Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2, 115–124. Agris category codes: P01 COBISS Code 1.01 ANALIZA TOKSI ČNOSTI IN GENOTOKSI ČNOSTI JEZERSKIH VODA Z BIOTESTI Ilja Gasan OSOJNIK ČRNIVEC a) in Romana MARINŠEK-LOGAR b) a) Univ. v Ljubljani, Biotehniška Fak., Odd. za zootehniko, Groblje 3, SI-1230 Domžale, Slovenija, b) isti naslov kot a) , prof., dr., mag., e-pošta: romana.marinsek@bfro.uni-lj.si. Delo je prispelo 14. novembra 2007, sprejeto 03. decembra 2007. Received November 14, 2007, accepted December 03, 2007. IZVLE ČEK Ustrezno izvajanje ukrepov za obvladovanje problematike onesnaženosti prostora je v veliki meri odvisno od nepretrganega spremljanja trenutnega stanja okolja. Zakonsko predpisane preiskave v Sloveniji ve činoma temeljijo na spremljanju fizikalnih in kemijskih kazalcev. Ker s takimi analizami ne moremo ugotoviti biološkega u činka, medsebojnega vpliva posameznih sestavin v vzorcu in bioaktivacije, je za celovitejši pregled mehanizmov in intenzivnosti vplivov okolja na organizme kemijsko fizikalne podatke potrebno dopolniti še z rezultati bioloških testov za toksi čnost in genotoksi čnost. V tej raziskavi smo preizkusili primernost komercialnega testnega kita za ugotavljanje toksi čnosti Thamnotoxkit F TM s sladkovodnim rakcem Thamnocephalus platyurus, primernost mikrobnega testa Ames s sevi TA97, TA98 in TA100 bakterije Salmonella typhimurium in kometnega testa z evkariontskim mikroorganizmom Tetrahymena thermophila za ugotavljanje genotoksi čnosti. Z izbranimi biotesti smo ovrednotili toksi čnost in genotoksi čnost vzorcev jezerske vode iz vzor čnih lokacij v Šaleški dolini in biološke u činke primerjali z izmerjenimi fizikalno-kemijskimi parametri. Klju čne besede: mikrobiologija / toksi čnost / genotoksi čnost / jezera / biotesti / varstvo okolja EVALUATION OF TOXIC AND GENOTOXIC POTENTIAL IN LAKE WATER SAMPLES BY BIOASSAYS ABSTRACT Preservation of the natural resources, valuable natural features and spatial characteristics plays an important role in the environmental management and is based on permanent environmental monitoring. For the time being, the current legislation regarding environmental monitoring in Slovenia is based mostly upon physicochemical analyses. Since the physicochemical analyses do not provide information about biological effects, interactions between sample compounds and bioactivation, bioassays have been considered for environmental monitoring supplementation. In the present study the adequacy of a commercial toxicity screening test Thamnotoxkit F TM , which includes a freshwater crustacean Thamnocephalus platyurus and two genotoxicity determination test, a standard microbial Ames plate incoroporation test with Salmonella typhimurium TA97, TA98 and TA100 strains and the comet assay with the eukaryotic microorganism Tetrahymena thermophila has been evaluated. With the selected biotests toxic and genotoxic effects of lake water samples from Šalek valley were evaluated and compared with the measured physicochemical values. Key words: microbiology / toxicity / genotoxicity / lakes / bioassays / environmental protection http://aas.bf.uni-lj.si Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 116 UVOD Rast svetovnega prebivalstva in razvoj ter pove čanje proizvodnje in obsega industrializacije sta povzro čila pove čano kopi čenje onesnaževal v okolju. Navkljub poznavanju tehnologij, ki nam omogo čajo obdelavo, recikliranje in ponovno uporabo odpadnih snovi, okolje še vedno obremenjujemo z izpusti v atmosfero, hidrosfero in litosfero. Prisotnost onesnaževal v okolju je spodbudila potrebo po razvoju dovolj natan čnih metod, s katerimi bi lahko ovrednotili škodljive vplive snovi na prisotne organizme, še posebno na zdravje ljudi. Zakonsko predpisane preiskave iz sklopa monitoringa okolja (površinskih voda) so ve činoma utemeljene na spremljanje fizikalnih in kemijskih kazalcev (Resolucija., Ur.l. RS, 2006; Uredba., Ur.l. RS, 2002). Pri izvajanju fizikalno-kemijskih analiz smo omejeni s spodnjo mejo občutljivosti, prav tako pa lahko z njimi zaradi cenovnih ali analitskih omejitev spremljamo le omejen nabor parametrov. S temi analizami ne moremo zaznati biološkega u činka, medsebojnega vpliva posameznih sestavin v vzorcu, deleža snovi, ki je organizmom dostopen in snovi, ki postanejo škodljive po bioaktivaciji (Josephy in sod., 1997; Derksen, 2002). Pomembna orodja v ekotoksikoloških raziskavah so bioanalitske metode. Ob pravilni izbiri testnega organizma v biotestu razmeroma u činkovito