Strokovni œlanki - Professional Articles
Patofiziologija staranja
Pathophysiology of aging
Zoran Grubiœ
POVZETEK Staranje je opredeljeno kot proces, v katerem postopno izgubljanje fizioloøkih funkcij v organizmu vodi v smrt. V tem prispevku najprej razpravljamo o tem, zakaj ima æivljensko obdobje starosti majhen pomen s staliøœa selekcije genov v procesu evolucije in kaj to pomeni za starajoœega posameznika. Sledi kratek pregled molekularnih in celiœnih mehanizmov, ki so po danaønjem prepriœanju najverjetneje vpleteni v proces staranja in kjer osrednjo vlogo pripisujejo ravnoteæju med økodljivimi mehanizmi, ki jih sproæijo reaktivne kisikove spojine (ROS) in obrambi pred njimi. Veœino teh mehanizmov so preuœevali na preprostih æivalskih modelih, zato v zadnjem delu razpravljamo øe o øtudijah, ki so bolj povezane s staranjem pri ljudeh. Opiøemo Wernerjev sindrom, kot primer pospeøenega staranja in razpravljamo o pomenu telomeraz kot dejavniku, ki omejuje øtevilo celiœnih delitev. Na koncu omenimo moænosti vplivanja na procese staranja in opozorimo na etiœne, socialne in ekonomske probleme, ki bi jih taki posegi lahko sproæili.
Kljuœne besede: staranje, evolucija, reaktivne kisikove spojine, Wernerjev sindrom, telomeraze
ABSTRACT Aging is defined as the progressive loss of physiological functions that culminates in death. We start our short review on this subject by explaining poor influence of aging on the evolutionary process of gene selection. We also discuss how the lack of this selection reflects at the level of aging individuals. We continue with molecular and cellular mechanisms which, to our present understanding, underlie the aging process. The balance between damaging effects of reactive oxygen species (ROS) and defense against them has been proposed as a major determinant of this process. Most of these mechanisms were investigated on the simple animal models, therefore we focus our last part of discussion on the studies related to the aging of humans. We describe Werner’s syndrome as an example of accelerated aging and discuss the role of telomerases in »counting« of cell divisions. At the end we mention future prospects on how the rate of aging can be modified and also the ethical, social and economical consequences that such interventions might have.
Key words: aging, evolution, reactive oxygen species, Werner’s syndrome, telomerases
1  Uvod
Ko se lotevamo procesov, ki jih pojmujemo kot staranje, se ne moremo izogniti vpraøanju, zakaj so æivi organizmi prav taki kot so in ne drugaœni. Øe posebej nas pri tem zanima, zakaj so æivljenske dobe teh organizmov tako dolge kot so in kaj te dolæine doloœa. Dokonœnega odgovora na to vpraøanje za zdaj øe ni, øtevilne raziskave pa so ob pomoœi modernih tehnik in poskusnih modelov, ki so jim bile na voljo v zadnjem œasu, pomembno osvetlile to podroœje. Œe smo øe pred nekaj desetletji imeli kar okrog 300 »teorij«, ki naj bi pojasnile proces staranja (1), bi danes lahko ugotovili, da celovite podobe o procesih staranja æivih organizmov sicer øe ni, da pa se pred nami æe kaæejo njeni grobi obrisi. Od bodoœih raziskav torej ne priœakujemo novih »teorij«, ampak prej zapolnitev praznih lis na tej podobi. Namen tega œlanka je podati kratek pregled trenutnega znanja o patofizioloøkih procesih staranja. Podrobneje je ta tematika obdelana v øtevilnih preglednih œlankih, ki so bili v zadnjem letu in pol objavljeni v uglednih mednarodnih revijah (2, 3, 4, 5, 6).
2  Staranje in evolucija
2.1 Staranje v luœi evolucijske fiziologije
Pri iskanju odgovorov na vpraøanja zakaj je œloveøki organizem tak kot je in kaj doloœa njegovo æivljensko dobo, ne moremo mimo teorije evolucije. Vse teorije staranja, ki so bile predlagane v preteklih letih, se opirajo na to teorijo in iøœejo v njej svojo potrditev.
Po evolucijski teoriji sta zgradba in delovanje doloœenega organizma rezultat njegovega prilagajanja na okolje skozi vsa obdobja njegovega razvoja, pri œemer se, v evolucijskem smislu, pojem prilagoditev nanaøa na vrsto (species) in ne na njene posameznike. Vrsta je prilagojena na okolje, œe uspe ohraniti dovolj visoko rodnost, da se njeni posamezniki vseskozi, od generacije do generacije, razmnoæijo v øtevilu, ki je dovolj veliko za nadaljni razplod.
Kot najpomembnejøe vodilo, ki doloœa æivljensko dobo posameznih vrst, se je v evolucijski fiziologiji uveljavilo naœelo ærtvovanja (angl. »trade off«) ene prednosti na raœun druge (2, 6). To naœelo izhaja iz dveh ugotovitev: 1) v naravnem okolju stresne razmere pomorijo veœi-no posameznikov neke æivalske vrste øe preden ti doseæejo obdobje starosti in 2) energijski viri, ki so v naravnem okolju na razpolago posameznim organizmom, so omejeni, to pa pomeni, da je v razvoju vsake posamezne vrste moralo priti do kompromisne odloœitve, kolikøen del razpoloæljive energije vloæiti v rast organizma, kolikøen del v obrambne mehanizme in veœjo zmoænost popravljanja økode, ki jo povzroœajo zunanji dejavniki, spet kolikøen del v shranjevanje energijskih zalog in kolikøen del v reprodukcijo. Ker vsaka od naøtetih usmeritev zahteva razvoj energetsko zelo zahtevnih celiœnih in molekularnih mehanizmov, ni mogoœe maksimalno uresniœiti vseh. Po darwinistiœnem naœelu naravne selekcije je bilo za preæivetje vrste bistveno, da je pri tej izbiri naøla optimalno reøitev za svoj razplod. Kot primer lahko opiøemo dobro raziskan primer miøi. Za to vrsto je znano, da v naravnem okolju æe v prvem letu æivljenja 90% populacije
Prof. dr. Zoran Grubiœ, dr. med., univ. dipl. kem., Inøtitut za patofiziologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani
farm vestn 2005; 56 59
Strokovni œlanki - Professional Articles
podleæe zunanjim dejavnikom kot so klimatske razmere, pomanjkanje hrane in vrsta predatorjev. V takih razmerah se je v procesih naravne selekcije izkazalo, da je za nadaljevanje vrste optimalno razporediti veœ energije v hiter in bolj mnoæiœen razplod na raœun veœje rasti in razvoja raznih obrambnih sistemov, kot so na molekularni ravni npr. boljøi mehanizmi za obrambo pred oksidativnim stresom (glej spodaj), na ravni organizma pa npr. obdajanje s økoljœno lupino, krila, veœji moægani in drugi sistemi, ki jih najdemo v æivalskem svetu. Kompromisna reøitev je torej miøim prinesla maksimalno æivljensko dobo 3 let, kar je bilo dovolj za oœuvanje vrste vse do danes.
