Metka Voga VPLIV IZBRANIH DEJAVNIKOV NA PROLIFERACIJO IN DIFERENCIACIJO MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV IN MAČK Doktorska disertacija Ljubljana, 2021 UDK 612.014:576.32/.36:611.018.3:611.013.1:636.7/.8(043.3) Metka Voga, dr. vet. med. VPLIV IZBRANIH DEJAVNIKOV NA PROLIFERACIJO IN DIFERENCIACIJO MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV IN MAČK Doktorska disertacija EFFECT OF SELECTED FACTORS ON PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF CANINE AND FELINE ADIPOSE DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS Doctoral dissertation Ljubljana, 2021 Metka Voga, Vpliv izbranih dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic iz maščobnega tkiva psov in mačk Delo je bilo opravljeno v Laboratoriju za genomiko na Inštitutu za predklinične vede Veterinarske fakultete v Ljubljani. Raziskovalno delo je bilo delno izvedeno tudi na Odseku za nanostrukturne materiale Inštituta Jožef Štefan v Ljubljani in na Zavodu Republike Slovenije za transfuzijsko medicino v Ljubljani. Mentor: prof. dr. Gregor Majdič Somentorica: doc. dr. Ana Nemec Člani strokovne komisije za oceno in zagovor: Predsednica: prof. dr. Nataša Tozon Član: doc. dr. Uroš Rajčević Član: izr. prof. dr. Matjaž Jeras Izjava o delu: Izjavljam, da je doktroska disertacija rezultat lastnega raziskovalnega dela, da so rezultati korektno navedeni in nisem kršila avtorskih pravic in intelektualne lastnine drugih. Izjavljam, da je elektronski izvod identičen tiskanemu. Lenja Voga, 6 let »I AM AMONG THOSE WHO THINK THAT SCIENCE HAS GREAT BEAUTY. A SCIENTIST IN HIS LABORATORY IS NOT ONLY A TECHNICIAN, HE IS ALSO A CHILD PLACED BEFORE NATURAL PHENOMENA WHICH IMPRESS HIM LIKE A FAIRY TALE« - Marie Curie M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 5 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija IZVLEČEK Ključne besede: mezenhimske matične celice – citologija; celična proliferacija – fiziologija; celična diferenciacija – fiziologija; celične kulture – metode; biomateriali – metabolizem; svilni fibroin – metabolizem; hondrogeneza – fiziologija; psi; mačke Matične celice so v zadnjih letih zaradi svojih edinstvenih lastnosti postale vir razvoja regenerativne medicine in tkivnega inženirstva. Ker različne lastnosti mezenhimskih matičnih celic (MSC) v pogojih in vitro lahko vodijo v potencialno različen terapevtski učinek, je temeljnega pomena odkrivanje vplivov različnih dejavnikov na značilnosti MSC. Uveljavljena podlaga za gojenje MSC je plastična osnova, vendar se zaradi boljšega posnemanja naravnega celičnega okolja za gojenje celic vedno bolj poudarja pomen uporabe celičnih nosilcev. V doktorski disertaciji smo raziskavo sistematično razdelili na dva dela. V prvem delu smo celice gojili na običajni plastični podlagi in proučevali vpliv vrste, spola in poznih pasaž na proliferacijski in diferenciacijski potencial MSC iz maščobnega tkiva (AMSC) psov in mačk. V drugem delu smo celice gojili na celičnih nosilcih iz svilnega fibroina (SF) in proučevali, kako SF vpliva na proliferacijski in diferenciacijski potencial AMSC. Rezultati prvega dela naše raziskave so pokazali, da AMSC mačk izkazujejo slabši proliferacijski in diferenciacijski potencial kot AMSC psov in da tudi pozne pasaže bolj negativno vplivajo na AMSC mačk kot na AMSC psov. Dodatno smo pokazali, da AMSC mačk v manjši meri izražajo preiskovane celične označevalce in v manj optimalnih pogojih izkazujejo slabšo živost. Z rezultati prvega dela raziskave smo pokazali, da vrsta živali lahko bistveno vpliva na značilnosti AMSC v pogojih in vitro in da bi živalsko vrsto morali upoštevati kot spremenljivko pri pripravi celic za regenerativno zdravljenje. Rezultati drugega dela naše raziskave so pokazali, da SF omogoča adhezijo celic in vodi usodo AMSC v smeri hondrogene diferenciacije, ki smo jo potrdili z analizo celične morfologije, barvanjem zunajceličnega matriksa diferenciranih celic ter kvantifikacijo izražanja genov, značilnih za hrustančne celice. Z rezultati drugega dela raziskave smo pokazali, da je hondrogeno diferenciacijo celic moč doseči brez posebnih pogojev gojenja celic, ki so sicer potrebni za hondrogenezo MSC na običajni plastični podlagi. Rezultati doktorske disertacije omogočajo poglobitev pomena poznavanja razlik matičnih celic med živalskimi vrstami in hkrati predstavljajo pomembno osnovo za prihodnje študije in potencial za uvajanje novih zdravljenj z matičnimi celicami v veterinarski klinični medicini. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 6 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija ABSTRACT Key words: mesenchymal stem cells – cytology; cell proliferation – physiology; cell differentiation – physiology; cell culture techniques – methods; biomaterials – metabolism; silk fibroin – metabolism; chondrogenesis – physiology; dogs; cats Due to their unique properties, stem cells have become an important source for the development of regenerative medicine and tissue engineering in recent years. Since different properties of mesenchymal stem cells (MSCs) in vitro can lead to potentially different therapeutic effects, investigating the influence of various factors on the properties of MSCs is essential. The established basis for the cultivation of MSCs is a plastic surface, but due to the better mimicking of the natural cellular environment, the use of cell carriers for cell cultivation is being increasingly developed. In this dissertation, our studies are systematically divided into two parts. In the first part, cells were grown on a conventional plastic surface and the influence of species, sex and late passages on the proliferation and differentiation potential of canine and feline adipose derived MSCs (AMSCs) were investigated. In the second part, cells were grown on silk fibroin (SF) cell carriers and influence of SF on the AMSCs was investigated. The results of the first part of our study showed that feline AMSCs had poorer proliferation and differentiation potential than canine AMSCs and that late passages had a more negative effect on feline AMSCs than on canine AMSCs. In addition, feline AMSCs expressed fewer examined cell surface markers and exhibited lower viability under less optimal conditions. The results of the first part of the study showed that animal species can significantly affect the properties of AMSCs in vitro and that animal species should be considered when preparing cells for regenerative treatment. The results of the second part of our study showed that SF enables cell adhesion and directs AMSC fate towards chondrogenic differentiation, which was confirmed by the analysis of cell morphology, staining of extracellular matrix of differentiated cells and quantification of genes, characteristic of chondrocytes. With the results of the second part of the study, we have shown that chondrogenic AMSC differentiation can be achieved without the special cell culture conditions that are otherwise required for chondrogenesis of AMSCs on a conventional plastic surface. The results of the dissertation allow us to deepen the knowledge about the importance of the stem cell differences between species and at the same time represent basis for further studies and the potential for the introduction of new stem cell therapies in clinical veterinary medicine. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 7 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija KAZALO VSEBINE 1 UVOD ................................................................................................................................. 11 1.1 PREGLED LITERATUTE IN PREDSTAVITEV PROBLEMATIKE ......................... 11 1.1.1 Matične celice glede na stopnjo razvoja organizma ........................................... 11 1.1.2 Matične celice glede na izvor ................................................................................ 12 1.1.3 Mezenhimske matične celice ................................................................................. 12 1.1.4 Terapevtski potencial MSC .................................................................................. 14 1.1.4.1 Parakrina signalizacija ...................................................................................... 14 1.1.4.2 Izločanje zunajceličnih veziklov ...................................................................... 15 1.1.4.3 Z apoptozo pogojena imunomodulacija ........................................................... 15 1.1.4.4 Prenos mitohondrijev ........................................................................................ 16 1.1.5 MSC v veterinarski regenerativni medicini ........................................................ 16 1.1.6 Proučevanje MSC v dvo– in trodimenzionalnih modelih in vitro ..................... 17 1.1.6.1 Dvodimenzionalne kulture ............................................................................... 17 1.1.6.2 Vpliv naravnega okolja na delitev MSC .......................................................... 18 1.1.6.3 Niša MSC ......................................................................................................... 19 1.1.6.4 Trodimenzionalne kulture ................................................................................ 20 1.1.7 Biomateriali ............................................................................................................ 21 1.1.7.1 Namen uporabe biomaterialov.......................................................................... 21 1.1.7.2 Vpliv lastnosti biomaterialov na MSC ............................................................. 21 1.1.7.3 Ogrodje biomaterialov za enkapsulacijo celic .................................................. 22 1.1.8 Svilni fibroin ........................................................................................................... 23 1.1.9 Vpliv svilnega fibroina na proliferacijo in diferenciacijo MSC ........................ 24 1.1.10 Idealni celični nosilec ........................................................................................... 24 1.2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE ..................................................................................... 26 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 8 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA .......................................................................... 27 2.1 MATIČNE CELICE V VETERINARSKI MEDICINI: TRENUTNO STANJE IN MOŽNOSTI ZDRAVLJENJA ............................................................................................. 27 2.2 PRIMERJAVA IZRAŽANJA POVRŠINSKIH OZNAČEVALCEV, VIABILNOSTI TER PROLIFERACIJSKEGA IN DIFERENCIACIJSKEGA POTENCIALA MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC / MEDICINSKIH SIGNALIZIRAJOČIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV IN MAČK ........................................................................ 49 2.3 SVILNI FIBROIN SPROŽA HONDROGENO DIFERENCIACIJO MULTIPOTENTNIH MEZENHIMSKIH STROMALNIH CELIC / MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV .................................................... 64 3 RAZPRAVA ....................................................................................................................... 80 4 SKLEPI .............................................................................................................................. 90 5 POVZETEK ....................................................................................................................... 91 6 SUMMARY ........................................................................................................................ 93 7 ZAHVALE ......................................................................................................................... 95 8 LITERATURA .................................................................................................................. 97 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 9 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija SEZNAM OKRAJŠAV AMSC Mezenhimske matične celice iz maščobnega tkiva (Adipose– derived mesenchymal stem cells) CD8+ Označevalec pripadnosti 8+ (Cluster of differentiation 8+) CD14 Označevalec pripadnosti 14 (Cluster of differentiation 14) CD29 Označevalec pripadnosti 29 (Cluster of differentiation 29) CD34 Označevalec pripadnosti 34 (Cluster of differentiation 34) CD44 Označevalec pripadnosti 44 (Cluster of differentiation 44) CD45 Označevalec pripadnosti 45 (Cluster of differentiation 45) CD56+ Označevalec pripradnosti 56+ (Cluster of differentiation 56+) CD73 Označevalec pripadnosti 73 (Cluster of differentiation 73) CD79α Označevalec pripadnosti 79 α (Cluster of differentiation 79α) CD90 Označevalec pripadnosti 90 (Cluster of differentiation 90) CD105 Označevalec pripadnosti 105 (Cluster of differentiation 105) CD Število celičnih podvojitev (Cell doubling) CDT Čas, ki je potreben, da se število celic podvoji (Cell doubling time) DNK Deoksiribonukleinska kislina ESC Embrionalne matične celice (Embrional stem cells) FBS Fetalni goveji serum (Foetal bovine serum) HLA–DR Humani levkocitni antigen – izotip DR HSC Hematopoetske matične celice (Hematopoietic stem cells) IDO Indolamin–2,3–dioksigenaza IL10 Interlevkin 10 IPSC Inducirane pluripotentne matične celice (Induced pluripotent stem cells) MAPK Z mitogenom aktivirana protein kinaza MSC Mezenhimske matične celice (Mesenchymal stem cells) / Mezenhimske stromalne celice (Mesenchymal stromal cells) / Medicinske signalizirajoče celice (Medicinal signaling cells) PGE2 Prostaglandin E2 p16 Protein 16 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 10 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija p53 Protein 53 PRP Krvna plazma obogatena s trombociti (Platelet rich plasma) RGD Zaporedje aminokislin arginin–glicin–aspartat RNK Ribonukleinska kislina ROS Reaktivne kisikove spojine (Reactive oxygen species) SF Svilni fibroin TGF – β Transformirajoči rastni dejavnik – β (Transforming growth factor – β) TNF – α Dejavnik tumorske nekroze – α (Tumor necrosis factor – α) 2D Dvodimenzionalen 3D Trodimenzionalen M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 11 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 1 UVOD 1.1 PREGLED LITERATUTE IN PREDSTAVITEV PROBLEMATIKE Matične celice so v zadnjih letih v splošni javnosti in na strokovnem področju vzbudile več zanimanja kot katerokoli drugo področje biologije. Eden izmed razlogov za to je obet, da bo poznavanje njihovega delovanja vodilo v globje razumevanje biologije celice in s tem možnost razvoja zdravljenja številnih degenerativnih bolezni [1]. Matične celice so nediferencirane celice, sposobne samoobnove in razvoja v specializirane celice posameznega tkiva [2]. Zaradi svojih edinstvenih lastnosti so postale vir razvoja regenerativne medicine in tkivnega inženirstva – interdisciplinarnega področja, ki kombinira znanje in tehnologijo celic, biomaterialov in biokemijskih dejavnikov, za namen regeneracije poškodovanega tkiva ali konstruiranja umetnega tkiva oziroma organa [3]. Presaditev matičnih celic je v rutinski klinični uporabi že od leta 1968 [4], ko je bila prvič opravljena presaditev kostnega mozga z namenom obnove hematopoetskega sistema, prizadetega zaradi radiacije ali kemoterapije pri zdravljenju malignih obolenj. Danes matične celice veljajo za bodoči temelj medicine v prihodnosti s potencialom nadomestitve katerekoli vrste celic v našem telesu [5]. 1.1.1 Matične celice glede na stopnjo razvoja organizma Glede na stopnjo razvoja matične celice lahko razdelimo na totipotentne ali omnipotentne, pluripotentne, multipotentne in unipotentne [6]. Totipotentne matične celice imajo pomembno vlogo v razvoju organizma, saj predstavljajo vir vseh znotraj– in zunajzarodnih tkiv [7]. Prisotne so takoj po oploditvi in še tri do štiri delitve za tem. Nadaljnje delitve vodijo zgodnji embrionalni razvoj v nastanek blastociste in nižjo potentnost celic. Embrioblast blastociste predstavlja vir pluripotentnih embrionalnih matičnih celic (angl., Embrional stem cells, ESC), ki so sposobne razvoja v celice vsakega od treh kličnih listov – ektoderma (iz katerega se razvijeta koža in živčni sistem), mezoderma (iz katerega se razvijejo kri, kosti mišice, hrustanec, maščoba) in endoderma (iz katerega se razvijeta dihalni in prebavni trakt). Nastanek kličnih listov je eden od najpomembnejših dogodkov embrionalnega razvoja. Iz pluripotentnih nastanejo multipotentne matične celice, sposobne diferenciacije v več vrst celic, ki pripadajo samo enemu od treh kličnih listov. Lastnost nekaterih odraslih matičnih celic, da se lahko razvijejo v le eno vrsto celic, posedujejo unipotentne matične celice, npr. epidermalne matične celice, ki se diferencirajo v keratinocite [6]. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 12 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 1.1.2 Matične celice glede na izvor Glede na izvor matične celice ločimo na embrionalne, inducirane pluripotentne in odrasle matične celice. Prva izolacija ESC iz embrioblasta blastociste miši leta 1981 [8] je vodila v možnost raziskovanja izražanja in delovanja genov med embrionalnim razvojem ter procesa celične diferenciacije, s hkratno vizijo uporabe matičnih celic za zdravljenje bolezni in določanja genov, ki bi lahko bili tarča za potencialna zdravila na področju regenerativne medicine. Z izolacijo ESC človeka leta 1998 [9] se je teoretična možnost zdravljenja bolezni z matičnimi celicami približala realnosti. Vendar pa je uporaba ESC z vidika potrebe po uničenju zarodkov za namen njihove izolacije omejena zaradi etičnih, moralnih in kulturnih zadržkov. Za nadaljevanje raziskovanja možnosti zdravljenja z matičnimi celicami se je pojavila potreba po iskanju drugih virov matičnih celic. Možnost pridobitve pluripotentnih matičnih celic brez uporabe zarodka sta leta 2006 prva odkrila japonska znanstvenika Takahashi in Yamanaka [10]. Inducirane pluripotentne matične celice (angl. Induced pluripotent stem cells, IPSC) so nastale z reprogramiranjem odraslih mišjih fibroblastov v inducirano pluripotentno stanje. Z retrovirusno transdukcijo genov Oct3/4, Sox2, c – Myc in Klf4, sicer pomembnih pri vzdrževanju značilnih lastnosti ESC, so nastale celice, ki so bile v morfologiji, samoobnovitvenih sposobnostih in diferenciacijskem potencialu podobne ESC. Kljub pomembnemu preboju v znanosti na področju matičnih celic je uporaba IPSC za terapevtske namene vprašljiva zaradi retrovirusne transdukcije onkogenov, ki z možnostjo sprožanja sprememb na kromosomih lahko vodi v tumorogenezo [10]. Alternativa ESC in IPSC so multipotentne matične celice, ki se nahajajo v odraslem organizmu. V primerjavi z embrionalnimi, odrasle matične celice kažejo podobne samoobnovitvene zmožnosti, a imajo hkrati bolj omejen diferenciacijski potencial za razvoj v specializirane vrste celic [11]. Odrasle matične celice se tvorijo med ontogenezo in ostanejo znotraj niše tkiv in organov odraslega organizma, kjer pod fiziološkimi ali patološkimi pogoji obnavljajo populacijo tkivnih celic [6]. 