dopolnimo omenjene pomanjkljivosti fizikalno-kemijskih testiranj. Z ustreznim biotestom lahko potrdimo biološki u činek potencialnih onesnaževal v vzorcu na testne organizme, ne moremo pa identificirati specifi čnih snovi, ki so za odziv odgovorne (Derksen, 2002, Fendt, 2003). Pravni okvir za vklju čevanje biotestov v monitoring vodnih virov podaja t.i. Vodna direktiva 2000/60/EC, ki v aneksu v programu monitoringa ob spremljanju hidroloških in fizikalno-kemijskih parametrov predvideva tudi spremljanje bioloških elementov kakovosti vodnih teles. Šaleška dolina je zaradi svoje obremenjenosti z raznolikimi onesnaževali kmetijskega in industrijskega izvora vzor čni primer, kjer na onesnaženje vplivajo številne toksi čne snovi, zapletene in nam pogosto nepoznane strukture in kjer za potrebe izvajanja ukrepov izboljševanja stanja okolja zgolj izvajanje rutinskih fizikalno-kemijskih raziskav ni dovolj. Biološke metode, ki se v takšnih razmerah izkažejo primerne za vrednotenje (geno)toksi čnosti, se v nadaljevanju lahko uporabijo za dopolnitev monitoringa okolja na državni ravni. Za preverjanje toksi čnosti vzorcev jezerske vode smo v raziskavi preizkusili testni set Thamnotoxkit FTM s sladkovodnim rakcem Thamnocephalus platyurus. Za ugotavljanje genotoksi čnosti jezerskih vzorcev pa smo izbrali standardni test Ames s sevi TA97, TA98 in TA100 bakterije Salmonella typhimurium in kometni test z migetalkarjem Tetrahynema thermophila. Pri biološkem testiranju toksi čnosti in genotoksi čnosti smo sledili sodobnemu konceptu 3R, ki uveljavlja predvsem alternativne metode biološkega testiranja z mikroorganizmi in organizmi na nižjih stopnjah evolucijskega razvoja. MATERIAL IN METODE Vzorci jezerskih voda Šaleška dolina je bila v preteklih desetletjih med okoljsko najbolj obremenjenimi regijami v Sloveniji. Premogovništvo in pridobivanje elektri čne energije spreminjata kvaliteto in fiziognomijo regije z emisijami nevarnih dimnih plinov, pepela in drugih produktov, ki nastanejo pri pridobivanju termoenergije ter s spreminjanjem reliefa montanogenega ugrezanja površja (Šalej, 2002). Iz ugrezninskih jezer smo odvzeli štiri vzorce (J1 – Družmirsko jezero; J2 – Velenjsko jezero pri nasipu pepela; J3 – Velenjsko jezero pri čolnarni, na drugi strani kot J2; J4 – Škalsko jezero) in jih do uporabe shranili pri –20 °C. Osojnik Črnivec, I. G. in sod. Analiza toksi čnosti in genotoksi čnosti jezerskih voda z biotesti. 117 Fizikalno-kemijske analize jezerskih voda Na vzorcih jezerske vode smo opravili ve čino fizikalno-kemijskih analiz, ki so predpisane v programu monitoringa jezer (2006). Iz sklopa meritev na terenu smo ovrednotili motnost (SIST EN ISO 7027, 2000), redoks potencial (SIST DIN 38404-6; 2000), vrednost pH in temperaturo (SIST ISO 10523, 1996). Iz sklopa analiz vode smo testirali vsebnosti celotnega organskega in raztopljenega organskega ogljika (SIST ISO 8245, 2000), amonijevega (Hach DR/400 Spectrophometre Handbook, 1999) in nitratnega ter nitritnega dušika, sulfatov in kloridov (SIST EN ISO 10304-2, 1998), skupnega fosforja (SIST EN ISO 6878, 2004), kalcija in magnezija (SIST ISO 7980, 2000) ter natrija in kalija (SIST ISO 9964/1&3, 2000). Opravili smo analize slede čih težkih kovin: raztopljenega bakra, kadmija, kroma, niklja, svinca, arzena in cinka (SIST DIN 38406-29, 2000) ter živega srebra (SIST ISO 5666, 2000). Analizirali smo tudi vsebnost policikli čnih aromatskih ogljikovodikov: benzopirena, fluorantrena, benzofluorantrena, benzoperilena, indenopirena, naftalena, acenaftilena, acenaftena, fluorena, fenatrena, antracena, pirena, benzoantracena, krizena in dibenzoantracena (SIST EN ISO 17993, 2004 in EPA Method 550.1, 1990). Thamnotoxkit F TM Postopek testa smo izvedli po navodilih proizvajalca (Microbiotests Ltd.,Belgium; Standard Operational Procedur for Thamnotoxkit F TM , 2006 ). Pred samo izvedbo testa smo najprej vitalizirali li činke organizma iz mirujo čih cist. Ciste smo rehidrirali in 20 do 22 ur inkubirali pri temperaturi 25°C in pri neprekinjeni osvetlitvi 2800 lux. Nato smo za vsak vzorec jezerske vode pripravili pet razli čnih red čitev (100 %, 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %) in li činke red čitvenim vrstam vzorcev izpostavili v testnih ploš čah (4 vrste in 6 stolpcev vdolbin). Po 24 urni inkubaciji testnih ploš č pri 25°C v temi smo pod lupo prešteli število mrtvih rakcev. Rezultate testa Thamnotoxkit F TM izrazimo s parametrom LC 50 , t. j. kot koncentracijo vzorca, ki je smrtna za 50 % testne populacije. Za