Po drugi strani se je v primeru œloveka, kot optimalna razporeditev razpoloæljivih energetskih virov, izkazala reøitev, ko se hiter in obilen razplod ærtvuje na raœun daljøe, a zato veœje rasti in boljøih obrambnih sistemov. Œlovek, katerega pribl. 5 milijonov let dolg razvoj se je, razen v zelo kratkem zadnjem obdobju civilizacije, odvijal v divjini, ima tako poleg veœje rasti, tudi razvitejøe moægane, poleg tega pa øe vrsto uœinkovitejøih molekularnih obrambnih sistemov proti fizikalnim, kemiœnim in bioloøkim okoljskim dejavnikom, ki so potrebni za daljøe preæivetje. Ti sistemi omogoœajo œloveku daljøe preæivetje, s tem pa tudi daljøe obdobje reprodukcije za zagotavljanje zadostnega potomstva. Kot vemo nastopi reproduktivno obdobje pri œloveku razmeroma pozno (slika 1) in ker potomci potrebujejo daljøi œas, da doseæejo sposobnost samostojnega æivljenja, mora œlovek v povpreœju æiveti vsaj nekaj desetletij, da uspe zagotoviti nadaljevanje vrste v naslednjo generacijo.
Slika 1: Æivljenska obdobja v œloveøki populaciji. Na sliki prikazane dolæine posameznih obdobij niso v pravih œasovnih razmerjih. Embrionalno obdobje (e ) od oploditve do rojstva traja 266 dni, obdobje rodnosti se (po merilu prve menstruacije) v povpreœju zaœne med 12 in 14 letom in se v povpreœju (po merilu nastopa menopavze) konœa med 40 in 50 letom. Povpreœna priœakovana æiv-ljenska doba je v razvitem svetu 75 let, maksimalna æivljenska doba (najviøja starost, ki jo lahko œlovek doseæe) pa se po danaønjih ocenah giblje okrog 125 let.
Figure 1: Life periods in human population. Lengths of individual periods are not presented in scale. Embryonic period (e ) lasts, from conception to birth, 266 days; fertility period begins at the age between 12 and 14 years (menarche) and ends at the age between 40 and 50 years (menopause). Average life expectancy in developed world is 75 years; maximal life span is, to our present estimation, around 125 years.
V podporo optimalni in zato kompromisni razporeditvi razpoloæljivih energetskih virov, obrambni mehanizmi, ki jih imamo proti okoljskim dejavnikom, niso popolni. So le dovolj uœinkoviti, da so skozi celoten œlovekov zgodovinski razvoj zaøœitili dovolj posameznikov za nadaljevanje vrste. Tako npr. obrambni sistem proti vdoru mikroorganizmov ni dovolj moœan, da bi zaøœitil vsakega posameznika pred vsako obliko teh stalnih napadalcev (sredi 14. stoletja je npr. kuga pomorila
velik del vsega takratnega œloveøtva), a je bil skozi vso zgodovino œloveøtva oœitno dovolj uœinkovit, da je zagotovil zadosten prehod posameznikov iz generacije v generacijo vse do danes.
V smislu navedenega, se obdobje starosti izkaæe ne le kot nepotrebno, ampak za nadaljevanje vrste tudi økodljivo obdobje, saj gre za porabo omejenih energetskih virov za del populacije, ki veœ ne pripomore k reprodukciji. Ta ugotovitev je, skupaj z odkritji vrste genov, pri katerih ena sama mutacija bodisi podaljøa ali pa skrajøa æivljensko dobo (7), pripeljala do teorije o staranju kot o genetsko programiranem procesu. Œeravno na videz logiœna, pa se je ta teorija iz øirøe-ga zornega kota evolucijskih dogajanj izkazala kot teæko razloæljiva, pa tudi øtudije na podroœju evolucijske genetike je niso uspele potrditi (glej spodaj). Danes staranje uspeøneje pojasnjuje teorija »somatskega ærtvovanja« (angl. »disposable soma theory«), ki temelji na zgoraj opisanih naœelih optimalnega razporejanja razpoloæljivih virov. Po tej teoriji vrsta, katere posamezniki v naravnem okolju skoraj nikoli ne doœakajo starosti, svojih omejenih energetskih virov skozi evolucijski razvoj ne vloæi v izgradnjo celiœnih molekularnih obrambnih mehanizmov pred zunanjimi stresorji, ki bi sicer podaljøali æivljensko dobo (glej spodaj), ampak raje v hitrejøo in obilnejøo reprodukcijo (2, 6). Ta odloœitev pomeni »ærtvovanje« somatskih celic, saj se, zaradi pomanjkanja in neuœinkovitosti teh obrambnih mehanizmov, økodljive spremembe v celicah s œasom kopiœijo, kar se na zunaj kaæe kot staranje. Napredujoœe kopiœenje økodljivih sprememb (glej spodaj) konœno pripelje do funkcionalne odpovedi organizma in smrti.
2.2 Staranje v luœi evolucijske genetike
V procesu prilagajanja doloœene æivalske vrste na okolje v katerem æivi, je v evolucijskem smislu kljuœnega pomena tudi selekcija znotraj vrste, ta pa se dogaja prek selekcije genov, ki se prenaøajo iz generacije v generacijo. Ko gre za preæivetje v okolju, nekateri geni in genske kombinacije, oziroma njihovi fenotipi, svojim nosilcem prinaøajo prednosti, drugi spet verjetnost preæivetja zmanjøujejo. Ker imajo organizmi z veœjo sposobnostjo preæivetja tudi veœjo moænost za razplod, se v neki populaciji, pod pritiski okolja, sœasoma geni, ki so ugodni za preæivet-je, uveljavijo, neugodni pa se odstranijo. Prav ta selekcija je osnova evolucijske plastiœnosti oziroma spremenljivosti organizmov, ki omogoœa, da se sœasoma izoblikuje genotip, ki omogoœa optimalno izrabo razpoloæljive energije ki, kot smo opisali zgoraj, tudi doloœa æivl-jensko dobo. Da do procesa selekcije genov sploh lahko pride, pa je potrebno, da se geni in njihove kombinacije na ravni posameznikov skozi generacije vseskozi spreminjajo. To se dogaja po eni strani na raœun razliœnih genskih kombinacij, ki jih ob mejotiœnih delitvah in zdruæitvah zarodnih celic posamezniki podedujejo od svojih starøev, po drugi pa na raœun spontanih in iz okolja sproæenih mutacij v zarod-nih celicah. Na razplod znotraj posamzne vrste lahko tako gledamo kot na naravni laboratorij, kjer po sluœajnem vzorcu nastajajo razliœne oblike in kombinacije genov, ki se nato, s staliøœa njihovega vpliva na preæivetvene, predvsem pa na reprodukcijske sposobnosti njihovih nosilcev, preizkuøajo v okolju.
