367 Farm Vestn 2024; 75 NAPREDEK IN IZZIVI V RAZVOJU ŽIVIh BIOTERAPEVTSKIh IZDELKOV PROGRESS AND ChALLENGES IN ThE DEVELOPMENT OF LIVE BIOThERAPEUTIC PRODUCTS AVTORICE / AUThORS: asist. Nina Katarina Grilc, mag. farm. izr. prof. dr. Špela Zupančič, mag. farm. zaslužna prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerčeva cesta 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: julijana.kristl@ffa.uni-lj.si POVZETEK Koža in sluznice so naseljene z mikrobioto, ki ima ključno vlogo pri ohranjanju zdravja, saj lahko njeno neravnovesje povzroči različne bolezni. Probiotiki prispevajo k ponovni vzpostavitvi mikrobiotskega ravnovesja z različnimi mehanizmi, med katerimi so preprečevanje naselitve patogenov, modulacija imunskega sistema in krepitev zaščitne funkcije sluz- nic. V prispevku so obravnavani tradicionalni pro- biotiki ter probiotiki nove generacije, namenjeni upo- rabi v živih bioterapevtskih izdelkih. Za izdelavo le-teh so ključni ustrezna izbira sevov, njihova spe- cifična karakterizacija, izbira metode sušenja in pri- lagoditev formulacije za vsak sev posebej. Kakovo- sten izdelek s probiotiki mora vsebovati zadostno količino živih bakterij, ki morajo ohraniti njihovo bio- loško aktivnost od vgradnje v formulacijo, shranje- vanja do dostave na tarčno mesto. Kljub hitremu znanstvenemu napredku pa prav visoka stopnja preživetja nekaterih sevov še vedno predstavlja teh- nološki izziv, ki je opisan v pričujočem članku. Pro- biotiki nove generacije obetajo velik potencial pri preprečevanju in zdravljenju nekaterih infekcijskih in vnetnih bolezni, kar je razvidno iz intenzivnih raziskav na tem področju. KLJUČNE BESEDE: probiotiki, živi bioterapevtski izdelki, sušenje, en- kapsulacija, testiranje probiotikov, načrtovanje for- mulacij ABSTRACT The skin and mucous membranes are inhabited by microbiota, which play a crucial role in maintaining health, as its imbalance can lead to various dis- eases. Probiotics contribute to restoring microbiota balance through mechanisms such as inhibiting pathogen colonization, modulating the immune sys- tem, and strengthening the protective function of mucous membranes. This paper discusses tradi- tional probiotics as well as next-generation probi- otics designed for use in live biotherapeutic prod- ucts. Their development requires appropriate strain selection, specific characterization, drying method optimization, and formulation adaptation for each strain. A quality probiotic product must contain suf- ficient live bacteria that retain their biological activity P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I 1 Uvod Kožo in sluznice ljudi in živali naseljuje veliko število mikro- organizmov, vključno z bakterijami, glivami, paraziti in virusi, ki jih skupno imenujemo mikrobiota. Milijoni let evolucije so privedli do simbiotskega razmerja med gostiteljem in mi- služne prav koristne bakterije oz. probiotiki. Uporaba slednjih za podporo splošnemu zdravju in preprečevanje ali zdravljenje črevesnih bolezni tako ni novost, pri čemer so probiotiki za ta namen izvirali sprva iz fermentiranih živil, kasneje pa so bili tudi izolirani iz zdrave črevesne mikrobiote. V zadnjih deset- letjih probiotike uporabljamo tudi za zdravljenje in prepreče- vanje drugih z disbiozo povezanih bolezni, kot so vaginalne okužbe, parodontitis ter ekcem in atopijski dermatitis. Poleg tega pri slednjih prehajamo na uporabo avtohtonih probioti- čnih sevov, izoliranih iz zdrave mikrobiote tarčnih področij. Za vaginalne okužbe je najpogosteje raziskovan v zdravi va- ginalni mikrobioti prevladujoč Lactobacillus crispatus, za zda- vljenje ekcema in atopijskega dermatitisa pa so npr. raziskovali kožni komenzal Staphylococcus hominis (4–6). Mehanizmi probiotičnega delovanja v glavnem slonijo na pre- prečevanju oz. odpravljanju disbioze z delovanjem proti pa- togenom. Slednje temelji na sproščanju sekundarnih meta- bolitov probiotikov s protibakterijskim ali protiglivičnim delovanjem in tekmovanju s patogeni za hranila ter sluznične površine, na voljo za adhezijo ter kolonizacijo. Poleg tega nekateri metaboliti, ki jih sproščajo probiotiki, izboljšujejo pre- gradno funkcijo sluzničnih epitelijev, nekateri pa izkazujejo imunomodulatorno delovanje in zavirajo hiperaktivni imunski odziv gostitelja, značilen za vnetne bolezni, kot sta parodon- titis in kolitis (slika 1) (3, 7). hiter razvoj na področju odkrivanja in vrednotenja novih pro- biotikov je omogočil tudi napredek v tehnikah in pristopih za presejanje ter karakterizacijo potencialnih probiotičnih sevov, kot npr. napredek