ISSN 0351-9716
VAKUUMIST 22/1 (2002)
UPORABA SINHROTRONSKE SVETLOBE PRI ŠTUDIJU STRUKTURE
PROTEINOV
Saša Jenko, Institut »Jožef Stefan«, Jamova 39, 1000 Ljubljana
Synchrotron Radiation in Macromolecular Crystallography
ABSTRACT
Synchrotron radiation has become a major structural research tool across the world in numerous scientific areas.lt is a critical component for many of these developments, and it is essential for high-throughput crystallography. The source characteristics of modern synchrotrons are ideally matched to a number of difficult problems m macromolecular crystallography Recent studies on viruses, membrane proteins and ribosomes give dear examples of the power of modern macromolecular crystallography using synchrotron radiation. The detailed structural information obtained enables the relationships between structure and function to be addressed with confidence
terija E. coli vsebuje več kot 1000 različnih proteinov, ki skrbijo za normalni potek življenjskih funkcij organizma).
Strukturo protema delimo na: primarno, sekundarno, terciarno in kvartarno. Najenostavnejša je primarna struktura, ki nam pove, kakšno je zaporedje aminokislin v polipeptidni verigi proteina.
S sekundarno strukturo (npr: vijačnica <x. nagubana struktura ß) opišemo ponavljajoče se strukturne elemente v proteinu in se nanaša na prostorsko orientacijo aminokislin, ki so si blizu skupaj glede na aminokislin-sko zaporedje.
POVZETEK
Smhrotronsko sevanje se zadnjih dvajset let uporablja za raziskave v številnih tehniških m naravoslovnih vedah, kot so fizika, kemija. fizikalna metalurgija, biokemija, farmacija, medicina in drugo Sinhro-tronsko sevanje je postalo eno izmed glavnih orodij v biokemiji za strukturne študije proteinov; je nujno potrebno za razvoj »high-throughput« kristalografije. ki bo omogočila avtomatizirano reševanje novih struktur množice proteinov. ki so rezultat hitrega razvoja področja genomike (določevanja zaporedja genov dednega zapisa) in proteomike (določevanja struktur proteinov. ki jih ti geni zapisujejo). Poleg tega moderni sinhrotroni omogočajo reševanje težjih problemov v makromolekulski knstaiografiji, kot so strukture virusov. membranskih proteinov idr Podatki, pridobljeni z uporabo sinhro-tronskega sevanja, omogočajo natančnejšo določitev strukture proteinov m s tem posredno njihove funkcije.
1 Proteini
Proteini so kompleksne makromolekule, ki igrajo pomembno vlogo v vseh bioloških procesih: kot encimi sodelujejo pri katalizi kemijskih reakcij v bioloških sistemih, prenašajo manjše molekule in ione, utrjujejo strukturo celice, sodelujejo pri imunskem odgovoru organizma, pri prenašanju živčnih impulzov ter kontrolirajo izražanje genske informacije, ki je nujna za rast in diferenciacijo celic. Sestavljeni so iz 20 različnih aminokislin, med seboj povezanih s peptidnimi vezmi .1/. Aminokisline se lahko na različne načine povezujejo v polipeptidne verige in s tem omogočijo izredno raznolikost strukture in funkcije proteinov (primer: bak-
¦ *     •     -     •     •     •     -     •
•            .            •            .
-¦'.-.Vi
¦       «              '        •                    •                    ¦
*              •              »              •
•              •              •             ¦
.              .              ,      -      .
•          •          .          i
Slika 2: Sekundarna struktura proteina: vi/ačnica a in nagubana struktura ß
¦ ¦
¦ .
-  ! I   .
-               -"¦
v     ¦
¦ ¦¦   . :
-   "   '  ¦ ¦
¦
¦   ¦ ¦ ¦
X   A   X
¦
--.   I    .-¦
-  ...  ,
¦
'¦          ¦
¦"         -"
¦"           :
X   X
- i s   :
¦
¦
¦
¦ "   ¦
z x : x
¦
¦
.   ¦ F   H
:   ¦
¦ ¦
¦
¦   . ¦
...   M
i   ¦;
¦ '
.- .  = v
¦
s i -
..-.                                                  .¦  -
X S V A
.," a
-   ¦   ¦   ¦                                            ¦    ¦ .   .