Gledano s tega zornega kota, obstajajo v organizmu samo dve vrsti celic: zarodne (jajœeca pri æenskah in spermatogoniji pri moøkih) in somatske (vse ostale celice organizma). Pri tem so zarodne celice, ki se prenaøajo iz generacije v generacijo, v nekem smislu nesmrtne, medtem ko je vloga somatskih celic zgolj v tem, da omogoœijo ploditev
farm vestn 2005; 56
in s tem prenos genov v naslednjo generacijo. Ko govorimo o genskih mutacijah, moramo tako loœiti pomen mutacij v zarodnih celicah od pomena mutacij v somatskih celicah. Medtem ko se prve prenesejo iz generacije v generacijo in, v primeru, da niso smrtonosne, pripomorejo k veœji genetski plastiœnosti in raznolikosti organizmov, se druge ne dedujejo. Mutacije, ki se skozi vse æivljenje posameznikov kopiœijo v somatskih celicah, povzroœajo vse veœjo »nestabilnost genoma«, ki se na celiœni ravni kaæe kot vse veœje øtevilo genskih in drugih okvar. Te se navzven kaæejo kot staranje in ki na koncu privedejo do smrti. Ta razlaga daje podporo zgoraj omenjeni teoriji »somatskega ærtvovanja« tudi s staliøœa evolucijske genetike.
S staliøœa selekcije genov, so od æivljenskih obdobij, prikazanih na sliki 1, pomembna samo obdobja do konca dobe razploda, medtem ko v dobi starosti, ko se geni veœ ne prenaøajo na naslednje generacije, pritiski okolja na to selekcijo ne morejo veœ vplivati. Vsi tisti geni in njihovi produkti, katerih izraæanje vpliva na zdravje in preæivetveno sposobnost œloveka øele v starosti (ponekje v literaturi jih imenujejo »geronto-geni«), se torej od genov, ki so odloœilni za preæivetje organizma v zgodnejøih obdobjih, pomembno razlikujejo po tem, da njihove kombinacije, spremembe in mutacije niso bile podvræene selekcijskim pritiskom. Vse morebitne okvare teh genov, ki jih je œlovek v svojih zaro-dnih celicah pridobil pred ali med obdobjem plodnosti in ki do konca tega obdobja niso povzroœale nobenih teæav, so se neovirano pre-naøale na potomce in se kozi generacije, v razliœnih kombinacijah, kopiœile v œloveøki populaciji. Ker v preteklosti velika veœina posameznikov starosti sploh ni doœakala, so se uœinki teh genov lahko pokazali le obœasno in za œloveøko populacijo niso predstavljali teæav s kakrønimi se sreœujemo danes, ko veœina posameznikov æivi daleœ preko reprodukcijskega obdobja. Velika variabilnost in pestrost, ki jo opaæamo med posamezniki tako glede trajanja starostnega obdobja kot tudi glede bolezni, okvar in vzrokov smrti, ki jih prinaøa to obdobje, izvira v veliki meri prav iz velike pestrosti gerontogenov in njihovih okvar, ki niso bile nikoli izpostavljene selektivnim pritiskom okolja. Tako npr. za sladkorno bolezen tipa 2, ki povzroœa teæave øele v starosti in ima moœan dedni dejavnik, niso uspeli odkriti enoten genski vzorec, ki bi pojasnjeval dedno plat te motnje. Odkrili so sicer æe vrsto mutacij na raznih genih, ki so povezani z inzulinskim signaliziranjem, ki je okvarjeno pri tej bolezni, a so bile te mutacije od druæine do druæine sladkornih bolnikov tipa 2 razliœne tako po tipu kot po lokaciji, kar je ob nabiranju mutacij po sluœajnem vzorcu in njihovem prenosu od generacije do generacije tudi priœakovati. Za razliko od zgodnjih, moœni selekciji podvræenih genov, so tako gerontogeni nekakøno »smetiøœe« najrazliœnejøih mutacij, ki so se imele moænost kopiœiti skozi tisoœletja œlovekovega razvoja (2, 6). Visoka stopnja variabilnosti na ravni starostnih genov, ki jo je omogoœila odsotnost selekcijskih pritiskov, je øe posebej oœitna, œe primerjamo natanœno programirano in po zaporedju dogodkov podrobno opredeljeno dogajanje v embrional-nem obdobju, s kaotiœnim obdobjem staranja, ki se, tako po œasu, kot tudi dogajanjih v organizmu razlikuje tako rekoœ od posameznika do posameznika.
Ta spoznanja so dodatno pripomogla k opuøœanju koncepta o staranju kot o genetsko programiranem procesu. Danes staranje razumemo kot posledico individualistiœnih, stohastiœnih in torej po sluœajnem vzorcu nastalih okvar, ki se z leti sicer kopiœijo, a se po vzorcu od posameznika do posameznika precej razlikujejo.
Patofiziologija staranja
3 Celiœni in molekularni mehanizmi staranja
Æe pred pribliæno sto leti so ugotovili, da imajo æivali, ki imajo hitrejøi metabolizem (kalorije /kg telesne teæe/dan), krajøo æivljensko dobo. Na podlagi te ugotovitve se je takrat razvila hipoteza »hitrosti æivljena«, po
Slika 2. Uravnavanje ravni reaktivnih kisikovih spojin (ROS) v celici in celiœni odgovori nanje. Raven ROS v celici doloœa ravnoteæje med njihovim nastajanjem in obrambo. ROS nastajajo kot posledica znotra-jceliœnih procesov (zgornje levo polje) ali pa pod vplivom zunanjih dejavnikov (zgornje desno polje). Najmoœnejøo obrambo pred njimi (zgornje srednje polje) predstavljajo znotrajceliœni encimi oziroma encimski sistemi katalaze (KAT), superoksidne dismutaze (SOD) in glutatioske peroksidaze (GPx). Poruøenje ravnoteæja bodisi v eno ali drugo smer vodi v celiœne poøkodbe takega ali drugaœnega tipa (spodaj), kar se na zunaj lahko kaæe tudi kot staranje organizma (desno spodaj). NADPH: reducirana oblika nikotinamidadenindinuk-leotidfosfata. (prirejeno po Finklu in Hoolbrooku: 10). Izraz reaktivne kisikove spojine ni najbolj posreœen, saj njihov glavni predstavnik, superoksidni anion, ni spojina, ker ga tvori en sam element. Prednost tega izraza je, da se kratica ROS ujema z razriøjeno angl. okrajøavo ROS (angl. "reactive oxygen species") za isto skupino spojin.