negativno kontrolo, valjenje cist in pripravo red čitvene vrste vzorcev smo uporabljali raztopino, ki jo v svojih metodah za ugotavljanje akutne toksi čnosti z vodnimi organizmi priporo ča Ameriška agencija za varstvo okolja (Standard methods for …, 2006). Test Ames Test Ames smo izvajali po postopku, ki sta ga opisala Maron in Ames (1983) s sevi TA97, TA98 in TA100 bakterije Salmonella typhimurium brez in z vklju čitvijo metabolne aktivacije z mešanico S9 (homogenat podganjih jeter). Kolonije smo prešteli po 48 urni inkubaciji na petrijevih ploščah pri 37°C. Mutageno aktivnost vzorcev smo izrazili s faktorjem indukcije (frekvenco mutacij). V skladu s priporo čili organizacij EPA in OECD, s testom Ames mutageni potencial vzorca potrdimo, kadar je frekvenca mutacij testne snovi 2,0 ali večja. Če je vrednost koli čnika frekvence mutacij vzorca in negativne kontrole med 1,7 in 1,9, tedaj lahko govorimo o potencialno mutagenem učinku testirane snovi. Če pa je ta vrednost nižja od 1,6 testni snovi ne pripisujemo mutagenega potenciala. Za pozitivne kontrole testa smo uporabili ICR-191 akridin (ICR), 4-nitroquinolin-N-oksid (4NQO), bezo piren (BP) in 2-aminofluoren (2AF) raztopljene v dimetil sulfoksidu (DMSO) in natrijev azid (NA) v vodi Mili-Q. Rezultate testa Ames smo statisti čno ovrednotili z programom GraphPadPrism, 3.02. Analizo variance smo opravili z enosmernim in neparametri čnim postopkom ANOVA (Kruskal-Walis test), test razlik med obravnavanimi skupinami pa s postopkom ve čkratne primerjave Dunnett C. Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 118 Kometni test z migetalkarjem Tetrahymana thermophila Kometni test ali elektroforezo posameznih celic, ki so ga razvili Singh in sod. (1988), smo prilagodili postopku, ki ga je za razli čico z migetalkarjem Tetrahymena thermophila razvila Lah (2004). Celice smo gojili v akseni čni laboratorijski kulturi v bogatem gojiš ču za praživali (Schultz, 1997). 24 ur pred izvedbo testa smo kulturo praživali inokulirali v gojiš ča z vklopljenimi vzorci, ki smo jih sterilizirali s filtracijo skozi 0,22 µm membranske filtre. Po 24 urah smo migetalkarje vklopili v agarozne minigele na mikroskopskih objektnikih. Sledila je alkalna liza celic (pH = 12,4 ), razvijanje DNA v elektroforetskem pufru, elektroforeza in nevtralizacija. DNA smo obarvali z etidijevim bromidom. Poškodbe jedrne DNA smo ovrednotili z epifluorescentnim mikroskopom in digitalno kamero ter programskim paketom Komet 5.0 za ra čunalniško analizo slike. Za oceno genotoksi čnosti smo izbrali parameter repni moment po Olivu (RM-Olive), ki upošteva vrednosti zajetih signalov v glavi in repu kometa: RM-Olive = (DNA glava – DNA rep ) x %DNA rep x 0,01 (Olive in sod., 1990). Pozitivni rezultat kometnega testa je statisti čno zna čilno pove čanje genotoksi čnosti v primerjavi z negativno kontrolo.Za negativno kontrolo smo gojili praživali Tetrahymena thermophila v gojiš ču z vklopljeno vodo MQ. Za pozitivno kontrolo smo celice iz istega gojiš ča izpostavili 500 mikro molarni raztopini vodikovega peroksida. Za statisti čno analizo podatkov smo prilagodili metodo, ki so jo opisali Verde in sod. (2006). Rezultate smo analizirali s programskim paketom R. Osnovne statisti čne parametre smo dolo čili s pomo čjo vgrajenih funkcij, razvoj in obdelavo modelov pa smo opravili z dodatkom za analizo preživetja, 'survival'. REZULTATI IN RAZPRAVA V industriji, kmetijstvu in doma čih gospodinjstvih dandanes uporabljamo številne potencialno (geno)toksi čne kemijske spojine (težke kovine, policikli čne aromatske ogljikovodike (PAH), poliklorirane bifenile (PCB), pesticide…) Te snovi, še posebno ksenobiotiki, so navzo če v kompleksnih mešanicah, ki so za prisotne organizme pogosto mutagene (Ohe in sod., 2004). V naši raziskavi smo z uporabo fizikalno-kemijskih analiz skušali ugotoviti koncentracije težkih kovin, PAH, pH, redoks potenciala, sulfatov, fosfatov, dušika in ogljika (pregl. 1). Ti parametri lahko pomembno vplivajo na toksi čni in genotoksi čnim potencial vzorca (Nieboer in Richardson, 1980), ki smo ga preverili s testom toksi čnosti Thamnotoxkit F TM, s testom mutagenosti Ames in s kometnim testom kot enem najob čutlivejših testov za geotoksi čnost. Uredba o kemijskem stanju površinskih voda (Uredba., Ur.l. RS, 2002) dolo ča mejne vrednosti fizikalno-kemijskih parametrov in merila za čezmerno obremenjenost površinskih voda. Fizikalno-kemijske analize vzorcev jezerske vode (pregl. 