¦   ¦¦
P H F L
¦
G Y S :
V           S  A X X  S
Slika 1: Primarna struktura encima heksokinaze
Slika 3: Terciarna struktura encima heksokinaze
'0
VAKUUMIST 22/1 (2002)
ISSN 0351-9716
Terciarna struktura je tridimezionalna struktura poli-peptidne verige. Kvartarno strukturo pa imajo le prote-ini, ki so sestavljeni iz več polipeptidnih verig, opisuje pa prostorsko orientacijo in organizacijo vseh polipeptidnih verig 121.
Slika 4: Kvartarna struktura hemoglobina
2 Določanje strukture proteinov
Lastnosti proteina in njegova fiziološka vloga v celici so odvisne od njegove tridimenzionalne strukture. To strukturo proteinov lahko določamo na več načinov: z NMR (jedrsko magnetno resonanco), z elektronsko mikroskopijo ter z difrakcijo rentgenskih žarkov ali nevtronov na kristalih Prva tridimenzionalna struktura biološke makromolekule je bila DNA-vijačnica, določena z difrakcijo rentgenskih žarkov leta 1953, za katero sta leta 1962 Watson in Crick prejela Nobelovo nagrado. Prva tridimenzionalna struktura proteina, ki je prav tako prinesla Nobelovo nagrado, je bila struktura mio-globina, ki stajo določila Perutz in Kendrew leta 1962.
Z metodo difrakcije rentgenske svetlobe na protein-skem kristalu lahko določimo položaje vseh atomov v molekuli in s tem strukturo molekule, saj je valovna dolžina vpadne rentgenske svetlobe približno enaka dolžini kovalentih vezi v molekuli (0,15 nm).
Pri rentgenski difrakciji analiziramo uklonske kote rentgenske svetlobe na monokristalu. (Monokristal je periodično urejena tridimenzionalna struktura molekul, med seboj povezanih z nekovalentnimi interakcijami.) Kristal vpnemo na goniometrsko glavo med vir rentgenske svetlobe in detektor. Vpadna svetloba se na navideznih ravninah kristala uklanja, in to tem močneje, čim gosteje so ravnine zasedene z atomi. Uklonjeno svetlobo, ki jo zazna detektorski sistem, nato računalniško obdelamo.
Določanje strukture proteina z metodo rentgenske difrakcije poteka v več stopnjah:
1. priprava čistega proteina
2. kristalizacija proteina ter rast visokokvalitetnih monokriotalov
3. merjenje difrakcijskega vzorca proteina
4. določitev prostorske grupe kristala in vrednotenje merjenih podatkov
5. usklajevanje modela z merjenimi rezultati
2.1 Kristalizacija
Določanje tridimenzionalne strukture proteinov z metodo rentgenske difrakcije se začne s pripravo monok-ristalov. Glavne razlike med anorganskimi kristali in kristali proteinov so, da slednji vsebujejo velik delež vode (20-80%, podobno kot živa celica) ter da so molekule med seboj povezane s šibkimi nespecifičnimi vezmi: (van der Waalsove sile, elektrostatske interakcije, vodikove vezi). Proteinske molekule se lahko posledično urejajo na več različnih načinov v kristalno strukturo, zato lahko en protein kristalizira v več različnih prostorskih grupah.
Proteinski kristali so optično aktivne molekule, sestavljene iz L-optičnih enantiomerov aminokislin, zato ne morejo vsebovati simetrijskih operacij, ki jih opazimo pri anorganskih kristalih in ki zahtevajo enako število D- in L-enantiomerov, kot so: zrcalna ravnina, drsna zrcalna ravnina ali center inverzije. Zaradi teh omejitev proteini kristalizirajo le v 65 prostorskih grupah od skupno 230 /3/.
Proteini kristalizirajo iz prenasičenih raztopin proteinov, v katerih se v določenem trenutku začnejo tvoriti stabilna kristalizacijska jedra, ki rastejo, dokler sistem ne pride v stanje nasičene raztopine, kjer vlada ravnotežje med trdno fazo in molekulami v raztopini /4/.