Figure 2. Regulation of the reactive oxygen species (ROS) level in the cell and cellular responses to ROS. Intracellular ROS level reflects the balance between rates of ROS formation and degradation. ROS are generated as a result of intracellular processes (upper left field) or the actions of extrinsic agents (upper right field). The strongest defense against ROS (upper middle field) are intracellular enzymes and enzyme systems: catalase (CAT); superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx). Any disruption of this balance results in cellular damage (bottom). Depending on the extent and type of damage it leads either to cell death, disease or aging. (bottom right). NADPH: reduced form of the nicotinamideadeninedinucleotide phosphate (modified after Finkel and Holbrook; 10).
farm vestn 2005; 56 61
Strokovni œlanki - Professional Articles
kateri æivljensko dobo vsake æivalske vrste doloœa hitrost njenega metabolizma. Pribliæno 50 let pozneje je Harman (8) predlagal »teorijo prostih radikalov«, ki je prispevala prvo mehanistiœno povezavo med metabolizmom in »hitrostjo æivljenja«. Staranje naj bi bilo po tej teoriji odsev kumulativnih poøkodb, ki se kopiœijo v organizmu zaradi økodljivih uœinkov prostih radikalov, ki nastajajo v oksidacijskih celiœnih metabolnih procesih. Veœja »hitrost æivljenja« kot hitrejøi metabolizem torej vodi v hitrejøe nabiranje celiœnih poøkodb, te pa se na zunaj kaæe-jo kot hitrejøi proces staranja, temu ustrezno pa je krajøa tudi æivljens-ka doba. Po tej teoriji torej staranje ni neposreden odsev hitrosti metabolizma, ampak mnoæine prostih radikalov, ki v teh oksidacijskih procesih nastanejo. Izkazalo se je tudi, da pri tem ni merodajna le hitrost nastajanja teh spojin, ampak tudi hitrost njihovega odstranjevanja. Odkritje encima superoksidne dismutaze (9), katerega edina naloga je odstranjevanje superoksidnega aniona, kot osrednjega predstavnika reaktivnih kisikovih spojin (ROS), kot zdaj s skupnim imenom imenujemo proste radikale, pa tudi odkritja, ki so pokazala, da so nekatere ROS udeleæene v procesih celiœnega signaliziranja (npr. duøikov monoksid, NO) so pripeljala do danaønjega prepriœanja, da je nastajanje in procesiranje ROS nadzorovan celiœni proces. V evolucijskem razvoju, kjer æiva bitja uporabljajo oksidacijske procese kot edino pot za pridobivanje energije, so se v celicah, po eni strani razvili za ta namen specializirani sistemi (na ravni organel mitohondriji, na ravni reakcijskih sistemov pa piruvatni dehidrogenazni kompleks, b-oksidacija, ciklus trikarboksilnih kislin in dihalna veriga, ki jih najdemo v mitohondrijskem matriksu in notranji mitohondrijski membrani) po drugi pa tudi sistemi za razgradnjo ROS (encimi katalaza, superoksid-na dismutaza, glutationska peroksidaza). Razmerje uœinkovitosti obeh sistemov uravnava raven ROS v celici. Uravnavanje ravni ROS v celici naj bi bilo po danaønjih spoznanjih vrstno specifiœen proces, katerega uœinkovitost se je, kot rezultat evolucijskih selekcijskih pritiskov, izse-lekcionirala po naœelu zgoraj omenjene teorije somatskega ærtvovanja. Vsaka posamezna æivalska vrsta ima torej svoji strategiji preæivetja prilagojen naœin uravnavanja ROS (slika 2), s tem pa tudi temu ustrezno æivljensko dobo (10) (glej zgoraj).
3.1. Molekularni mehanizmi staranja pri preprostejøih organizmih
Najuœinkovitejøi dejavnik, za katerega je bilo v poskusih na æivalih nesporno ugotovljeno, da podaljøa æivljensko dobo, je zmanjøan kaloriœni vnos (ZKV). V poskusih predstavlja to zmanjøanje dieto, ki je po kaloriœni vrednosti za pribliæno 30 – 40% manjøa od vrednosti, ki jo s hrano vnesejo kontrolne æivali, ki so hranjene po naœelu ad libitum. V takih razmerah so pri vseh preiskovanih vrstah: protozojih, vodnih bolhah, pajkih, ribah in tudi podganah opazili tako podaljøanje povpreœne kot tudi maksimalne æivljenske dobe za pribliæno enak odstotek (11). Za œloveka teh podatkov ni, vendar pa je prav ponovljivost tega uœin-ka pri vseh drugih vrstah moœan argument za sklepanje, da bi poskusi, œe bi bili izvedljivi, pokazali enak uœinek tudi pri œloveku.
V zaœetku so podaljøanje æivljenske dobe zaradi ZKV tolmaœili preprosto z zniæano koliœino ROS. Ob vsakem vnosu kaloriœnih virov (ogljikovih hidratov, maøœob in proteinov), se kot stranski uœinek potovanja elektronov vzdolæ dihalne verige, kar je konœna stopnja oksi-dacije teh snovi, tvorijo ROS, ti pa prek økodljivih uœinkov na DNK, celiœne membrane (lipidna peroksidacija) in beljakovinske molekule,
Slika 3. Signalne poti v celici, za katere je bilo ugotovljeno, da jih prek razliœnih stresnih dejavnikov iz okolja, uravnavajo ROS. Ti lahko nastanejo v endogenih procesih znotraj celice, ali pa kot odziv na zunanje stresne dejavnike, ki povzrosajo oksidativni stres. ROS prek razliœnih transkripcijskih dejavnikov (HSF 1, NF-eB, in p53) ali pa prek signalnih encimov, ki vplivajo na transkripcijske dejavnike (sistem PI(3)K/Akt, JNK, p38/MAPK), vplivajo tako na gensko podvoje-vanje, kot tudi na gensko prepisovanje. Kakøen bo konœni odgovor celice je odvisno od jakosti in trajanja stresa pa tudi od tipa celice Debelo obrobljeni so dejavniki, za katere so povezavo s staranjem æe ugotovili. Mutacije raznih genov v signalnih poteh, kjer ti sodelujejo, so namreœ povzroœile bodisi podaljøanje ali skrajøanje æivljenske dobe poskusne vrste. (prirejeno po Finklu in Hoolbrooku: 10).