1) so pokazale, da nobeden od preiskovanih parametrov jezerske vode iz izbranih vzor čnih obmo čji (J1–J4) ni presegel predpisanih mejnih vrednosti. Vsebnosti vseh preiskovanih policikli čnih aromatskih ogljikovodikov so bile pod mejo kemijske detekcije (<0,04 µg L –1 ; rezultati niso prikazani v preglednici 1). Rezultati testa Thamnotoxkit F TM so za vse jezerske vzorce v vseh red čitvah pokazali tako majhno smrtnost testenega organizma, da izra čun LC 50 ni bil smiseln za nobeno od ponovitev testa (rezultati niso prikazani). Odzivi so se pri posameznih vzorcih nekoliko razlikovali, vendar smrtnost testnega organizma v nobenem primeru ni presegla 10 %, ki jih po normativih testa sicer lahko doseže sama negativna kontrola (Microbiotests Ltd., Belgium, Standard Operational Procedure for Thamnotoxkit F TM , 2006). Možno, je, da toksi čnosti nismo dokazali zaradi filtracije vzorcev pred testiranjem, s čimer smo lahko odstranili del toksi čnega bremena vzorca. Osojnik Črnivec, I. G. in sod. Analiza toksi čnosti in genotoksi čnosti jezerskih voda z biotesti. 119 Preglednica 1. Fizikalno-kemijske analize vzorcev jezerske vode Table 1. Physico-chemical parameters of lake water samples Vzorec Parameter Enote J1 J2 J3 J4 Meritve na terenu Temperatura °C 17,6 18,2 17,3 17,5 Vrednost pH / 8,60 8,28 8,26 8,29 Redoks potencial mV 484 489 483 487 Motnost FTU 7 14 7 15 Analize vode Ogljik – celotni organski TOC mgC L –1 13,1 14,5 16,4 17,7 Ogljik – raztopljeni organski DOC mgC L –1 8,97 9,97 10,90 11,80 Amonijev dušik mgN L –1 0,16 0,16 0,22 0,22 Nitratni dušik mgN L –1 0,55 1,02 1,04 0,79 Nitritni dušik mgN L –1 <0,3 <0,3 <0,3 <0,3 Sulfat mg L –1 38,5 44,5 8,73 28,5 Klorid mg L –1 5,84 29,60 30,10 12,40 Fosfor celotni – F mg L –1 0,05 0,03 0,04 0,03 Kalcij – Ca mg L –1 52,4 211,0 214,0 67,6 Magnezij – Mg mg L –1 14,0 15,2 14,2 20,8 Natrij – Na mg L –1 6,66 59,20 58,70 8,32 Kalij – K mg L –1 2,31 42,8 42,4 2,34 Težke kovine Arzen raztopljeni – As µg L –1 <0,5 1,3 1,4 0,5 Svinec raztopljeni – Pb µg L –1 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 Živo srebro – Hg µg L –1 <0,20 <0,20 <0,20 <0,20 Kadmij raztopljeni – Cd µg L –1 <0,5 <0,5 <0,5 <0,5 Krom raztopljeni – Cr µg L –1 <5,0 <5,0 <5,0 <5,0 Nikelj raztopljeni – Ni µg L –1 <1,0 1,5 1,7 <1,0 Cink raztopljeni – Zn µg L –1 <2,0 18,1 3,3 <2,0 Baker raztopljeni – Cu µg L –1 < 1,0 1,1 1,3 <1,0 Test akutne toksi čnosti Thamnotoxkit F TM spada v skupino mikrobiotestov. Ti biotesti zavzamejo malo laboratorijskega prostora, so cenovno ugodni, preprosti, hitri in ob čutljivi ter dajejo ponovljive rezultate (Derksen, 2002). Thamnotoxkit F TM spada med najob čutljivejše mikrobioteste (Willemsen in sod., 1995). V Sloveniji uporaba tega razmeroma novega testa toksi čnosti še ni razširjena. Sladkovodni škrgonožec Th. Platyurus, ki ga uporabljamo v tem testu, je ubikvitaren vodni organizem. Njegov najpogostejši življenjski prostor so presihajo či ribniki, začasna jezerca in luže. V ekotoksikoloških raziskavah s sladkovodnimi rakci pogosto vrednotimo prisotnost toksi čnih u činkov onesnaževal v vzorcih površinskih voda (Stark in Banks, 2003). Zaradi navedenih vzrokov je bil ta biotest v raziskavi toksi čnosti jezerskih voda tudi izbran. Kljub temu, da rezultati testa akutne toksi čnosti Thamnotoxkit F TM niso potrdili toksi čnega u činka vzorcev jezerske vode, toksi čnosti na podlagi enega biotesta še ne moremo izklju čiti. Za boljši pregled toksi čnih u činkov jezerskih voda iz Šaleške doline in biološke ustreznosti preizkušenega testnega kita bi bilo potrebno vzorce pregledati še z drugimi testi toksi čnosti v katerih so zastopani testni organizmi z razli čnih taksonomskih nivojev in z razli čni končni odzivi. Rezultati testa Ames z in brez vklju čitve metabolne aktivacije so predstavljeni v preglednici 2. S sevom TA97 smo pri testu z aktivacijo dokazali mutageni potencial vzorcev 2 in 3. Pri testu brez aktivacije kaže potencialni mutageni u činek le vzorec 2 (pregl. 2). Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 120 Table 2. Results of the Ames test with (+S9) and without (–S9) activation of four lake water samples tested with the bacteria S. typhimurium strains TA97, TA98 and TA100 expressed as mean (P) and standard deviation (SD) of revertants/plate and induction factors (IF) Preglednica 2. Rezultati Ames testa z (+S9) in brez (–S9) aktivacije vzorcev jezerske vode, testiranih s TA97, TA98 in TA100 sevi bakterije S. typhimurium, podani kot povpre čje (P) in standardni odklon (SD) števila revertant/ploš čo in faktor indukcije (IF) TA97 TA98 TA100 Vzorec Št. revertant ploš čo Faktor indukcije Št. revertant Ploš čo Faktor indukcije Št. revertant ploš čo Faktor indukcije –S9 60,5±20,5 1 26±3 1 87,0±5,3 1 Negativna kontrola P±SD IF±SD P±SD IF±SD P±SD IF±SD J1 91,0±36,8 1,50±0.50 25,6±6,8 0,98±0,26 86,9±12 0,99±0,14 J2 105,5±24,8 1,74±0,35 19,9±3,4 0,76±0,13 73,2±13,7 0,84±0,15 J3 98,8±11,1 1,63±0,22 24,8±5,2 0,95±0,20 68,6±15,3 0,78±0,17 J4 71,7±24,9 1,18±0,36 22±4,4 0,84±0,17 78,1±9,2 0,89±0,10 ICR (0,1 µg/ploš čo) 163,3±25,9 2,7±0,43 4NQO (0,5 µg/ploš čo) 347,5±4,9 13,4±0,21 NA (3,0 µg/ploš čo) 221,3±7,4 2,54±0,08 +S9 59,0±6,2 1 15,7±3,2 1 65,5±4,9 1 Negativna kontrola Povp.±SD IF±SD povp.±SD IF±SD povp.±SD IF±SD J1 75,5±31,3 1,28±0,57 19,3±3,5 1,23±0,23 66,1±12 1,00±0,18 J2 131,1±33,2 2,22±0,55 18,1±6,3 1,15±0,42 63,3±16,1 0,96±0,26 J3 139,9±18,6 2,37±0,15 21,9±4,5 1,39±0,28 63,6±17,1 0,97±0,26 J4 96,8±18,2 1,64±0,25 21,1±5,2 1,34±0,33 48,8±8,3 0,74±0,12 BP (50 µg/ploš čo) 104,0±13,0 1,76±0,21 2AF (10 µg/ploš čo) 494,7±4,0 31,50±2,51 191,0±35,2 2,92±0,67 Test Ames se zelo pogosto uporablja v monitoringu mutagenosti voda in je najbolje validiran in razširjen in vitro test za identifikacijo mutagenega potenciala tako posameznih poznanih snovi kot kompleksno sestavljenih okoljskih vzorcev. S testom dokazujemo sposobnost sestavin vzorca za indukcijo to čkovnih mutacij, ki so vzrok številnih genetskih bolezni. Pozitivni rezultati tega bakterijskega testa kažejo, da testna snov/mešanica snovi inducira to čkovne mutacije z zamenjavo baz ali premikom bralnega okvirja v genomu Salmonella typhimurium. Negativni rezultati kažejo, da testna snov/mešanica snovi pri takšnih testnih pogojih ni mutagena za izbrani testni organizem (Koivusalo in Vartiainen, 1995). Seva TA97 inTA98 zaznavata mutagene snovi, ki so sposobne indukcije premika bralnega okvirja v histidinskem genu in tako spremenijo mutanto nazaj v divji tip. Takšne snovi so npr. nitroareni, aromatski amini in žveplo vsebujo če heterocikli čne spojine. Sev TA100 pa zaznava mutagene snovi, ki so sposobne zamenjave baz (GC para) v mutiranem genu. Mnoge mutagene snovi pa imajo sposobnost indukcije revertant obeh sevov (Chen in White, 2004). Kljub temu, da analizirani fizikalno-kemijski parametri vzorcev jezerskih voda v našem primeru niso presegali mejnih vrednosti, smo s testom Ames v vzorcu 3 zaznali prisotnost snovi, ki za mutageno delovanje potrebujejo bioaktivacijo, v vzorcu 2 pa tudi tiste, ki so direktno mutagene.Vzorca 2 in 3 se od ostalih dveh razlikujeta po ve čji vsebnosti nitratnega dušika in nekaterih težkih kovin, ki bi eventualno lahko bili induktorji mutacij, vsebujeta pa tudi ve čje koli čine klorida, kalcija in natrija (pregl. 1). Številni avtorji poro čajo, da je zaradi kombiniranja sestavin v vzorcu (npr. sinergizma in antagonizma) izredno težko dolo čiti povezave med vsebnostjo posameznih onesnaževal v vzorcu in rezultati testov (geno)toksi čnosti (Bekaert in Osojnik Črnivec, I. G. in sod. Analiza toksi čnosti in genotoksi čnosti jezerskih voda z biotesti. 121 sod., 1999). V vodnih vzorcih pogosto zaznamo težke kovine, PAH, PCB ali pesticide, vendar vsebnosti teh kemikalij pogosto ne korelirajo z ocenjeno (geno)toksi čnostjo vzorca (Ohe in sod., 2004). Prav tako številna so poro čila, kjer rezultati fizikalno-kemijskih analiz ne zaznavajo (geno)toksi čnih snovi, vendar preiskovani vzorci vseeno izražajo (geno)toksi čne u činke (Maron in Ames, 1983; Donnely in sod., 1995). S kometnim testom z migetalkarjem T. thermophila za noben vzorec jezerske vode nismo dokazali genotoksi čnega potenciala, saj stopnja poškodb DNA, ki so jih povzro čili vzorci jezerske vode ni bila statisti čno zna čilno ve čja kot pri negativni kontroli. Rezultate kometnega testa prikazuje slika 1. N. kontrola J1 J2 J3 J4 0 10 20 30 40 50 60 Vzorci jezerskih voda Stopnja poškodovanosti DNA (OTM) Figure 1. Nuclear DNA damage in T. thermophila treated with lake water samples represented as OTM (Olive tail moment). Results from 100 comets for each water sample are shown as box- and-whiskers plots. 