*
1 '
r._
fV.   P   ¦¦'"
Slika 5: Energijski diagram poteka kristalizacije proteinov 141
Kristalizacijske pogoje določimo s »screeni«. To je določeno Število raztopin z različnimi pH in različnimi koncentracijami aditivov: obarjalnega reagenta in drugih anorganskih in organskih komponent. Raztopinam. v katerih rastejo kristali, še dodatno spreminjamo sestavo, da dobimo monokristal, primeren za strukturno analizo. Pri tem ne smemo pozabiti, da so proteini, ki jih kristaliziramo, vajeni fizioloških pogojev, ki jih imajo v celici /5/.
Za kristalizacijo makromolekul obstaja več metod: dializa, difuzija topila preko plinske faze (angleško: vapour diffusion), difuzija topila med dvema raztopinama (angleško: crystallization by the interface diffusion), metoda vsadka (angleško: batch method).
Najbolj razširjena je metoda izhlapevanja topila z difuzijo preko plinske faze, kjer se stanju prenasičenosti približamo z difuzijo hlapnih molekul topila. Poznamo dve tehniki: z visečo kapljico ter s sedečo kapljico. Kapljica, ki jo sestavljajo protein, pufer in obarjalni reagent, se nahaja v posodici z rezervoarjem, ki vse-
1:
ISSN 0351-9716
VAKUUMIST 22/1(2002)
buje višjo koncentracijo obarjalnega reagenta kot kapljica. Hlapne molekule topila {ponavadi vode) di-fundirajo iz kapljice v rezervoar, dokler se parni tlak topila v kapljici ne izenači s parnim tlakom topila v rezervoarju. Pri tem se v kapljici koncentracija obarjalnega reagenta povečuje in približuje območju pre-nasičenja raztopine, prične se rast kristala.
h.C:
• le/m •''
Slika 6: Kristalizacija z metodo izhlapevanja preko plin-ske faze 141
Optimalen čas rasti proteinskih kristalov je 14 dni. rastejo pa lahko od nekaj dni do nekaj mesecev.
Pri prehitrem prenasičenju se tvori veliko število majhnih knstalizacijskih jeder, kar ima za posledico nastanek velikega števila majhnih kristalov ali pa celo amoiine oborine /5/.
2.2 Meritve difrakcije vzorca
Proteinski monokristal pripravimo za meritev v kapilari oziroma ga ujamemo v zanko, potopimo v tekoči dušik, da v hipu zamrzne ler vpnemo na goniometrsko glavo med vir rentgenske svetlobe in detektor.
Slika 8: Zanka in kapilara za kristal
Vpadni žarki se na navideznih ravninah kristala uklan-jajo. in to tem močneje, čim gosteje so ravnine zasedene z atomi. Kristal med snemanjem difrakci-jskega vzorca vrtimo, pri čemer se izpolnjuje interference pogoj za različne navidezne ravnine.

-  '.
Slika 7: Kapljici z amorfno oborino in majhnimi kristali
Slika 9: Merjenje proteinskih monoknstalov z metodo rentgenske difrakcije
Slika 10: Elektronska gostota in tridimenzionalna struktura proteina (6)
]2
VAKUUMIST 22/1 (2002)
ISSN 0351-9716
Window (Be)
I .,r(-,'i (nKMine «node)

i i i I I : 1 i . t II t II
\
Window (Be)
---------r
Slika 11: Anoda in rotirajoča anoda 18/
Rentgenska svetloba se dejansko uklanja na elektronskih oblakih atomov v molekulah kristala, zato lahko dobimo iz uklonske slike karto elektronske gostote molekule, ki je osnova za izdelavo modela molekule. Kot vir rentgenske svetlobe se uporabljajo: rentgenska elektronka, rentgenska elektronka z rotirajočo anodo ter pospeševalniki delcev, ki proizvajajo sinhrotronsko sevanje v območju rentgenske svetlobe. V rentgenski elektronki elektrone iz vroče katode pospešimo proti kovinski anodi. Ko jo zadanejo, se v snovi ustavijo in pri tem sevajo svetlobo karakteristične valovne dolžine skozi berilijevo okence. V proteinski kristalografiji uporabljamo karakteristično rentgensko svetlobo K„ iz bakrove anode. Gostota toka rentgenske svetlobe je omejena s količino toplote, ki