: 585, doi:10.1128/IAI.05766-11: 9 str. Powell L. F., Lawes J. R., Clifton-Hadley F. A., Rodgers J., Harris K., Evans S. J. 2012. The prevalence of Campylobacter spp. in broiler flocks and on broiler carcases, and the risks associated with highly contaminated carcases. Epidemiology and Infection, 140, 12: 2233–2246 Püning C., Su Y., Lu X., Gölz G. 2021. Molecular mechanisms of Campylobacter biofilm formation and quorum sensing. Current Topics in Microbiology and Immunology, 431: 293–319 Quiñones B., Miller W. G., Bates A. H., Mandrell R. E. 2009. Autoinducer-2 production in Campylobacter jejuni contributes to chicken colonization. Applied and Environmental Microbiology, 75, 1: 281–285 Ramić D., Dogša I., Smole Možina S. 2021. Obvladovanje biofilma bakterij Campylobacter jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. V: Mikrobiološke ideje na prepihu: zbornik prispevkov. Stopar D. (ur.). Ljubljana, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo: 63-74 Ramić D., Jug B., Šimunović K., Tušek Žnidarič M., Kunej U., Toplak N., Kovač M., Fournier M., Jamnik P., Smole Možina S., Klančnik A. 2022. The role of luxS in Campylobacter jejuni beyond intercellular signaling. Microbiology Spectrum (v recenziji) Rasmussen J. J., Vegge C. S., Frøkiær H., Howlett R. M., Krogfelt K. A., Kelly D. J., Ingmer H. 2013. Campylobacter jejuni carbon starvation protein A (CstA) is involved in peptide utilization, motility and agglutination, and has a role in stimulation of dendritic cells. Journal of Medical Microbiology, 62, 8: 1135–1143 Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 91 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Reeser R. J., Medler R. T., Billington S. J., Jost B. H., Joens L. A. 2007. Characterization of Campylobacter jejuni biofilms under defined growth conditions. Applied and Environmental Microbiology, 73, 6: 1908–1913 Relucenti M., Familiari G., Donfrancesco O., Taurino M., Li X., Chen R., Artini M., Papa R., Selan L. 2021. Microscopy methods for biofilm imaging: Focus on SEM and VP-SEM pros and cons. Biology, 10, 1: 51, doi:10.3390/biology10010051: 17 str. Rickard A. H., Campagna S. R., Kolenbrander P. E. 2008. Autoinducer-2 is produced in saliva-fed flow conditions relevant to natural oral biofilms. Journal of Applied Microbiology, 105, 6: 2096–2103 Roy R., Tiwari M., Donelli G., Tiwari V. 2018. Strategies for combating bacterial biofilms: A focus on anti-biofilm agents and their mechanisms of action. Virulence, 9, 1: 522– 554 Rozman V., Bogovič Matijašić B., Smole Možina S. 2018. Antimicrobial resistance of common zoonotic bacteria in the food chain: An emerging threat. V: Antimicrobial resistance - a global threat. Kumar Y. (ur.). London, IntechOpen, doi:10.5772/INTECHOPEN.80782: 20 str. Rukambile E., Sintchenko V., Muscatello G., Kock R., Alders R. 2019. Infection, colonization and shedding of Campylobacter and Salmonella in animals and their contribution to human disease: A review. Zoonoses and Public Health, 66, 6: 562–578 Rutherford S. T., Bassler B. L. 2012. Bacterial quorum sensing: Its role in virulence and possibilities for its control. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine, 2, 11: a012427, doi:10.1101/CSHPERSPECT.A012427: 25 str. Saleem M., Nazir M., Ali M. S., Hussain H., Lee Y. S., Riaz N., Jabbar A. 2009. Antimicrobial natural products: an update on future antibiotic drug candidates. Natural Products Report, 27: 238-254 Satpathy S., Sen S. K., Pattanaik S., Raut S. 2016. Review on bacterial biofilm: An universal cause of contamination. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 7: 56–66 Silva J., Leite D., Fernandes M., Mena C., Gibbs P. A., Teixeira P. 2011. Campylobacter spp. As a foodborne pathogen: A review. Frontiers in Microbiology, 2: 200, doi:10.3389/FMICB.2011.00200: 12 str. Stefanic P., Kraigher B., Lyons N. A., Kolter R., Mandic-Mulec I. 2015. Kin discrimination between sympatric Bacillus subtilis isolates. PNAS, 112, 45: 14042–14047 Steindler L., Venturi V. 2007. Detection of quorum-sensing N-acyl homoserine lactone signal molecules by bacterial biosensors. FEMS Microbiology Letters, 266, 1: 1–9 Surette M. G., Miller M. B., Bassler B. L. 1999. Quorum sensing in Escherichia coli, Salmonella typhimurium, and Vibrio harveyi: A new family of genes responsible for autoinducer production. PNAS, 96, 4: 1639–1644 Šikić Pogačar M., Klančnik A., Bucar F., Langerholc T., Smole Možina S. 2016. Anti-adhesion activity of thyme ( Thymus vulgaris L.) extract, thyme post-distillation waste, and olive ( Olea europea L.) leaf extract against Campylobacter jejuni on polystyrene and intestine epithelial cells. Journal of the Science of Food and Agriculture, 96, 8: Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 92 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2723–2730 Šimunović K., Ramić D., Xu C., Smole Možina S. 2020. Modulation of Campylobacter jejuni motility, adhesion to polystyrene surfaces, and invasion of int407 cells by quorum-sensing inhibition. Microorganisms, 8, 1: 104, doi:10.3390/microorganisms8010104: 14 str. Šimunović K., Stefanic P., Klančnik A., Erega A., Mandic Mulec I., Smole Možina