3/2018 letnik CXX70 ZDRAVJE ČEBEL Patogenost različnih genotipov bakterije Genotipi ERIC izločajo različne dejavnike patogenosti, s katerimi poškodujejo čebeljo ličinko. Ugotovili so, da P. larvae izloča številne biološko aktivne snovi s protibakterij- sko, protiglivno in celo protivirusno dejavnostjo. P. larvae je obligatorni ubijalec, kar pomeni, da za preživetje v po- pulaciji čebel neizbežno usmrti svojo gostiteljico – čebeljo ličinko. Vse to vodi v slabljenje in propad celotne čebelje Huda gniloba čebelje zalege (HGČZ) je najnevar- nejša bakterijska bolezen čebel. Povzroča jo spo- rogena po Gramu pozitivna bakterija Paenibacillus larvae (P. larvae). Bakterija ima obliko ravne ali ra- hlo ukrivljene paličke zaobljenih robov. Z moleku- larno metodo ERIC PCR so ugotovili, da se povzro- čitelj bolezni pojavlja v štirih biološko pomembnih genotipih ERIC I, II, III in IV. Genotipi se med seboj razlikujejo tudi v virulenci. V kliničnih izbruhih bo- lezni po svetu se pojavljata samo genotipa ERIC I in ERIC II, medtem ko genotipov ERIC III in IV ne ugotavljajo v izbruhih bolezni, sta pa shranjena v mednarodni zbirki bakterijskih kultur. Povzročitelj in laboratorijska diagnostika hude gnilobe čebelje zalege Alenka Žugelj, dr. vet. med.1 in Jerica Vreček Šulgaj, dr. vet. med.2 1 VF NVI, enota Maribor-Ptuj, 2 Inštitut za patologijo, divjad, ribe in čebele, Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta alenka.zugelj@vf.uni-lj.si, jerica.vreceksulgaj@vf.uni-lj.si P. larvae – ravna oz. rahlo ukrivljena paličasta bakterija zaobljenih robov Fo to : h ttp :// qu ec on ce ito .co m .b r/p at og en ico Spore – edina kužna oblika P. larvae Fo to : h ttp :// te ca .fa o.o rg /c om m en t/3 31 4 družine. Znano je, da so genotipi ERIC II, III in IV hitri ubi- jalci in povzročijo smrt ličinke v šestih do sedmih dneh po okužbi. So zelo pato- geni za posamezno ličinko, vendar čebe- lja zalega v tem času še ni pokrita s satnimi pokrovci, kar odraslim čebelam či- stilkam omogoča učinkovito čiščenje okuženih in spreme- njenih satnih celic. Genotipi ERIC I so na ravni posamezne čebelje ličinke manj patogeni in povzročijo njeno smrt šele v dvanajstih dneh po okužbi. Takrat je čebelja zalega že po- krita in zato so čebele čistilke takrat manj oziroma neučin- kovite pri odstranjevanju okužene zalege iz panja. P. larvae genotip ERIC I je tako manj patogen na ravni posamezne čebelje ličinke, vendar učinkovitejši na ravni celotne čebe- lje družine. Diagnostika bolezni V Sloveniji izvajamo diagnostiko hude gnilobe čebelje zalege na več ravneh, odvisno od razpoložljivih anamne- stičnih, kliničnih in epidemioloških podatkov o določenem čebelarstvu. Laboratorijsko diagnostiko hude gnilobe če- belje zalege opravimo, kadar je postavljen sum na bolezen v čebelji družini na podlagi značilnih kliničnih znakov. Za potrditev suma bolezni veterinar specialist za zdravstveno varstvo čebel VF NVI odvzame ostanke bolezensko spreme- njene zalege, to je vlecljivo maso, iz okužene satne celice. V laboratorijih VF NVI opravimo bakteriološko preiskavo vzorcev. Spremenjeno zalego nasadimo na gojišča in jo inkubiramo na 37 °C za tri do sedem dni. Iz brisa vleclji- ve mase zraste P. larvae dokaj hitro, prve kolonije lahko že po dveh dneh inkubacije. Iz kliničnega materiala večinoma zrastejo v čisti kulturi, kar je posledica izločanja zaviralnih snovi P. larvae, ki inhibirajo rast drugih bakterij. Rast P. lar- vae na gojišču ugotavljamo kot prisotnost značilnih kolonij, skupkov