50 % of the OTM data are included in the boxes. The inner lines mark the median values and the top and bottom whiskers represent 25 th and 75 th percentiles. Slika 1. Poškodbe jedrne DNA na celicah T. thermophila, izražene z OTM (repni moment po Olivu) po izpostavitvi vzorcem jezerske vode. Rezultati 100 ocenjenih celic so prikazani v grafikonu z okvirji z ro čaji. Okvirji obsegajo 50 % vrednosti OTM. Vmesne meje predstavljajo mediane, zgornji in spodnji ro čaji pa 25. in 75. percentile. Stopnje poškodb DNA, ki so jih povzro čili vzorci jezerskih voda, so bile celo manjše, kot pri negativni kontroli. Idealna negativna kontrola, 'kontrolna jezerske vode', bi namre č morala vsebovati vse sestavine jezerske vode, z izjemo genotoksi čnih sestavin. Sestavine, ki so v manjših koli činah lahko prisotne v jezerski vodi (mikroelementi…), bi na testni organizem lahko delovale celo zaš čitno in zmanjšale genotoksi čni odziv. Bekaert in sod. (2002) poro čajo, da je ocena onesnaženosti okolja v filtriranih izlužkih vzorcev zemlje lahko podcenjena. Na podlagi takih poro čil lahko predvidevamo, da je filtracija vzorcev lahko vplivala tudi na podcenitev genotoksi čnega vpliva vzorcev jezerske vode v našem primeru. V številnih ekotoksikoloških študijah se je test Ames izkazal za manj ob čutljivega kot kometni test (Musatova in sod., 1999; Lah in sod., 2005), kar se v naši raziskavi ni pokazalo. Predvidevamo, da so v vzorcih jezerskih voda Šaleške doline prisotne snovi, ki delujejo mutageno, ne povzro čajo pa enoverižnih prelomov DNA, ki jih sledimo z alkalno razli čico kometnega testa. Rezultati biotestov toksi čnosti in genotoksi čnosti obi čajno niso direktno primerljivi. Ker imajo snovi, ki delujejo toksi čno v organizmih druga čna prijemališ ča kot genotoksi čne snovi, Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 122 imajo dolo čene substance lahko samo toksi čni u činek in ne genotoksi čnega ter obratno (Chroust in sod., 2006). Toksi čne snovi najve čkrat posegajo v delovanje celi čnega metabolizma, na encimatskem ali hormonalnem (Hill in sod., 2002) nivoju oz. preko mehanizmov oksidativnega stresa (Hoffman, 2002). Genotoksi čne u činkovine najpogosteje povzro čajo poškodbe DNA ali/in inhibirajo samopopravljalne mehanizme DNA (Bertin in Averbeck, 2006). V naši raziskavi nismo dokazali toksi čnega potenciala jezerskih voda v Šaleški dolini, dokazali pa smo mutageni potencial v dveh vzorcih. Zanesljivost teh rezultatov pa je potrebno potrditi z uporabo ve čjega števila biotestov z organizmi ali celicami na razli čnih trofi čnih nivojih. V ekotoksikoloških raziskavah želimo pridobiti širši vpogled na dogajanja v okolju. Celostni pristop do problematike lahko dosežemo le s kombiniranjem fizikalno-kemijskih analiz z dobro izbranim naborom biotestov. Če z biotestom potrdimo škodljive u činke okolja, lahko glede na karakteristike danega okolja in študije poti in na činov prenosa onesnaževal v ekosistemu s fizikalno-kemijskimi analizami identificiramo in kvantificiramo znane in tudi potencialno (geno)toksi čne snovi. SKLEPI Za celovitejši pregled mehanizmov in intenzivnosti vpliva okolja na organizme je rezultate uveljavljenih metod fizikalno-kemijskih analiz potrebno dopolniti še z biološkim testiranjem toksi čnosti in genotoksi čnosti. Pred dokon čno oceno biološke relevantnosti izbranega nabora biotestov za vrednotenje vzorcev površinskih voda, bi bilo v nadaljnjih preu čevanjih obravnavanih vzorcev potrebno preizkusiti ve č razli čnih biotestov toksi čnosti s testnimi organizmi razli čnih taksonomskih nivojev in razli čnimi kon čnimi odzivi. Vse v tej raziskavi uporabljene bioteste za toksi čnost in genotoksičnost bi bilo potrebno tako prilagoditi, da bi lahko testirali nefiltrirane vzorce jezerskih vod. Predvidevamo, da bi bili rezultati v takem primeru lahko druga čni in bolj zanesljivi. SUMMARY Every day thousands of chemical compounds are released into the atmosphere, land and water bodies. Thus numerous contaminants, especially xenobiotics, can eventually be found found in surface waters and sediments. Some include toxic, genotoxic compounds or/and potent carcinogens. These hazardous components and their degradation metabolites affect aquatic and soil ecosystems and ultimately human health. Coal and lignite-mining and their use for heating, industry, nearby thermal power plant and lead smelter, traffic and agriculture have all left severe ecological consequences in Slovenian industrial region of Šalek valley. Physicochemical analyses of four lake water samples have been supplemented with a battery of selected biotests. A commercial toxicity screening test Thamnotoxkit F TM , which includes a freshwater crustacean Thamnocephalus platyurus and two genotoxicity determination tests, a standard Ames plate incorporation test with Salmonella typhimurium TA97, TA98 and TA100 strains and the comet assay with the ciliate Tetrahymena thermophila have been performed. The results of physicocemical analyses showed no positive deviation from the limit values of Slovenian Decree on the chemical status of surface waters. Also the results of the Thamnotoxkit F TM and the comet assay showed no genotoxic activity. The results of the Ames test confirmed the mutagenic potential of lake water samples 2 and 3 (both from lake of Velenje). The suggested biotest battery has to be further extended and examined before a conclusion of its biological relevance toward surface water ecotoxicity can be drawn. Osojnik Črnivec, I. G. in sod. Analiza toksi čnosti in genotoksi čnosti jezerskih voda z biotesti. 