S. 2022. Bacillus subtilis PS-216 antagonistic activities against Campylobacter jejuni NCTC 11168 are modulated by temperature, oxygen, and growth medium. Microorganisms, 10, 2: 289, doi:10.3390/MICROORGANISMS10020289: 14 str. Teh A. H. T., Lee S. M., Dykes G. A. 2019. Association of some Campylobacter jejuni with Pseudomonas aeruginosa biofilms increases attachment under conditions mimicking those in the environment. PLOS ONE, 14, 4: e0215275, doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0215275: 15 str. Teh K. H., Flint S., French N. 2010. Biofilm formation by Campylobacter jejuni in controlled mixed-microbial populations. International Journal of Food Microbiology, 143, 3: 118–124 Terlep S., Hympanova M., Dogsa I., Pajk F., Stopar D. 2022. Photoacoustic removal of Enterococcus faecalis biofilms from titanium surface with an Er:YAG laser using super short pulses. Lasers in Medical Science, 37, 1: 381–390 Teunis P. F. M., Falkenhorst G., Ang C. W., Strid M. A., De Valk H., Sadkowska-Todys M., Zota L., Kuusi M., Rota M. C., Simonsen J. B., Mølbak K., Van Duynhoven Y. T. H. P., Van Pelt W. 2013. Campylobacter seroconversion rates in selected countries in the European Union. Epidemiology and Infection, 141, 10: 2051–2057 Tram G., Day C. J., Korolik V. 2020. Bridging the gap: A role for Campylobacter jejuni biofilms. Microorganisms, 8, 3: 452, doi:10.3390/microorganisms8030452: 11 str. Turan N. B., Chormey D. S., Büyükpınar Ç., Engin G. O., Bakirdere S. 2017. Quorum sensing: Little talks for an effective bacterial coordination. Trends in Analytical Chemistry, 91: 1–11 Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. 2002. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology, 3, 7: research0034.1, doi:10.1186/GB-2002-3-7-RESEARCH0034: 12 str. Vaou N., Stavropoulou E., Voidarou C., Tsigalou C., Bezirtzoglou E. 2021. Towards advances in medicinal plant antimicrobial activity: A review study on challenges and future perspectives. Microorganisms, 9, 10: 2041, doi:0.3390/microorganisms9102041: 28 str. Wagle B. R., Upadhyay A., Upadhyaya I., Shrestha S., Arsi K., Liyanage R., Venkitanarayanan K., Donoghue D. J., Donoghue A. M. 2019. Trans-cinnamaldehyde, eugenol and carvacrol reduce Campylobacter jejuni biofilms and modulate expression of select genes and proteins. Frontiers in Microbiology, 10: 1837, doi:10.3389/fmicb.2019.01837: 16 str. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakterij C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. 93 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Waters C. M., Bassler B. L. 2006. The Vibrio harveyi quorum-sensing system uses shared regulatory components to discriminate between multiple autoinducers. Genes and Development, 20: 2754-2767 Whiteley M., Diggle S. P., Greenberg E. P. 2017. Bacterial quorum sensing: the progress and promise of an emerging research area. Nature, 551: 313–320 Xavier J. B., Kim W., Foster, K. R. 2011. A molecular mechanism that stabilizes cooperative secretions in Pseudomonas aeruginosa. Molecular Microbiology, 79, 1: 166–179 Xie F., Xiao P., Chen D., Xu L., Zhang B. 2012. miRDeepFinder: A miRNA analysis tool for deep sequencing of plant small RNAs. Plant Molecular Biology, 80, 1: 75–84 Zhao J, Quan C., Jin L, Chen M. 2018. Production, detection and application perspectives of quorum sensing autoinducer-2 in bacteria. Journal of Biotechnology, 268: 53–60 Zhong X., Wu Q., Zhang J., Ma Z., Wang J., Nie X., Ding Y., Xue L., Chen M., Wu S., Wei X., Zhang Y. 2020. Campylobacter jejuni biofilm formation under aerobic conditions and inhibition by ZnO nanoparticles. Frontiers in Microbiology, 11: 207, doi:10.3389/FMICB.2020.00207: 6 str. Ramić D. Obvladovanje biofilma bakt. C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Veliko hvala moji menotrici, prof. dr. Sonji Smole Možina, brez katere moje doktorsko potovanje ne bi bilo omogočeno. Hvala za podporo, zaupanje in razumevanje. Najlepša hvala tudi mojem somentorju, doc. dr. Iztoku Dogši, ki je s svojimi nasveti, pozitivo in rešitvami olajšal in izboljšal moje doktorsko potovanje. Hvala vsem članom komisije za izredno hitre odzive, konstruktivne pripombe in profesionalno delo. Posebno hvala prof. dr. Ines Mandić Mulec za vso pomoč tekom celotnega študija. Ogromne zahvale grejo vsem mojim prijateljem in kolegom s Katedre BMV, ki so polepšali in olajšali ves čas, ki smo ga preživeli skupaj. Še posebej se zahvaljujem izr. prof. dr. Anji Klančnik, s katero sva nadgradile delo na mojem doktoratu, kot tudi delo skupine ŽM. Največja zahvala gre moji družini, še posebej mojemu Blažu, brez katerih ne bi bila kjer sem… Ramić D. Obvladovanje biofilma bakt. C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGE Priloga A: Dovoljenje založnika revije »Applied and Environmnetal Microbiology« za objavo članka z naslovom »Antibiofilm potential of Lavandula preparations against Campylobacter jejuni« Ramić D. Obvladovanje biofilma bakt. C. jejuni z zaviranjem medcelične komunikacije. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Priloga B: Pokritost steklene površine (po globini) z biofilmom bakterij C. jejuni NCTC 11168 (Ramić in sod., 2021)