Figure 3: ROS mediated stress signalling in the cell. ROS are formed either in endogenous cellular processes or as a result of exogenous stress stimuli resulting in oxidative stress. ROS affects DNA replication or transcription through the action of various transcription factors (HSF 1, NF-eB, in p53) or signaling enzymes con-troling transcription factors (PI(3)K/Akt, JNK, p38/MAPK), The ultimate cell response depends on the nature and duration of the stress as well as on the cell type. Pathways demonstrated to influence aging processes are indicated. by bold frame. Mutations of various genes involved in these pathways have been demonstrated to influence longevity (modified after Finkel and Holbrook; 10).
kopiœijo okvare v celici, kar pospeøi staranje in vodi v zgodnjo smrt. Ob ZKV je teh okvar manj in æivljenje zato daljøe (11)
farm vestn 2005; 56
Œeravno na videz prepriœljiva, se gornja razlaga ni uspela potrditi v poskusih. Poleg tega je vrsta øtudij pokazala, da ZKV ni edin dejavnik, ki podaljøa æivljensko dobo. Na preprostih æivalskih modelih je bilo to mogoœe doseœi tudi z vzpostavljanjem najrazliœnejøih drugih razmer, katerih skupni imenovalec pa je bil stresni dejavnik. Ko so po drugi strani ugotovili, da je v teh modelih moæno æivljensko dobo bod-isi podaljøevati ali pa tudi skrajøevati tudi z mutacijo doloœenih genov, med katerimi prevladujejo taki, ki so prek svojih beljakovinski produktov vkljuœeni v uravnavanje metabolnih procesov in torej ravni ROS, je zaœelo prevladovati mnenje, da se za podaljøano æivljensko dobo v razmerah ZKV skriva øirøe delujoœi in izdelan molekularni mehanizem Po danaønjih spoznanjih naj bi ta mehanizem, kot odgovor na stresne razmere, prilagodil procese v organizmu na naœin, ko se zaœasno ærtvujejo reprodukcijske sposobnosti posameznikov na raœun njihovega daljøega preæivetja. Tako ærtvovanje (angl. »trade off«) je v naravi razøirjen pojav. Bakterije v neugodnih razmerah tvorijo dolgoæive a v smislu razmnoæevanja neaktivne spore, vrsta valjastega œrva Caenorhabditis elegans v takih razmerah preide v stanje imenovano »dauer«, v katerem se tako oksidacijski procesi kot tudi staranje moœno upoœasnijo (12), podobno vlogo pa ima tudi hibernacija, ki jo sreœamo pri nekaterih sesalcih. Visoka konzervativnost genov, ki so udeleæeni v procese, ki uravnavajo opisani pojav, govori v prid hipotezi, da se je tak odgovor na stresne razmere v evolucijskih procesih uveljavil æe zelo zgodaj in se ohranil vse do danes, a je zarad prevlade viøjih mehanizmov v uravnavanju metabolizma, ki so se razvili pri bolj razvitih vrstah, kot je npr. œlovek, postal pri teh vrstah vse bolj prikrit. Logiœen je tak mehanizem tudi s staliøœa zakonov evolucije, saj omogoœa posameznikom znotraj vrst, da »prevedrijo« neugodne razmere, svoje reprodukcijske sposobnosti, ki ostanejo ob upoœasnjenem staranju v takih razmerah ohranjene dalj œasa, pa prihranijo za poznejøa, ugodnejøa obdobja. V zadnjem œasu se je nabralo precej podatkov, ki kaæejo na to, da razliœne stresne razmere najprej povzroœijo »oksidativni stres«, ta pa nato prek ravni ROS vpliva na celo vrsto pomembnih metabolnih poti v organizmu, ki so jih pred tem prepoznali æe na drugih raziskovalnih podroœjih in ki so odgovorne za zgoraj opisane spremembe, (10) (slika 3).
Podrobnejøe øtudije so pokazale, da pri poskusnih glodalcih in celo primatih zmanjøan kaloriœni vnos (ZKV) zniæa incidenco za starost znaœilnih karcinomov, kot tudi incidenco srœno-æilnih obolenj in upoœasni peøanje imunskega sistema, ki je znaœilno za starost (13). Iz tega sklepajo, da fizioloøke spremembe, ki jih povzroœi ZKV, prispevajo k boljøemu sploønemu zdravstvenemu stanju, kar ima za posledico podaljøano æivljensko dobo. To se ujema tudi z izkuønjami pri œloveku, kjer je znano, da je kroniœno zveœan vnos kalorij dejavnik tveganja za srœno-æilna obolenja, veœ tipov raka, sladkorno bolezen tipa 2 in øe nekatera obolenja, ki bremenijo predvsem starostnike
Okvir tega pisanja ne dopuøœa, da bi v podrobnosti opisovali øtevilne hipoteze, poskuse in poskusne modele, ki poskuøajo najti razlago za opisane pojave. Omejili se bomo le na nekaj dognanj, ki so bila v zadnjem œasu deleæna veœje pozornosti
3.1.1 Vloga sistema Sir pri povezavi zmanjøanega kaloriœnega vnosa s podaljøano æivljensko dobo
skanje molekularnih mehanizmov, ki bi povezali ZKV z opisanimi uœinki in podaljøano æivljensko dobo, je v poskusih na kvasovkah
Patofiziologija staranja
(Saccharomyces cervisiae), pripeljalo do odkritja sistema Sir (angl »silent information regulator«), ki ga sestavlja kompleks beljakovin Sir2, Sir3 in Sir4. Ko so kvasovke iz hranilnega medija z 2% glukozo prenesli v medij z 0,5% glukozo, so ugotovili za okrog 50% podaljøano æivljensko dobo, ta uœinek pa je spremljalo utiøanje genov rDNK, s katerih se prepisuje ribozomalna RNK (rRNK). Vlogo sistema Sir pri tem uœinku moœno podpirajo rezultati poskusov, v katerih so z odstranitvijo beljakovine Sir2 kvasovkam æivljensko dobo skrajøali medtem ko so jo pri kvasovkah z dodano kopijo gena SIR2, moœno podaljøali (12). Danes je znano, da Sir2 deluje kot od NAD-odvisna deacetilaza. Pri tem NAD ne opravlja vlogo prejemnika elektronov in protonov, kar je njegova vloga, kadar deluje kot koencim raznih dehidrogenaz v katabolnih reakcijah, ampak deluje kot aktivator deacetilazne encimske aktivnosti Sir2, tarœa deacitiliranja pa so his-tonske molekule v kromatinu, kar pripelje do utiøanja genov za rDNK. Prav odvisnost aktivnosti Sir2 od koencima NAD povezuje ta encim z metabolizmom, kjer je razmerje NAD/NADH pomemben pokazatelj energetskega statusa v celici in je veœje ob zmanjøanju vnosa energetskih virov. Izkazalo se je, da je mehanizem Sir zelo konzervativen Najdemo ga tako pri niæjih kot tudi viøjih vrstah, zaradi œesar lahko priœakujemo podoben uœinek morda tudi pri œloveku, œeprav za zdaj øe ni znano, katere predele genoma bi Sir2 utiøal v teh viøjih organizmih in kako bi to utiøanje podaljøalo njihovo æivljensko dobo. V najnovejøi literaturi (13) najdemo vrsto predlaganih modelov, kjer se sesalska oblika Sir2, imenovana SIRT1, vkljuœuje v najrazliœnejøe metabolne poti, pripisujejo pa mu tudi zaøœitno vlogo pred nevrode-generacijo. Raven ROS v celici, ki je pomemben dejavnik v procesu staranja, naj bi SIRT1 zniæeval prek uravnavanja izraæanja odklopnih proteinov v notranji mitohondrijski membrani. Zveœano øtevilo teh beljakovin bi pripeljalo do zmanjøane depolarizacije notranje mitohondri-jske membrane, ki jo ustvarja gradient protonov, to pa bi pripeljalo do zniæane hitrosti nastajanja ROS
3.1.2 Vloga signalne poti inzulin/inzulinu podoben rastni dejavnik (IGF-1) pri povezavi zmanjøanega kaloriœnega vnosa in podaljøano æivljensko dobo.