bioinformatike, podrobne raziskave meta- boloma, tj. celotnega nabora metabolitov dotičnega preisko- vanega seva, ter sekvenciranje naslednje generacije. To omo- goča odkrivanje novih terapevtskih sevov oz. probiotikov naslednje generacije, katerih uporaba ni nujno osnovana na dolgoletni zgodovini uporabe (8, 9). Podrobna karakterizacija sevov postaja aktualna tudi zaradi vedno strožjih regulatornih zahtev. Tako Ameriški vladni urad za zdravila in prehrano (FDA) kot Evropska farmakopeja sta v zadnjih 10 letih namreč uvedli termin »živi bioterapevtski izdelki« (angl. live biothera- peutic products, LBP), ki lahko pridobijo dovoljenje za promet kot zdravila za zdravljenje specifičnih bolezni, vendar morajo biti v njih vključeni terapevtski sevi podrobno ovrednoteni. To vključuje identifikacijo na ravni vrste in seva ter ustrezno fe- notipizacijo in genotipizacijo, za katero je zahtevano sekven- ciranje celotnega genoma. Slednje je med drugim ključno za potrditev varnosti LBP, kar vključuje odsotnost genov za vi- rulenčne dejavnike in genov, ki nakazujejo na možnost pre- nosa odpornosti proti protimikrobnim učinkovinam na tarčno mikrobioto (8, 10). Urad FDA je že odobril prva dva LBP, Re- byotaTM in VOWSTTM (11). Poleg probiotikov, LBP, živih tera- kroorganizmi, v katerem mikrobiota prispeva k številnim fi- ziološkim procesom gostitelja, gostitelj pa mikroorganizmom zagotavlja prostor in hranila, potrebna za njihovo preživetje. V zadnjem desetletju je znanstveno razumevanje vpliva mi- krobiote na zdravje ljudi močno napredovalo. Večina razi- skav je bila usmerjena na mikrobioto črevesja, kjer so ugo- tovili, da glavni prispevki mikrobiote vključujejo prebavo in fermentacijo ogljikovih hidratov, proizvodnjo vitaminov, pre- prečevanje kolonizacije patogenov in interakcije z imunskim odzivom (1). Nedavno so raziskovalci svojo pozornost usmerili tudi na druge mikrobiote, vključno z mikrobioto ustne votline, kože, vagine in zgornjega dela dihal (2, 3). Sestava mikrobiote ne izkazuje le pozitivnega vpliva na zdravje ljudi, vendar lahko deluje tudi negativno, saj v pri- meru disbioze, tj. povečane prisotnosti patogenih ali škod- ljivih v primerjavi s koristnimi mikroorganizmi, močno pri- speva k razvoju različnih lokalnih infekcijskih in vnetnih bolezni. Ker trenutne raziskave kažejo na povezavo med črevesno mikrobioto, imunskim sistemom in številnimi organi v človeškem telesu, lahko disbioza prispeva tudi k nastanku sistemskih bolezni, kot so alergije, sladkorna bolezen tipa 2, debelost in nevrodegenerativne bolezni. Posledično se- danje raziskave mikrobiote dajejo zelo informativne rezultate, ki prispevajo k razumevanju nastanka številnih bolezni in s tem tudi novim strategijam zdravljenja (2, 3). 2 od tradiCionalnih do probiotikov naSlednJe generaCiJe Ugodne učinke fermentirane hrane poznamo že tisočletja, konec 19. stoletja pa so znanstveniki odkrili, da so zanje za- from incorporation into the formulation, through storage, to delivery at the target site. Despite fast scientific advances, ensuring the high survival rate of some strains remains a technological challenge addressed in the present article. Next-generation probiotics hold great promise for the prevention and treatment of some infectious and inflammatory diseases, as evidenced by intensive research in this field. KEY WORDS: probiotics, live biotherapeutic products, drying, en- capsulation, probiotic testing, formulation design 368 N A P R E D E K IN IZ ZI V I V R A ZV O JU Ž IV Ih B IO TE R A P E V TS K Ih IZ D E LK O V Farm Vestn 2024; 75 369 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I pevtskih bakterij in probiotikov naslednje generacije se v lite- raturi pojavljajo tudi izrazi, kot so prebiotiki, postbiotiki in sin- biotiki, ki so za boljše razumevanje predstavljeni v preglednici 1. Probiotične bakterije se lahko uporabljajo same, v kombi- naciji s prebiotiki in sinbiotiki ali mešane z drugimi probiotičnimi sevi, da za izboljšanje učinka tvorijo konzorcij (tj. združba ra- zličnih bakterij, ki sodelujejo pri opravljanju določenih funkcij ali oblikovanju biofilma). Za namen izboljšanja terapevtske učinkovitosti in varnostnega profila probiotičnih sevov, lahko slednje tudi gensko modifi- ciramo. Varnostna tveganja lahko odpravimo z izbitjem genov za virulenco, poleg tega pa lahko uvedemo gene za encime s terapevtskim delovanjem ter citotoksične spojine z delo- vanjem proti rakavim celicam ali imunomodulatorne snovi, kot so kemokini in citokini. Tako trenutno razvijajo več novih gensko spremenjenih bakterijskih sevov za zdravljenje raka in presnovnih bolezni (12, 13). 