bakterijskih celic. Kolonije P. larvae se pojavljajo v različnih oblikah, barvah in strukturi. Kolonije P. larvae, značilne za genotip ERIC I, so belkasto sive, hrapave z neravnimi robovi. Gladke pigmentirane ko- lonije so značilne za genotip ERIC II. Pojavljanje različnih genotipov ERIC v izbruhih bolezni v Sloveniji še ni pozna- no. Naši izolati P. larvae kažejo veliko pestrost v morfologiji 3/2018 letnik CXX 71 ZDRAVJE ČEBEL zraslih kolonij, zato dopuščamo možnost, da pripadajo raz- ličnim tipom ERIC. V medu ugotavljamo prisotnost spor povzročitelja bo- lezni. Pregledujemo lahko med posameznih panjev, ki so lahko različno močno okuženi, ali skupni vzorec medu. Pri skupnem vzorcu je rezultat lahko manj natančen, ker se med slabo meša in je število spor v isti posodi lahko neena- komerno razporejeno. Za preiskavo potrebujemo najmanj 50 g medu. Vzorec ustrezno obdelamo in sadimo na gojišča ter inkubiramo na 37 °C za tri do sedem dni. Za razliko od vzorcev iz zalege P. larvae iz vzorcev medu večkrat zraste ob prisotnosti drugih bakterij iz okolja, ki tudi ustvarjajo spo- re. Večkrat tudi ugotavljamo, da kljub intenzivni rasti spo- rogenih kontaminantov P. larvae izloča antibiotične snovi, ki zavirajo njihovo rast, kar se kaže v obliki zaviralne cone. S sporami onesnažen med predstavlja pomemben vir okužbe za čebeljo družino in se ne uporablja za hranjenje čebel. Za preiskavo medu se odločimo predvsem, ko obstaja možnost prenosa bolezni, bolezen pa klinično še ni izražena, saj lahko spore P. larvae v medu dokažemo že pred pojavom kliničnih znakov. Ko se pojavijo klinični znaki, je v medu na- vadno že več tisoč spor na 1 g medu. Po podatkih iz literatu- re naj bi na gojiščih vzklila približno vsaka dvatisoča spora. Število spor v medu pa ni vedno v korelaciji z iz- bruhom bolezni. Izjemoma je v medu lahko prisotnih tudi več milijonov spor brez prisotnosti kliničnih zna- kov bolezni, kar lahko nakazuje na nedovoljeno uporabo antibiotikov. Ugotovljeno približno število spor v medu je čebelarju lahko v pomoč pri spremljanju bolezni. Pri ugotovlje- nem velikem številu spor v medu se priporoča posebna skrbnost pri spre- mljanju zdravstvenega stanja čebelje družine. Diagnostične metode se izboljšujejo Značilne bakterijske kulture, ki zrastejo na gojišču, je treba še potr- diti oziroma identificirati do vrste P. larvae. To lahko naredimo s kom- binacijo nekaterih klasičnih mikro- bioloških metod, ki so zamudne in manj zanesljive. V zadnjem času jih je že nadomestila metoda masne spektrometrije (MALDI TOF), ki se je izkazala za zelo hitro in zanesljivo. Z namenom boljšega spremlja- nja širjenja bolezni v Sloveniji na VF NVI trenutno uvajamo moleku- larne metode ugotavljanja prisotnosti različnih genotipov ERIC. Pričakujemo, da nam bo prevalenca genotipov ERIC v pomoč pri boljši diagnostiki bolezni tudi v povezavi z ge- notipsko značilno klinično sliko. Spremenjene celice čebelje zalege s prizadetimi ličinkami, ki razpadejo v vlecljivo maso (levo), in kolonije P. larvae na gojišču po sedmih dneh bakteriološke preiskave (desno). Fo to : A le nk a Ž ug el j Različne barve in oblike kolonij P. larvae Fo to : A le nk a Ž ug el j Fo to : A le nk a Ž ug el j Cone zaviranja rasti kontaminantov zaradi antibiotičnih snovi P. larvae Aparatura MALDI TOF za hitro in zanesljivo identifikacijo P. larvae Fo to : w w w. qu ila ba n. pt /e n- us /C om pa ny /N ew s/A rti cle Id /4 9/ im pl em en ta tio n- of -m al di -to f-t ec no lo gy -in -p or tu ga l