jo prenese anoda. Desetkrat boljši izkoristek dobimo z uporabo rotirajoče anode, pri kateri elektroni zadevajo večjo površino anode, ki se zato počasneje segreva. Najmočnejši vir rentgenske svetlobe pa so pospeševalniki delcev, pri katerih pospešeni elektroni ali pozitroni krožijo v visokem vakuumu s hitrostjo, ki se lahko približa svetlobni hitrosti. Energija je pospeševanim delcem dovedena z radiotrekvenčnimi oddajniki, kroženje pospešenih delcev pa vzdržujemo z močnimi magneti. Pospešeni nabiti delci, kot sta elektron in pozrtron, pri kroženju oddajo skoraj celotno energijo v obliki sinhro-tronskega sevanja. S sistemom fokusirajočih zrcal in monokromatorjev. ki so nameščeni tangencialno na obroč, lahko izbiramo močne monokromatske rentgenske žarke določenih valovnih dolžin (0,01 -10 nm) III-
Pospeševalniki. namenjeni uporabi v proteinski kristalografiji za določevanje tridimenzionalnih struktur pro-teinov, so: ELETTRA v Italiji, ESRF v Franciji, DESY v Nemčiji, SRS v Veliki Britaniji, APS, ALS, CHESS, NSLS in SSRL v ZDA in drugi.
Rentgensko svetlobo, ki se uklanja na kristalu, zaznamo z detektorsko ploščo, s CCD-kamero (angleško Charge Coupled Device) ali z večkanalnim proporcionalnim Števcem (angl. multiwire proportional chamber). Najbolj uporabljene so detektorske plošče, prekrite s tanko plastjo anorganske fosforjeve spojine, pri kateri uklonjena rentgenska svetloba vzbudi e'ektrone. Det elektronov se vrne v izhodno stanje in izseva energijo kot fluorescenčno svetlobo, del elektronov pa ostane ujetih v metastabilnih stanjih. Informacijo o poziciji
Slika 12: Sinhrotron ESRF, Francija
in intenziteti uklonjenih žarkov, shranjeno v detektorski plošči, preberemo z laserjem, ki vzbudi elektrone iz metastabilnih stanj v višja, kratkoživeča stanja. Pri prehodu iz vzbujenega v osnovno stanje pride do oddajanja svetlobe, ki jo zaznamo s fotopomnoževalko. Merjena oddana svetloba je sorazmerna s številom fotonov, ki so padli na ploščo oziroma z intenziteto sipanega žarka /8/.
2.3 Reševanje tridimenzionalne strukture p rote i na
Pri uklonu rentgenske svetlobe na realni mreži kristala dobimo difrakcijski vzorec oziroma recipročno mrežo, ki ima enako rotacijsko simetrijo kot realna. Vsak uklon na realni mreži lahko opišemo s Fourierovo vrsto v enačbi strukturnih faktorjev.
11-i
=1',
i '
.Snilh^.ky,.!?,)
Fhw........strukturni faktor
n............število atomov v osnovni celici
h.k.l.......koordinate uklona v recipročnem prostoru
X|,yj,Z)......položaj atoma j v osnovni celici
f,..............uklon žarka na atomu j
Enačba strukturnih faktorjev je torej zveza med recipročno in realno mrežo. Pove, da je posamezna slika uklona na detektorju vsota prispevkov uklonov vsakega posameznega atoma v osnovni celici. Atom predstavlja krogelni delec elektronske gostote in ga zapišemo kot vsoto prispevkov volumskih elementov elektronske gostote v osnovni celici. Gostoto v volumskem elementu zapišemo kot p(x,y,z).
Fourierova transformacija je reverzibilna operacija, zato lahko z njeno uporabo izrazimo elektronsko gostoto.
p(x,y,z) = - LL]TFhkle
-2iuHhx-kyl1'(
13
ISSN 0351-9716
VAKUUMIST 22/1 (2002)
Vsako periodično funkcijo opišemo z amplitudo. s frekvenco in fazo. Pri metodi rentgenske difrakcije izmerimo intenziteto (sorazmerna s kvadratom amplitude funkcije) in pozicijo uklona. Faze navadno ne moremo neposredno meriti, lahko pa jo določimo z derivati molekule, ki vsebujejo težke atome (Pb, Pt, Hg itd.), z anomalnim sipanjem nekaterih elementov (Fe, Cu. Zn, Mn, Se) ter z molekulami s podobno strukturo (metoda molekulske zamenjave).