3 tehnoloŠki vidik izdelave živih bioterapevtSkih izdelkov Pri izdelavi končnega izdelka s probiotiki oz. živimi tera- pevtskimi bakterijami moramo vgraditi zadostno količino Slika 1: Delovanje probiotikov na gostitelja. A) Kompleksna trosmerna komunikacija med probiotiki, mikrobioto in gostiteljem, ki na zdravje slednjega vpliva tako na lokalni kot sistemski ravni. B) Mehanizmi probiotičnega delovanja na ravni celic in tkiv. GIT – gastrointestinalni trakt; MO – mikroorganizmi. Celotna slika B in posamezni deli slike A so izdelani s programom Biorender. Figure 1. Probiotic action on the host. A) Complex three-way communication between probiotics, microbiota, and the host, which affects both local and systemic levels. B) Mechanisms of probiotic activity on the celular and tissue level. Figure B in its entirety and parts of Figure A were created in Biorender. 370 N A P R E D E K IN IZ ZI V I V R A ZV O JU Ž IV Ih B IO TE R A P E V TS K Ih IZ D E LK O V Farm Vestn 2024; 75 bakterij in ohraniti njihovo biološko aktivnost. To vključuje zagotavljanje visoke stopnje bakterijskega preživetja med vgradnjo bakterij v dostavni sistem, shranjevanjem kon- čnega izdelka ter izpostavitvijo bakterij neugodnim dejav- nikom (npr. ph ali prebavnim encimom) v človeškem telesu po uporabi (15, 16). Za terapevtsko učinkovitost je namreč ključnega pomena, da na tarčnem mestu delovanja do- sežemo potrebno visoke odmerke živih in biološko aktivnih terapevtskih bakterij. Po tem, ko se iz dostavnega sistema sprostijo probiotične celice, morajo slednje namreč rea- ktivirati želeno presnovno aktivnost, se deliti in vsaj pre- hodno kolonizirati tarčna mesta (12, 17). Zagotavljanje vi- soke stopnje preživetja v končnem izdelku predstavlja velik izziv zaradi strukturne in funkcionalne kompleksnosti bak- terijskih celic. Poleg vrste, števila in živosti vhodnih tera- pevtskih bakterij je preživetje odvisno tudi od sestave for- mulacije in tehnološkega procesa izdelave dostavnega sistema oz. končnega izdelka (slika 2) (16, 18). Dolgotrajno ohranjanje bakterijske živosti zahteva zaustavitev bakterijskega metabolizma za preprečevanje litičnih procesov, saj le-ti vodijo k razgradnji bakterijske celične stene ali mem- brane in posledično do smrti celice (19, 20). Najpogostejša pristopa, ki se uporabljata za ta namen, sta krioprezervacija (zamrzovanje) in sušenje. Krioprezervacija je metoda izbora na laboratorijski ravni, njeno širšo uporabo pa omejujejo izzivi pri povečevanju velikosti serij ter zahteve za vzdrževanje hladne verige (21). Za izdelavo končnih izdelkov je zato pri- mernejši pristop ohranjanje živosti na osnovi sušenja. 3.1 SUŠENJE PROBIOTIKOV Princip ohranjanja bakterijske živosti s sušenjem temelji na prehodu živih bakterij v stanje zaustavljenega metabolizma, imenovano anhidrobioza. Anhidrobioza na osnovi sušenja omogoči dolgotrajno preživetje bakterij pri shranjevanju nad nizkimi temperaturami, potrebnimi za krioprezervacijo. Poznamo različne metode sušenja, vsem pa sta skupna naslednja dejavnika stresa na bakterijske celice: dehidracija in z njo povezan intenziven osmotski šok. Ob dehidraciji namreč prihaja do odstranitve vode, ki je sicer vezana na polarne skupine proteinov in fosfolipidov. To vodi v njihovo entropijsko preurejanje na molekularni ali supramolekularni ravni, zaradi česar prihaja do porušenja funkcionalnih struk- tur proteinov in fosfolipidnih dvoslojev. Osmotski šok oz. bistveno zviševanje znotrajcelične koncentracije osmotsko aktivnih snovi, do katerega prihaja zaradi dehidracije bak- terijskih celic med sušenjem, pa lahko povzroči tudi njihovo plazmolizo in s tem celično smrt (19, 20). Dodaten stres Preglednica 1: Definicija izrazov, povezanih s koristnimi mikroorganizmi za zdravje (14). Table 1: Definition of terms related to microorganisms beneficial for health (14). Probiotiki: živi mikroorganizmi, ki pri uporabi v ustreznih odmerkih koristno delujejo na zdravje gostitelja. Prebiotiki: neživi substrati, ki delujejo kot hranila za koristne mikroorganizme mikrobiote gostitelja, pri čemer med slednje spadajo tako namensko zaužiti probiotični sevi kot stalno prisotni komenzalni mikroorganizmi. Postbiotiki: pripravki iz neživih mikroorganizmov in/ali njihovih komponent s koristnim delovanjem na zdravje gostite- lja. Sinbiotiki: pripravki s koristnim delovanjem na zdravje gostitelja, sestavljeni iz mešanice živih koristnih mikroorganizmov (probiotikov) in substratov, ki jih lahko selektivno izkoriščajo samo koristni mikroorganizmi. Probiotike, prebiotike, postbiotike