Poleg kvasovk in vinske muøice, je zelo uporaben model za prouœevanje molekularnih mehanizmov staranja tudi æe omenjena vrsta valjastega œrva Caenorhabditis elegans (CAEL) el). Pri CAEL, ki so jim mutirali gen DAF-2, ki kodira receptor za inzulin/IGF-1 oziroma za ustrezne ligande v tem organizmu, so opazili ne le dvakrat daljøo æivljensko dobo, ampak tudi mladostno obnaøanje, ki bi, po analogiji s œlovekom, pomenilo vedenje in izgled øtiridesetletnika pri starosti devetdesetih let. Iz opisanih ugotovitev bi lahko torej sklepali, da signaliziranje prek hormonov ne sluæi le metabolni koordinaciji ampak tudi koordinaciji starostnih procesov med tkivi. Mutacije, ki vplivajo na æivljensko dobo, so pri CAEL sorazmerno øibke. Moœnejøe mutacije v tej signalni poti pa povzroœijo, da se liœinke teh æivali spremenijo v dor-mantno, stanje, imenovano »dauer«, kjer je rast zaustavljena, obramba proti stresu pa poveœana. Prehod v tako stanje je znaœilen za okoliøœine ko gre za pomanjkanje hrane.
Po aktivaciji receptorja inzulin/IGF-1 pride do aktivacije reakcijske kaskade, v kateri ima kljuœno vlogo fosfatidilinozitol -3-OH kinaza (PI(3)K), konœni vpliv na prepis genov pa se s te kaskade prenese prek transkripcijskega dejavnika DAF-16, ki je bistven za opisano podaljøanje æivljenske dobe (12). Æivljensko dobo doloœa prek te
farm vestn 2005; 56 6
Strokovni œlanki - Professional Articles
kaskade dvoje tkiv: senzoriœni sistem, prek katerega æival zaznava spremembe v okolju in njen reprodukcijski aparat, kar kaæe na hormonsko uravnavanje procesov staranja pri teh æivalih in kar spet pomeni, da lahko reprodukcijski aparat prek ustreznih signalov koordinira œas reprodukcije z procesom staranja. To ne preseneœa, saj so tudi pri œloveku starostno-specifiœne spremembe kot npr. puberteta in menopavza uravnavane hormonsko. Œe pri CAEL kak dejavnik iz okolja zadræi reprodukcijo, se zaœnejo izloœati signalne molekule, ki upoœasnijo staranje na ravni posameznih celic. Tako se æival zaœne starati poœasneje s tem pa ohrani reproduktivno sposobnost za œase, ko bo za razplod veœ moænosti, kar prinaøa prednost tudi v evolucijskem smislu.
3.2 Molekularni mehanizmi staranja pri œloveku
Kvasovke, vinska muøica in valjasti œrv so enostavni in za poskuse dostopni organizmi, poleg tega pa njihova sorazmerno kratka æivljen-ska doba omogoœa spremljanje sprememb v njihovih organizmih skozi celo æivljensko obdobje in tudi skozi veœ generacij. Vse to so za raziskovanje molekularnih mehanizmov staranja pomembne prednosti, kot vedno pa se ob uporabi takih modelov spraøujemo o veljavnost dobljenih izsledkov na œloveøkem organizmu. V tem smislu so sicer obetavna opaæanja, da so nekateri elementi signalnih sistemov, ki uravnavajo staranje v preprostih æivalih, visoko konzervativni in so jih odkrili pri vseh do zdaj prouœevanih vrstah. To bi lahko pomenilo, da bi vsaj do neke mere lahko bili vkljuœeni tudi v procese staranja pri œloveku, vendar ustreznih dokazov za to øe ni. Prav zato je øe posebej pomembno ugotoviti, ali obstajajo pri œloveku stanja in mehanizmi, ki bi povezovali spoznanja, pridobljena na enostavnejøih modelih, s procesom staranja pri œloveku.
V raziskavah staranja sta bila do zdaj pri œloveku v ospredju dva modela: progerije, ki jih v oæjem smislu pojmujemo kot genetske motnje, ki se kaæejo kot pospeøeno staranje in kulture œloveøkih celic. Med prog-erijami, ki jih je sicer veœ, je bilo do zdaj najveœ raziskav posveœenih Wernerjevemu sindromu (14). Bolniki s tem sindromom so homozigoti za mutacijo v genu, ki kodira encim RecQ iz druæine helikaz (15). Helikaze so encimi, ki se v procesu replikacije, torej podvojevanja DNK, veæejo na eno verigo dvojne vijaœnice in se, korak za korakom, premikajo vzdolæ te verige pri œemer potrebujejo energijo v obliki ATP. Njihovo delovanje razklene dvojno vijaœnico, kar je pomembno za nemoten proces podvojevanja DNK. Na kliniœne znake, ki jih najdemo pri Wernerjevem sindromu, je torej treba gledati kot na posledice motenj v podvojevanju DNK, kar ima za posledico tudi motnje v procesu celiœnih delitev. S tem se ujemajo poskusi, kjer so primerjali delitvene sposobnosti humanih fibroblastov, ki so jih pridobili iz pod-koæja novorojenœka, stoletne osebe in osebe z Wernerjevim sindromom (slika 4).