Najpogostejša je metoda molekulske zamenjave, pri kateri dobimo faze iz strukturnih faktorjev znanega proteina. Faze znanega proteina nam rabijo za začetno oceno faz našega modela. Pričakujemo namreč, da ima naš protein podobno zgradbo kot fazirajoči model 17/:
*^)-v-X52>
ravi
m
e
-2.n<h*-kyrlz)-aS?"
V............volumen osnovne celice
<(hki........faze fazirajočega modela znanega proteina
Faze. izračunane iz strukturnih faktorjev FCaic. in amplitude merjene strukture uporabimo za izračun diferenč-nih map elektronske gostote 2F0bs- FCaic in Fobs- Fcaic-Mapa 2F0bs - FCaic pomeni celotno elektronsko gostoto. mapa F0bs Fcaic pa dele elektronske gostote. ki v modelu manjkajo.
Po izračunu faz sledi gradnja modela molekule z interpretacijo elektronske gostote. Prvotne faze so bile zgolj grobi približki, zato iterativno izboljšujemo model, do najboljšega ujemanja izračunanih strukturnih faktorjev z merjenimi podatki. Pri tem minimiziramo energijo z metodo najmanjših kvadratov:
E = * + Eg
*=L(lFo*|-rF<
caic
i -
';
E.........celotna energija molekule
Eg.......energija geometrije molekule (kotov, vezi, kon-
formacij)
<P.........vsota kvadratov razlik med merjenimi in izračunanimi amplitudami (kristalografsko minimizi-ranje)
oziroma za konvergenco je rezidualni indeks ali R-fak-tor/77:
R =
Fobsl-F.
calc
obs |
R.....................R-faktor oz. rezidualni indeks
Fobs................izmerjeni strukturni faktor
Fcaic...............izračunani strukturni faktor
Osnovno merilo za konec iterativnega postopka reševanja strukture proteina je nepretrgana diferenčna mapa elektronske gostote okrog večine atomov in ujemanje le-te z molekulskim modelom. Končni model molekule v kristalu mora biti tudi kemijsko možen, kar pomeni, da nima kiralnega centra inverzije. Dolžine vezi so ustrezne, peptidne vezi so skoraj planarne, neprolinski peptidi so v konformaciji trans, razen če za to ni posebnega vzroka. Konformacijska kota glavne verige * in f morata biti v okviru mej. dobljenih z Ramachandrovim diagramom, torzijski koti vezi stranskih skupin pa morajo biti v mejah stabilnih konformacij /7,9/.
2.4 PDB-baza tridimenzionalnih struktur proteinov
Rešene tridimenzionalne strukture proteinov so shranjene v PDB-bazi (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/), kjer vsaka dobi svojo kodo. Od vzpostavitve PDB-baze leta 1972 do danes je število rešenih tridimenzionalnih struktur proteinov naraslo iz nekaj struktur na leto na okoli 50 na teden.
Sedaj je v bazi okoli 17.000 tridimenzionalnih struktur proteinov (19. 2. 2002: 17.357 struktur). K hitremu razvoju m aktualnosti področja so prispevale vedno boljše tehnike pridobivanja proteinov in merjenja pro-teinskih kristalov ter pojav genomike (določevanja zaporedja genov dednega zapisa).