in sinbiotike kot opisane zgoraj definira Mednarodna znanstvena organizacija za probiotike in prebiotike (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP). Probiotiki naslednje generacije (angl. next-generation probiotics): mikroorganizmi, katerih terapevtsko delovanje je bilo odkrito in potrjeno izven okvira dolgotrajne uporabe, običajno s pomočjo modernih metod za mikrobiološko ka- rakterizacijo. Živi bioterapevtski izdelki (angl. live biotherapeutic products, LBP): pripravki, ki vsebujejo žive mikroorganizme (ene vrste ali njihov konzorcij) s terapevtskim ali preventivnim delovanjem proti človeškim boleznim. Žive terapevtske bakterije (angl. live therapeutic bacteria): žive bakterije, ki predstavljajo aktivno komponento LBP. 371 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I za posušene bakterije predstavlja še rehidracija, kateri so izpostavljene med rekonstitucijo oz. raztapljanjem suhega končnega izdelka pred administracijo ali med samo admi- nistracijo suhega izdelka, ko le-ta pride v stik s fiziološkimi tekočinami, npr. v črevesnem soku ali vaginalni tekočini. Tudi med rehidracijo namreč prihaja do osmotskega stresa na bakterijske celice, poleg tega pa lahko rehidracija pov- zroči poškodbe in povečano prepustnost celičnih membran zaradi hitrega prehoda fosfolipidnih dvoslojev iz gelu pod- obne oblike v obliko tekočih kristalov (22). Vsi omenjeni procesi povzročajo poškodbe bakterijskih ce- lic in potencialno vodijo v njihovo smrt. Z dehidracijo po- vezan stres lahko omilimo z dodatkom pomožnih snovi s stabilizacijskim delovanjem. Stabilizatorji izboljšajo preživetje bakterij med zamrzovanjem in sušenjem, saj zmanjšujejo osmotski stres ter termodinamično in kinetično stabilizirajo bakterije. Pod termodinamično stabilizacijo, znano tudi kot »hipotezo nadomestitve vode«, pojmujemo tvorbo vodi- kovih vezi med molekulami stabilizatorjev in komponentami bakterijskih celic, kot so proteini in maščobnokislinski ostanki fosfolipidov. Pri tem stabilizatorji nadomestijo od- stranjeno vodo in s tem ohranjajo strukturno integriteto proteinov ter fosfolipidnih dvoslojev (14, 19, 23). Kinetična stabilizacija bakterijskih celic pomeni imobilizacijo bakterij- skih celic oz. njihovih komponent v trdnem, pogosto ste- klastem ogrodju, kar omejuje difuzijo in gibanje tako struk- turnih makromolekul kot celotnih bakterijskih celic ter tako upočasnjuje razgradne reakcije (20). Stabilizatorje najdemo v razredih mono-, di- ali oligosaharidov, poliolov in protei- nov, med najpogosteje uporabljenimi pa so trehaloza, sa- haroza, laktoza in inulin (19, 24). Najpogostejši metodi sušenja za ohranjanje živosti tera- pevtskih bakterij sta liofilizacija in sušenje z razprševanjem (21, 25, 26), v zadnjem času pa za ta namen vedno pogo- steje uporabljajo elektrostatsko sukanje (27). Drugi možni tehnološki pristopi so še sušenje v zvrtinčenih plasteh, va- kuumsko sušenje (26), elektrostatsko razprševanje (14) in sušenje na zraku kot najbolj osnovna in preprosta, a tudi obsoletna metoda. Liofilizacija je najpogosteje uporabljena metoda sušenja živih bakterij z najdaljšo zgodovino uporabe. Proces liofili- zacije je sestavljen iz treh medsebojno odvisnih faz. Pred postopkoma primarnega in sekundarnega sušenja moramo izvesti zamrzovanje, med katerim nastanejo ledeni kristali, ki lahko povzročijo poškodbe živih bakterijskih celic. To preprečimo ali omejimo z dodajanjem krioprotektantov (npr. glicerola) ali z ustrezno hitrostjo zamrzovanja, s katero vpli- vamo na morfologijo nastajajočih kristalov (14). Sušenje z razprševanjem predstavlja alternativo liofili- zaciji, saj ne vključuje zamrzovanja, po drugi strani pa sta za to metodo sušenja značilna mehanski in toplotni stres. Sušenje z razprševanjem namreč temelji na razprševanju vstopne tekočine (disperzije bakterij z dodatkom pomožnih snovi), med katerim so bakterije izpostavljene strižnim silam, nato pa so zaradi potrebe po izhlapevanju topila iz- postavljene tudi povišanim temperaturam (vstopni zrak na- mreč lahko doseže 130–170 °C). Kljub temu da je izpo- stavitev bakterij omenjenim stresnim dejavnikom kratkotrajna, lahko to v kombinaciji z dehidracijskim stre- som povzroči poškodbe ali smrt celic. V izogib omenjenim težavam lahko bakterije pred sušenjem z razprševanjem zaščitimo z enkapsuliranjem. Privlačno prednost sušenja z razprševanjem pred liofilizacijo predstavljajo časovna in energijska učinkovitost ter možnost kontinuirane izvedbe procesa (25, 28, 29). Sušenje v zvrtinčenih plasteh in vakuumsko sušenje za namen sušenja