Motnje se pri bolniku z Wernerjevim sindromom zaœnejo v obdobju odraøœanja, ko ne pride do obdobja hitre rasti, ki je znaœilno za zdrave mladostnike, nizka telesna viøina pa se tudi pozneje ne nadoknadi. Æe pri tridesetih letih se pri praktiœno vseh bolnikih pojavijo katarakte, poznejøe motnje pa so æe bolj raznolike. Najpogostejøi znak, ki je v poznejøem obdobju skupen vsem bolnikom, so hude koæne ulceraci-je v podroœju gleænjev. Bolniki imajo tipiœne bolezni starostnega obdobja kot so osteoporoza, sladkorna bolezen tipa 2, ateroskleroza
Slika 4: Delitvene sposobnosti humanih fibroblastov, izoliranih iz pod-koæja novorojenœka, 100 let stare osebe in dvajsetletne osebe z Wernerjevim sindromom. Zmoænost celic, da zrastejo v petrijevki z radijem 100 mm do konfluence (pribl. 1.8 x 106 celic) se zmanjøuje z veœanjem øtevila podvojitve populacij. Po doloœenem in za vsako od omenjenih treh populacij znaœilnem øtevilu delitev, celice izgubijo delitveno sposobnost in ostanejo ujete v dokonœnem stanju poimenovanem celiœna ostarelost (angl. "senescence"). (prirejeno po Diceu: 16).
Figure 4: Division potential of human fibroblasts isolated from newborn, 100 year old, and 20 year old patient with Werner's syndrome. Cell capacity to grow to confluence (appr. 1.8 x 106 cells) decreases by the number of population doublings. After certain number of cell divisions, which is different for each of the three conditions, cells stop to divide and remain captured in a final state named cellular senescence. (modified after Dice: 16).
kot tudi zveœano pojavnost benignih in malignih neoplazem. Vzrok smrti, ki tipiœno nastopi okrog 47 leta, je ponavadi miokardni infarkt ali kaka od oblik raka.
Œeravno se v sploønem Wernerjev sindrom kaæe kot pospeøeno staranje, je za zdaj teæko najti molekularne mehanizme, ki bi povezali osnovno motnjo na ravni RecQ helikaze z znaki staranja. Motnje na ravni podvajanja DNK bi lahko bile vzrok za pogoste maligne spremembe pri teh bolnikih, koæne spremembe, vkljuœno z ulceracijami v podroœju gleænjev, pa so najbræ posledica zmanjøane delitvene sposobnosti celic. Ostale motnje je teæe pojasniti in so najverjetneje sekundarnega znaœaja. Trenutne raziskave so usmerjene v iskanje povezav med motnjami na ravni podvojevanja DNK in uœinki ROS, ki bi lahko pojasnili to stanje; morda bi v tej povezavi lahko imel svojo vlogo prej omenjeni sistem SIRT2. Seveda pa Wernerjevega sindroma ne gre razumeti kot zgolj pospeøeno obliko normalnega staranja, saj gre za redko osnovno motnjo, ki je drugi starostniki nimajo.
Povezavo med motnjami na ravni podvajanja DNK in staranjem ponuja tudi koncept skrajøanja telomer. To so kratke, ponavljajoœe se
farm vestn 2005; 56
sekvence DNK (TTAGGG), ki tvorijo linearne konce kromosomov in so pomembne: 1) za zagotavljanje kompletnega podvajanja DNK na konceh kromosomov; opisane sekvence zasidrajo kromosome na nuklearni matriks in razmejujejo kodirajoœo DNK od konœiœev kromosomov in: 2) za zaøœito kromosomskih koncev pred fuzijo in razgradnjo; telomere prepreœujejo kromosomsko nestabilnost, fragmentacijo in prerazporeditev. Delovanje telomeraz je prikazano na sliki 5.
Slika 5: Vloga telomeraze pri "øtetju" celiœnih delitev. Telomere so kratke, ponavljajoœe se sekvence DNK (TTAGGG), ki tvorijo linearne konce kromosomov (spodaj). Za sintezo opisanih sekvenc je odgovoren poseben ribonukleoprotein, imenovan telomeraza, ki stabilizira dolæino telomer tako, da z dodajanjem teh sekvenc podaljøuje njihove konce. Aktivnost telomeraze zavrejo regulatorne beljakovine, ki na neki stopnji omejijo nadaljno podaljøevanje telomer, kar je torej mehanizem, ki zaznava dolæino telomer (zgoraj). V odsotnosti delovanja telomeraz, se z vsako celiœno delitvijo izgubi nekaj baznih parov telomer, tako da postajajo le-te s postopnimi delitvami vse kra-jøe in krajøe dokler na neki stopnji tega skrajøanja, delitev ni veœ moæna. Celica zastane v G1/S fazi celiœnega ciklusa in preide v stanje celiœne ostarelosti. (prirejeno po Cotranu in sod: 17).
Figure 5: The role of telomerase at "counting" cell divisions. Telomeres are short, repeating DNA sequences (TTAGGG), forming linear chromosomal ends at their tips (bottom). These sequences are synthesized by special ribonucleoprotein called telomerase, which stabilizes telomere length by adding new repeats of these sequences. Telomerase activity is inhibited by regulatory proteins which, at certain stage, stop further telomere lenghtening, acting in this way as a mechanism sensing telomerase length (top). In the absence of telomerase, telomeres are losing a couple of base pairs after each division so that telomeres become shorter and shorter until, at the certain level of shortening, division is not possible any more. Cell is captired in G1/S phase of cell cycle and enters the stage of cellular senescence (modified after Cotran e tal: 17).
Patofiziologija staranja
Telomerazna aktivnost je izraæena v zarodnih celicah, ob nekoliko niæji aktivnosti jo najdemo tudi v nekaterih matiœnih celicah, v somatskih celicah pa je ni. Pomen telomeraznega mehanizma pri pojavu celiœne ostarelosti podpira ugotovitev, da je v nesmrtnih, rakastih celicah, kjer øtevilo delitev ni omejeno, telomeraza ponovno aktivna, tako da se v teh celicah telomere ne krajøajo. Pomen telomeraz v procesu staranja po drugi strani zmanjøuje ugotovitev, da ima oksidativni stres veœji uœinek na hitrost izgube telomer, kot izguba telomerazne aktivnosti (18).