123 VIRI Bertin, G./ Averbeck, D. Cadmium: cellular effects, modifications of biomolecules, modulation of DNA repair and genotoxic consequences (a review). Biochimie, 88(2006), 1549–1559. Bekaert, C./ Rast, C./ Ferrier, V./ Bispo, A./ Jourdain, M.J./ Vasseur, P. Use of in vitro (Ames and Mutatox) and in vivo (Amphibian Micronucleus test) assays to asses the genotoxicity of leachates from contaminated soil. Organic Geochemistry, 30(1999), 953–962. Bekaert, C./ Ferrier, V./ Marty, J./ Pfohl-Leszkowicz, A./ Bispo, A./ Jourdain, M.J./ Jauzein, M./ Lambolez-Michael, L./ Billard, H. Evaluation of toxic and genotoxic potential of stabilized industrial waste and contaminated soils. Waste Management, 22(2002), 241–247. Chen, G./ White, P.A. The mutagenic hazards of aquatic sediments: a review. Mutation research, 567(2004), 151–225. Chroust, K./ Pavlova, M./ Prokop, Z./ Mendel, J./ Božkova, K./ Kubat, Z./ Zaji čkova V./ Damborsky J./ Quantitative structure–activity relationships for toxicity and genotoxicity of halogenated aliphatic compounds: Wing spot test of Drosophila melanogaster. Chemosphere, 2006, v tisku. Derksen, J.G.M. Microbiotests, Possibilities and Limitations. With special reference to (sub)tropical conditions and developing countries. Amsterdam, Aquasense, 2000, 76 str. Donnely, K.C./ Safe S.H./ Randerath, K./ Randerath, E. Bioassays-based risk assessment of complex mixtures. Journal of hazardous materials, 14(1995), 341–350. EPA Method 550.1, Determination of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Drinking Water by Liquid-Solid Extraction and HPLC with Coupled Ultraviolet and Fluorescence Detection, 1990, 22 str. Fendt, K. Ecotoxicological Problems Associated with Contaminated Sites. Toxicology Letters, 140–141(2003), 353–365. Hach DR/400 Spectrophometre Handbook, Loveland, 1999. Hill, M./ Stabile, C./ Kraig Steffen, L./ Hill A. Toxic effects of endocrine disrupters on freshwater sponges: common developmental abnormalities. Environmental Pollution, 117(2002), 295–300. Hoffman D.J. Role of selenium toxicity and oxidative stress in aquatic birds. Aquatic Toxicology, 57(2002), 11–26. Josephy, P.D./ Gruz, P./ Nohmi, T. Recent Advances in the Construction of Bacterial Genotoxicity Assays. Mutation Research, 386(1997), 1–23. Koivusalo, M./ Vartiainen, T. Drinking water mutagenicity and leukemia lymphomas and cancers of the liver, pancreas and soft tissue. Archives of Environmental Health, 50(1995), 269–76. Lah, B./ Malovrh, Š./ Narat, M./ Čepeljnik,T./ Marinšek-Logar, R. Detection and quantification of genotoxicity in wastewater-treated Tetrahymena thermophila using the comet assay. Environ. toxicol.,19( 2004), 545–553. Lah, B./ Žinko, B/ Narat, M./ Marinšek Logar, R. Monitoring of Genotoxicity in Drinking Water Using in vitro Comet Assay and Ames Test. Food Technology and Biotechnology, 43 (2005), 139–146. Maron, D.M./ Ames, N.B. Revised methods for the Salmonella typhimurium mutagenicity assay. Mutation Research, 113(1983), 211–245. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. Fifth edition. United States Environmental Protection Agency, 2002, 275 str. Musatova, S.A./ Anisimov, V.N./ Andre, V./ Vigreux, C./ Godard, T./ Sichelc F. Effects of melatonin on N-nitroso- N-methylurea-induced carcinogenesis in rats and mutagenesis in vitro (Ames test and COMET assay). Cancer Letters, 138(1999), 37–44. Nieboer, E./ Richardson, D.H.S. The replacement of the nondescript term heavy metals by a biologically and chemically significant classification of metal ions. Environmental Pollution, 1(1980), 3–26. Ohe, T./ Watanabe, T./ Wakabayashi, K. Mutagens in surface waters: a review. Mutation Research 567(2004), 109–149. Olive, P.L./ Banáth, J.P./ Durand, R.E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the “comet” assay. Radiation Research, 112(1990), 86–94. Program monitoringa kakovosti jezer v letu 2006. Ljubljana, Ministrstvo za okolje in prostor, Agencija Republike