probiotikov preučujejo redkeje kot su- šenje z razprševanjem in liofilizacijo (26). Glavni izziv sušenja v zvrtinčenih plasteh predstavlja potreba po uporabi po- možnih snovi, primernih za granulacijo, ali inertnih nosilnih delcev, na katere lahko bakterije nanašamo. Poleg tega prihaja pri sušenju v zvrtinčenih plasteh do izpostavitve Slika 2: Ključni koraki pri razvoju izdelka s probiotiki, ki lahko vsebuje probiotike, vgrajene v hidrofilno ogrodje (mikrokapsul ali zrnc) ali v nanovlakna. Slika je izdelana s programom Biorender. Figure 2: Key steps in the development of a probiotic product, which may involve incorporating probiotics into a hydrophilic matrix (of microcapsules or granules) or embedding them within nanofibers. Figure was created in Biorender. 372 N A P R E D E K IN IZ ZI V I V R A ZV O JU Ž IV Ih B IO TE R A P E V TS K Ih IZ D E LK O V Farm Vestn 2024; 75 bakterij toplotnemu in mehanskemu stresu, čeprav sta le- ta manj izrazita kot pri sušenju z razprševanjem (30). To- plotnemu in mehanskemu stresu se izognemo pri vaku- umskem sušenju, pri katerem je zaradi neželene oblike končnega izdelka (trdna pogača) pogosto potreben doda- ten korak njegovega procesiranja, kot npr. lomljenje oz. drobljenje pogače. Poleg tega je vakuumsko sušenje, ki je najpogosteje izvedeno serijsko in ne kot kontinuiran proces, časovno relativno zahtevna metoda (26, 30). Elektrostatsko sukanje predstavlja obetavno sodobno metodo za ohranjanje živosti bakterij, saj se med sušenjem curka polimerne disperzije s probiotičnimi celicami hkrati doseže tudi vgradnja oz. enkapsulacija bakterij v nanov- lakna. To pomeni, da metoda omogoča sočasno sušenje, imobilizacijo celic in pripravo naprednega dostavnega si- stema. Elektrostatsko sukanje temelji na izpostavitvi poli- merne disperzije električnemu polju, pri čemer pride do elektrohidrodinamičnega pojava, poganjanja curka iz ka- pljice raztopine z ustrezno viskoznostjo ter njegovega in- tenzivnega raztezanja, zaradi česar ob hitrem izhlapevanju topila nastanejo trdna, suha nanovlakna. Elektrostatsko sukanje poteka pod relativno blagimi pogoji, saj ne zahteva visokih temperatur. Glavna stresna dejavnika, katerima so med elektrostatskim sukanjem izpostavljene bakterije, sta blag mehanski stres in visoka napetost. Za proces je po- membna tudi relativna vlaga, saj vpliva na učinkovito su- šenje nanovlaken in delež vlage ter vodno aktivnost v kon- čnem izdelku, ki za zagotavljanje preživetja bakterij med shranjevanjem ne sme biti previsoka (14). 3.2 ENKAPSULACIJA PROBIOTIKOV Pod enkapsulacijo bakterij pojmujemo njihovo ujetje v za- prt prostor s pomočjo fizične pregrade, npr. membrane oziroma obloge. To lahko izvedemo na ravni posameznih celic z oblaganjem s plastenjem polielektrolitov (angl. »layer-by-layer«) posameznih bakterijskih celic (31) ali pa z enkapsulacijo skupkov več bakterijskih celic, najpogo- steje z mikrokapsuliranjem (32). Zgodovinsko izraz en- kapsulacija v povezavi s probiotiki ni bil omejen le na ujetje v membrane, temveč ga uporabljamo tudi za ujetja bakterij v ogrodje iz pomožnih snovi, najpogosteje poli- merov (33, 34). Enkapsulacija je oblika imobilizacije bakterijskih celic, s katero lahko podaljšamo njihovo preživetje z vplivom na metabolizem in zaščito celic pred škodljivimi vplivi okolja. Tako kot krioprezervacija in sušenje, ki zaradi zmanjšanja aktivnosti vode v bakterijskih celicah zavirata fiziološke in razgradne procese v njih, tudi imobilizacija celotne bak- terijske celice omeji njeno gibanje in s tem nekoliko upo- časni metabolizem, čeprav ta učinek še zdaleč ni tako iz- razit kot v primeru sušenja ali krioprezervacije (35). Nadalje lahko z enkapsulacijo bakterije zaščitimo pred neugodnimi dejavniki v človeškem telesu in med shranjevanjem (34). Takšno kombinacijo zaščitnega delovanja in vpliva imobi- lizacije na bakterijski metabolizem poznamo tudi iz nara- vno prisotnih bakterijskih biofilmov, za katere je znana povečana odpornost vanje vključenih bakterij na ek- stremne ph vrednosti ali prisotnost spojin s protimikrob- nim delovanjem (36). Enkapsulacija bakterij je pomembna tudi pri njihovi lokalni dostavi, saj omogoča nadzorovano sproščanje in izboljša bioadhezijo, s čimer se podaljša zadrževanje terapevtskih bakterij na tarčnih sluznicah ali na koži. Za doseganje teh funkcij lahko uporabimo različne pomožne snovi in metode vgradnje v mikrokapsule. Enkapsulacija bakterij je tako še posebno razširjena v živilski tehnologiji, kjer probiotične bakterije vgrajujejo v biološko razgradljiva vodotopna poli- merna ali proteinska