1.1.3 Mezenhimske matične celice Mezenhimske matične celice (angl., Mesenchymal stem cells, MSC), imenovane tudi mezenhimske stromalne celice (angl., Mesenchymal stromal cells, MSC), so multipotentne odrasle matične celice. Z vidika pomena mezenhima, ki je embrionalno vezivo mezodermalnega izvora v prenatalnem obdobju, so MSC ostanek embrionalnega veziva, ki se M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 13 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija v nediferencirani obliki nahajajo v številnih organih in igrajo vloge celične diferenciacije, nadomeščanja celic oz. popravila poškodb in imunomodulacije [12]. Leta 1968 je bila prvič omenjena osteogena populacija celic, izolirana iz kostnega mozga s fibroblastom podobno morfologijo [13]. Nadaljne študije so pokazale tudi zmožnost pritrditve teh celic na plastično podlago za gojenje celic in edinstveno zmožnost diferenciacije v različne vrste specializiranih celic [14, 15]. Slabi dve desetletji kasneje so celice poimenovali MSC [12]. Rezultati začetnih študij so pokazali sposobnost MSC za diferenciacijo v osteoblaste, adipocite in hondrocite in vitro [16]. Kasneje je bilo ugotovljeno, da so MSC zmožne tudi diferenciacije v celice drugih tkiv mezodermalnega izvora, kot so celice tetiv in ligamentov [17], kardiomiociti [18] in miociti [19]. Nadaljne študije so pokazale, da so MSC sposobne diferenciacije tudi v celice endodermalnega in ektodermalnega izvora. Rezultati raziskav, ki so pokazali sposobnost diferenciacije MSC v celice kože [20], pigmentni epitelij mrežnice [21], celice pljuč [22], hepatocite [23], ledvične tubule [24], Langerhansove otočke [25] in nevrone [26], nakazujejo na to, da MSC niso zgolj multipotentne, saj posedujejo zmožnost diferenciacije v tkiva izvirajočih iz vseh treh kličnih listov in torej izkazujejo pluripotenten značaj. MSC se nahajajo v vseh ožiljenih tkivih in so zaradi svojih edinstvenih lastnosti predmet številnih predkliničnih in kliničnih raziskav po vsem svetu (ClinicalTrials.gov). Kljub temu pa je njihov izvor še vedno neznanka. Fiziološka vloga MSC je najbolj proučevana v kostnem mozgu, ki predstavlja pomemben vir MSC in kjer imajo MSC pomembno vlogo v ohranjanju niše hematopoetskih matičnih celic (angl., Hematopoietic stem cells, HSC) – celic v kostnem mozgu, iz katerih v procesu hematopoeze nastanejo specializirane krvne celice [27]. Fenotip MSC so v večih raziskavah povezali s periciti – perivaskularnimi celicami kapilar in manjših žil [28-31], ki so v celični kulturi zaradi sposobnosti adhezije na plastiko, enake morfologije ter enakega proliferacijskega in diferenciacijskega potenciala neločljivi od MSC [32]. Povezanost MSC s periciti je bila dodatno potrjena tudi z izražanjem istih površinskih označevalcev [32]. Ali so periciti zgolj predhodniki MSC ali pa bi jim tudi z vidika funkcionalnosti lahko rekli MSC, zaenkrat ostaja nerešeno vprašanje [33]. Vendar periciti niso edine perivaskularne celice, pri katerih je bil pokazan potencial za razvoj v MSC. Fibroblastom podobne progenitorne celice, ki se nahajajo v tuniki adventiciji – zunanji ovojnici stene večjih arterij in žil – so bile prav tako prepoznane kot predhodnice MSC. Na podlagi raziskav tako obstajata dva perivaskularna vira MSC – periciti kapilar in majhnih žil ter adventicijske celice v steni večjih M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 14 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija žil [34]. Kljub nerešenemu problemu določitve natančne definicije so se MSC zaradi svojih edinstvenih lastnosti, odsotnosti večjih etičnih zadržkov pri njihovi uporabi, lahki dostopnosti in enostavni manipulaciji v pogojih in vitro izkazale kot najustreznejše za uporabo v terapevtske namene. Mednarodno združenje za celična zdravljenja je z namenom poenotene karakterizacije MSC ljudi in primerljivosti rezultatov raziskav z njimi leta 2006 izdalo minimalna merila za njihovo identifikacijo. Zahtevana merila vključujejo sposobnost adhezije MSC na plastiko v standardni celični kulturi, izražanje celičnih označevalcev CD105, CD73, CD90, odsotnost izražanja celičnih označevalcev CD45, CD34, CD14 (ali CD11b), CD79α (ali CD19) in HLA– DR ter sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondroblaste in adipocite [16]. 1.1.4 Terapevtski potencial MSC Z vidika sposobnosti diferenciacije MSC v specializirane celice različnih tkiv je moč sklepati, da je njihov terapevtski potencial posledica njihove diferenciacije v celice tkiv [35, 36]. Vendar so rezultati kasnejših raziskav pokazali, da je terapevtski učinek MSC predvsem posledica njihovega imunomodulatornega delovanja. Predpostavljeno je, da mesto nahajanja MSC v perivaskularni niši igra ključno vlogo v zaznavanju poškodb lokalnih ali oddaljenih tkiv, na katere se MSC odzovejo z migracijo proti mestu poškodbe in sodelovanjem v procesu celjenja [37]. Na podlagi tega je bil leta 2017 predstavljen predlog, da bi poimenovanje »mezenhimske matične celice« spremenili v »medicinske signalizirajoče celice« (angl., Medicinal signaling cells, MSC) [38]. Imunomodulatorno delovanje MSC vključuje parakrino signalizacijo, izločanje zunajceličnih veziklov, z apoptozo pogojeno imunomodulacijo ter prenos mitohondrijev v tarčne celice. 1.1.4.1 Parakrina signalizacija Vse več je dokazov, da primarno delovanje MSC temelji na parakrinem izločanju (t.j. izločanju dejavnikov v svojo neposredno okolico) signalnih molekul, ki vplivajo na funkcionalne spremembe imunskih celic, kot so monociti in makrofagi [39], dendritične celice [40], celice T [41], celice B [42] in naravne celice ubijalke [43, 44]. Med najpomembnejše in najbolj proučevane dejavnike, ki omogočajo imunomodulatorni učinek MSC, se uvrščajo transformirajoči rastni dejavnik–β (angl., Transforming growth factor–beta, TGF–β), indolamin–2,3–dioksigenaza (angl., Indolamine–2,3–dioxygenase, IDO), prostaglandin E2 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 15 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija (angl., Prostaglandine E2, PGE2), interlevkin 10 (angl., Interleukin 10, IL10) in dejavnik tumorske nekroze–α (angl. Tumor necrosis factor–α, TNF– α). Učinek parakrine signalizacije MSC se kaže v zaviranju delovanja dendritičnih celic [45], polarizaciji makrofagov – pretvorbi vnetnega v protivnetni tip makrofagov [46-52], aktivaciji regulatornih celic T [53-55], zaviranju aktivacije in proliferacije naravnih celic ubijalk [43] ter celic T [45, 53] in B [56] in posledičnem zaviranju citotoksičnega in protitelesnega imunskega odziva [45]. MSC tako na podlagi parakrine signalizacije z vplivom na delovanje imunskega sistema omogočajo spreminjanje poteka in posledic nekaterih bolezni. 1.1.4.2 Izločanje zunajceličnih veziklov Poleg parakrinega izločanja topnih molekul, MSC izločajo tudi številne molekule v zunajceličnih veziklih – heterogeni populaciji membranskih veziklov, ki se iz celice sproščajo z brstenjem membrane v notranjost ali zunanjost celice [57]. Zunajcelični vezikli so glede na mesto nastanka v celici in velikost razdeljeni v eksosome (vezikli endocitotskega izvora velikosti 30 – 150 µm), mikrovezikle (vezikli, ki nastanejo z brstenjem membrane, velikosti 100 – 1000 nm) in apoptotska telesca (vezikli, sproščeni med programirano celično smrtjo, velikosti 50 nm – 5 µm) [58]. Zunajcelični vezikli so prenašalci informacijske ribonukleinske kisline (RNK), male interferenčne RNK, beljakovin in mitohondrijev, ki zaradi membranske zaščite vezikla lahko prepotujejo daljše razdalje znotraj telesa [59, 60]. V večih raziskavah je bilo pokazano, da je učinek delovanja zunajceličnih veziklov MSC podoben učinku parakrine signalizacije [61-63], zaradi česar zunajcelični vezikli predstavljajo potencial za izkoriščanje terapevtskih učinkov MSC brez uporabe samih celic [64, 65]. 1.1.4.3 Z apoptozo pogojena imunomodulacija Eden izmed načinov terapevtskega delovanja MSC je tudi imunomodulacija, pogojena z apoptozo. Fagocitoza odmrlih celic igra pomembno vlogo v zmanjševanju vnetja in obnavljanju funkcije tkiva in tudi v adaptivnem imunskem odzivu v vnetem tkivu [66]. Tudi MSC so po intravenski aplikaciji celic v telo podvržene apoptozi. V eni od raziskav [67] so pokazali, da so MSC podvržene apoptozi po fizičnem stiku s citotoksičnimi CD56+ naravnimi celicami ubijalkami in CD8+ celicami T. Odmrle MSC fagocitirajo makrofagi, posledica česar je polarizacija makrofagov in modulacija adaptivnega imunskega sistema [67-69]. Z apoptozo M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 16 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija pogojena imunomodulacija je tudi ena izmed možnih razlag za dolgotrajno terapevtsko delovanje MSC, ki nasprotuje dokazom o njihovi kratkoživosti po intravenski aplikaciji [69]. 1.1.4.4 Prenos mitohondrijev Rezultati novejših raziskav kažejo, da je eden izmed možnih načinov delovanja MSC tudi prenos organelov med celicami s pomočjo nanocevk. Prenos mitohondrijev med somatskimi celicami in MSC je bil pokazan na mišjih modelih bolezni pljuč [70] in ledvic [71]. Prenos mitohondrijev med celicami je povezan z različnimi fiziološkimi in patološkimi stanji in bi lahko predstavljal potencial za zdravljenje različnih patoloških stanj v prihodnosti. 1.1.5 MSC v veterinarski regenerativni medicini MSC so v veterinarski medicini v večji meri uporabljane eksperimentalno za zdravljenje številnih bolezni. Med te sodijo bolezni kit, tetiv in sklepov, bolezni ustne votline in zob, bolezni prebavnega trakta, jeter, ledvic in srca, bolezni dihal, bolezni kože in oči, bolezni živčnomišičnega sistema in bolezni spolnih organov. Izkoriščanje kompleksnih imunomodulacijskih sposobnosti MSC se je tako izkazalo za uspešno tudi pri zdravljenju različnih bolezni psov in mačk. Pri psih po uspešnosti zdravljenja najbolj stopajo v ospredje ortopedske bolezni [72-77], medtem ko se je pri mačkah kot najbolj obetavna indikacija za zdravljenje z MSC izkazal kronični gingivostomatitis [78-81]. Med bolezni z obetavnimi rezultati zdravljenja z MSC pri obeh vrstah živali se uvršča tudi kronična vnetna bolezen črevesa [82, 83]. Ker različen potencial MSC v pogojih in vitro lahko vodi v različen terapevtski učinek, so za namen presoje zdravljenja z MSC v veterinarski klinični medicini v teku številne raziskave, ki se osredotočajo na preiskovanje vplivov dejavnikov na lastnosti celic in vitro. Za namen uporabe MSC v terapevtske namene je potrebna izolacija, karakterizacija in namnožitev MSC. Pri psih in mačkah so bile MSC izolirane iz številnih tkiv, kot so maščobno tkivo [84-88], kostni mozeg [85, 86, 89-91], sklepna tekočina [84, 85, 92], popkovnica [93], Whartonova žolica [94], periferna kri [95], mišično tkivo in pokostnica [96]. Zaradi lahke dostopnosti, minimalnega posega, potrebnega za odvzem tkiva in velikega števila celic ob izolaciji, je maščobno tkivo najbolj uporabljano tkivo za izolacijo MSC [97]. Matičnost izoliranih celic je določena s sposobnostjo pritrditve celic na plastiko, trilinijskega diferenciacijskega potenciala in M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 17 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija izražanjem ustreznih površinskih označevalcev [16]. MSC živali so, tako kot MSC ljudi, sposobne adhezije na plastiko in difereneciacije v kostne, hrustančne in maščobne celice, vendar v primerjavi z MSC ljudi ne izražajo enakih površinskih označevalcev. Minimalna merila za identifikacijo MSC živali zaenkrat še niso določena. Ker je za namen zdravljenja živali z MSC potrebna obsežna namnožitev celic izven organizma, sta dve osnovni in pogosto proučevani lastnosti v pogojih in vitro njihov proliferacijski in diferenciacijski potencial. V večih raziskavah je bilo pokazano, da na proliferacijski in diferenciacijski potencial MSC ex vivo vplivajo različni dejavniki, kot so tkivo izvora MSC [84, 86, 89, 98], anatomsko mesto tkiva [88, 99, 100], starost živali [99, 101-103] in število pasaž [104-107]. Potencialni dejavnik vpliva na MSC bi lahko bila tudi vrsta živali. Posamezne študije, narejene na MSC posamezne vrste živali, so med seboj težko primerljive zaradi nestandardiziranih postopkov izolacije, karakterizacije in gojenja celic ter zaradi individualne sestave celičnih gojišč, uporabljanih med posameznimi laboratoriji. Posameznih raziskav, v katerih bi neposredno proučevali vpliv vrste, je zelo malo [108-110] in temeljijo predvsem na primerjavi MSC živali z MSC ljudi. Tudi vpliv spola je v veterinarski regenerativni medicini redko proučevan. Vpliv spola je bil pokazan v nekaterih raziskavah iz področja biologije matičnih celic in njihovega terapevtskega učinka [111-114]. Napredek v pridobivanju znanja s področja uporabe MSC in mehanizmov njihovega delovanja omogoča izrazito napredovanje razvoja ne le humane, ampak tudi veterinarske regenerativne medicine. Zato je proučevanje celic izjemnega pomena, saj nam omogoča vpogled v celično fiziologijo in procese tkiv izven organizma in posledično presojo uporabe MSC za zdravljenje. 1.1.6 Proučevanje MSC v dvo– in trodimenzionalnih modelih in vitro 1.1.6.1 Dvodimenzionalne kulture Celične kulture predstavljajo model za proučevanje celic in procesov v tkivih izven organizma in so uveljavljene na področju raziskovanja celične in molekularne biologije, mutageneze in karcinogeneze ter učinkov zdravil in toksičnih komponent na celice [115]. Za proučevanje MSC je zaradi njihove sposobnosti adhezije na plastiko uveljavljena uporaba dvodimenzionalne (2D) podlage iz plastike. Prednosti gojenja MSC na plastiki so stroškovna nezahtevnost [116], preprostost gojenja ter možnost nadzora nad pogoji v kulturi [115]. Vse celice so izpostavljene M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 18 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija enakim količinam hranilnih snovi, rastnih in ostalih dejavnikov ter se posledično nahajajo v isti fazi celičnega cikla [116], kar omogoča enostavno interpretacijo ponovljivih rezultatov [117]. Priprava celic na nadaljne analize je nezahtevna [115]. Kljub prednostim uporabe 2D plastične podlage za proučevanje MSC se vedno bolj poudarja vprašanje ustreznosti uporabe 2D podlag. Ugotovljeno je bilo, da gojenje MSC na plastični podlagi vodi v heterogeno populacijo celic in lahko vpliva na njihove lastnosti [118, 119]. 2D podlaga iz plastike se namreč bistveno razlikuje od fiziološkega okolja v telesu, zato je podobnost celic, gojenih na plastiki, s celicami v naravnem okolju v telesu vprašljiva. 1.1.6.2 Vpliv naravnega okolja na delitev MSC Pomembno vlogo pri ugotavljanju in primerjavi značilnosti celic v pogojih in vitro in in vivo igra poznavanje njihovega naravnega okolja in mehanizmov njihovega delovanja. Samoobnovitvena sposobnost in sposobnost diferenciacije v specializirane celice tkiv sta edinstveni lastnosti matičnih celic, ki sta posledici celičnih delitev znotraj njihovega naravnega okolja, kjer neprestano poteka ravnotežje med mirujočimi in delečimi se matičnimi celicami. Delitev matičnih celic je lahko simetrična, pri kateri nastaneta dve hčerinski matični celici, ali asimetrična, pri kateri nastaneta ena hčerinska identična matična celica in ena hčerinska progenitorna celica [120]. Celični cikel sestavljajo štiri faze – faza S (faza podvojitve DNK) in faza M (faza delitve) ter vmesni kontrolni fazi rasti G1 in G2. Napredovanje celičnega cikla je strogo nadzorovano s pomočjo kontrolnega sistema celičnega cikla, ki zagotavlja ohranjanje integritete celičnega genoma. Pomemben vpliv na celično delitev imajo mitogeni – zunajcelične signalne molekule, ki povzročajo napredovanje celičnega cikla skozi fazo G1 in s tem začetek diferenciacije. ESC imajo v primerjavi s somatskimi celicami značilno krajšo fazo G1 in posledično manj omejen diferenciacijski potencial [11]. Podobno velja tudi za IPSC [121]. Odrasle matične celice v izogib vplivom mitogenov in s tem diferenciaciji izstopijo iz celičnega cikla v fazo mirovanja G0 ter tako ohranjajo populacijo matičnih celic v tkivu [122]. Vstop v celični cikel in s tem začetek diferenciacije matičnih celic sovpada z zmanjšanjem proliferacije in povečanim izražanjem genov, značilnih za specifične celične linije [123]. Poleg mitogenov ima pomemben vpliv na celično delitev tudi vezava celic na površino – zunajcelični matriks. V naravnem okolju se matične celice povezujejo s proteini zunajceličnega matriksa preko transmembranskih adhezijskih proteinov – integrinov, ki so tesno povezani s citoskeletnima M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 19 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija elementoma aktinom in miozinom. Vezava integrinov na zunajcelični matriks omogoča ustvarjanje stika (fokalne adhezije) med celico in površino, ter mehanotransdukcijo – prenos informacij iz zunajceličnega matriksa v celico. Pomen integrinov je tudi v aktivaciji signalne poti pri nastanku ciklinov G1, ključnih regulatornih proteinov, pomembnih za vstop celice v celični cikel. Vezava celice na podlago ima torej pomembno vlogo za njeno delitev [124]. Zunajcelični matriks je ena izmed najpomembnejših komponent mikrookolja – niše, ki regulirajo delovanje MSC, t.j. adhezijo, migracijo, proliferacijo, diferenciacijo in preživetje MSC [120]. 1.1.6.3 Niša MSC Niša matičnih celic je specifično anatomsko mesto v visoko specializiranem mikrookolju, ki z vodenjem in nadzorovanjem njihove usode regulira delovanje matičnih celic pri nastanku, vzdrževanju in popravilu tkiva [125]. Ključna naloga niše je ohranjanje stalne zaloge matičnih celic in dinamično uravnavanje njihove samoobnove in diferenciacije z namenom zagotavljanja homeostaze in regeneracije tkiva. V niši so matične celice obdane s podpornimi celicami, zunajceličnim matriksom in intersticijsko tekočino. Strukturni proteini, kot so kolagen, fibronektin in laminin, dajejo zunajceličnemu matriksu mehanske lastnosti, ki celicam omogočajo adhezijo in mehanotransdukcijo. Tako so matične celice izpostavljene številnim zunanjim dejavnikom, kot so medcelične interakcije, interakcije celic z zunajceličnim matriksom, fizikalno–kemijski dražljaji (npr. temperatura, delni tlak kisika) in drugi topni dejavniki, npr. rastni dejavniki in citokini [5]. Kombinacija organizacije celičnega citoskeleta in delovanja zunajceličnih bioaktivnih molekul spodbuja ohranjanje matičnih celic znotraj niše in migracijo progenitornih celic iz niše ter njihovo diferenciacijo v specializirane celice tkiva [120]. Celično mikrookolje tako prispeva k prostorsko in časovno kompleksni signalizaciji, ki usmerja celični fenotip. Celica je skupaj z zunajceličnim matriksom, rastnimi dejavniki, hormoni in drugimi molekulami povezana v celoto, ki vodi delovanje posameznih organov in celotnega organizma [126]. Na spremembe v okolju, npr. na poškodbo ali bolezen, se celice odzivajo z izločanjem proteaz, rastnih dejavnikov in drugih signalnih molekul, ki usmerjajo znotrajcelično in medcelično komunikacijo in tako vodijo procese proliferacije, sinteze proteinov, migracije in apoptoze. Celični odzivi na spremembe v tkivu so posledica neposredne povezave z zunajceličnim matriksom ali vpliva signalnih molekul, ki izvirajo iz zunajceličnega M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 20 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija matriksa. Posledica izgube niše je izguba matičnih celic in s tem zmanjšanje regenerativnih zmožnosti [5]. Medsebojni vpliv matičnih celic in njihove niše ustvarja dinamični sistem, po katerem se zgledujejo modeli niš in vitro, ustvarjeni z namenom terapevtske rabe matičnih celic [125]. 1.1.6.4 Trodimenzionalne kulture Trodimenzionalni (3D) načini gojenja celic posnemajo ključne mehanske in biokemijske lastnosti naravnega celičnega okolja in posledično omogočajo boljši vpogled v fiziološko delovanje MSC [127], kar je še posebno pomembno z vidika uporabe MSC za terapevtske namene [118]. Študije vpliva 3D okolja na MSC so pokazale, da 3D okolje celicam nudi boljše možnosti za izkazovanje bioloških mehanizmov, vključujoč število celic, živost, morfologijo, proliferacijo, diferenciacijo, odzivanje na okoljske signale, medcelično komuniciranje, migracijo, stimulacijo angiogeneze, izogibanje imunskemu sistemu, izražanje genov in sintezo proteinov in se je tako z vidika posnemanja naravnega celičnega okolja izkazalo kot bolj ustrezno za gojenje celic [115]. Obstaja več različnih načinov gojenja celic v 3D modelih, ki jih lahko razdelimo na 2 skupini – 3D kulture z ali brez uporabe nosilcev. 