4 Zakljuœek
Spoznanja, ki so se o patofizioloøkih mehanizmih staranja nabrala v zadnjih letih, so zanikala prej popularno teorijo, da je staranje genetsko programiran proces. Danes je po sploønem prepriœanju proces staranja odsev stohastiœnih in torej po sluœajnem vzorcu nastalih celiœnih sprememb, ki se od posameznika do posameznika dogajajo razliœno, zaradi œesar najdemo tudi glede trajanja starostnega obdobja in dogajanj, ki ga spremljajo, velike individualne razlike. Po drugi strani pa pred sto leti predlagana teorija »hitrosti æivljenja«, po kateri æivljensko dobo doloœa hitrost metaboliœnih procesov, vsaj v grobih potezah, øe vedno velja. Pribliæno 50 let mlajøe ugotovitve, da za okrog 30% zniæan vnos kalorij za pribliæno enak odstotek podaljøa æivljensko dobo, so pripeljale do prve mehanistiœne povezave med hitrostjo metabolizma (pri tem so miøljeni predvsem oksidacijski procesi) in dolæino æivljenja. Prva, enostavna razlaga, tega pojava, po kateri zmanjøan vnos kalorij zniæa raven ROS v celicah, zaradi œesar se økodljive spremembe v organizmu nabirajo poœasneje in zato ta æivi dlje, se ni uspela potrditi v poskusih. Novejøe raziskave, ki so jim bile æe na voljo moderne molekularno bioloøke in druge tehnike so po eni strani ugotovile, da raven ROS v celicah ne doloœa le hitrost njihovega nastanka ampak tudi delovanje encimskih obrambnih sistemov, ki so se kot zaøœita pred ROS razvili v celici. Œe se raven ROS zaradi neuravnoteæenosti med njihovim nastajanjem in njihovim odstranjevanjem zaradi kakrønegakoli vzroka spremeni, pride do proæenja kompleksnih mehanizmov, ki v celici uravnavajo metabolne poti in se prek proæenja s strani ROS vkljuœujejo v raznih stresnih razmerah. Ti mehanizmi delujejo tudi na ravni genov, kjer prek akti-vacije in inaktivacije raznih transkripcijskih dejavnikov, vplivajo na gensko prepisovanje pa tudi podvojevanje in s tem na delitveno sposobnost celic in vrsto drugih procesov, ki so povezani s staranjem. Povezave med procesi staranja in motnjami na ravni DNK so bile ugotovljene tako na ravni samih genov, kjer lahko mutacije enega samega gena moœno skrajøa ali podaljøa æivljensko dobo, kot tudi na celiœni ravni, kjer so ugotovili, da je øtevilo delitev povezano z aktivnostjo telomeraz. Wernerjev sindrom pa je primer, kjer se dedna motnja na ravni podvajanja DNK, kaæe kot hitrejøa postara-nost celega organizma.
Med preprostimi æivalskimi modeli, kjer je bilo pridobljenega najveœ znanja o molekularnih mehanizmih staranja in œlovekom, obstajajo velike razlike, kar vzbuja dvom o moænosti da bi ti mehanizmi na enak naœin delovali tudi pri œloveku. Po drugi strani pa visoka konzervativnost komponent teh mehanizmov v posameznh æivalskih vrstah in ugotovitve, da so nekateri od teh mehanizmov v nekoliko preurejeni obliki in v nekoliko drugaœni soodvisnosti z drugimi sistemi prisotni tudi pri œloveku, vzbuja upanje, da bi bilo moæno z ustreznimi posegi na farmakoloøki ravni ali kakimi drugimi sredstvi,
farm vestn 2005; 56 65
Strokovni œlanki - Professional Articles
vplivati na procese staranja tudi pri œloveku. Mnogi raziskovalci pa seveda æe zdaj opozarjajo na vrsto etiœnih, socialnih in ekonomskih problemov, ki bi jih taki posegi utegnili povzroœiti.
Zahvala Avtor se zahvaljuje dr. Katarini Miø, asist. dr. Tomaæu Marøu in asist. mag. Marku Jevøku za njihov trud pri izdelavi slik.
5 Literatura
1.    Medvedev ZA. An attempt at a rational classification of theories of aging. Biol Rev Camb Philos Soc, 1990; 65: 375 – 398.
2.    Kirkwood TBL. Understanding the odd science of aging. Cell, 2005; 120: 437-447.
3.    Nemoto S, Finkel T. Ageing and the mystery of Arles. Nature, 2004; 429: 149-152.
4.    Dufour E, Larsson N-G. Understanding aging: revealing order out of chaos. Biochim Biophys Acta, 2004; 1658: 122-132.
5.    Rattan SI. Aging, anti-aging, and hormesis. Mech Ageing Dev, 2004; 125: 285-289.
6.    Kirkwood TB, Austad SN. Why do we age? Nature, 2000; 408: 233-238.
7.    Browner WS, Kahn AJ, Ziv E, Reiner AP, Oshima J, Cawthon RM, Hsueh WC, Cummings SR. The genetics of human longevity. Am J Med, 2004; 117: 851-860.
8.    Harman D. Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry. J. Gerontol, 1957; 2: 298-300.
9.    McCord JM, Fridovich I. Superoxide dismutaze. An enzymatic function for erythrocuperin (hemocuperin). J Biol Chem, 1969; 244, 6049-6055.
10.  Finkel T, Holbrook NJ. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature, 2000; 408: 239-247.
11.  Weindruch R. Caloric restriction and aging. Scient American, 1996; Jan: 32 – 38.
12.  Guarente L, Kenyon C. Genetic pathways that regulate ageing in model organisms.
Nature, 2000; 408: 255-262.
13.  Bordone L, Guarente L. Calorie restriction, SIRT1 and metabolism: understanding longevity. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005; 6: 298-305.
14.  Martin GM, Oshima J. Lessons from human progeroid syndromes. Nature, 2000; 408: 263-266.
15.  Epstein CJ, Motulsky AG. Werner syndrome: entering helicase era. Bioessays 1996; 18:1025-1027
16.  Dice JF. Cellular and molecular mechanisms of aging. Physiol Rev, 1993; 73: 149-159.
17.  Cotran RS, Kumar V, Collins T. Cellular pathology II: Adaptation, Intracellular Accumulations, and Cell Aging. In: Robbins pathologic basis of disease. 6th ed. Philadelphia: W.B.Saunders Company, 1999: 31-49.
18.  von Zglinicki T. Replicative senescence and the art of counting. Exp Gerontol, 2003; 38: 1259-1264.
66 farm vestn 2005; 56