ogrodja z metodami iztiskanja, emul- giranja ali koacervacije. Prva dva pristopa obsegata tvorbo delcev iz iztiskanih ali emulgiranih kapljic polimernih raztopin z dispergiranimi bakterijami, pogosto s premreževanjem, ter tako dosežeta ujetje bakterij v trdno ali gelasto ogrodje tvorjeno in situ (33). Pogoste pomožne snovi, ki jih upora- bljajo kot tvorilce takšnih ogrodij, so naravni biokompatibilni polimeri, npr. natrijev alginat (37), pektin (38), sirotkine be- ljakovine (39) in karagenan (40). Pri koacervaciji prihaja do ločevanja s koloidom bogate in osiromašene tekoče faze, pri čemer za metodo uporabljajo podobne polimere in pro- teine kot pri mikrokapsuliranju z iztiskanjem ali emulgiranjem. Ločevanje faz lahko v odvisnosti od uporabljenih polimerov dosežemo s spreminjanjem ph ali temperature, dodatkom visokih koncentracij soli, dodatkom novih polimerov (npr. nasprotno nabitih), ki z že prisotnimi polimeri tvorijo med- molekulske interakcije ter z dodatkom ne-topil, ker pa so le-ta po večini toksična organska topila, je to običajno ne- primeren pristop za enkapsulacijo bakterij. Bakterije s koa- cervacijo enkapsuliramo s tvorbo membrane, ki nastane iz koloidno bogate faze, ki obda probiotike (33, 41). 4 vrednotenJe izdelkov S probiotiki Za vrednotenje probiotikov ali končnih izdelkov s probiotiki oz. živimi terapevtskimi bakterijami je ključen izbor ustreznih 373 Farm Vestn 2024; 75 P R E G LE D N I Z N A N S TV E N I Č LA N K I metod za kvantifikacijo bakterijske živosti in/ali metabolne aktivnosti. S tem lahko potrdimo, da so bakterije obdržale želeno biološko aktivnost med vgradnjo in shranjevanjem, kar odločilno vpliva na terapevtsko učinkovitost. Najpomembnejši vidik vrednotenja je določanje bakterijske živosti. Standarden pristop za vrednotenje živosti vključuje določanje števila kolonijskih enot (angl. colony-forming units) na masno ali volumsko enoto končnega izdelka. Kljub temu da je to metoda izbora, na takšen način ne moremo zaznati živih, a nekultivabilnih bakterij (angl. viable but non-culturable), tj. bakterij brez sposobnosti razmno- ževanja in kolonizacije tarčnih sluznic, a z ohranjeno pres- novno aktivnostjo in situ na mestu delovanja, kjer vseeno sproščajo sekundarne metabolite (npr. protibakterijske ali imunomodulatorne), ki doprinesejo k probiotičnem delo- vanju (42, 43). Za celovitejšo oceno živosti so torej poleg določanja števila bakterijskih kolonij potrebne tudi druge metode, npr. mikroskopske tehnike ali pretočna citometrija po ustreznem diskriminatornem obarvanju živih in mrtvih bakterij ter kvantitativna reakcija s polimerazo in kvantifi- kacija 16S ribosomalne RNA kot metodi za kvantifikacijo bakterijskega genskega materiala v vzorcu (43, 44). Učinkovitost ohranjanja živosti bakterij v končnem izdelku lahko vrednotimo tudi posredno, in sicer tako, da določimo njihovo relevantno aktivnost s testi protimikrobnega delo- vanja proti patogenom (v kokulturah ali z difuzijskimi testi na agarju) (45–47), z analizo izražanja relevantnih proteinov (48) in z različnimi metabolnimi testi (47, 49). Med slednjimi so pogosti tako nespecifični (npr. resazurinski test) kot tudi bolj specifični testi, namenjeni analizam določenih vrst bak- terij. V primeru pogosto uporabljenih laktobacilov na primer njihov metabolizem vrednotimo z določanjem sproščanja laktata in spremembo ph (49, 50). 5 Sklep Probiotiki predstavljajo obetavne aktivne komponente za zdravljenje številnih bolezni, vendar je za njihovo uspešnost potreben izbor učinkovitega seva, njegova natančna ka- rakterizacija in premišljena izdelava kakovostne in varne formulacije. Kljub napredku pri sušenju in enkapsulaciji bakterij ostajajo izzivi predvsem pri ohranjanju živosti bakterij in prenosu procesa z laboratorijskega na industrijski nivo. Glede na mehanizem delovanja pa imajo probiotiki velik terapevtski potencial, kar narekuje hitro razvijajoče se po- dročje, zato je v prihodnosti na tržišču moč pričakovati vedno več LBP. 6 izJava Avtorji se zahvaljujemo Javni agenciji za znanstvenorazi- skovalno in inovacijsko dejavnost Republike Slovenije za finančno podporo programa P1-0189 ter projektov J7- 4418 in J4-4556. 7 literatUra 1. Kamada N, Seo SU, Chen GY, Núñez G. Role of the gut microbiota in immunity and inflammatory disease. Nat Rev Immunol. 2013 May;13(5):321–35. 2. Sanders ME, Merenstein DJ, Reid G, Gibson GR, Rastall RA. Probiotics and prebiotics in intestinal health and disease: from biology to the clinic. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2019 Oct;16(10):605–16. 