Z minimizacijo energije želimo doseči konvergenco modela k dejanski strukturi. Merilo za uspešnost je radij konvergence: razdalja do globalnega minimuma. Radij konvergence mora biti na začetku izboljševanja strukture čim večji. To dosežemo z uporabo podatkov nizke resolucije pri računanju funkcije *. Z manjšanjem radija konvergence povečujemo resolucijo in čedalje manj omejujemo parametre modela, ki postopno kon-vergira k merjenim podatkom. Konvergenco merjenih podatkov z modelom dosežemo torej z iterativnim izboljševanjem geometrije molekule; izboljšujemo tudi temperaturne faktorje posameznih atomov, ki so mera za oscilacijo atoma okrog položaja v modelu. Ko je ujemanje med merjenimi in izračunanimi intenzitetami veliko, dodamo še molekule topila. Mera za ujemanje
?PDfJ 1800
2   16X "¦   U;V.
a   1200
:¦    1000
'    tx
':    f'X
o
¦;:¦:
2Xi
O
..lil
01   m    t-    ai    •-r-    r-    r-    r-    <o
n    w    m
LQtC
Slika 13: Zgodovinski razvoj PDB-baze 1101
14
VAKUUMIST 22/1 (2002)
ISSN 0351-9716
3 Sklep
Z razcvetom genomike se je pojavilo tudi vprašanje, v kaj se ti geni prepisujejo. S tem se je odprlo novo področje proteomike oziroma strukturne genomike, ki se je naenkrat srečala z ogromnim številom proteinov, pri katerih bi bilo treba določiti tridimenzionalno strukturo. Zaradi množice vhodnih podatkov se prihodnost reševanja tridimenzionalnih struktur nagiba k avtomatizaciji vseh procesov, od pridobivanja proteina do robotske kristalizacije in avtomatskega merjenja kristalov na sinhrotronih /11/. Ob sinhrotronih že rastejo tovarne proteinov, npr.: Protein Production Factory (SRS, Daresbury, Velika Britanija), Protein Structure Factory (Berlin, Nemčija), ki bodo kos novim zahtevam po avtomatizaciji vseh procesov, ki vodijo do rešene tridimenzionalne strukture proteina. Poleg njih se na sinhrotronih tudi navdušujejo nad možnostjo merjenja proteinskih kristalov in določevanje strukture proteina na daljavo preko interneta (protein poslan po hitri pošti na sinhrotron, avtomatske nastavitve ter spremljanje procesov preko interneta).
Čeprav bo avtomatizacija skrajšala čas in povečala efektivnost reševanja struktur, bo posledično povzročila »poplavo« podatkov, ki jih bo treba smiselno obdelati. ter vsem proteinom, ki jim bo določena tridimenzionalna struktura, tudi pripisati njihovo funkcijo v bioloških procesih. Z razcvetom genomike in proteomike in uporabo vseh tehnik, ki so se posledično razvile, ter
DR. AVGUST BELIC (1928-2002)
Dr. Avgust Belič je izhajal iz skromne železničarske družine na Viču v Ljubljani. Rojen je bil 5.3.1928. Po osnovni soli na Viču se je 1.1939 vpisal na 1. državno moško realno gimnazijo v Ljubljani in jo z odliko končal Ieta1947 Jeseni istega leta se je vpisal na Tehniško visoko šolo. Oddelek za elektrotehniko.
Kot mladinec je med vojno sodeloval pn aktivnostih narodnoosvobodilnega boja v domači Rožni dolini. Že zgodaj ga je privlačila tehnika. Med študijem je pričel (1952) kot laborant sodelovati v Inštitutu za šibki tok TVS pri prof. Dušanu Lasiču. S tem se je vklopil v formiranje nastajajočega Inštituta za elektroniko in vakuumsko tehniko, ki mu je ostal zvest vso svojo delovno dobo. Leta 1956 je z odliko diplomiral, postal samostojni raziskovalec. kmalu potem (1960) vodja Laboratorija za optična merjenja v Oddelku za elektronsko vakuumsko tehniko in štiri leta kasneje vodja Odseka za termične elektronke. Vzporedno z ustvarjanjem družine je povečeval aktivnosti na strokovnem področju in bil postavljen za vodjo Oddelka za kontakte in specialne elektronke (1972). Iz tega obdobja se njegovi sodelavci spominjamo razvoja hermetičnih kontaktnikov. številnih patentov, spoznavanja novih tehnologij, stikov s tujino, aktivnosti za rast inštituta (IEVT) in povečevanja oddelka. Sodeloval je pri vodenju razvojnorazisko-vaine dejavnosti celotne hiše in po inž. Kobetu postal direktor (1974); njegovi tnje mandati so bili najuspešnejše obdobje Inštituta. Doktoriral je I. 1977 in se istočasno trudil za postavitev
z uporabo sinhrotronske svetlobe, se je odprlo novo, zelo zanimivo področje, ki bo pripomoglo k razumevanju delovanja celotnega organizma na molekularnem nivoju.