Slovenije za okolje, 2006, 24 str. Resolucija o nacionalnem programu varstva okolja 2005–2012, Ur.l. RS št. 2(2006), 3. Singh, N.P./ McCoy, M.T./ Tice, R.R./ Schneider, E.L. A Simple Technique for Quantitation of Low Levels of DNA Damage in Individual Cells. Experimental Cell Research, 175(1988), 184–191. SIST DIN 38404-6. Nemške standardne metode za preiskavo vode, odpadne vode in usedlin – Fizikalni in fizikalno- kemijski parametri (skupina C) – Dolo čevanje redoks potenciala (C 6), (2000), 10 str. SIST DIN 38406-29, Nemške standardne metode za preiskavo vode, odpadne vode in usedlin – Kationi (skupina E) – 29. del: Dolo čevanje 61 elementov z masno spektrometrijo z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-MS) (E29), 2000, 25. str. Acta agriculturae Slovenica, 90(december 2007)2. 124 SIST EN ISO 10304-2, Kakovost vode – Dolo čevanje raztopljenih anionov z ionsko kromatografijo – 2. del: Dolo čevanje bromida, klorida, nitrata, nitrita, ortofosfata in sulfata v odpadni vodi. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 1998, 21 str. SIST EN ISO 17993, Kakovost vode – Dolo čevanje 15 policikli čnih aromatskih ogljikovodikov (PAH) v vodi s tehniko HPLC s fluorescen čno detekcijo po ekstrakciji teko če-teko če. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2004, 23 str. SIST EN ISO 6878, Kakovost vode – Dolo čevanje fosforja – Spektrometrijska metoda z amonijevim molibdatom. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, (2004), 23 str. SIST EN ISO 7027, Kakovost vode - Ugotavljanje motnosti. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 10 str. SIST ISO 10381-6. Kakovost tal - Vzor čenje - 6. del. Navodilo za zbiranje, ravnanje in hranjenje tal za oceno aerobnih mikrobioloških procesov v laboratoriju. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 1993, 4 str. SIST ISO 10523, Kakovost vode - Dolo čanje pH. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 1996, 10 str. SIST ISO 11464. Kakovost tal – Priprava vzorcev za fizikalno-kemijske analize. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 1994, 11 str. SIST ISO 5666, Kakovost vode – Dolo čevanje živega srebra. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 16 str. SIST ISO 7980, Kakovost vode - Dolo čevanje kalcija in magnezija - Atomska absorpcijska spektrometrijska metoda. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 5 str. SIST ISO 8245, Kakovost vode – Smernice za dolo čevanje celotnega organskega ogljika (TOC) in raztopljenega organskega ogljika (DOC). Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 11 str. SIST ISO 9964-1, Kakovost vode – Dolo čevanje natrija in kalija – 1. del: Dolo čevanje natrija z atomsko absorpcijsko spektrometrijo. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 4 str. SIST ISO 9964-2 Kakovost vode – Dolo čevanje natrija in kalija – 2. del: Dolo čevanje kalija z atomsko absorpcijsko spektrometrijo. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 4 str. SIST ISO 9964-3, Kakovost vode – Dolo čevanje natrija in kalija – 3. del: Dolo čevanje natrija in kalija s plamensko atomsko spektrometrijo. Geneve, Switzerland, International Organization for Standardization, 2000, 5 str. Schultz, T.W. Tetratox: Tetrahymena pyriformis population growth impairment endpoint-a surrogate for fish lethality. Toxicology Methods, 7(1997), 289–309. Stark, J.D./ Banks, E.J. Population Level Effects of Pesticides and other Toxicants on Arthropods. Annual Review of Entomology, 48(2003), 505–519. Šalej, M. Odnos prebivalcev obremenjenih obmo čij do okolja in okoljskih problemov na vzor čnih primerih Šaleške doline in Zasavja. Velenje. ERICo Velenje, Inštitut za ekološke raziskave. Dela, 18(2002), 378–399. Uredba o kemijskem stanju površinskih voda. Ur.l. RS št. 11(2002), 461. Verde, P.E./ Geracitano, L.A./ Amado, L.L./ Rosa, C.E./ Bianchini, A./ Monserrat, J.M. Application of public- domain statistical analysis software for evaluation and comparison of comet assay data. Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 604(2006), 71-82. Willemsen, A./ Vaal, M.A./ de Zwart, D. Microbiotests as tools for environmental monitoring. Bilthoven, National Institute of Publick Health and Environmental Protection (RIVM), 1995, 39 str. White, P.A. The genotoxicity of priority polycyclic aromatic hydrocarbons in complex mixtures. Mutation Research, 515(2002), 85–98. Zang, Y./ Zhong, Y./ Luo, Y./ Kong, Z.M. Genotoxicity of Two Novel Pesticides for the Earthworm Eisenia fatida. Environmental Pollution, 108(2000), 271–278.