3. Stavropoulou E, Bezirtzoglou E. Probiotics in Medicine: A Long Debate. Front Immunol. 2020 Sep 25;11:2192. 4. Cunningham M, Azcarate-Peril MA, Barnard A, Benoit V, Grimaldi R, Guyonnet D, et al. Shaping the Future of Probiotics and Prebiotics. Trends in Microbiology. 2021 Aug;29(8):667–85. 5. Vaneechoutte M. The human vaginal microbial community. Research in Microbiology. 2017 Nov;168(9–10):811–25. 6. Grilc NK, Zidar A, Kocbek P, Rijavec T, Colja T, Lapanje A, et al. Nanofibers with genotyped Bacillus strains exhibiting antibacterial and immunomodulatory activity. Journal of Controlled Release. 2023 Mar;355:371–84. 7. Barzegari A, Kheyrolahzadeh K, Hosseiniyan Khatibi SM, Sharifi S, Memar MY, Zununi Vahed S. The Battle of Probiotics and Their Derivatives Against Biofilms. IDR. 2020 Feb;Volume 13:659–72. 8. O’Toole PW, Marchesi JR, Hill C. Next-generation probiotics: the spectrum from probiotics to live biotherapeutics. Nat Microbiol. 2017 May;2(5):17057. 9. Al-Fakhrany OM, Elekhnawy E. Next-generation probiotics: the upcoming biotherapeutics. Mol Biol Rep. 2024 Dec;51(1):505. 10. Rouanet A, Bolca S, Bru A, Claes I, Cvejic H, Girgis H, et al. Live Biotherapeutic Products, A Road Map for Safety Assessment. Front Med. 2020 Jun 19;7:237. 11. Jain N, Umar TP, Fahner AF, Gibietis V. Advancing therapeutics for recurrent clostridioides difficile infections: an overview of vowst’s FDA approval and implications. Gut Microbes. 2023 Dec 31;15(1):2232137. 12. Charbonneau MR, Isabella VM, Li N, Kurtz CB. Developing a new class of engineered live bacterial therapeutics to treat human diseases. Nat Commun. 2020 Apr 8;11(1):1738. 13. Meng J, Liu S, Wu X. Engineered probiotics as live biotherapeutics for diagnosis and treatment of human diseases. Critical Reviews in Microbiology. 2023 Mar 22;1–15. 374 N A P R E D E K IN IZ ZI V I V R A ZV O JU Ž IV Ih B IO TE R A P E V TS K Ih IZ D E LK O V Farm Vestn 2024; 75 14. Grilc NK, Kristl J, Zupančič Š. Can polymeric nanofibers effectively preserve and deliver live therapeutic bacteria? Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2025 Jan;245:114329. 15. Sarao LK, Arora M. Probiotics, prebiotics, and microencapsulation: A review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2017 Jan 22;57(2):344–71. 16. Pot B, Vandenplas Y. Factors that influence clinical efficacy of live biotherapeutic products. Eur J Med Res. 2021 May 4;26(1):40. 17. Heavey MK, Durmusoglu D, Crook N, Anselmo AC. Discovery and delivery strategies for engineered live biotherapeutic products. Trends in Biotechnology. 2022 Mar;40(3):354–69. 18. Chang CJ, Lin TL, Tsai YL, Wu TR, Lai WF, Lu CC, et al. Next generation probiotics in disease amelioration. Journal of Food and Drug Analysis. 2019 Jul;27(3):615–22. 19. Merivaara A, Zini J, Koivunotko E, Valkonen S, Korhonen O, Fernandes FM, et al. Preservation of biomaterials and cells by freeze-drying: Change of paradigm. Journal of Controlled Release. 2021 Aug;336:480–98. 20. Crowe JH, Carpenter JF, Crowe LM. The Role of Vitrification in Anhydrobiosis. Annu Rev Physiol. 1998 Oct;60(1):73–103. 21. Kiepś J, Dembczyński R. Current Trends in the Production of Probiotic Formulations. Foods. 2022 Aug 4;11(15):2330. 22. Broeckx G, Vandenheuvel D, Claes IJJ, Lebeer S, Kiekens F. Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics. International Journal of Pharmaceutics. 2016 May;505(1–2):303–18. 23. Crowe JH, Crowe LM, Chapman D. Preservation of Membranes in Anhydrobiotic Organisms: The Role of Trehalose. Science. 1984;223:701–3. 24. Gomez Zavaglia A, Tymczyszyn E, De Antoni G, Anibal Disalvo E. Action of trehalose on the preservation of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus by heat and osmotic dehydration. J Appl Microbiol. 2003 Dec;95(6):1315–20. 25. Huang S, Vignolles ML, Chen XD, Le Loir Y, Jan G, Schuck P, et al. Spray drying of probiotics and other food-grade bacteria: A review. Trends in Food Science & Technology. 2017 May;63:1–17. 26. Santivarangkna C, Kulozik U, Foerst P. Alternative Drying Processes for the Industrial Preservation of Lactic Acid Starter Cultures. Biotechnol Prog. 2007 Apr 9;23(2):302–15. 27. Shahriar S, Mondal J, Hasan M, Revuri V, Lee D, Lee YK. Electrospinning Nanofibers for Therapeutics Delivery. Nanomaterials. 2019 Apr 3;9(4):532. 28. Santivarangkna C, Kulozik U, Foerst P. Inactivation mechanisms of lactic acid starter cultures preserved by drying processes. Journal of Applied Microbiology. 2008 Jul;105(1):1–13. 