3D kulture brez uporabe nosilcev vključujejo kulturo viseče kapljice, ki omogoča agregacijo celic na podlagi gravitacije, magnetno levitacijo oz. magnetno lebdenje, pri čemer je agregacija celic posledica izpostavljenosti magnetnim nanodelcem, ter gojenje celic na okroglih ploščah z nizko adhezivno prevleko, ki se običajno uporablja za proučevanje tumorskih celic [127]. V 3D kulturah z uporabo nosilcev oziroma biomaterialov se uporabljajo štiri osnovne skupine materialov – polimerni, keramični, kovinski in kompozitni materiali [128], med katerimi so najpogosteje uporabljani hidrogeli, polimerni materiali, hidrofilna steklena vlakna in organoidi [127]. Prednost uporabe 3D nosilcev je predvsem v možnosti posnemanja zunajceličnega matriksa in vivo [115]. Z napredovanjem razvoja 3D modelov za gojenje celic in vitro se večajo tudi možnosti za premostitev razlik med pogoji gojenja celic in vitro in živalskimi modeli. Ena izmed pomembnih prednosti uporabe 3D celičnih kultur je, da omogočajo simulacijo delovanja celice v naravnem okolju, a je hkrati proučevanje celice omogočeno v pogojih in vitro, zaradi česar je verjetna predpostavka, da se bo potreba po uporabi živalskih modelov v prihodnosti zmanjševala [127]. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 21 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 1.1.7 Biomateriali 1.1.7.1 Namen uporabe biomaterialov Namen razvoja biomaterialov je posnemanje naravnega zunajceličnega matriksa za zagotavljanje potrebnih lastnosti celičnega okolja za vodenje usode matičnih celic znotraj njihove niše. Biomaterial mora zagotavljati mikrookolje, ki posnema fiziološko nišo in matičnim celicam omogoča pretvorbo vpliva strukturnih lastnosti biomateriala v biokemijske signale. Biomateriali lahko služijo kot bioadhezivne površine za namen adhezije in proliferacije celic v 2D celičnih kulturah, ali kot 3D celični nosilci za gojenje celic v okolju, ki bi omogočalo prostorsko in časovno zahtevne celične procese, potrebne za regeneracijo določenega tkiva [129]. 1.1.7.2 Vpliv lastnosti biomaterialov na MSC Za vodenje celične usode so ključne mehanske, površinske in kemijske lastnosti biomateriala [120]. Znano je, da so matične celice občutljive na mehanske lastnosti biomaterialov in da imajo zmožnost zaznavanja trdne podlage, četudi niso v neposrednem stiku z njo [130]. Njihov oprijem na podlago je odvisen od elastičnosti biomateriala, kar kaže na to, da že najmanjše spremembe mehanskih lastnosti biomateriala lahko vplivajo na diferenciacijo matičnih celic. Različna elastičnost biomateriala tako različno vpliva na celično adhezijo, proliferacijo in njihov diferenciacijski potencial. Večja trdnost biomateriala pogojuje večji potencial za osteogeno diferenciacijo, ki je posledica povečane aktivacije integrinov, mehkejši biomateriali pa večajo celični potencial za adipogeno ali hondrogeno diferenciacijo, ki sta posledici povečanega izražanja kolagena tipa II in lipaze lipoproteinov, označevalcev hrustančnih in maščobnih celic [131]. Matične celice se ne vežejo neposredno na površino biomateriala, ampak se v raztopini z vsebnostjo proteinov, npr. v mediju za gojenje celic, zaradi počasnejšega gibanja v primerjavi s proteini vežejo na površino biomateriala posredno preko vezave na predhodno vezane proteine. Vezava celic na proteine je odvisna od razporeditve in konformacije proteinov, slednji pa sta odvisni od omočljivosti in kemijske sestave biomateriala. Različne polarne skupine na površini biomateriala različno vplivajo na vezavo proteinov in lahko izzovejo denaturacijo ali spremembo orientacije proteinov. Ustrezna orientacija proteina omogoča prepoznavanje in vezavo površinskih celičnih receptorjev na vezavna mesta na proteinu. Za vodenje celične adhezije je torej posebnega pomena manipulacija proteinov, M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 22 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija vezanih na površino biomateriala [130]. Rezultati številnih študij kažejo tudi na vpliv kemijskih lastnosti površine biomateriala na smer celične diferenciacije [132-134]. Obdelava površine biomateriala z različnimi kemijskimi skupinami, npr. metilno (–CH3), amino (–NH2), tiolno (– SH), hidroksilno (–OH) ali karboksilno (–COOH) skupino lahko različno vpliva na celično usodo in vodi MSC v smeri adipogene, osteogene ali hondrogene diferenciacije [133, 134]. Smer celične diferenciacije pa je ob dodatku iste kemijske skupine lahko različna v 2D ali 3D okolju [130]. 2D ali 3D okolje lahko torej neodvisno od funkcionalne kemijske skupine različno vpliva na usodo MSC. 1.1.7.3 Ogrodje biomaterialov za enkapsulacijo celic Poleg mehanskih, površinskih in kemijskih lastnosti je za biomaterial pomembno tudi samo ogrodje oz. konstrukcija materiala, ki omogoča enkapsulacijo celic. 3D biomateriali so lahko mikroporne, nanofibrozne ali hidrogelne sestave. Mikroporni nosilci sicer omogočajo enkapsulacijo celic, vendar zaradi velikosti por (100 µm), večjih od povprečnega premera celice (10 µm), predstavljajo ukrivljeno 2D mikrookolje. Nanofibrozni nosilci z vsebnostjo fibrilarnih proteinov zunajceličnega matriksa zagotavljajo boljši približek naravnega celičnega okolja, vendar so njihove mehanske lastnosti preslabe, da bi obvladovale stres, potreben za mehanotransdukcijo. Hidrogeli nimajo omenjenih omejitev, zato predstavljajo ustrezen biomaterial za razvoj zunajceličnemu matriksu podobnega okolja. Mrežasta struktura medsebojno povezanih polimernih verig omogoča visoko vsebnost vode, transport kisika, hranilnih in odpadnih snovi ter drugih topnih molekul. Hidrogeli so lahko sestavljeni iz številnih naravnih ali sintetičnih materialov, ki nudijo širok razpon različnih mehanskih in kemijskih lastnosti [126]. Naravni hidrogeli v primerjavi s sintetičnimi ne le omogočajo, ampak tudi spodbujajo njihovo delovanje. Naravne hidrogele navadno sestavljajo proteini zunajceličnega matriksa, kot so kolagen, fibrin, hialuronska kislina, ali pa sestavine iz drugih bioloških virov kot so hitozan [135], alginat [136], amnijska membrana [137] in svila [138]. Področje uporabe biomaterialov v tkivnem inženirstvu se usmerja v razvoj univerzalnih biomaterialov, s katerimi bi bilo moč voditi usodo celic v katerokoli želeno smer [139] in ki bi bili ustrezni za vnos v telo [129]. Zaenkrat ne poznamo biomateriala, ki bi zadostil potrebam vseh vrst tkiv, zato po vsem svetu potekajo raziskave v smeri iskanja univerzalnega M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 23 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija biomateriala za uporabo v regenerativni medicini. Eden izmed obetavnih biomaterialov za uporabo v tkivnem inženirstvu je svilni fibroin (SF). 1.1.8 Svilni fibroin Zaradi svojih mehanskih lastnosti, elastičnosti, prilagodljivih strukturnih in morfoloških lastnosti ter biokompatibilnosti [138] v ospredje številnih raziskav s področja biomaterialov stopa SF. Svilni proteini so prisotni v žlezah sviloprejk, pajkov, škorpijonov, pršic in čebel. Naravni biopolimer, ki ga proizvaja sviloprejka Bombyx mori, je najpogosteje uporabljena, komercialno dostopna in najbolje proučena svila, ki je sicer že dolga leta v uporabi v tekstilni industriji in v medicini kot šivalni material [138]. Svila je sestavljena iz dveh proteinov – fibroina, ki predstavlja glavno komponento svile, in sericina, ki povezuje vlakna SF med seboj. Sericin je imunogen in se ga med pripravo nosilca SF odstrani. SF sestoji iz lahke (25 kDa) in težke polipeptidne verige (350 kDa), med seboj povezanih z disulfidno vezjo. Na obe verigi se nekovalentno pripenja še dodatni glikoprotein p25, ki utrjuje integriteto svile. Hidrofobne domene težke verige sestojijo iz ponavljajočih se polipeptidnih enot, med seboj povezanih z vodikovimi vezmi. Hidrofobne domene tvorijo kristale iz β–plošč, zavzemajo do 70 % celotne strukture proteina ter svili dajejo moč in stabilnost. Hidrofobne domene so obdane s hidrofilnimi neponavljajočimi se amorfnimi regijami iz lahkih verig, ki svili omogočajo prožnost. Neurejene hidrofilne domene prej pridejo v stik z vodo, kisikom in encimi in so posledično bolj dovzetne za razgradnjo v primerjavi s hidrofobnim delom. Razgradnja in mehanske lastnosti svile so tako močno odvisne od sekundarne strukture SF. Kemijski in fizikalni dejavniki v žlezi sviloprejk vodijo v spremembo lastnosti svile, ki je potrebna za njeno izločanje. S spreminjanjem pH, koncentracije ionov ali strižnih sil v žlezi se sekundarna struktura SF pretvarja v topno – neurejeno, ali netopno – urejeno konformacijo iz β–plošč ter se tako spremenja v sol ali gel stanje. Mehanizem spreminjanja topnosti svile znotraj žlez sviloprejke je slabo poznan, ugotovljeno pa je, da ima pri tem pomembno vlogo kalcij, katerega koncentracija se v različnih delih žleze spreminja. Z dodatkom CaCl2 je možno doseči pretvorbo SF iz sol v gel stanje. Konformacijske in reološke spremembe SF v žlezah sviloprejk nastajajo z namenom potovanja tekočega SF skozi lumen in nastajanja vlakna v distalnem delu predilne žleze. Možnost spreminjanja in prilagajanja molekularne strukture in morfologije svilnega proteina omogoča uporabo SF tudi v tkivnem inženirstvu [140]. V zadnjih letih se SF M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 24 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija testira in uporablja kot biomaterial v tkivnem inženirstvu v različnih oblikah kot so filmi, vlakna, mreže, hidrogeli in porozni 3D nosilci [138]. 1.1.9 Vpliv svilnega fibroina na proliferacijo in diferenciacijo MSC SF v različnih oblikah, kot so filmi [141, 142], vlakna [143], mreža vlaken [144] ali 3D nosilec [145, 146], omogoča proliferacijo in diferenciacijo MSC. Proliferacija in diferenciacija MSC na SF sta odvisni od mikrostrukturnih, mehanskih in površinskih lastnosti SF. V nekaterih raziskavah so pokazali, da 3D struktura SF omogoča boljšo proliferacijo in diferenciacijo MSC kot 2D filmi SF, najverjetneje zaradi boljšega posnemanja naravnega celičnega okolja, ki ga nudi 3D oblika [147, 148]. Na boljšo proliferacijo in diferencijo MSC, gojenih na SF, je pomembno vplivalo tudi kombiniranje SF z drugimi elementi, kot so grafenov oksid [147] ali zaporedje aminokislin arginin–glicin–aspartat (RGD), vezavna domena fibronektina zunajceličnega matriksa [149]. Hondrogeno diferenciacijo MSC, gojenih na SF, so spodbudili z dodajanjem hialuronske kisline [150], askorbinske kisline [151] ali krvno plazmo, obogateno s trombociti (angl., Platelet rich plasma, PRP) [151, 152], osteogeno diferenciacijo pa z dodatkom kombinacije polikaprolaktona, deksametazona in askorbinske kisline [153]. Nadalje na proliferacijski in diferenciacijski potencial MSC na SF vpliva tudi spreminjanje mehanskih in površinskih lastnosti SF [154], stopnja mineralizacije [145] in različna poroznost 3D nosilca SF [146]. Površinske, kemijske, mehanske in mikrostrukturne lastnosti SF so tako odločilnega pomena za vodenje celične usode in vitro in posledično njihov regeneracijski potencial in vivo. 1.1.10 Idealni celični nosilec Ne glede na vrsto nosilca obstajajo ključni dejavniki, ki jih je potrebno obravnavati pri odločanju o primernosti nosilca za uporabo v tkivnem inženirstvu. 1) Nosilci morajo biti biokompatibilni: omogočati morajo celično adhezijo, normalno celično funkcijo, migracijo celic skozi nosilec, pred izločanjem novega matriksa pa morajo biti celice na nosilcu sposobne proliferacije. Po presaditvi v telo nosilec ne sme izzvati imunskega odziva, ki bi sicer lahko vodil v zmanjšano celjenje ali zavrnitveno reakcijo. 2) Nosilec mora biti razgradljiv in tako omogočiti telesu lastnim celicam, da nosilec nadomestijo in začno izločati lastni zunajcelični matriks. Produkti razgradnje nosilca morajo biti netoksični in sposobni eliminacije iz telesa, ne M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 25 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija da bi pri tem škodovali drugim organom. 3) Nosilec mora imeti mehanske lastnosti, ki se skladajo z anatomskim mestom, kamor bo presajen. Hkrati mora biti dovolj močan, da prenese kirurško manipulacijo med presajanjem. Ravnotežje med mehanskimi lastnostmi in porozno strukturo, ki omogoča celično infiltracijo in vaskularizacijo, je ključnega pomena za uspešno rabo nosilca. 4) Struktura nosilca mora biti porozna, da lahko zagotovi infiltracijo celic, zadostno difuzijo hranilnih snovi in odstranjevanje odvečnih produktov ter da celicam omogoča izločanje zunajceličnega matriksa [3]. Meja najustreznejše velikosti por naj bi segala od 85 do 325 µm, odvisno od tkiva in vrste uporabljenih celic [155]. 5) Da bi bila uporaba nosilca v klinčni medicini izvedljiva, mora biti proizvodnja nosilca stroškovno sprejemljiva, hkrati pa mora omogočati izdelavo večih nosilcev naenkrat. Razvoj proizvodnega postopka v okviru standardov dobre proizvodne prakse je ključnega pomena za zagotovitev uspešnega prenosa tkivnega inženirstva iz laboratorija v kliniko [3]. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 26 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 1.2 NAMEN DELA IN HIPOTEZE Prvi namen našega dela je bil ugotoviti, kako vrsta, spol živali ter pozne pasaže vplivajo na proliferacijski in diferenciacijski potencial AMSC psov in mačk, gojenih na običajni podlagi iz plastike: 1. Gojenje celic in vitro omogoča preiskovanje celic in fizioloških ter bolezenskih procesov tkiva izven oganizma. Običajna podlaga za gojenje matičnih celic je 2D osnova iz polistirena. Ker je za namen zdravljenja bolezni z MSC potrebna obsežna namnožitev celic in transport celic od laboratorija do pacienta in ker različne lastnosti MSC v pogojih in vitro lahko vodijo v potencialno različen terapevtski učinek, so za namen presoje zdravljenja z MSC v veterinarski klinični medicini potrebne raziskave, ki temeljijo na odkrivanju vplivov različnih dejavnikov na osnovne značilnosti MSC in vitro. Med njimi sta vpliv vrste in vpliv spola v veterinarski regenerativni medicini redko proučevana. Drugi namen našega dela je bil gojiti celice na celičnih nosilcih iz SF in ugotoviti, kako svilni fibroin vpliva na AMSC: 2. Poskusi, izvedeni v 2D celičnih modelih, nam omogočajo razumevanje osnove celičnega delovanja in povezavo celic z mikrookoljem, v katerem se nahajajo. Vendar se zaradi težnje k posnemanju naravnega celičnega okolja, stremenja po možnosti nadzora, vodenja usode MSC in vitro ter možnosti uvajanja novih načinov vnosa celic v telo za gojenje MSC vedno bolj poudarja pomen uporabe celičnih nosilcev. Običajne plastične podlage za gojenje celic tako nadomeščajo 3D načini gojenja celic. Zaradi svojih mehanskih lastnosti, elastičnosti, biokompatibilnosti in nadzorovane razgradnje v ospredje številnih raziskav s področja biomaterialov stopa SF, naravni polimer, ki v različnih oblikah, kot so filmi, vlakna, mreža vlaken ali 3D nosilec, omogoča proliferacijo in diferenciacijo MSC. Zastavili smo si štiri delovne hipoteze: 1 Vrsta živali vpliva na proliferacijo in diferenciacijo AMSC 2 Spol živali vpliva na proliferacijo in diferenciacijo AMSC psov in mačk 3 Pozne pasaže negativno vplivajo na proliferacijo in diferenciacijo AMSC psov in mačk 4 Svilni fibroin omogoča adhezijo, proliferacijo in diferenciacijo AMSC M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 27 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 2 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1 MATIČNE CELICE V VETERINARSKI MEDICINI: TRENUTNO STANJE IN MOŽNOSTI ZDRAVLJENJA Stem cells in veterinary medicine: current state and treatment options Metka Voga1, Neza Adamic1, Modest Vengust1, Gregor Majdic1,2 1 Veterinarska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Medicinska fakulteta, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Frontiers in Veterinary science: 7:278, doi: 10.3389/fvets.2020.00278 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 28 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija Izvleček V zadnji letih se močno razvija regenerativna medicina - veja medicine, ki razvija metode za rast, popravilo ali nadomeščanje poškodovanih, obolelih ali odmrlih celic, organov in tkiv. Matične celice so nediferencirane celice z zmožnostjo samoobnavljanja in diferenciacije v specializirane celic tkiv. Namen zdravljenja z matičnimi celicami je premostitev telesne nezmožnosti za regeneracijo poškodovanih tkiv ali metabolnih procesov po akutni ali kronični poškodbi. Koncept zdravljenja z matičnimi celicami je bil prvič predstavljen leta 1991 s predpostavko, da je množično diferenciacijo celic v celice kateregakoli tkiva mogoče doseči z izolacijo, gojenjem in namnožitvijo matičnih celic v pogojih in vitro. Med različnimi vrstami matičnih celic so mezenhimske matične celice (MSC) prepoznane kot najustreznejše za uporabo v terapevtske namene zaradi enostavne izolacije in gojenja ter odsotnosti etičnih zadržkov pri njihovi uporabi. Zaradi izjemnih imunomodulatornih sposobnosti MSC in omejitev obstoječih možnosti zdravljenja se vedno bolj razvija tudi veterinarska regenarativna medicina. MSC predstavljajo možnost zdravljenja različnih belozni živali, kot so ortopedske in orodentalne bolezni, bolezni prebavnega trakta, bolezni jeter, ledvic, srca, kože in dihal, živčnomišična obolenja, očesne bolezni in bolezni reprodukcijskega sistema. Kljub napredku v znanju in razumevanju delovanja MSC pa še vedno ostajajo odprta številna vprašanja v zvezi z rabo MSC v terapevtske namene. Namen tega pregleda je bil povzeti trenutno stanje in izpostaviti ključne izzive na področju rabe MSC za terapevtske namene v veterinarski regenerativni medicini ter predstaviti rezultate klinične uporabe MSC pri veterinarskih pacientih. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 29 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 30 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 31 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 32 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 33 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 34 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 35 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 36 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 37 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 38 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 39 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 40 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 41 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 42 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 43 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 44 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 45 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 46 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 47 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 48 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 49 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 2.2 PRIMERJAVA IZRAŽANJA POVRŠINSKIH OZNAČEVALCEV, VIABILNOSTI TER PROLIFERACIJSKEGA IN DIFERENCIACIJSKEGA POTENCIALA MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC / MEDICINSKIH SIGNALIZIRAJOČIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV IN MAČK Comparison of canine and feline adipose – derived mesenchymal stem cells / medicinal signaling cells with regard to cell surface marker expression, viability, proliferation and differentiation potential Metka Voga1, Valerija Kovač2, Gregor Majdič1,3 1 Veterinarska fakulteta, Inštitut za predklinične vede, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, Ljubljana, Slovenija 3 Medicinska fakulteta, Inštitut za fiziologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Frontiers in Veterinary Science: 7:610240, doi: 10.3389/fvets.2020.610240 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 50 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija Izvleček Izjemne imunomodulatorne sposobnosti mezenhimskih matičnih celic, imenovanih tudi medicinske signalizirajoče celice (MSC) so v zadnjih letih omogočile izrazit napredek veterinarske regenerativne medicine. Kljub pozitivnim učinkom zdravljenja različnih bolezni živali z MSC, pa razlike v lastnostih MSC med posameznimi živalskimi vrstami niso dobro poznane. V raziskavi smo primerjali izražanje površinskih označevalcev, viabilnost ter proliferacijski in diferenciacijski potencial MSC iz maščobnega tkiva psov in mačk. Za izolacijo, karakterizacijo in gojenje celic psov in mačk smo uporabili isti medij in metode. Maščobno tkivo smo odvzeli 11 psom in 8 mačkam obeh spolov. Izražanje površinskih označevalcev smo določili z metodo pretočne citometrije. Viabilnost MSC, merjeno s hemocitometrom neposredno po tripsinizaciji celic in pretočno citometrijo po predhodnem shranjevanju celic čez noč smo primerjali med seboj. Proliferacijski potencial MSC smo analizirali med drugo in osmo pasažo z določanjem števila celičnih podvojitev in časa, potrebnega za podvojitev števila celic. Diferenciacijski potencial MSC smo določali pri zgodnji in pozni pasaži z diferenciranjem celic v kostne, hrustančne in maščobne celice. Rezultati raziskave so pokazali, da MSC psov v večji meri izražajo izbrane površinske označevalce, izkazujejo večjo viabilnost v manj optimalnih pogojih in izkazujejo večji proliferacijski in diferenciacijski potencial kot MSC mačk. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 51 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 52 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 53 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 54 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 55 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 56 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 57 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 58 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 59 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 60 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 61 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 62 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 63 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 64 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 2.3 SVILNI FIBROIN SPROŽA HONDROGENO DIFERENCIACIJO MULTIPOTENTNIH MEZENHIMSKIH STROMALNIH CELIC / MEZENHIMSKIH MATIČNIH CELIC IZ MAŠČOBNEGA TKIVA PSOV Silk fibroin induces chondrogenic differentiation of canine adipose – derived multipotent mesenchymal stromal cells / mesenchymal stem cells Metka Voga1, Natasa Drnovsek2, Sasa Novak2, Gregor Majdic1,3 1 Veterinarska fakulteta, Inštitut za predklinične vede, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 2 Inštitut Jožef Štefan, Odsek za nanostrukturne materiale, Ljubljana, Slovenija 3 Medicinska fakulteta, Inštitut za fiziologijo, Univerza v Mariboru, Maribor, Slovenija Journal of tissue engineering: 10:1-14, doi: 10.1177/2041731419835056 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 65 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija Izvleček Pod ustreznimi pogoji in vitro so se mezenhimske matične celice (MSC) sposobne diferencirati v različne specializirane celice. Z namenom vodenja celične usode se razvijajo različni biomateriali, katerih namen je posnemanje naravnega okolja - niše MSC. V naši raziskavi smo kot celični nosilec uporabili biomaterial iz svilnega fibroina in proučevali učinek nosilca na hondrogeno diferenciacijo MSC iz maščobnega tkiva psov. Maščobno tkivo smo odvzeli devetim lastniškim psom. Celice smo gojili na dvodimenzionalnih fibroinskih filmih in trodimenzionalnih fibroinskih poroznih nosilcih v običajnem celičnem gojišču. Morfologijo celic smo analizirali z uporabo vrstičnega elektronskega mikroskopa. Hondrogeno diferenicacijo celic smo analizirali z barvanjem celic z alcian modrim in s kvantifikacijo izražanja genov kolagen tipa 1, kolagen tipa 2, SOX9 in agrekan. Celice, gojene na fibroinskih filmih in poroznih nosilcih, so se obarvale modro z alcian modrim. Na slikah, posnetimi z elektronskim mikroskopom, so bili vidni vezikli in vlakna zunajceličnega matriksa ob skupkih celic, podobnimi hrustančnim celičnim skupkom. Izražanje genov SOX9 in agrekan je bilo statistično značilno večje v celicah, gojenih na fibroinskih filmih, v primerjavi s celicami negativne kontrole. Rezultati raziskave nakazujejo, da je hondrogeno diferenciacijo MSC iz maščobnega tkiva psov mogoče doseči z gojenjem MSC na fibroinskih nosilcih v običajnem celičnem gojišču brez uporabe specifičnih pogojev, ki so sicer potrebni za sprožitev hondrogene diferenciacije na standardni plastični podlagi. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 66 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 835056TEJ0010.1177/2041731419835056 Journal of Tissue EngineeringVoga et al. resear ch-article 2019 Original Article Journal of Tissue Engineering Volume 10: 1 –14 Silk fibroin induces chondrogenic © The Author(s) 2019 Article reuse guidelines: sagepub.com/journals-permissions differentiation of canine adipose–derived https: D//d O o I:i. o 1rg 0./1 1 0 1 .1 7 1 7 7 / 7 2 /2 0 0 4 4 1 1 7 7 3 3 114 4 1 1 9 9 8 8 3505 0 6 5 journals.sagepub.com/home/tej multipotent mesenchymal stromal cells/mesenchymal stem cells Metka Voga1, N atasa Drnovsek2, Sasa N ovak2 and Gregor Majdic1,3 Abstract Under appropriate culture conditions, mesenchymal stem cells (MSC), also called more properly multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC), can be induced toward differentiation into different cell lineages. In order to guide stem cell fate within an environment resembling the stem cell niche, different biomaterials are being developed. In the present study, we used silk fibroin (SF) as a biomaterial supporting the growth of MMSC and studied its effect on chondrogenesis of canine adipose–derived MMSC (cADMMSC). Adipose tissue was collected from nine privately owned dogs. MMSC were cultured on SF films and SF scaffolds in a standard cell culture medium. Cell morphology was evaluated by scanning electron microscopy (SEM). Chondrogenic differentiation was evaluated by alcian blue staining and mRNA expression of collagen type 1, collagen type 2, Sox9, and Aggrecan genes. cADMMSC cultured on SF films and SF scaffolds stained positive using alcian blue. SEM images revealed nodule-like structures with matrix vesicles and fibers resembling chondrogenic nodules. Gene expression of chondrogenic markers Sox9 and Aggrecan were statistically significantly upregulated in cADMMSC cultured on SF films in comparison to negative control cADMMSC. This result suggests that chondrogenesis of cADMMSC could occur when cells were grown on SF films in a standard cell culture medium without specific culture conditions, which were previously considered necessary for induction of chondrogenic differentiation. Keywords Mesenchymal stem cells, multipotent mesenchymal stromal cells, dog, silk fibroin, chondrogenic differentiation Date received: 14 September 2018; accepted: 11 February 2019 Introduction high cell density, or by induction with different hormones and growth factors, particularly TFG-β.4,5 However, there Mesenchymal stem cells (MSC), more properly called are also several reports describing spontaneous dif feren- multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC), have tiation of MMSC toward dif ferent lineages.6–9 received significant interest for their potential use in regenerative therapy in human and veterinary medicine due to their immunosuppressive and multilineage dif fer-1 Institute of Preclinical Sciences, Veterinary Faculty, University of entiation capabilities. 1 There are several established pro - Ljubljana, Ljubljana, Slovenia tocols for induction of MMSC dif ferentiation in vitro, 2 Department for Nanostructured Materials, Jozef Stefan Institute, which are optimized for conventional culturing of MMSC Ljubljana, Slovenia 3 Institute of Physiology, Medical School, University of Maribor, Maribor, in two-dimensional (2D) cell culture system with polysty - Slovenia rene vessels. Under appropriate culture conditions, dif ferentiation of MMSC can be induced toward adipocytic, Corresponding author: Gregor Majdic, Institute of Preclinical Sciences, Veterinary Faculty, osteocytic, and chondrocytic lineages. 2,3 Chondrogenesis University of Ljubljana, Gerbi čeva 60, 1000 Ljubljana, Slovenia. can be induced with specific culture conditions such as Email: gregor.majdic@vf.uni-lj.si Creative Commons Non Commercial CC BY-NC: This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 License (http://www.creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/) which permits non-commercial use, reproduction and distribution of the work without further permission provided the original work is attributed as specified on the SAGE and Open Access page (https://us.sagepub.com/en-us/nam/open-access-at-sage). M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 67 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 68 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 69 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 70 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 71 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 72 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 73 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 74 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 75 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 76 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 77 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 78 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 79 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 80 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 3 RAZPRAVA Matične celice predstavljajo potencial za zdravljenje številnih do zdaj neozdravljivih bolezni pri živalih in ljudeh. Izkoriščanje njihovih edinstvenih lastnosti se je v zadnjih letih izkazalo obetavno ne samo v humani, ampak tudi v veterinarski regenerativni medicini. Pri psih in mačkah, pogostih veterinarskih pacientih, po uspešnosti zdravljenja z MSC izstopajo predvsem ortopedske bolezni pri psih [72-77] in bolezni ustne votline pri mačkah [78-81]. Za klinično uporabo MSC je potrebna obsežna namnožitev celic in običajno tudi transport celic od laboratorija do pacienta. Ker znana intrinzična heterogenost MSC lahko znatno vpliva na njihov terapevtski potencial [156] in ker različne lastnosti MSC v pogojih in vitro lahko vodijo v različen terapevtski učinek, je proučevanje celic izjemnega pomena, saj nam omogoča vpogled v celično fiziologijo in procese tkiv izven organizma in posledično presojo uporabe MSC za zdravljenje. Za matične celice velja, da so sposobne adhezije na plastiko, zato se je za proučevanje MSC uveljavila 2D podlaga iz plastike. Matične celice definirajo stanje nediferenciranosti, sposobnost samoobnove in sposobnost diferenciacije v specializirane celice tkiv [2]. Dve pomembni lastnosti, ki ju lahko merimo v pogojih in vitro, sta tako njihov proliferacijski in diferenciacijski potencial. V prvem delu naše raziskave smo AMSC iz psov in mačk gojili na standardni podlagi iz plastike in proučevali vpliv vrste, spola in poznih pasaž na proliferacijski in diferenciacijski potencial AMSC. Življenjska doba MSC v pogojih in vitro je omejena, kar je bilo pokazano v večih raziskavah pri proučevanju vpliva poznih pasaž na njihov multipotentnost [104-107]. Določanje števila celičnih podvojitev (angl., Cell doubling, CD) in časa, potrebnega, da se število celic podvoji (angl., Cell doubling time, CDT), nam lahko omogoči vpogled v proliferacijski potencial MSC in olajša presojo zdravljenja z MSC. V predhodnih raziskavah so pokazali, da se z večanjem števila pasaž pri različnih živalskih vrstah vrednost CD zmanjšuje in vrednost CDT povečuje [79, 98, 104, 157]. Tudi v naši raziskavi smo pokazali, da se z večanjem števila pasaž proliferacijski potencial AMSC psov in mačk zmanjšuje, pri čemer je bilo podaljševanje CDT od druge do osme pasaže pri celicah psov razmeroma postopno, pri celicah mačk pa bolj neenakomerno. Na potentnost MSC poleg števila pasaž lahko vplivajo tudi drugi dejavniki, kot so tkivo izvora MSC [84, 86, 89, 98], anatomsko mesto tkiva [88, 99, 100] in starost živali [99, M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 81 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 101-103]. Glede na rezultate nekaterih raziskav bi lahko sklepali, da bi tudi vrsta živali lahko bila potencialni dejavnik vpliva na MSC. Pri MSC, izoliranih iz maščobnega tkiva psov, je bilo pokazano, da izkazujejo večji diferenciacijski potencial kot MSC, izoliranih iz drugih tkiv – kostnega mozga, popkovnice, amnijske membrane ali placente [86], medtem ko so raziskave pri konjih pokazale, da so MSC, izolirane iz kostnega mozga, izkazovale večji hondrogeni [158] in osteogeni [159] diferenciacijski potencial kot MSC iz maščobnega tkiva. Rezultati omenjenih raziskav nakazujejo možnost, da imajo MSC različnih živalskih vrst različne značilnosti. Tudi v naši raziskavi smo pokazali medvrstno različen proliferacijski potencial AMSC. AMSC psov so z ozirom na statistično značilno večji CD in statistično značilno krajši CDT izkazovale večji proliferacijski potencial kot AMSC mačk. Medvrstne razlike v proliferacijskem potencialu so se kazale tudi v poznih pasažah. V pasaži 8 pri AMSC mačk je bil CDT statistično značilno daljši kot v vseh ostalih pasažah pri obeh vrstah živali, kar nakazuje na to, da pozne pasaže bolj negativno vplivajo na proliferacijo AMSC mačk kot AMSC psov. Različen vpliv poznih pasaž med živalskima vrstama se je kazal tudi v diferenciacijskem potencialu AMSC psov in mačk. Medtem ko so bile celice obeh vrst živali sposobne diferenciacije v hrustančne, kostne in maščobne celice v zgodnji pasaži, so bile celice psov zmožne trilinijske diferenciacije tudi v pasaži 8, celice mačk pa v pasaži 6, ne pa tudi v poznejših pasažah. To kaže na bolj negativen vpliv poznih pasaž na diferenciacijski potencial AMSC pri mačkah kot pri psih. Celice psov so v primerjavi s celicami mačk izkazovale tudi večji hondrogeni in osteogeni diferenciacijski potencial v zgodnji pasaži, kar smo pokazali s kvantifikacijo pri majhni povečavi posnetih slik diferenciacije z uporabo programa ImageJ. Očitnih razlik med kvalitativno oceno maščobne diferenciacije med AMSC psov in mačk nismo zaznali. Adipogeno diferenciacijo smo analizirali zgolj kvalitativno zaradi majhnosti maščobnih vakuol, ki so v primerjavi z vakuolami, ki nastanejo pri maščobni diferenciaciji MSC ljudi, precej manjše [110]. Na velikost nastalih maščobnih vakuol morda vpliva tudi tkivo izvora MSC, kot je bilo pokazano v eni od raziskav, kjer so bile maščobne vakuole, nastale pri diferenciaciji MSC iz pokožnega maščobnega tkiva in kostnega mozga psov, manjše od vakuol maščobnih celic, pridobljenih iz MSC sinovije ali infrapatelarne maščobe [85]. Med analizo proliferacijskega in diferenciacijskega potenciala smo našli le manjše razlike med spoloma in sicer v zgodnji pasaži osteogene diferenciacije, kjer so samice obeh vrst živali izkazovale večji diferenciacijski potencial kot samci. Razlike med spoloma so v predkliničnih M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 82 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija raziskavah redko proučevane [160], čeprav je znano, da spol pacienta lahko vpliva na tveganje za dovzetnost in razvoj bolezni [161]. Razlike med spoloma so bile objavljene tudi na področju regenerativne medicine v povezavi z nevrogenim diferenciacijskim potencialom [111, 112], sposobnostjo imunomodulacije [113] in terapevtskim učinkom [114] MSC pri ljudeh in živalih. V naši raziskavi smo našli le manjše razlike med spoloma, ki nakazujejo na to, da spol živali ne vpliva bistveno na osnovne lastnosti AMSC, a vendar bi prisotne razlike lahko pomenile potencialno različno regeneracijsko sposobnost AMSC med spoloma. Več razlik med spoloma bi potencialno lahko našli na molekularni ravni, zaradi česar bi razlike med spoloma morali proučevati v prihodnjih študijah. Proučevanje razlik med spoloma v raziskavah, ki vključujejo celice, živali in ljudi, lahko pomembno vplivajo na razvoj novih strategij zdravljenja različnih bolezni [161]. Poleg proučevanja proliferacijskega in diferenciacijskega potenciala smo v nadaljevanju raziskave analizirali tudi izražanje površinskih označevalcev in živost celic obeh vrst živali. Pri obeh analizah smo našli medvrstne razlike, ki smo jih vključili med rezultate. Minimalna merila za identifikacijo človeških MSC je leta 2006 oblikovalo Mednarodno združenje za celična zdravljenja z namenom poenotene karakterizacije MSC in primerljivosti rezultatov raziskav z njimi. Zahtevana merila vključujejo sposobnost adhezije MSC na plastiko v standardni celični kulturi, izražanje celičnih označevalcev CD105, CD73, CD90, odsotnost izražanja celičnih označevalcev CD45, CD34, CD14 (ali CD11b), CD79α (ali CD19) in HLA– DR ter sposobnost diferenciacije v osteoblaste, hondroblaste in adipocite [16]. MSC živali so, podobno kot MSC ljudi, sposobne adhezije na plastiko in trilinijske diferenciacije, vendar ne izražajo enakih celičnih označevalcev kot MSC ljudi. Večina MSC živali izraža CD29 in CD44, medtem ko je izražanje CD105, CD73 in CD90 med živalskimi vrstami različno [162]. Minimalni kriteriji za identifikacijo MSC živali zaenkrat zato še niso določeni. Predhodne raziskave so pokazale, da MSC psov [84, 163-165] in mačk [87, 157] stalno izražajo označevalce CD44 in CD90 in ne izražajo CD34, medtem ko je izražanje ostalih površinskih označevalcev, CD105 in CD73, spremenljivo in odvisno od tkiva izvora MSC [84] oziroma so izraženi samo pri psih [98, 166], ne pa tudi pri mačkah [157]. V naši raziskavi smo analizirali površinske označevalce, za katere je znano, da so na MSC psov in mačk stalno izraženi. Med pozitivnimi označevalci smo analizirali CD44 in CD90, med negativnimi pa CD34. V skladu z M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 83 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija rezultati predhodnih raziskav smo pokazali, da večina živih AMSC psov in mačk izraža CD44 in CD90 in ne izraža CD34. Odstotek celic, ki so izražale CD44 in CD90 oziroma niso izražale CD34, je bil statistično značilno večji pri celicah psov kot pri celicah mačk. Razlik med spoloma nismo našli. Glede na znano heterogenost MSC, ki se kaže v različnih populacijskih skupinah znotraj celične populacije MSC [156], bi kot enega izmed možnih vzrokov za medvrstne razlike v relativnem izražanju preiskovanih celičnih označevalcev lahko navedli večjo intrinzično heterogenost populacije celic mačk v primerjavi s populacijo celic psov. CD34 je transmembranski fosfoglikoprotein, ki je bil prvotno identificiran na hematopoetskih matičnih in hematopoetskih progenitornih celicah [167, 168], pri katerih na eni strani z zaviranjem adhezije spodbuja migracijo HSC [169], na drugi strani pa s spodbujanjem adhezije HSC omogoča interakcijo celic z okoljsko stromo [170]. V splošnem velja prevladujoče mnenje, da MSC ne izražajo CD34 [16, 171]. Vendar številne raziskave kažejo, da je CD34 izražen tudi na MSC in na številnih drugih nehematopoetskih celicah, kot so satelitske celice mišičnega tkiva [172], stromalne celice številnih organov [173, 174], progenitorne celice epitelija [175] in progenitorne celice žilnega endotela [176]. CD34 lahko izražajo tudi stromalne celice maščobnega tkiva, ki se nahajajo ob žilnem endotelu in poleg CD34 izražajo označevalce, značilne za pericite in MSC ter so sposobne adhezije na plastiko in imajo multidiferenciacijski potencial [29]. Variabilnost podatkov iz različnih raziskav, ki kažejo, da so stromalne celice maščobe ali CD34–/– ali CD34+/+, so verjetno posledica adhezije celic na plastiko in zmanjševanja izražanja CD34 z večanjem števila pasaž [171, 174, 177]. Ali so v naši raziskavi celice psov in mačk, ki niso bile CD34–/–, pripadale MSC ali ne, je težko predpostaviti, saj bi bila za bolj natančno identifikacijo celic poleg analize večjega števila celičnih označevalcev potrebna tudi analiza funkcionalnosti in diferenciacijskih sposobnosti posameznih celičnih populacij [174]. Na podlagi raznolikosti podatkov v literaturi o fenotipu MSC je v prihodnosti verjetno pričakovati spremembe v zvezi z identifikacijo MSC [171]. Z ozirom na že znane medvrstne razlike v izražanju površinskih označevalcev je pričakovati tudi nadaljne primerjalne raziskave fenotipa MSC med posameznimi živalskimi vrstami. V naši raziskavi smo pokazali, da je relativno izražanje tudi že znanih označevalcev MSC med vrstami različno. Ko bodo znani tkivno in vrstno specifični označevalci MSC in ko bo na voljo večji izbor vrstno specifičnih protiteles, bo olajšano tudi bolj podrobno proučevanje izražanja označevalcev MSC med različnimi vrstami veterinarskih pacientov. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 84 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija V raziskavi smo med analizo proliferacijskega potenciala in površinskih označevalcev AMSC merili tudi celično živost ter našli razlike v živosti med AMSC psov in mačk. Živost celic smo merili med analizo proliferacijskega potenciala pri vsaki pasaži neposredno po tripsinizaciji celic z uporabo hemocitometra ter med analizo površinskih označevalcev pri tretji pasaži z uporabo pretočnega citometra, po predhodnem shranjevanju celic čez noč v PBS pri 4°C. Živost celic pri tretji pasaži, merjeno z obema metodama, smo primerjali med seboj, z namenom ugotoviti morebitne razlike v živosti med vrstama in med spoloma. Razlik med spoloma nismo našli, prav tako je bila živost, merjena s hemocitometrom, med živalskima vrstama podobna. Živost celic, merjena s pretočnim citometrom po predhodnem shranjevanju celic čez noč v PBS pri 4°C, pa je bila statistično značilno večja pri celicah psov kot pri celicah mačk. V večih raziskavah je bilo pokazano, da so podatki o živosti celic, merjene pod mikroskopom ali s pretočno citometrijo, med seboj primerljivi [178-180], zato razlaga za dobljene rezultate najverjetneje leži v različni občutljivosti AMSC psov in mačk na manipulacijo z njimi v manj optimalnih pogojih. Večja dovzetnost celic mačk na manj optimalne pogoje nakazuje na pomen upoštevanja živalske vrste pri pripravi celic za klinično uporabo. Za namen uporabe AMSC v kliniki je običajno potreben tudi transport celic, ki v odvisnosti od razdalje laboratorija do pacienta terja različen čas. Vpliv dodatne manipulacije in hrambe celic na celično živost pri različnih vrstah živali bi bilo zato potrebno podrobneje proučevati tudi v prihodnjih študijah. Rezultati prvega dela naše raziskave so pokazali, da AMSC mačk izkazujejo slabši proliferacijski in diferenciacijski potencial kot AMSC psov in da pozne pasaže bolj negativno vplivajo na proliferacijski in diferenciacijski potencial AMSC mačk kot na AMSC psov. Z rezultati smo potrdili prvo in tretjo hipotezo, ter delno potrdili drugo hipotezo. Rezultati so tudi pokazali, da AMSC mačk v manjši meri izražajo preiskovane celične označevalce in v manj optimalnih pogojih izkazujejo slabšo živost. Ena izmed možnih razlag za slabše karakteristike AMSC mačk v primerjavi z AMSC psov morda leži v večji dovzetnosti AMSC mačk na kisik v atmosferi gojenih celic. Značilna asimetrična delitev matičnih celic vodi v nastanek ene nove matične celice in druge progenitorne celice – delno diferencirane celice, usmerjene v razvoj določene celične linije [120]. Delitev MSC tako vodi v dve populaciji MSC gojenih in vitro – majhne, vretenaste, hitro deleče se celice in večje, ploščate celice nepravilnih oblik s počasno proliferacijo [181], ki z M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 85 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija večanjem števila celičnih delitev vztrajno nadomeščajo prve [182]. Življenjska doba MSC v pogojih in vitro je tako omejena zaradi replikativne senescence, procesa, ki vodi v prenehanje delitve celic, akumulacijo metabolnih produktov in celično smrt [183]. V naravnem okolju se MSC nahajajo v mirujočem stanju, za katerega so značilne visoka potentnost celic, počasna proliferacija in glikoliza kot vodilni proces energetskega metabolizma. V celični kulturi z visoko vsebnostjo hranilnih snovi je proliferacija pospešena, energetski metabolizem pa odvisen predvsem od oksidativne fosforilacije [184, 185], ki vodi v akumulacijo reaktivnih kisikovih spojin (ROS) [186]. Kljub temu, da se MSC v telesu nahajajo perivaskularno, je koncentracija kisika v niši MSC nizka – 2% – 9% [187]. Senescenca v pogojih in vitro je pospešena zaradi kisika, ki v atmosferi gojenih celic štiri– do desetkrat presega vsebnost kisika v telesu znotraj tkiv [186]. V kulturi z zmanjšano vsebnostjo kisika je senescenca celic zmanjšana kot posledica ohranjanja glikolize in zaviranja oksidativne fosforilacije [188, 189]. Večja vsebnost kisika v atmosferi gojenih celic pa vodi do poškodbe proteinov in telomer deoksiribounkleinske kisline (DNK) ter posledične aktivacije s senescenco povezanih signalnih poti [186], vključujoč MAPK in molekul p53 in p16 [190], ključnih za napredovanje in ustavitev celičnega cikla [191]. Senescenca celic poleg učinka na manjšanje proliferacijskega potenciala vpliva negativno tudi na migracijske sposobnosti MSC in njihov diferenciacijski potencial [192]. Z vplivom na imunomodulatorne lastnosti MSC, ključne pri njihovem terapevtskem delovanju, pa senescenca pomembno zmanjšuje terapevtski potencial MSC [185, 193]. V naši raziskavi bi predpostavljena morebitna večja dovzetnost AMSC mačk na kisik lahko bila posledica različnega metabolizma AMSC mačk v primerjavi z AMSC psov, kar bi bilo potrebno proučiti v prihodnjih raziskavah. Z znižanjem koncentracije kisika v atmosferi bi morda do neke mere lahko posnemali pogoje v naravnem okolju MSC in s tem morebiti dosegli boljše rezultate gojenja AMSC mačk, kot je bilo to pokazano v predhodnih raziskavah pri ljudeh in drugih vrstah živali [194-198]. Kljub temu, da bistvenih razlik med spoloma v preiskovanih parametrih AMSC psov in mačk nismo našli, so rezultati naše preiskave pokazali pomembne medvrstne razlike, kar kaže na bistven vpliv vrste živali na značilnosti AMSC, gojenih na običajni plastični podlagi v pogojih in vitro. Ker je za namen zdravljenja bolezni z MSC potrebna obsežna namnožitev celic in transport celic od laboratorija do pacienta, bi medvrstne razlike v značilnostih MSC lahko M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 86 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija potencialno vplivale tudi na njihov terapevtski učinek. Živalsko vrsto bi zato morali upoštevati kot spremenljivko pri pripravi celic za regenerativno zdravljenje. Raziskave na področju matičnih celic se osredotočajo na iskanje in razumevanje mehanizmov, potrebnih za vodenje celične usode v želeno smer. Podobnosti med lastnostmi v laboratoriju gojenih AMSC z lastnostmi celic v naravnem okolju v telesu so vprašljive. Običajne plastične podlage za gojenje celic tako nadomeščajo 3D načini gojenja celic, saj omogočajo opazovanje celic v pogojih, ki bolje posnemajo naravno celično okolje in hkrati nudijo možnost uvajanja novih načinov vnosa celic v telo. V drugem delu naše raziskave smo AMSC psov gojili na celičnem nosilcu iz SF z namenom ugotoviti, ali biomaterial iz SF omogoča adhezijo, proliferacijo in diferenciacijo celic. Iz SF smo pripravili 2D filme in 3D porozne nosilce. V raziskavi smo potrdili, da SF omogoča adhezijo celic, a ne omogoča njihove proliferacije, temveč sproža hondrogeno diferenciacijo celic. Hondrogeno diferenciacijo MSC na običajni plastični podlagi je moč doseči z uporabo vlažne atmosfere, veliko gostoto naseljenih celic in uporabo ustreznih rastnih dejavnikov, kot je transformirajoči rastni dejavnik beta (TGF–β) [199]. Ključni dejavniki, odgovorni za celično diferenciacijo, niso dobro znani. V predhodnih raziskavah so pokazali, da nekateri biomateriali kot so polimeri, kompozitni in nanofibrozni materiali lahko usmerjajo MSC proti adipogeni [200] ali osteogeni [201, 202] diferenciaciji celic. Rezultati predhodnih raziskav, v katerih so proučevali vpliv SF na proliferacijo in diferenciacijo MSC, so pokazali, da SF omogoča proliferacijo MSC. Rodriguez–Lozano F in sodelavci (2014) so pri proučevanju vpliva SF na MSC iz pozobnice pokazali, da je proliferacija MSC na filmih SF slabša kot na plastiki [147], medtem ko so Collado–Gonzalez in sodelavci (2018) pokazali, da je bila proliferacija MSC, izoliranih iz zobne pulpe človeških zob, gojenih na 3D poroznem nosilcu SF, podobna kot pri celicah, gojenih na plastiki [148]. V primerjavi z omenjenimi raziskavami smo v naši raziskavi pokazali, da SF ne omogoča proliferacije AMSC psov, ampak sproža hondrogeno diferenciacijo celic. Hondrogeno diferenciacijo smo dokazovali z analizo morfologije celic, z barvanjem celic z alcian modrim in analizo izražanja genov. Celice, gojene na fibroinskih filmih, so bile morfološko zelo podobne tistim iz pozitivne kontrole. Celice pozitivne kontrole smo z uporabo diferenciacijskega gojišča na plastiki diferencirali v hrustančne celice in so se združevale v tako imenovane hrustančne skupke s številnimi vezikli zunajceličnega matriksa, M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 87 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija zaznanih pod vrstičnim elektronskim mikroskopom. Številni vezikli zunajceličnega matriksa so bili prisotni tudi pri celicah, gojenih na filmih in poroznih nosilcih SF. Celice, gojene na poroznih nosilcih, so se večinoma združevale v amorfne plasti, združevanje v hrustančne skupke je bilo opazno le mestoma. Celice, gojene na filmih in poroznih nosilcih so se, tako kot celice pozitivne kontrole, barvale modro z alcian modrim, specifičnim barvilom, s katerim se modro obarvajo proteoglikani hrustanca, kot je hondroitin sulfat [203]. Za MSC, diferencirane na plastiki v hondrogenem diferenciacijskem gojišču v ustreznih atmosferskih pogojih velja, da v začetku združevanja v skupke izražajo kolagen tipa 1, po dveh do treh tednih pa začno izločati zunajcelični matriks z vsebnostjo kolagena tipa 2 [204]. Za diferenciacijo MSC je značilno zmanjševanje proliferacije in povečevanje izražanja za diferenciacijsko linijo značilnih genov [123]. TGF–β je znan dejavnik, ki z aktivacijo signalne poti SMAD in SOX9, prvega transkripcijskega dejavnika, ključnega za hondrogenezo, sproža hondrogeno diferenciacijo MSC [205]. Pomemben označevalec hondrogene diferenciacije je tudi agrekan, značilen za zrel hrustanec in katerega izražanje se povečuje med hondrogeno diferenciacijo MSC [206]. V naši raziskavi smo s kvantitativno reakcijo s polimerazo v realnem času analizirali izražanje genov kolagen tipa 1, kolagen tipa 2, SOX9 in agrekan v celicah, gojenih na filmih SF in celicah pozitivne in negativne kontrole. Izražanje genov kolagen tipa 1 in kolagen tipa 2 je bilo med skupinami podobno, medtem ko je bilo v primerjavi z negativno kontrolo izražanje genov SOX9 in agrekan statistično značilno večje v celicah pozitivne kontrole in celicah, gojenih na filmih SF. Rezultati kvantifikacije izražanja genov potrjujejo rezultate morfološke analize in barvanja z alcian modrim v naši raziskavi in kažejo na hondrogeno diferenciacijo celic, gojenih na SF. Kot enega izmed možnih razlogov za statistično neznačilno izražanje kolagena tipa 2 bi lahko navedli morebitno prekratko časovno obdobje, v katerem je potekala diferenciacija celic. Do večjega izražanja kolagena tipa 2 bi morda prišlo po daljšem času gojenja celic. Zakaj je v naši raziskavi SF vplival na hondrogeno diferenciacijo AMSC psov, je težko predpostaviti. V nekaterih raziskavah je bilo pokazano, da vzdrževanje konfluentne kulture AMSC ljudi lahko izzove izražanje označevalcev, značilnih za hrustančno, kostno ali maščobno linijo diferenciranih celic [207]. Podobno so pokazali tudi Bosnakovski in sodelavci (2004), ki so zgolj s kulturo celic v obliki peleta MSC iz kostnega mozga goveda dosegli hondrogeno M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 88 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija diferenciacijo celic [208]. V naši raziskavi smo celice na filme SF naseljevali v majhni gostoti. Celice zaradi nezmožnosti proliferacije niso dosegle konfluence, zato smo gostoto celic izključili kot morebiten razlog za nastop hondrogene diferenciacije na filmih SF. Visoka gostota celic bi lahko igrala vlogo v hondrogenezi celic, naseljenih na porozne nosilce, kamor smo celice naseljevali v večji gostoti zaradi bistveno večje površine nosilca. Poleg visoke gostote naseljevanja celic na celične plošče je bil v predhodnih raziskavah kot možen vzrok za spontano hondrogeno diferenciacijo MSC konj navedeno celično gojišče z vsebnostjo 10% fetalnega govejega seruma (angl., Foetal Bovine Serum, FBS) [209]. V naši razsikavi se celice negativne kontrole, gojene na plastiki v gojišču z vsebnostjo 10% FBS, niso diferencirale, zato dodatek FBS verjetno ni bil vzrok za hondrogeno diferenciacijo celic na SF. Spontano hondrogeno diferenciacijo so zaznali tudi pri naseljevanju celic iz periosta ljudi v primeru uporabe celic iz zgodnjih pasaž [210]. V naši raziskavi so bile tudi uporabljene celice zgodnje (druge do četrte) pasaže, vendar to najverjetneje ni bil razlog za diferenciacijo na SF, saj so bile celice negativne kontrole, ki se niso diferencirale, tudi iz zgodnje pasaže. Poleg omenjenih je bilo kot eden izmed možnih vzrokov za spontano diferenciacijo omenjeno tudi tkivo izvora MSC. MSC podgan, izolirane iz fetalne periferne krvi in gojene na plastični podlagi v običajnem celičnem gojišču, so bile v primerjavi z MSC podgan, izoliranih iz kostnega mozga, sposobne spontane hondrogene in osteogene diferenciacije [211]. V naši raziskavi smo uporabili AMSC psov, za katere v literaturi nismo našli podatkov o pojavu spontane hondrogene diferenciacije. Potencialna predpostavka, da bi tkivo izvora MSC v naši raziskavi lahko imelo vpliv na dane rezultate, ni verjetna, saj do diferenciacije v celicah negativne kontrole, izvirajočih iz istega tkiva, ni prišlo. Glede na to, da sta do sprožitve hondrogene diferenciacije AMSC privedla oba uporabljena, strukturno različna nosilca iz SF (filmi in porozni nosilci), tudi mehanske lastnosti SF najverjetneje niso vzrok za hondrogeno diferenciacijo celic. Verjetnejša potencialna razlaga za hondrogeno diferenciacijo celic na SF v naši raziskavi je povezana z adhezijo celic na SF. Znano je, da adhezija celic na zunajcelični matriks preko mehanotransdukcije pomembno vpliva na morfologijo in usodo MSC [212]. Bai in sodelavci (2015) so npr. s spreminjanjem trdnosti in površinskih lastnosti nanovlaken SF vplivali na proliferacijski in diferenciacijski potencial MSC podgan iz kostnega mozga in ugotovili, da lahko biomaterial sam aktivno spodbuja celice k diferenciaciji v mišične in endotelne celice [154]. Adhezija celic pa je tako odločilnega pomena tudi za hondrogeno diferenciacijo MSC [213]. V večih raziskavah so pokazali, da RGD, vezavna domena fibronektina zunajceličnega matriksa, pomembno prispeva M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 89 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija k boljši adheziji in hondrogenezi MSC [214]. Vpliv RGD na adhezijo MSC je bil pokazan tudi pri gojenju MSC na SF [149], vendar pa dodatek RGD k nosilcem iz SF, zanimivo, ni prispeval k boljši hondrogenezi človeških MSC iz kostnega mozga, izražanje COL2A1 v celicah je bilo celo večje na samem SF v primerjavi z SF z dodanim RGD [215]. Jaipaew in sodelavci (2016) so ugotovili, da na različno stopnjo hondrogene diferenciacije človeških MSC iz popkovine lahko vpliva tudi različna vsebnost hialuronske kisline v poroznem nosilcu iz SF [150]. V naši raziskavi SF ni bil vezan z RGD ali hialuronsko kislino, vendar pa bi lahko bila hondrogeneza posledica kombinacije vpliva SF in katere izmed komponent uporabljenega celičnega gojišča. Hondrogeno diferenciacijo MSC gojenih na SF so v predhodnih raziskavah dosegli npr. z uporabo gojišča z vsebnostjo askorbinske kisline [151] ali PRP [151, 152], pri čemer se je PRP izkazal kot ustreznejši za sprožitev hondrogene diferenciacije, saj je omogočal večjo akumulacijo glikozaminoglikanov kot askorbinska kislina [151]. Zaradi individualne sestave celičnih gojišč, uporabljanih med posameznimi laboratoriji, ki onemogočajo neposredno primerjavo posameznih študij, se bodo nadaljne analize za ugotovitev vzroka za hondrogeno diferenciacijo AMSC na SF v naši raziskavi najprej osredotočale na preiskovanje povezave vpliva kombinacije SF in komponent celičnega gojišča. V naši raziskavi smo na SF gojili AMSC psov. Za ugotovitev morebitne vrstne specifičnosti hondrogene diferenciacije MSC na SF bodo potrebni nadaljni poskusi gojenja MSC različnih vrst živali na SF. Rezultati drugega dela naše raziskave so pokazali, da SF omogoča adhezijo AMSC, vendar ne omogoča njihove proliferacije, temveč vodi razvoj AMSC psov v smeri hondrogene diferenciacije. Četrto hipotezo smo tako delno potrdili in delno ovrgli. Hondrogeno diferenciacijo smo potrdili z analizo celične morfologije pod svetlobnim in vrstičnim elektronskim mikroskopom, barvanjem hrustančnih proteoglikanov v zunajceličnem matriksu diferenciranih celic ter kvantifikacijo izražanja genov, značilnih za hrustančne celice. Celice so se na SF diferencirale brez posebnih pogojev naseljevanja, atmosferskih pogojev ali diferenciacijskih gojišč, ki so sicer potrebni za hondrogeno diferenciacijo na običajni plastični podlagi. Rezultati raziskave predstavljajo osnovo za nadaljne raziskave v smeri ugotavljanja in razumevanja ključnih dejavnikov in mehanizmov, odgovornih za sprožitev diferenciacije AMSC na SF. Še posebno smiselno bi bilo nadgraditi proučevanje vpliva SF na AMSC v smeri ugotavljanja izražanja drugih hrustančnih in tudi hipertrofičnih označevalcev ter možnosti prilagajanja dejavnikov vpliva SF, z vizijo prenosa znanja v klinično veterinarsko medicino. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 90 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 4 SKLEPI 1. Vrsta živali bistveno vpliva na lastnosti AMSC psov in mačk. AMSC mačk izkazujejo slabši proliferacijski in diferenciacjiski potencial kot AMSC psov. Potrdili smo prvo hipotezo, da vrsta živali vpliva na proliferacijski in diferenciacijski potenical AMSC. AMSC mačk so tudi bolj podvržene vplivu poznih pasaž kot AMSC psov, v manjši meri izražajo izbrane površinske označevalce CD90, CD44 in CD34 in izkazujejo slabšo živost v manj optimalnih pogojih, kar dodatno nakazuje na vpliv vrste živali na lastnosti AMSC v pogojih in vitro. 2. Spol živali ne vpliva bistveno na lastnosti AMSC psov in mačk. Spol živali nima vpliva na proliferacijski potencial AMSC psov in mačk, a ima manjši vpliv na diferenciacijski potencial AMSC, pri čemer samice psov in mačk v zgodnji pasaži osteogene diferenciacije izkazujejo večji diferenciacijski potenical v primerjavi s samci obeh vrst živali. Drugo hipotezo, da spol živali vpliva na proliferacijski in diferenciacijski potenical AMSC psov in mačk, smo tako delno potrdili in delno ovrgli. 3. Pozne pasaže negativno vplivajo na proliferacijo in diferenicacijo AMSC psov in mačk, s čimer smo potrdili tretjo hipotezo. Vplivu poznih pasaž so bolj podvržene AMSC mačk. 4. Svilni fibroin omogoča adhezijo AMSC psov, vendar ne omogoča njihove proliferacije, temveč vodi razvoj AMSC v smeri hondrogene diferenciacije, ki nastopi brez posebnih pogojev gojenja celic, sicer potrebnih za hondrogenezo AMSC na običajni plastični podlagi. Četrto hipotezo, da svilni fibroin omogoča adhezijo, proliferacijo in diferenciacijo AMSC, smo tako delno potrdili in delno ovrgli. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 91 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 5 POVZETEK Matične celice so nediferencirane celice, sposobne samoobnove in razvoja v specializirane celice posameznega tkiva. Zaradi svojih edinstvenih lastnosti matične celic predstavljajo potencialni temelj medicine v prihodnosti. Gojenje celic in vitro omogoča preiskovanje celic in fizioloških ter bolezenskih procesov tkiva izven oganizma. Običajna podlaga za gojenje matičnih celic je 2D osnova iz polistirena. Ker različne lastnosti MSC v pogojih in vitro lahko vodijo v potencialno različen terapevtski učinek, je za lažjo presojo učinkovitosti zdravljenja z MSC pomembno odkrivanje vplivov različnih dejavnikov na osnovne značilnosti MSC in vitro. Med njimi sta vpliv vrste in vpliv spola v veterinarski regenerativni medicini redko proučevana. Namesto običajne plastične podlage za gojenje MSC se zaradi boljšega posnemanja naravnega celičnega okolja, stremenja po možnosti nadzora in vodenja usode MSC in vitro ter možnosti uvajanja novih načinov vnosa celic v telo za gojenje celic vedno bolj poudarja pomen uporabe celičnih nosilcev. Zaradi svojih mehanskih lastnosti, elastičnosti, biokompatibilnosti in nadzorovane razgradnje v ospredje številnih raziskav s področja biomaterialov stopa svilni fibroin. Prvi namen našega dela je bil gojiti AMSC psov in mačk na običajni podlagi iz plastike ter ugotoviti, kako vrsta, spol živali in pozne pasaže vplivajo na proliferacijski in diferenciacijski potencial AMSC pri psih in mačkah. Drugi namen našega dela je bil gojiti celice tudi na celičnih nosilcih iz svilnega fibroina in ugotoviti, kako svilni fibroin vpliva na AMSC. V prvem delu raziskave smo pokazali, da AMSC mačk izkazujejo slabši proliferacijski potencial, saj je bilo med merjenjem proliferacijskega potenciala od druge do osme pasaže število celičnih podvojitev bistveno manjše, čas, ki je potreben za podvojitev števila celic, pa bistveno daljši pri AMSC mačk kot pri AMSC psov. AMSC mačk so v primerjavi z AMSC psov izkazovale tudi slabši diferenciacijski potencial, saj so se lahko diferencirale pri pasaži 6, ne pa tudi pri poznejših pasažah, kot smo dokazali za AMSC psov. Osteogeni in hondrogeni diferenciacijski potencial je bil na podlagi kvantifikacije slik diferenciacije slabši pri AMSC mačk kot pri AMSC psov. Pozne pasaže so bolj negativno vplivale tako na proliferacijski kot na diferenciacijski potencial AMSC mačk kot na AMSC psov. Dodatno smo pokazali tudi, da AMSC mačk v manjši meri izražajo preiskovane celične označevalce. Odstotek celic, ki so izražale CD44 in CD90 oziroma niso izražale CD34, je bil večji pri celicah psov kot pri celicah M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 92 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija mačk. AMSC mačk so v primerjavi z AMSC psov v manj optimalnih pogojih izkazovale tudi slabšo živost, merjeno z metodo pretočne citometrije. V raziskavi smo našli le manjše razlike med spoloma, ki so bile prisotne v zgodnji pasaži osteogene diferenciacije, pri čemer so AMSC samic izkazovale večji diferenciacijski potencial kot AMSC samcev obeh vrst živali. Drugih razlik med spoloma nismo našli. Z rezultati prvega dela raziskave smo pokazali, da vrsta živali lahko bistveno vpliva na značilnosti AMSC v pogojih in vitro in da bi živalsko vrsto morali upoštevati kot spremenljivko pri pripravi celic za regenerativno zdravljenje. Rezultati drugega dela naše raziskave so pokazali, da SF omogoča adhezijo AMSC in vodi usodo AMSC psov v smeri hondrogene diferenciacije. Hondrogeno diferenciacijo smo najprej potrdili z analizo celične morfologije, ki je bila med celicami pozitivne kontrole in celicami, gojenimi na SF, podobna, celice obeh skupin so se združevale v značilne hondrogene skupke. Hondrogeno diferenciacijo smo v nadaljevanju potrdili z barvanjem zunajceličnega matriksa diferenciranih celic z uporabo barvila alcian modro, ki modro obarva hrustančne proteoglikane. Celice, gojene na SF, so se, tako kot celice pozitivne kontrole, obarvale modro. Kot tretjo metodo za dokazovanje hondrogene diferenciacije smo uporabili kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času, s katero smo potrdili, da celice, gojene na SF, izražajo gene, značilne za hrustančne celice. Z rezultati drugega dela raziskave smo pokazali, da je hondrogeno diferenciacijo celic moč doseči brez posebnih pogojev gojenja celic, ki so sicer potrebni za hondrogenezo AMSC na običajni plastični podlagi. Rezultati naše raziskave predstavljajo izvirni prispevek k znanosti na področju razumevanja osnovnih bioloških lastnosti MSC. Omogočajo poglobitev pomena poznavanja razlik matičnih celic med živalskimi vrstami in med spoloma ter posledično presojo zdravljenja živali z matičnimi celicami v veterinarski praksi. Hkrati predstavljajo tudi pomembno osnovo za prihodnje študije in potencial za uvajanje novih zdravljenj z matičnimi celicami v veterinarsko klinično medicino. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 93 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 6 SUMMARY Stem cells are undifferentiated cells capable of self–renewal and development into specialized cells of various tissues. Because of their unique properties, stem cells represent a potential basis of the medicine in the future. Cell cultures allow studies of cells, as well as physiological and pathological processes in various tissues outside the organism. The usual surface for stem cell culture is a two–dimensional polystyrene. Different properties of MSC in vitro can potentially lead to different therapeutic effects. The influence of various factors on the basic properties of MSC in vitro is being studied with regard to the therapeutic potential of MSC. However, factors such as species and sex are rarely studied in regenerative veterinary medicine. Instead of the established plastic surface for MSC culturing, the use of cell carriers is increasingly studied in recent years as they provide a better imitation of the natural cellular environment, which might control the MSC fate in vitro. Furthermore, such carriers might represent potential novel ways of cell administration. Because of the suitable mechanical properties, good elasticity and biocompatibility, silk fibroin is at the forefront in the field of biomaterials research. The first aim of our study was to culture AMSCs on a conventional plastic surface to determine the influence of animal species and sex, and late passages on the proliferation and differentiation potential of canine and feline AMSCs. The second aim of our work was to grow AMSCs on silk fibroin carriers to find out how silk fibroin affects AMSCs. In the first part of the study, we established that feline AMSC showed poorer proliferative potential, as the number of cell doublings from the second to the eighth passage was significantly lower and the time required for cell number to double was significantly longer in feline AMSC than in canine AMSCs. AMSCs from cats also showed poorer differentiation potential compared to AMSCs from dogs, as feline cells differentiated at passage 6 but not at later passages, while canine cells successfully differentiated also in later passages. Moreover, osteogenic and chondrogenic differentiation potential of feline AMSCs was lower in comparison to canine AMSCs, based on the quantification of differentiation images. Late passages had a more negative effect on both the proliferation and differentiation potential of feline AMSC than on canine AMSCs. In addition, we also established that AMSCs from cats M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 94 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija showed lower expression of several cell surface markers. The percentage of cells expressing CD44 and CD90 and not expressing CD34 was higher in canine cells than in feline cells. Feline AMSCs also showed poorer viability under less optimal conditions, as measured by flow cytometry. However, in the present study, only minor differences between sexes of both species were found. Sex differences were present in the early passage in osteogenic differentiation, with AMSCs of females showing greater differentiation potential than AMSCs of males of both animal species. No other sex differences were found. The results of the first part of the study therefore showed that the animal species can significantly affect the basic characteristics of AMSCs in vitro. Animal species should therefore be considered as a variable in the preparation of cells for regenerative treatment. The results of the second part of our study showed that SF enables canine AMSC adhesion and directs AMSC fate towards chondrogenic differentiation. Chondrogenic differentiation was confirmed by analysis of cell morphology, which was similar between positive control and cells grown on SF, with cells from both groups coalescing into characteristic chondrogenic clusters. Chondrogenic differentiation was further confirmed by staining the extracellular matrix of differentiated cells with the Alcian blue dye, known to stain cartilaginous proteoglycans blue. Cells grown on SF were stained blue, as did positive control cells. As a third method for confirming chondrogenic differentiation, real–time quantitative polymerase chain reaction was used and the expression of cartilage specific genes in cells grown on SF was confirmed. The results of the second part of the study showed that chondrogenic cell differentiation can be achieved without the specific conditions, otherwise required for chondrogenesis of AMSCs on a conventional plastic surface. The results of this dissertation represent an original contribution to science in understanding the fundamental biological properties of animal MSCs. The results of our research allow us to deepen the knowledge about importance of the interspecies stem cells differences and, at the same time, provide a relevant basis for future studies and the potential for introducing new stem cell therapies into clinical veterinary medicine. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 95 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 7 ZAHVALE Najprej in najbolj se iz vsega srca zahvaljujem svojemu mentorju prof. dr. Gregorju Majdiču. Hvala za ponujeno priložnost za delo. Hvala za strokovno pomoč pri prehajanju ovir in potrpežljivost pri usmerjanju moje raziskave na pravo pot. Hvala za stalno prisotnost in hitro odzivnost pri vseh mojih vprašanjih in dilemah. Hvala za neomajno zaupanje v moje delo, pomiritev ob vseh mojih skrbeh in vztrajno vlivanje upanja, da bo na koncu vse dobro. Hvala za svobodo, ki sem je bila deležna pri svojem delu in hvala za posluh in upoštevanje mojih idej. Iskrena hvala za neprecenljivo mentorstvo in krasna leta, preživeta v Laboratoriju za genomiko na VF. Zahvaljujem se Saši Novak, Nataši Drnovšek in Kaji Križman ter ostalim sodelavcem iz Inštituta Jožef Štefan za večni entuziazem pri delu, ki me je navdahnil z željo po znanju iz meni nepoznanega strokovnega področja in hkrati z razumevanjem pomena interdisciplinarnega dela. Hvala za omogočeno sodelovanje, ki je napolnilo moje srce s hvaležnostjo za izjemno timsko delo. Zahvaljujem se doc. dr. Urošu Rajčeviću in dr. Valeriji Kovač, ki sta mi omogočila, da sem del raziskave lahko opravila na Zavodu RS za transfuzijsko medicino. Hvala za omogočeno sodelovanje, ves trud, pomoč in prijaznost. Zahvaljujem se veterinarjema Blažu Vrtačniku in Nuši Schumet iz Šolske veterinarske ambulante za pomoč pri zbiranju pacientov in vzorcev. Iz srca se zahvaljujem, da sta mi z obilico dobre volje in sproščenosti ponudila dragoceno pomoč pri moji raziskavi. Za pomoč pri zbiranju pacientov in vzorcev se prav tako lepo zahvaljujem somentorici doc. dr. Ani Nemec in asist. dr. Juriju Želu. Hvala tudi izr. prof. Alenki Nemec Svete in Aleksandru Jenku za analizo vzorcev. Najlepše se zahvaljujem izr. prof. dr. Janku Mrkunu in izr. prof. dr. Primožu Klincu ter ostalim sodelavcem iz Klinike za reprodukcijo in velike živali, ker so mi omogočili vzpostavitev »svojega mini laboratorija«, zaradi česar sem imela prvovrstne pogoje za opravljanje svojega dela. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 96 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija Iskrena hvala Luku Mohoriču za vpeljavo v laboratorijski svet dela z matičnimi celicami, za neprecenljivo pomoč na začetku moje raziskave, za vse koristne in zanimive »matične« debate, nepogrešljiv entuziazem in izvrstno sodelovanje. Zahvaljujem se doc. dr. Neži Grgurevič za koristne napotke, uporabne nasvete in pogovore, ob katerih sem se mnogokrat zavedla pomena iskrenosti, kritičnega razmišljanja in dojemanja medčloveških odnosov. Zahvaljujem se Nini Šterman za nenehno pripravljenost priskočiti na pomoč pri vseh možnih urgentnih situacijah in inovativno reševanje tehničnih zagonetk. Hvala za krasno sodelovanje in nepozabljivo prijateljstvo. Hvala Sonji Prpar Mihevc za strokovno pomoč, pametne nasvete, drugačno perspektivo in vzor produktivnosti. Hvala Maši Čater za nepozabljiv sarkazem, vesoljske razprave in poživljujoč humor. Hvala Malan Štrbenc in vsem ostalim sodelavcem iz Laboratorija za genomiko, s katerimi sem tako ali drugače sodelovala in preživela čas. Za konec se iz vsega srca zahvaljujem možu Denisu in najinima puncama Lenji in Varji za njihovo podporo in brezmejno ljubezen, ki mi je v času doktorskega dela dajala moč za hojo po poti proti zmagi in vero v sebe, da je moj uspeh neizogiben. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 97 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 8 LITERATURA 1 Melton D. “Stemness”: definitions, criteria and standards. In: Atala AL, Lonza R, eds. Handbook of stem cells. 2nd ed. Amsterdam : Elsevier, 2013: 5–12. 2 Morrison SJ, Wandycz AM, Hemmati HD, Wright DE, Weissman IL. Identification of a lineage of multipotent hematopoietic progenitors. Development 1997; 124: 1929–39. 3 O’Brien FJ. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today 2011; 14: 88–95. doi: 10.1016/S1369-7021(11)70058-X 4 Bach FH, Albertini RJ, Joo P, Anderson JL, Bortin MM. Bone-marrow transplantation in a patient with the wiskott-aldrich syndrome. Lancet 1968; 2: 1364–6. doi: 10.1016/s0140-6736(68)92672-x 5 Cosson S, Otte EA, Hezaveh H, Cooper-White JJ. Concise review: tailoring bioengineered scaffolds for stem cell applications in tissue engineering and regenerative medicine. Stem Cells Transl Med 2015; 4: 156–64. doi: 10.5966/sctm.2014-0203 6 Zakrzewski W, Dobrzynski M, Szymonowicz M, Rybak Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e68. doi: 10.1186/s13287-019-1165-5 7 Rippon HJ, Bishop AE. Embryonic stem cells. Cell Prolif 2004; 37: 23–34. doi: 10.1111/j.1365-2184.2004.00298.x 8 Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1981; 78: 7634–8. doi: 10.1073/pnas.78.12.7634 9 Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145–7. doi: 10.1126/science.282.5391.1145 10 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663–76. doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024 11 White J, Dalton S. Cell cycle control of embryonic stem cells. Stem Cell Rev 2005; 1: 131–8. doi: 10.1385/SCR:1:2:131 12 Caplan AI. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res 1991; 9: 641–50. doi: 10.1002/jor.1100090504 13 Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI, Frolova GP. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation 1968; 6: 230–47. 14 Dennis JE, Merriam A, Awadallah A, Yoo JU, Johnstone B, Caplan AI. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res 1999; 14: 700–9. doi: 10.1359/jbmr.1999.14.5.700 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 98 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 15 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143–7. doi: 10.1126/science.284.5411.143 16 Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8: 315–7. doi: 10.1080/14653240600855905 17 Wang QW, Chen ZL, Piao YJ. Mesenchymal stem cells differentiate into tenocytes by bone morphogenetic protein (bmp) 12 gene transfer. J Biosci Bioeng 2005; 100: 418– 22. doi: 10.1263/jbb.100.418 18 Xie XJ, Wang JA, Cao J, Zhang X. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by myocardial medium under hypoxic conditions. Acta Pharmacol Sin 2006; 27: 1153–8. doi: 10.1111/j.1745-7254.2006.00436.x 19 Gang EJ, Jeong JA, Hong SH, et al. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood. Stem Cells 2004; 22: 617–24. doi: 10.1634/stemcells.22-4-617 20 Nakagawa H, Akita S, Fukui M, Fujii T, Akino K. Human mesenchymal stem cells successfully improve skin-substitute wound healing. Br J Dermatol 2005; 153: 29–36. doi: 10.1111/j.1365-2133.2005.06554.x 21 Vossmerbaeumer U, Ohnesorge S, Kuehl S, et al. Retinal pigment epithelial phenotype induced in human adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells. Cytotherapy 2009; 11: 177–88. doi: 10.1080/14653240802714819 22 Ma N, Gai H, Mei J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells can differentiate into type ii alveolar epithelial cells in vitro. Cell Biol Int 2011; 35: 1261–6. doi: 10.1042/CBI20110026 23 Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood 2005; 106: 756–63. doi: 10.1182/blood-2005-02-0572 24 Singaravelu K, Padanilam BJ. In vitro differentiation of MSC into cells with a renal tubular epithelial-like phenotype. Ren Fail 2009; 31: 492–502. doi: 10.1080/08860220902928981 25 Marappagounder D, Somasundaram I, Dorairaj S, Sankaran RJ. Differentiation of mesenchymal stem cells derived from human bone marrow and subcutaneous adipose tissue into pancreatic islet-like clusters in vitro. Cell Mol Biol Lett 2013; 18: 75–88. doi: 10.2478/s11658-012-0040-5 26 Munoz-Elias G, Marcus AJ, Coyne TM, Woodbury D, Black IB. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long-term survival. J Neurosci 2004; 24: 4585–95. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5060-03.2004 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 99 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 27 Mitroulis I, Kalafati L, Bornhauser M, Hajishengallis G, Chavakis T. Regulation of the bone marrow niche by inflammation. Front Immunol 2020; 11: e1540. doi: 10.3389/fimmu.2020.01540 28 Schwab KE, Gargett CE. Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium. Hum Reprod 2007; 22: 2903– 11. doi: 10.1093/humrep/dem265 29 Traktuev DO, Merfeld-Clauss S, Li J, et al. A population of multipotent cd34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circ Res 2008; 102: 77–85. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.107.159475 30 Brachvogel B, Moch H, Pausch F, et al. Perivascular cells expressing annexin a5 define a novel mesenchymal stem cell-like population with the capacity to differentiate into multiple mesenchymal lineages. Development 2005; 132: 2657–68. doi: 10.1242/dev.01846 31 Sacchetti B, Funari A, Michienzi S, et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell 2007; 131: 324–36. doi: 10.1016/j.cell.2007.08.025 32 Crisan M, Yap S, Casteilla L, et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell 2008; 3: 301–13. doi: 10.1016/j.stem.2008.07.003 33 Gomez-Salazar M, Gonzalez-Galofre ZN, Casamitjana J, Crisan M, James AW, Peault B. Five decades later, are mesenchymal stem cells still relevant? Front Bioeng Biotechnol 2020; 8: e148. doi: 10.3389/fbioe.2020.00148 34 Corselli M, Chen CW, Sun B, Yap S, Rubin JP, Peault B. The tunica adventitia of human arteries and veins as a source of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev 2012; 21: 1299–308. doi: 10.1089/scd.2011.0200 35 Miyahara Y, Nagaya N, Kataoka M, et al. Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med 2006; 12: 459–65. doi: 10.1038/nm1391 36 Quinn C, Flake AW. In vivo differentiation potential of mesenchymal stem cells: prenatal and postnatal model systems. Transfus Med Hemother 2008; 35: 239–47. doi: 10.1159/000129129 37 Niess H, Thomas MN, Schiergens TS, et al. Genetic engineering of mesenchymal stromal cells for cancer therapy: Turning partners in crime into trojan horses. Innov Surg Sci 2016; 1: 19–32. doi: 10.1515/iss-2016-0005 38 Caplan AI. Mesenchymal stem cells: time to change the name! Stem Cells Transl Med 2017; 6: 1445–51. doi: 10.1002/sctm.17-0051 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 100 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 39 Souza-Moreira L, Soares VC, Dias S, Bozza PT. Adipose-derived mesenchymal stromal cells modulate lipid metabolism and lipid droplet biogenesis via akt/mtor -ppargamma signalling in macrophages. Sci Rep 2019; 9: e20304. doi: 10.1038/s41598-019-56835-8 40 Gao WX, Sun YQ, Shi J, et al. Effects of mesenchymal stem cells from human induced pluripotent stem cells on differentiation, maturation, and function of dendritic cells. Stem Cell Res Ther 2017; 8: e48. doi: 10.1186/s13287-017-0499-0 41 Laing AG, Fanelli G, Ramirez-Valdez A, Lechler RI, Lombardi G, Sharpe PT. Mesenchymal stem cells inhibit t-cell function through conserved induction of cellular stress. PLoS One 2019; 14: e0213170. doi: 10.1371/journal.pone.0213170 42 Luk F, Carreras-Planella L, Korevaar SS, et al. Inflammatory conditions dictate the effect of mesenchymal stem or stromal cells on b cell function. Front Immunol 2017; 8: e1042. doi: 10.3389/fimmu.2017.01042 43 Spaggiari GM, Capobianco A, Abdelrazik H, Becchetti F, Mingari MC, Moretta L. Mesenchymal stem cells inhibit natural killer-cell proliferation, cytotoxicity, and cytokine production: role of indoleamine 2,3-dioxygenase and prostaglandin e2. Blood 2008; 111: 1327–33. doi: 10.1182/blood-2007-02-074997 44 Spaggiari GM, Capobianco A, Becchetti S, Mingari MC, Moretta L. Mesenchymal stem cell-natural killer cell interactions: Evidence that activated nk cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit il-2-induced nk-cell proliferation. Blood 2006; 107: 1484–90. doi: 10.1182/blood-2005-07-2775 45 de Vries JE. Immunosuppressive and anti-inflammatory properties of interleukin 10. Ann Med 1995; 27: e53741. doi: 10.3109/07853899509002465 46 Liu F, Qiu H, Xue M, et al. MSC-secreted tgf-beta regulates lipopolysaccharide-stimulated macrophage m2-like polarization via the akt/foxo1 pathway. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e345. doi: 10.1186/s13287-019-1447-y 47 Wu R, Liu C, Deng X, Chen L, Hao S, Ma L. Enhanced alleviation of agvhd by tgf-beta1-modified mesenchymal stem cells in mice through shifting mphi into m2 phenotype and promoting the differentiation of treg cells. J Cell Mol Med 2020; 24: 1684–99. doi: 10.1111/jcmm.14862 48 Gazdic M, Markovic BS, Arsenijevic A, et al. Crosstalk between mesenchymal stem cells and t regulatory cells is crucially important for the attenuation of acute liver injury. Liver Transpl 2018; 24: 687–702. doi: 10.1002/lt.25049 49 Schmidt A, Zhang XM, Joshi RN, et al. Human macrophages induce cd4(+)foxp3(+) regulatory t cells via binding and re-release of tgf-beta. Immunol Cell Biol 2016; 94: 747–62. doi: 10.1038/icb.2016.34 50 Melief SM, Schrama E, Brugman MH, et al. Multipotent stromal cells induce human regulatory t cells through a novel pathway involving skewing of monocytes toward anti-inflammatory macrophages. Stem Cells 2013; 31: 1980–91. doi: 10.1002/stem.1432 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 101 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 51 Francois M, Romieu-Mourez R, Li M, Galipeau J. Human MSC suppression correlates with cytokine induction of indoleamine 2,3-dioxygenase and bystander m2 macrophage differentiation. Mol Ther 2012; 20: 187–95. doi: 10.1038/mt.2011.189 52 Jin L, Deng Z, Zhang J, et al. Mesenchymal stem cells promote type 2 macrophage polarization to ameliorate the myocardial injury caused by diabetic cardiomyopathy. J Transl Med 2019; 17: e251. doi: 10.1186/s12967-019-1999-8 53 Fallarino F, Grohmann U, You S, et al. The combined effects of tryptophan starvation and tryptophan catabolites down-regulate t cell receptor zeta-chain and induce a regulatory phenotype in naive t cells. J Immunol 2006; 176: 6752–61. doi: 10.4049/jimmunol.176.11.6752 54 Kalinski P. Regulation of immune responses by prostaglandin e2. J Immunol 2012; 188: 21–8. doi: 10.4049/jimmunol.1101029 55 Couper KN, Blount DG, Riley EM. Il-10: The master regulator of immunity to infection. J Immunol 2008; 180: 5771–7. doi: 10.4049/jimmunol.180.9.5771 56 Franquesa M, Mensah FK, Huizinga R, et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells abrogate plasmablast formation and induce regulatory b cells independently of t helper cells. Stem Cells 2015; 33: 880–91. doi: 10.1002/stem.1881 57 Abels ER, Breakefield XO. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol 2016; 36: 301–12. doi: 10.1007/s10571-016-0366-z 58 Kalra H, Drummen GP, Mathivanan S. Focus on extracellular vesicles: Introducing the next small big thing. Int J Mol Sci 2016; 17: e170. doi: 10.3390/ijms17020170 59 Jung JW, Kwon M, Choi JC, et al. Familial occurrence of pulmonary embolism after intravenous, adipose tissue-derived stem cell therapy. Yonsei Med J 2013; 54: 1293–6. doi: 10.3349/ymj.2013.54.5.1293 60 Makela T, Takalo R, Arvola O, et al. Safety and biodistribution study of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells and mononuclear cells and the impact of the administration route in an intact porcine model. Cytotherapy 2015; 17: e392402. doi: 10.1016/j.jcyt.2014.12.004 61 Hyvarinen K, Holopainen M, Skirdenko V, et al. Mesenchymal stromal cells and their extracellular vesicles enhance the anti-inflammatory phenotype of regulatory macrophages by downregulating the production of interleukin (il)-23 and il-22. Front Immunol 2018; 9: e771. doi: 10.3389/fimmu.2018.00771 62 Crain SK, Robinson SR, Thane KE, et al. Extracellular vesicles from wharton's jelly mesenchymal stem cells suppress cd4 expressing t cells through transforming growth factor beta and adenosine signaling in a canine model. Stem Cells Dev 2019; 28: 212– 26. doi: 10.1089/scd.2018.0097 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 102 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 63 Park KS, Svennerholm K, Shelke GV, et al. Mesenchymal stromal cell-derived nanovesicles ameliorate bacterial outer membrane vesicle-induced sepsis via il-10. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e231. doi: 10.1186/s13287-019-1352-4 64 Kornicka-Garbowska K, Pedziwiatr R, Wozniak P, Kucharczyk K and Marycz K. Microvesicles isolated from 5-azacytidine-and-resveratrol-treated mesenchymal stem cells for the treatment of suspensory ligament injury in horse-a case report. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e394. doi: 10.1186/s13287-019-1469-5 65 El-Tookhy OS, Shamaa AA, Shehab GG, Abdallah AN, Azzam OM. Histological evaluation of experimentally induced critical size defect skin wounds using exosomal solution of mesenchymal stem cells derived microvesicles. Int J Stem Cells 2017; 10: 144–53. doi: 10.15283/ijsc17043 66 Elliott MR, Koster KM, Murphy PS. Efferocytosis signaling in the regulation of macrophage inflammatory responses. J Immunol 2017; 198: 1387–94. doi: 10.4049/jimmunol.1601520 67 Galleu A, Riffo-Vasquez Y, Trento C, et al. Apoptosis in mesenchymal stromal cells induces in vivo recipient-mediated immunomodulation. Sci Transl Med 2017; 9(416): eaam7828. doi: 10.1126/scitranslmed.aam7828 68 Cheung TS, Galleu A, von Bonin M, Bornhauser M, Dazzi F. Apoptotic mesenchymal stromal cells induce prostaglandin e2 in monocytes: implications for the monitoring of mesenchymal stromal cell activity. Haematologica 2019; 104: e438–41. doi: 10.3324/haematol.2018.214767 69 de Witte SFH, Luk F, Sierra Parraga JM, et al. Immunomodulation by therapeutic mesenchymal stromal cells (MSC) is triggered through phagocytosis of MSC by monocytic cells. Stem Cells 2018; 36: 602–15. doi: 10.1002/stem.2779 70 Jackson MV, Morrison TJ, Doherty DF, et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ards. Stem Cells 2016; 34: 2210–23. doi: 10.1002/stem.2372 71 Li C, Cheung MKH, Han S, et al. Mesenchymal stem cells and their mitochondrial transfer: a double-edged sword. Biosci Rep 2019; 39(5): BSR20182417. doi: 10.1042/BSR20182417 72 Mohoric L, Zorko B, Ceh K, Majdic G. Blinded placebo study of bilateral osteoarthritis treatment using adipose derived mesenchymal stem cells. Slovenian Veterinary Research 2016; 53(3): 167–74. 73 Black LL, Gaynor J, Gahring D, et al. Effect of adipose-derived mesenchymal stem and regenerative cells on lameness in dogs with chronic osteoarthritis of the coxofemoral joints: a randomized, double-blinded, multicenter, controlled trial. Vet Ther 2007; 8: 272–84. M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 103 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 74 Vilar JM, Morales M, Santana A, et al. Controlled, blinded force platform analysis of the effect of intraarticular injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem cells associated to prgf-endoret in osteoarthritic dogs. BMC Vet Res 2013; 9: e131. doi: 10.1186/1746-6148-9-131 75 Srzentic Drazilov S, Mrkovacki J, Spasovski V, Fazlagic A, Pavlovic S, Nikcevic G. The use of canine mesenchymal stem cells for the autologous treatment of osteoarthritis. Acta Vet Hung 2018; 66: 376–89. doi: 10.1556/004.2018.034 76 Harman R, Carlson K, Gaynor J, et al. A prospective, randomized, masked, and placebo-controlled efficacy study of intraarticular allogeneic adipose stem cells for the treatment of osteoarthritis in dogs. Front Vet Sci 2016; 3: e81. doi: 10.3389/fvets.2016.00081 77 Shah K, Drury T, Roic I, et al. Outcome of allogeneic adult stem cell therapy in dogs suffering from osteoarthritis and other joint defects. Stem Cells Int 2018; 2018: e7309201. doi: 10.1155/2018/7309201 78 Arzi B, Clark KC, Sundaram A, et al. Therapeutic efficacy of fresh, allogeneic mesenchymal stem cells for severe refractory feline chronic gingivostomatitis. Stem Cells Transl Med 2017; 6: 1710–22. doi: 10.1002/sctm.17-0035 79 Arzi B, Kol A, Murphy B, et al. Feline foamy virus adversely affects feline mesenchymal stem cell culture and expansion: implications for animal model development. Stem Cells Dev 2015; 24: 814–23. doi: 10.1089/scd.2014.0317 80 Arzi B, Mills-Ko E, Verstraete FJ, et al. Therapeutic efficacy of fresh, autologous mesenchymal stem cells for severe refractory gingivostomatitis in cats. Stem Cells Transl Med 2016; 5: 75–86. doi: 10.5966/sctm.2015-0127 81 Arzi B, Peralta S, Fiani N, et al. A multicenter experience using adipose-derived mesenchymal stem cell therapy for cats with chronic, non-responsive gingivostomatitis. Stem Cell Res Ther 2020; 11: e115. doi: 10.1186/s13287-020-01623-9 82 Perez-Merino EM, Uson-Casaus JM, Duque-Carrasco J, et al. Safety and efficacy of allogeneic adipose tissue-derived mesenchymal stem cells for treatment of dogs with inflammatory bowel disease: endoscopic and histological outcomes. Vet J 2015; 206: 391–7. doi: 10.1016/j.tvjl.2015.07.023 83 Webb TL, Webb CB. Stem cell therapy in cats with chronic enteropathy: a proof-of-concept study. J Feline Med Surg 2015; 17: 901–8. doi: 10.1177/1098612X14561105 84 Bearden RN, Huggins SS, Cummings KJ, Smith R, Gregory CA and Saunders WB. In-vitro characterization of canine multipotent stromal cells isolated from synovium, bone marrow, and adipose tissue: a donor-matched comparative study. Stem Cell Res Ther 2017; 8: e218. doi: 10.1186/s13287-017-0639-6 85 Sasaki A, Mizuno M, Ozeki N, et al. Canine mesenchymal stem cells from synovium have a higher chondrogenic potential than those from infrapatellar fat pad, adipose tissue, and bone marrow. PLoS One 2018; 13: e0202922. doi: 10.1371/journal.pone.0202922 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 104 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 86 Zhan XS, El-Ashram S, Luo DZ, et al. A comparative study of biological characteristics and transcriptome profiles of mesenchymal stem cells from different canine tissues. Int J Mol Sci 2019; 20: e1485. doi: 10.3390/ijms20061485 87 Lee BY, Li Q, Song WJ, et al. Altered properties of feline adipose-derived mesenchymal stem cells during continuous in vitro cultivation. J Vet Med Sci 2018; 80: 930–38. doi: 10.1292/jvms.17-0563 88 Bahamondes F, Flores E, Cattaneo G, Bruna F, Conget P. Omental adipose tissue is a more suitable source of canine mesenchymal stem cells. BMC Vet Res 2017; 13: e166. doi: 10.1186/s12917-017-1053-0 89 Webb TL, Quimby JM, Dow SW. In vitro comparison of feline bone marrow-derived and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Feline Med Surg 2012; 14: 165– 8. doi: 10.1177/1098612X11429224 90 Zhang S, Zhao C, Liu S, et al. Characteristics and multilineage differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from the tibetan mastiff. Mol Med Rep 2018; 18: 2097–109. doi: 10.3892/mmr.2018.9172 91 Martin DR, Cox NR, Hathcock TL, Niemeyer GP, Baker HJ. Isolation and characterization of multipotential mesenchymal stem cells from feline bone marrow. Exp Hematol 2002; 30: 879–86. doi: 10.1016/s0301-472x(02)00864-0 92 Krawetz RJ, Wu YE, Martin L, Rattner JB, Matyas JR, Hart DA. Synovial fluid progenitors expressing cd90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLoS One 2012; 7: e43616. doi: 10.1371/journal.pone.0043616 93 Zhang BY, Wang BY, Li SC, et al. Evaluation of the curative effect of umbilical cord mesenchymal stem cell therapy for knee arthritis in dogs using imaging technology. Stem Cells Int 2018; 2018: e1983025. doi: 10.1155/2018/1983025 94 Kang BJ, Ryu HH, Park SS, et al. Comparing the osteogenic potential of canine mesenchymal stem cells derived from adipose tissues, bone marrow, umbilical cord blood, and wharton's jelly for treating bone defects. J Vet Sci 2012; 13: 299–310. doi: 10.4142/jvs.2012.13.3.299 95 Sato K, Yamawaki-Ogata A, Kanemoto I, Usui A, Narita Y. Isolation and characterisation of peripheral blood-derived feline mesenchymal stem cells. Vet J 2016; 216: 183–8. doi: 10.1016/j.tvjl.2016.08.009 96 Kisiel AH, McDuffee LA, Masaoud E, Bailey TR, Esparza Gonzalez BP, Nino-Fong R. Isolation, characterization, and in vitro proliferation of canine mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, muscle, and periosteum. Am J Vet Res 2012; 73: 1305–17. doi: 10.2460/ajvr.73.8.1305 97 Chu DT, Nguyen Thi Phuong T, Tien NLB, et al. Adipose tissue stem cells for therapy: An update on the progress of isolation, culture, storage, and clinical application. J Clin Med 2019; 8: e917. doi: 10.3390/jcm8070917 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 105 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 98 Russell KA, Chow NH, Dukoff D, et al. Characterization and immunomodulatory effects of canine adipose tissue- and bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. PLoS One 2016; 11: e0167442. doi: 10.1371/journal.pone.0167442 99 Guercio A, Di Bella S, Casella S, Di Marco P, Russo C, Piccione G. Canine mesenchymal stem cells (MSCs): Characterization in relation to donor age and adipose tissue-harvesting site. Cell Biol Int 2013; 37: 789–98. doi: 10.1002/cbin.10090 100 Yaneselli KM, Kuhl CP, Terraciano PB, et al. Comparison of the characteristics of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells extracted from different sites and at different passage numbers. J Vet Sci 2018; 19: 13–20. doi: 10.4142/jvs.2018.19.1.13 101 Sancak IG, Ozen, A. Bayraktaroglu A.G., Ceylan, A., Can, P. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the adipose tissue of young and old dogs. Ankara Üniv Vet Fak Derg 2016; 63: 297–302. doi: 10.1501/Vetfak_0000002743 102 Zajic LB, Webb TL, Webb P, Coy JW, Dow SW, Quimby JM. Comparison of proliferative and immunomodulatory potential of adipose-derived mesenchymal stem cells from young and geriatric cats. J Feline Med Surg 2017; 19: 1096–102. doi: 10.1177/1098612X16680703 103 Lee J, Lee KS, Kim CL, et al. Effect of donor age on the proliferation and multipotency of canine adipose-derived mesenchymal stem cells. J Vet Sci 2017; 18: 141–8. doi: 10.4142/jvs.2017.18.2.141 104 Lee KS, Cha SH, Kang HW, et al. Effects of serial passage on the characteristics and chondrogenic differentiation of canine umbilical cord matrix derived mesenchymal stem cells. Asian-Australas J Anim Sci 2013; 26: 588–95. doi: 10.5713/ajas.2012.12488 105 Panasophonkul S, Samart P, Kongon K, Sathanawongs A. Phenotypic characteristics of feline adipose-derived stem cells affected by cell passage number. Pol J Vet Sci 2017; 20: 651–60. doi: 10.1515/pjvs-2017-0082 106 Requicha JF, Viegas CA, Albuquerque CM, Azevedo JM, Reis RL, Gomes ME. Effect of anatomical origin and cell passage number on the stemness and osteogenic differentiation potential of canine adipose-derived stem cells. Stem Cell Rev Rep 2012; 8: 1211–22. doi: 10.1007/s12015-012-9397-0 107 Lee KS, Kang HW, Lee HT, et al. Sequential sub-passage decreases the differentiation potential of canine adipose-derived mesenchymal stem cells. Res Vet Sci 2014; 96: 267–75. doi: 10.1016/j.rvsc.2013.12.011 108 Clark AG, Rohrbaugh AL, Otterness I, Kraus VB. The effects of ascorbic acid on cartilage metabolism in guinea pig articular cartilage explants. Matrix Biol 2002; 21: 175–84. doi: 10.1016/s0945-053x(01)00193-7 109 Clark KC, Fierro FA, Ko EM, et al. Human and feline adipose-derived mesenchymal stem cells have comparable phenotype, immunomodulatory functions, and transcriptome. Stem Cell Res Ther 2017; 8: e69. doi: 10.1186/s13287-017-0528-z M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 106 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 110 Bertolo A, Schlaefli P, Baur M, et al. Comparative characterization of canine and human mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Int J Stem Cell Res Ther 2015; 2: e005. doi: 10.23937/2469-570X/1410005 111 Yuan J, Yu JX, Ge J. Sexual dimorphism on the neurogenic potential of rhesus monkeys mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2010; 396: 394–400. doi: 10.1016/j.bbrc.2010.04.103 112 Waldron J, McCourty A, Lecanu L. Neural stem cell sex dimorphism in aromatase (cyp19) expression: A basis for differential neural fate. Stem Cells Cloning 2010; 3: 175–82. doi: 10.2147/SCCAA.S15200 113 Mckinnirey F. Immunomodulation by mesenchymal stem cells is sex dependent. Cytotherapy 2019; 21: eS84. doi: 10.1016/j.jcyt.2019.03.502 114 Sammour I, Somashekar S, Huang J, et al. The effect of gender on mesenchymal stem cell (MSC) efficacy in neonatal hyperoxia-induced lung injury. PLoS One 2016; 11: e0164269. doi: 10.1371/journal.pone.0164269 115 Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci 2015; 16: 5517–27. doi: 10.3390/ijms16035517 116 Langhans SA. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Front Pharmacol 2018; 9: e6. doi: 10.3389/fphar.2018.00006 117 Kapalczynska M, Kolenda T, Przybyla W, et al. 2d and 3d cell cultures – a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci 2018; 14: 910–19. doi: 10.5114/aoms.2016.63743 118 Egger D, Oliveira AC, Mallinger B, Hemeda H, Charwat V, Kasper C. From 3d to 3d: isolation of mesenchymal stem/stromal cells into a three-dimensional human platelet lysate matrix. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e248. doi: 10.1186/s13287-019-1346-2 119 Carter K, Lee HJ, Na KS, et al. Characterizing the impact of 2d and 3d culture conditions on the therapeutic effects of human mesenchymal stem cell secretome on corneal wound healing in vitro and ex vivo. Acta Biomater 2019; 99: 247–57. doi: 10.1016/j.actbio.2019.09.022 120 Martino S, D'Angelo F, Armentano I, Kenny JM, Orlacchio A. Stem cell-biomaterial interactions for regenerative medicine. Biotechnol Adv 2012; 30: 338–51. doi: 10.1016/j.biotechadv.2011.06.015 121 Ghule PN, Medina R, Lengner CJ, et al. Reprogramming the pluripotent cell cycle: Restoration of an abbreviated g1 phase in human induced pluripotent stem (ips) cells. J Cell Physiol 2011; 226: 1149–56. doi: 10.1002/jcp.22440 122 Jaiswal RK, Jaiswal N, Bruder SP, Mbalaviele G, Marshak DR, Pittenger MF. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J Biol Chem 2000; 275: 9645–52. doi: 10.1074/jbc.275.13.9645 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 107 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 123 Stein GS, Lian JB, Owen TA. Relationship of cell growth to the regulation of tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation. FASEB J 1990; 4: 3111–23. doi: 10.1096/fasebj.4.13.2210157 124 McMurray RJ, Dalby MJ, Tsimbouri PM. Using biomaterials to study stem cell mechanotransduction, growth and differentiation. J Tissue Eng Regen Med 2015; 9: 528–39. doi: 10.1002/term.1957 125 Scadden DT. The stem-cell niche as an entity of action. Nature 2006; 441: 1075–9. doi: 10.1038/nature04957 126 Tibbitt MW, Anseth KS. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3d cell culture. Biotechnol Bioeng 2009; 103: 655–63. doi: 10.1002/bit.22361 127 Jensen C, Teng Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture? Front Mol Biosci 2020; 7: e33. doi: 10.3389/fmolb.2020.00033 128 Kapusetti G, More N, Choppadandi M. Introduction to ideal characteristics and advanced biomedical applications of biomaterials. In: Paul S, eds. Biomedical engineering and its applications in healthcare. Singapore : Springer, 2019: 171–204. doi: 10.1007/978-981-13-3705-5_8 129 Xu Y, Chen C, Hellwarth PB, Bao X. Biomaterials for stem cell engineering and biomanufacturing. Bioact Mater 2019; 4: 366–79. doi: 10.1016/j.bioactmat.2019.11.002 130 Schaap-Oziemlak AM, Kühn PT, van Kooten TG, van Rijn P. Biomaterial-stem cell interactions and their impact on stem cell response. RSC Adv 2014; 4: 53307–20. doi: 10.1039/C4RA07915A 131 Xu W, Liao X, Zhang, L, Liu B. Tissue induction, the relationship between biomaterial’s microenvironment and mesenchymal stem cell differentiation. J Biomed Sci Eng 2013; 6: 85–91. doi: 10.4236/jbise.2013.61011 132 Ren YJ, Zhang H, Huang H, et al. In vitro behavior of neural stem cells in response to different chemical functional groups. Biomaterials 2009; 30: 1036–44. doi: 10.1016/j.biomaterials.2008.10.028 133 Curran JM, Chen R, Hunt JA. The guidance of human mesenchymal stem cell differentiation in vitro by controlled modifications to the cell substrate. Biomaterials 2006; 27: 4783–93. doi: 10.1016/j.biomaterials.2006.05.001 134 Benoit DS, Schwartz MP, Durney AR, Anseth KS. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat Mater 2008; 7: 816–23. doi: 10.1038/nmat2269 135 Ribeiro JCV, Vieira RS, Melo IM, Araujo VMA, Lima V. Versatility of chitosan-based biomaterials and their use as scaffolds for tissue regeneration. ScientificWorldJournal 2017; 2017: e8639898. doi: 10.1155/2017/8639898 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 108 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 136 Sun J, Tan H. Alginate-based biomaterials for regenerative medicine applications. Materials (Basel) 2013; 6: 1285–309. doi: 10.3390/ma6041285 137 Niknejad H, Peirovi H, Jorjani M, Ahmadiani A, Ghanavi J, Seifalian AM. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. Eur Cell Mater 2008; 15: 88–99. doi: 10.22203/ecm.v015a07 138 Kundu B, Rajkhowa R, Kundu SC, Wang X. Silk fibroin biomaterials for tissue regenerations. Adv Drug Deliv Rev 2013; 65: 457–70. doi: 10.1016/j.addr.2012.09.043 139 Bratt-Leal AM, Carpenedo RL, Ungrin MD, Zandstra PW, McDevitt TC. Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials 2011; 32: 48–56. doi: 10.1016/j.biomaterials.2010.08.113 140 Drnovsek N, Kocen R, Gantar A, et al. Size of silk fibroin beta-sheet domains affected by ca(2). J Mater Chem B 2016; 4: 6597–608. doi: 10.1039/c6tb01101b 141 Wang X, Kim HJ, Xu P, Matsumoto A, Kaplan DL. Biomaterial coatings by stepwise deposition of silk fibroin. Langmuir 2005; 21: 11335–41. doi: 10.1021/la051862m 142 Navone SE, Pascucci L, Dossena M, et al. Decellularized silk fibroin scaffold primed with adipose mesenchymal stromal cells improves wound healing in diabetic mice. Stem Cell Res Ther 2014; 5: e7. doi: 10.1186/scrt396 143 Altman GH, Horan RL, Lu HH, et al. Silk matrix for tissue engineered anterior cruciate ligaments. Biomaterials 2002; 23: 4131–41. doi: 10.1016/s0142-9612(02)00156-4 144 Jin HJ, Chen J, Karageorgiou V, Altman GH, Kaplan DL. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials 2004; 25: 1039–47. doi: 10.1016/s0142-9612(03)00609-4 145 Zheng K, Chen Y, Huang W, Lin Y, Kaplan DL, Fan Y. Chemically functionalized silk for human bone marrow-derived mesenchymal stem cells proliferation and differentiation. ACS Appl Mater Interfaces 2016; 8: 14406–13. doi: 10.1021/acsami.6b03518 146 Zhang Y, Fan W, Ma Z, et al. The effects of pore architecture in silk fibroin scaffolds on the growth and differentiation of mesenchymal stem cells expressing bmp7. Acta Biomater 2010; 6: 3021–8. doi: 10.1016/j.actbio.2010.02.030 147 Rodriguez-Lozano FJ, Garcia-Bernal D, Aznar-Cervantes S, et al. Effects of composite films of silk fibroin and graphene oxide on the proliferation, cell viability and mesenchymal phenotype of periodontal ligament stem cells. J Mater Sci Mater Med 2014; 25: 2731–41. doi: 10.1007/s10856-014-5293-2 148 Collado-Gonzalez M, Pecci-Lloret MP, Garcia-Bernal D, et al. Biological effects of silk fibroin 3d scaffolds on stem cells from human exfoliated deciduous teeth (sheds). Odontology 2018; 106: 125–34. doi: 10.1007/s10266-017-0310-9 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 109 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 149 Chen J, Altman GH, Karageorgiou V, et al. Human bone marrow stromal cell and ligament fibroblast responses on rgd-modified silk fibers. J Biomed Mater Res A 2003; 67: 559–70. doi: 10.1002/jbm.a.10120 150 Jaipaew J, Wangkulangkul P, Meesane J, Raungrut P, Puttawibul P. Mimicked cartilage scaffolds of silk fibroin/hyaluronic acid with stem cells for osteoarthritis surgery: morphological, mechanical, and physical clues. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2016; 64: 173–82. doi: 10.1016/j.msec.2016.03.063 151 Barlian A, Judawisastra H, Alfarafisa NM, Wibowo UA, Rosadi I. Chondrogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells induced by l-ascorbic acid and platelet rich plasma on silk fibroin scaffold. PeerJ 2018; 6: e5809. doi: 10.7717/peerj.5809 152 Rosadi I, Karina K, Rosliana I, et al. In vitro study of cartilage tissue engineering using human adipose-derived stem cells induced by platelet-rich plasma and cultured on silk fibroin scaffold. Stem Cell Res Ther 2019; 10: e369. doi: 10.1186/s13287-019-1443-2 153 Gandhimathi C. Controlled release of dexamethasone in pcl/silk fibroin/ascorbic acid nanoparticles for the initiation of adipose derived stem cells into osteogenesis. J Drug Metab Toxicol 2015; 06: e2. doi: 10.4172/2157-7609.1000177 154 Bai S, Han H, Huang X, et al. Silk scaffolds with tunable mechanical capability for cell differentiation. Acta Biomater 2015; 20: 22–31. doi: 10.1016/j.actbio.2015.04.004 155 Murphy CM, O'Brien FJ. Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminoglycan scaffolds. Cell Adh Migr 2010; 4: 377–81. doi: 10.4161/cam.4.3.11747 156 Phinney DG. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. J Cell Biochem 2012; 113: 2806–12. doi: 10.1002/jcb.24166 157 Kim HR, Lee J, Byeon JS, et al. Extensive characterization of feline intra-abdominal adipose-derived mesenchymal stem cells. J Vet Sci 2017; 18: 299–306. doi: 10.4142/jvs.2017.18.3.299 158 Vidal MA, Robinson SO, Lopez MJ, et al. Comparison of chondrogenic potential in equine mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue and bone marrow. Vet Surg 2008; 37: 713–24. doi: 10.1111/j.1532-950X.2008.00462.x 159 Fideles SOM, Ortiz AC, Assis AF, et al. Effect of cell source and osteoblast differentiation on gene expression profiles of mesenchymal stem cells derived from bone marrow or adipose tissue. J Cell Biochem 2019; 120: 11842–52. doi: 10.1002/jcb.28463 160 Karp NA, Reavey N. Sex bias in preclinical research and an exploration of how to change the status quo. Br J Pharmacol 2019; 176: 4107–18. doi: 10.1111/bph.14539 161 Golden LC, Voskuhl R. The importance of studying sex differences in disease: The example of multiple sclerosis. J Neurosci Res 2017; 95: 633–43. doi: 10.1002/jnr.23955 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 110 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 162 Boxall SA, Jones E. Markers for characterization of bone marrow multipotential stromal cells. Stem Cells Int 2012; 2012: e975871. doi: 10.1155/2012/975871 163 Trindade AB, Therrien J, Garcia JM, Smith LC. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Prolif 2017; 50: e12391. doi: 10.1111/cpr.12391 164 Takemitsu H, Zhao D, Yamamoto I, Harada Y, Michishita M, Arai T. Comparison of bone marrow and adipose tissue-derived canine mesenchymal stem cells. BMC Vet Res 2012; 8: e150. doi: 10.1186/1746-6148-8-150 165 Nakamura M, Nishida H, Yoshizaki K, et al. Canine mesenchymal stromal cell-conditioned medium promotes survival and neurite outgrowth of neural stem cells. J Vet Med Sci 2020; 82: 668–72. doi: 10.1292/jvms.19-0141 166 Ivanovska A, Grolli S, Borghetti P, et al. Immunophenotypical characterization of canine mesenchymal stem cells from perivisceral and subcutaneous adipose tissue by a species-specific panel of antibodies. Res Vet Sci 2017; 114: 51–8. doi: 10.1016/j.rvsc.2017.02.019 167 Huss R. Isolation of primary and immortalized cd34-hematopoietic and mesenchymal stem cells from various sources. Stem Cells 2000; 18: 1–9. doi: 10.1634/stemcells.18-1-1 168 Servida F, Soligo D, Caneva L, et al. Functional and morphological characterization of immunomagnetically selected cd34+ hematopoietic progenitor cells. Stem Cells 1996; 14: 430–8. doi: 10.1002/stem.140430 169 Nielsen JS, McNagny KM. Cd34 is a key regulator of hematopoietic stem cell trafficking to bone marrow and mast cell progenitor trafficking in the periphery. Microcirculation 2009; 16: 487–96. doi: 10.1080/10739680902941737 170 Gangenahalli GU, Singh VK, Verma YK, et al. Hematopoietic stem cell antigen cd34: Role in adhesion or homing. Stem Cells Dev 2006; 15: 305–13. doi: 10.1089/scd.2006.15.305 171 Lin CS, Ning H, Lin G, Lue TF. Is cd34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells? Cytotherapy 2012; 14: 1159–63. doi: 10.3109/14653249.2012.729817 172 Beauchamp JR, Heslop L, Yu DS, et al. Expression of cd34 and myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J Cell Biol 2000; 151: 1221– 34. doi: 10.1083/jcb.151.6.1221 173 Kuroda N, Nakayama H, Miyazaki E, et al. Distribution and role of cd34-positive stromal cells and myofibroblasts in human normal testicular stroma. Histol Histopathol 2004; 19: 743–51. doi: 10.14670/HH-19.743 174 Sidney LE, Branch MJ, Dunphy SE, Dua HS, Hopkinson A. Concise review: evidence for cd34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells 2014; 32: 1380–9. doi: 10.1002/stem.1661 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 111 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 175 Tumbar T, Guasch G, Greco V, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science 2004; 303: 359–63. doi: 10.1126/science.1092436 176 Fina L, Molgaard HV, Robertson D, et al. Expression of the cd34 gene in vascular endothelial cells. Blood 1990; 75: 2417–26. 177 Scherberich A, Di Maggio ND, McNagny KM. A familiar stranger: Cd34 expression and putative functions in svf cells of adipose tissue. World J Stem Cells 2013; 5: 1–8. doi: 10.4252/wjsc.v5.i1.1 178 Kim JS, Nam MH, An SS, et al. Comparison of the automated fluorescence microscopic viability test with the conventional and flow cytometry methods. J Clin Lab Anal 2011; 25: 90–4. doi: 10.1002/jcla.20438 179 Kummrow A, Frankowski M, Bock N, Werner C, Dziekan T, Neukammer J. Quantitative assessment of cell viability based on flow cytometry and microscopy. Cytometry A 2013; 83: 197–204. doi: 10.1002/cyto.a.22213 180 Thakur A, Zaman A, Hummel J, Jones K, Hortelano G. Single-colour flow cytometric assay to determine nk cell-mediated cytotoxicity and viability against non-adherent human tumor cells. Biotechnol Lett 2012; 34: 447–53. doi: 10.1007/s10529-011-0828-9 181 Colter DC, Sekiya I, Prockop DJ. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 7841–5. doi: 10.1073/pnas.141221698 182 Liu J, Ding Y, Liu Z, Liang X. Senescence in mesenchymal stem cells: Functional alterations, molecular mechanisms, and rejuvenation strategies. Front Cell Dev Biol 2020; 8: e258. doi: 10.3389/fcell.2020.00258 183 Denu RA, Hematti P. Effects of oxidative stress on mesenchymal stem cell biology. Oxid Med Cell Longev 2016; 2016: e2989076. doi: 10.1155/2016/2989076 184 Pattappa G, Heywood HK, de Bruijn JD, Lee DA. The metabolism of human mesenchymal stem cells during proliferation and differentiation. J Cell Physiol 2011; 226: 2562–70. doi: 10.1002/jcp.22605 185 Yuan X, Logan TM, Ma T. Metabolism in human mesenchymal stromal cells: A missing link between hMSC biomanufacturing and therapy? Front Immunol 2019; 10: e977. doi: 10.3389/fimmu.2019.00977 186 Finkel T, Holbrook NJ. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing. Nature 2000; 408: 239–47. doi: 10.1038/35041687 187 Haque N, Rahman MT, Abu Kasim NH, Alabsi AM. Hypoxic culture conditions as a solution for mesenchymal stem cell based regenerative therapy. ScientificWorldJournal 2013; 2013: e632972. doi: 10.1155/2013/632972 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 112 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 188 Dos Santos F, Andrade PZ, Boura JS, Abecasis MM, da Silva CL, Cabral JM. Ex vivo expansion of human mesenchymal stem cells: A more effective cell proliferation kinetics and metabolism under hypoxia. J Cell Physiol 2010; 223: 27–35. doi: 10.1002/jcp.21987 189 Munoz N, Kim J, Liu Y, Logan TM, Ma T. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of human mesenchymal stem cell metabolism during proliferation and osteogenic differentiation under different oxygen tensions. J Biotechnol 2014; 169: 95– 102. doi: 10.1016/j.jbiotec.2013.11.010 190 Lin AW, Barradas M, Stone JC, van Aelst L, Serrano M, Lowe SW. Premature senescence involving p53 and p16 is activated in response to constitutive mek/mapk mitogenic signaling. Genes Dev 1998; 12: 3008–19. doi: 10.1101/gad.12.19.3008 191 Vono R, Jover Garcia E, Spinetti G, Madeddu P. Oxidative stress in mesenchymal stem cell senescence: Regulation by coding and noncoding rnas. Antioxid Redox Signal 2018; 29: 864–79. doi: 10.1089/ars.2017.7294 192 Liu M, Lei H, Dong P, et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from the elderly exhibit decreased migration and differentiation abilities with senescent properties. Cell Transplant 2017; 26: 1505–19. doi: 10.1177/0963689717721221 193 Turinetto V, Vitale E, Giachino C. Senescence in human mesenchymal stem cells: Functional changes and implications in stem cell-based therapy. Int J Mol Sci 2016; 17: e1164. doi: 10.3390/ijms17071164 194 Kwon SY, Chun SY, Ha YS, et al. Hypoxia enhances cell properties of human mesenchymal stem cells. Tissue Eng Regen Med 2017; 14: 595–604. doi: 10.1007/s13770-017-0068-8 195 Boregowda SV, Krishnappa V, Chambers JW, et al. Atmospheric oxygen inhibits growth and differentiation of marrow-derived mouse mesenchymal stem cells via a p53-dependent mechanism: Implications for long-term culture expansion. Stem Cells 2012; 30: 975–87. doi: 10.1002/stem.1069 196 Yew TL, Chang MC, Hsu YT, et al. Efficient expansion of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow under hypoxic conditions. J Tissue Eng Regen Med 2013; 7: 984–93. doi: 10.1002/term.1491 197 Caroti CM, Ahn H, Salazar HF, et al. A novel technique for accelerated culture of murine mesenchymal stem cells that allows for sustained multipotency. Sci Rep 2017; 7: e13334. doi: 10.1038/s41598-017-13477-y 198 Hu X, Xu Y, Zhong Z, et al. A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization. Circ Res 2016; 118: 970–83. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.307516 199 Cancedda R, Descalzi Cancedda F, Castagnola P. Chondrocyte differentiation. Int Rev Cytol 1995; 159: 265–358. doi: 10.1016/s0074-7696(08)62109-9 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 113 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 200 Xu X, Kratz K, Wang W, et al. Cultivation and spontaneous differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells on polymeric surfaces. Clin Hemorheol Microcirc 2013; 55: 143–56. doi: 10.3233/CH-131698 201 Lee JH, Shin YC, Jin OS, et al. Reduced graphene oxide-coated hydroxyapatite composites stimulate spontaneous osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Nanoscale 2015; 7: 11642–51. doi: 10.1039/c5nr01580d 202 Sonomoto K, Yamaoka K, Kaneko H, et al. Spontaneous differentiation of human mesenchymal stem cells on poly-lactic-co-glycolic acid nano-fiber scaffold. PLoS One 2016; 11: e0153231. doi: 10.1371/journal.pone.0153231 203 Fagan C, Dapson RW, Horobin RW, Kiernan JA. Revised tests and standards for biological stain commission certification of alcian blue dyes. Biotech Histochem 2020; 95: 333–40. doi: 10.1080/10520295.2019.1699163 204 Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res 1998; 238: 265– 72. doi: 10.1006/excr.1997.3858 205 Coricor G, Serra R. Tgf-beta regulates phosphorylation and stabilization of sox9 protein in chondrocytes through p38 and smad dependent mechanisms. Sci Rep 2016; 6: e38616. doi: 10.1038/srep38616 206 Lu TJ, Chiu FY, Chiu HY, Chang MC, Hung SC. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells in three-dimensional chitosan film culture. Cell Transplant 2017; 26: 417–27. doi: 10.3727/096368916X693464 207 Dudakovic A, Camilleri E, Riester SM, et al. High-resolution molecular validation of self-renewal and spontaneous differentiation in clinical-grade adipose-tissue derived human mesenchymal stem cells. J Cell Biochem 2014; 115: 1816–28. doi: 10.1002/jcb.24852 208 Bosnakovski D, Mizuno M, Kim G, et al. Chondrogenic differentiation of bovine bone marrow mesenchymal stem cells in pellet cultural system. Exp Hematol 2004; 32: 502– 9. doi: 10.1016/j.exphem.2004.02.009 209 Fortier LA, Nixon AJ, Williams J, Cable CS. Isolation and chondrocytic differentiation of equine bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Am J Vet Res 1998; 59: 1182– 7. doi: 210 De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP. Human periosteum-derived cells maintain phenotypic stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age. Arthritis Rheum 2001; 44: 85–95. doi: 10.1002/1529-0131(200101)44:1<85::AID-ANR12>3.0.CO;2-6 211 Naruse K, Urabe K, Mukaida T, et al. Spontaneous differentiation of mesenchymal stem cells obtained from fetal rat circulation. Bone 2004; 35: 850–8. doi: 10.1016/j.bone.2004.05.006 M. Voga: Vpliv... dejavnikov na proliferacijo in diferenciacijo mezenhimskih matičnih celic... psov in mačk. 114 Ljubljana: UL, Veterinarska fakulteta, 2021. Doktorska disertacija 212 Dalby MJ, Gadegaard N, Oreffo RO. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater 2014; 13: 558–69. doi: 10.1038/nmat3980 213 Singh P, Schwarzbauer JE. Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis. J Cell Sci 2012; 125: 3703–12. doi: 10.1242/jcs.095786 214 Casanellas I, Lagunas A, Vida Y, et al. The janus role of adhesion in chondrogenesis. Int J Mol Sci 2020; 21: e5269. doi: 10.3390/ijms21155269 215 Meinel L, Hofmann S, Karageorgiou V, et al. Engineering cartilage-like tissue using human mesenchymal stem cells and silk protein scaffolds. Biotechnol Bioeng 2004; 88: 379–91. doi: 10.1002/bit.20252