4 Literatura
/1/ Siryer. L., Biochemistry. W. H. Freeman and Company. New
York. (1995). 18-72 /2/ Voet. D., Voet. j G.. Biochemistry. John Wiley & Sons. Inc .
New York. (1996). 141-188 131 Eisenberg. D . X-Ray Crystallography and Enyzme Structure.
editor: Boyer P. D . The Enzymes. Academic Press New York.
(1970). 1-23 /4/ Mc Pherson. A. Crystallization of biological macromolecules.
Cold Spring harbor Laboratory Press. NY (1970). 159-215 IS/ Ducruix. A.. Giege. R . Methods ol Crystallization  Crystallization of Nucleic Acids and Proteins. Oxford University Press.
New York. (1992). 73-91 /6' Zarembinski. I. Hung. L. W . Mueller-Dieckmann. J.. Kim. K
K, Yokota, H. Kim, R.. and Kim. H. S.. Proc. Natl Acad. Sei..
15.(1998), 15189 /7/ Rhodes. G., Crystallography Made Crystal Clear. Academic
Press. San Diego. (1993). 85-99 /8/ Drenth. J . Principles ot Protein X-Ray Crystallography. Springer-Verlag, New York (1994). 34-37. /9/ Stern. I.. Določanje tridimenzionalne strukture kompleksov
kalepsmov s sintetičnimi inhibitorji. Magistrsko delo. Univerza
vLlubtjani. (20Q1), 21 -25 /10/ Welssig. H . Bourne. P. E.. Biointormattcs. 15 (1990). 807-831 /11/ Lamzin. V. S . Perrakis, A.. Nature Structural Biology. (2000).
978-981 /12/ Orengo, C. A.. Curr.OpinStruct Biol.. 4 (1994). 429-440 /13/ Holm. L, Sander. C . Nucleic AckJs Res . 27 (1999). 244-247
močne vodstvene strukture, ki jo je inštitut z nad 300 zaposlenimi nujno potreboval. Upokojil se je leta 1987.
Dr. Belič, vseskozi napredno tehnično misleč, je okrog sebe z veseljem zbiral mlajše sodelavce, jih vpeljeval v raziskovalno delo in skrbel za njihovo napredovanje. Že iz rane mladosti ga je spremljal izreden socialni čut, kar smo velikokrat opazili, ko je z njemu značilno vztrajnostjo pomagal vsakomur, ne glede na stan ali izobrazbo. V prostem času. kolikor mu ga je ostajalo, je poleg družine vlagal svojo energijo še v Združenje rezervnih vojaških starešin, deloval pri lovskih in strelskih družinah, bil strasten radioamater, kasneje tudi računalničar. ekspert za strelna orožja, za letala in sploh za tehnološko zahtevne tehnične izdelke vseh vrst. Prav v zadnjem obdobju se je z vsem žarom posvetil sistemom GPS. Na tem novem področju je svetoval številnim podjetjem, med drugim tudi Ministrstvu za obrambo in Ministrstvu za notranje zadeve, vodil je tečaje za uporabo GPS sistemov in bil celo somentor pri diplomah študentov, ki so se ukvarjali s tem tehnično dokaj zahtevnim področjem.
Strokovno in znanstveno delo dr. Beliča obsega številne članke v tujih in domačih revijah, referate na simpozijih in konterencah. strokovna poročila, recenzije in patente. Bil j3 znanstveno-tehnološki svetovalec v več tujih firmah, dobil dve nagradi za izume in tehnične izboljšave, sodeloval pri snovanju in začetnem delovanju Jugoslovanskega centra za vakuumsko tehniko ter bil predsednik Jugoslovanskega komiteja za vakuumsko tehniko. Ves čas je z velikim razumevanjem podpiral delovanje našega društva, ki je nastalo in živelo v isti stavbi kot Inštitut: številne aktivnosti so se v skupnem okolju dopolnjevale. Nanje in na dr. Beliča nas vežejo mnogi lepi spomini.
Andrej Pregelj
n memonam
15