29. Tang HW, Abbasiliasi S, Murugan P, Tam YJ, Ng HS, Tan JS. Influence of freeze-drying and spray-drying preservation methods on survivability rate of different types of protectants encapsulated Lactobacillus acidophilus FTDC 3081. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 2020 Sep 1;84(9):1913–20. 30. Zaghari L, Basiri A, Rahimi S. Preparation and characterization of double-coated probiotic bacteria via a fluid-bed process: a case study on Lactobacillus reuteri. International Journal of Food Engineering. 2020 Sep 21;16(9):20190384. 31. Mirtič J, Kogej K, Gašperlin M, Lapanje A, Kristl J. Polielektrolitni kompleksi kot osnova za razvoj novih nanodelcev in nanooblog. Farmacevtski vestnik. 2016;67(4):310–7. 32. Kristl J, Zupančič Š, Mirtič J, Kocbek P. Napredni dostavni sistemi učinkovin za preventivo in zdravljenje parodontalne bolezni. Farmacevtski vestnik. 70(2162–171):2019. 33. Vivek K, Mishra S, Pradhan RC, Nagarajan M, Kumar PK, Singh SS, et al. A comprehensive review on microencapsulation of probiotics: technology, carriers and current trends. Applied Food Research. 2023 Jun;3(1):100248. 34. Li S, Zhang YX. Sensitive delivery systems and novel encapsulation technologies for live biotherapeutic products and probiotics. Critical Reviews in Microbiology. 2024 May 3;50(3):371–84. 35. Żur J, Wojcieszyńska D, Guzik U. Metabolic Responses of Bacterial Cells to Immobilization. Molecules. 2016 Jul 22;21(7):958. 36. Flemming HC, Wingender J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 2010 Sep;8(9):623–33. 37. Mirtič J, Rijavec T, Zupančič Š, Zvonar Pobirk A, Lapanje A, Kristl J. Development of probiotic-loaded microcapsules for local delivery: Physical properties, cell release and growth. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2018 Aug;121:178–87. 38. Gebara C, Chaves KS, Ribeiro MCE, Souza FN, Grosso CRF, Gigante ML. Viability of Lactobacillus acidophilus La5 in pectin– whey protein microparticles during exposure to simulated gastrointestinal conditions. Food Research International. 2013 May;51(2):872–8. 39. Wang M, Wang C, Gao F, Guo M. Effects of polymerised whey protein-based microencapsulation on survivability of Lactobacillus acidophilus LA-5 and physiochemical properties of yoghurt. Journal of Microencapsulation. 2018 Jul 4;35(5):504–12. 40. Cheow WS, Hadinoto K. Biofilm-Like Lactobacillus rhamnosus Probiotics Encapsulated in Alginate and Carrageenan Microcapsules Exhibiting Enhanced Thermotolerance and Freeze- Drying Resistance. Biomacromolecules. 2013 Sep 9;14(9):3214–22. 41. Nezamdoost-Sani N, Amiri S, Mousavi Khaneghah A. The application of the coacervation technique for microencapsulation bioactive ingredients: A critical review. Journal of Agriculture and Food Research. 2024 Dec;18:101431. 42. Zhang S, Guo L, Yang K, Zhang Y, Ye C, Chen S, et al. Induction of Escherichia coli Into a VBNC State by Continuous-Flow UVC and Subsequent Changes in Metabolic Activity at the Single-Cell Level. Front Microbiol. 2018 Sep 25;9:2243. 43. Davis C. Enumeration of probiotic strains: Review of culture- dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria. Journal of Microbiological Methods. 2014 Aug;103:9–17. 44. Amna T, Hassan MS, Pandeya DR, Khil MS, Hwang IH. Classy non-wovens based on animate L. gasseri-inanimate poly(vinyl alcohol): upstream application in food engineering. Appl Microbiol Biotechnol. 2013 May;97(10):4523–31. 45. Zupančič Š, Rijavec T, Lapanje A, Petelin M, Kristl J, Kocbek P. Nanofibers with Incorporated Autochthonous Bacteria as Potential Probiotics for Local Treatment of Periodontal Disease. Biomacromolecules. 2018 Nov 12;19(11):4299–306. 46. Heunis TDJ, Botes M, Dicks LMT. Encapsulation of Lactobacillus plantarum 423 and its Bacteriocin in Nanofibers. Probiotics & Antimicro Prot. 2010 Mar;2(1):46–51. 47. Minooei F, Gilbert NM, Zhang L, Sarah NeCamp M, Mahmoud MY, Kyser AJ, et al. Rapid-dissolving electrospun nanofibers for intra- vaginal antibiotic or probiotic delivery. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2023 Sep;190:81–93. 48. Tong HW, Mutlu BR, Wackett LP, Aksan A. Manufacturing of bioreactive nanofibers for bioremediation. Biotechnol Bioeng. 2014 Aug;111(8):1483–93. 49. Vass P, Pantea E, Domokos A, Hirsch E, Domján J, Németh Á, et al. Electrospun Solid Formulation of Anaerobic Gut Microbiome Bacteria. AAPS PharmSciTech. 2020 Aug;21(6):214. 50. Mahmoud MY, Wesley M, Kyser A, Lewis WG, Lewis AL, Steinbach-Rankins JM, et al. Lactobacillus crispatus-loaded electrospun fibers yield viable and metabolically active bacteria that kill Gardnerella in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 2023 Jun;187:68–75.