32.	Andress D. Nonclassical aspects of differential vitamin D receptor activation. Implications for survival in patients with chronic kidney disease. Drugs 2007; 67: 1999-2012.
33.	Brancaccio D, Cozzolino M, Pasho S, Fallabrino G, Olivi L, Gallieni M. New acqusitions in therapy of secondary hyperparathyroidism in chronic kidney disease and peritoneal dialysis patients: role of vitamin D receptor activators. Contrib Nephrol 2009; 163: 219-26.
34.	Cardus A, Panizo S , Parisi E, Fernandez E, Valdi-vielso JM.Differential effects of vitamin D analogs on vascular calcification. J Bone Miner Res 2007; 22: 860-6.
35.	Mizobuchi M, Finch J, Martin DR, Slatopolsky E. Differential effects of vitamin D receptor activators on vascular calcification on uremic rats. Kidney Int 2007. In press.
36.	Wang TJ, Pencina MJ, Booth SL. Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease. Circulation 2008; 117: 503-11.
37.	Mathieu C, Adorini L. The coming of age of 1,25-dihydroxyvitamin D3 analogs as immunomo-dulatory agents. Trends Mol Med 2002; 8: 174-9.
38.	Eleftheriadis T, Antomiadi G, Liakopoulos V, Kartsios C, Stefanidis I, Galaktidou G. Paricalci-tol reduces basal and lipopolysaccharide-induced (LPS) TNF-a and IL-8 production by peripheral blood mononuclear cells. Int Urol Nephrol 2010; 42: 181-5.
39.	Schwartz GG, Eads D, Naczki C, Northrup S, Chen T, Koumenis C. 19-nor-1a,25-dihydroxyvitamin D2 (Paricalcitol) inhibits the proliferation of human pancreatic cancer cells in vitro and in vivo. Cancer Biology&Therapy 2008; 7: 1-7
40.	Flanagan JN, Zheng S, Chiang KC, Kittaka A, Sitaki K, Nakabayashi S, et al. Evaluation of 19-nor-2alpha-(3-hydroxypropyl)-1alpha,25-dihy-droxyvitamin D3 as a therapeutic agent for andro-gen-dependent prostate cancer. Anticancer Res. 2009 Sep; 29: 3547-53.
41.	Kumagai T, O'Kelly J, Said JW, Koeffler HP. Vitamin D2 analog 19-nor-1,25-dihydroxyvitamin D2: antitumor activity against leukemia, myeloma, and colon cancer cells. J Natl Cancer Inst. 2003;
95: 896-905.
42.	Mizobuchi M, Morrissey J, Finch JL, Martin DR, Liapis H, Akizawa T, et al. Combination therapy with an angiotensin-converting enzyme inhibitor and a vitamin D analog suppresses the progression of renal insufficiency in uremic rats. J Am Soc Nephrol 2007; 18: 1796-806.
43.	Tan X, He W, Liu Y. Combination therapy with paricalcitol and trandolapril reduces renal fibrosis in obstructive nephropathy. Kidney Int 2009; 76:
1248-57.
44.	Freundlich M, Quiroz Y, Zhang Z , Zhang Y, Bravo Y, Wisinger JR, et al. Suppression of renin-angio-tensin gene expression in the kidney by paricalci-tol. Kidney Int 2008; 74: 1394-402.
45.	Doorenbos CRC, van den Born J, Navis G, de Borst MH. Possible renoprotection by vitamin D in chronic renal disease: beyond mineral metabolism. Nat Rev Nephrol 2009; 5: 691-700.
46.	Nishizawa Y, Shoji T. Does paricalcitol reduce proteinuria in patients with chonic kidney disease? Nature Clinical Practice Nephrology 2006; 2:
352-3.
47.	Alborzi P, Patel NA, Peteson C, Bills JE, Bekele DM, Bunaye Z, et al. Paricalcitol reduces albuminria and inflamation in chronic kidney disease. A randomised double-blind pilot trial. Hypertension 2008; 52: 249-55.
48.	Agarwal R, Acharya M, Tian J, Heepensteel RL, Melnick JZ, Qiu P, et al. Antiproteinuic effect of oral paricalcitol in chronic kidney disease. Kidney Int 2005; 68: 2823-8.
49.	deZeeuw D, Agarwal R, Amdahl M, Audhya P, Coyne D, garimella T, et al. The selective vitamin D receptor activator for albuminuria lowering (VITAL) study. Lancet 2010 ; 376: 1543-51.
Od tkivnega inženirstva do regenerativne medicine -
sodoben pristop k rekonstrukciji sečil
From tissue engineering to regenerative medicine -a modern approach to the reconstruction of the urinary tract
Urška Dragin Jerman, Mateja Erdani Kreft
Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biologijo celice, Lipičeva 2, SI-1000 Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
doc. dr. Mateja Erdani Kreft, Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biologijo celice, Lipičeva 2, SI-1000 Ljubljana, Tel.: +386 1 543 76 93, Fax: + 386 1 543 76 81, Email: mateja.erdani@mf.uni-lj.si
Ključne besede:
tkivno inženirstvo, regenerativna medicina, tkivni nosilec, matične celice, sečila
Key words:
tissue engineering, regenerative medicine, supporting matrix (scaffold), stem cells, urinary system
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2012; 81: 735-44
Prispelo: 20. jul. 2011, Sprejeto: 26. mar. 2012
Izvleček
Izhodišča: Tkivno inženirstvo je hitro razvijajoče se interdisciplinarno področje, ki postaja vedno pomembnejši del regenerativne medicine, saj razviti tkivni nadomestki omogočajo obnovitev, vzdrževanje in izboljšanje funkcij poškodovanega ali okvarjenega tkiva. Zaradi številnih bolezni sečil, ki zahtevajo obnovitev ali nadomestitev tkiva ali organa, se tehnike tkivnega inže-nirstva vedno bolj uveljavljajo tudi v regenerativ-ni medicini sečil.
Zaključki: Študije na živalskih modelih kot tudi klinične študije dokazujejo, da je s tkivnim inže-nirstvom mogoče vzpostaviti funkcionalna tkiva, primerna za uspešno rekonstrukcijo tkiv in organov sečil. To delo podaja pregled najnovejših spoznanj o uporabi, uspešnosti in omejitvah različnih tehnik tkivnega inženirstva pri rekonstrukciji sečnice, sečnega mehurja, sečevodov in ledvic.
Abstract
Background: Tissue engineering is a rapidly developing interdisciplinary field, which is becoming an increasingly important part of regenerative medicine. The tissue-engineered substitutes enable the restoration, maintenance and improvement of the functions of damaged or defective tissue. Given the number of urinary tract diseases, which require repair or replacement of the tissue or organ, the techniques of tissue engineering are also gaining importance in regenerative medicine of the urinary tract.
Conclusions: A number of animal studies and several clinical studies have shown that it is possible to reconstruct urinary tract tissues and organs using tissue engineering. This review provides a detailed survey of the latest knowledge on the use, efi'ectiveness and limitations of various tissue engineering techniques for reconstruction of the urethra, urinary bladder, ureters and kidneys.
Uvod
Tkivno inženirstvo je hitro razvijajoče se interdisciplinarno področje, ki uporablja načela bioloških in inženirskih znanosti za razvoj živih tkivnih ali organskih nadomestkov. Postaja vedno pomembnejši del rege-nerativne medicine, saj terapevtski izdelki tkivnega inženirstva omogočajo obnovitev, vzdrževanje in izboljšanje funkcij poškodovanega ali okvarjenega tkiva.
Poznamo tri različne pristope tkivnega inženirstva: (1) vsaditev (implantacija) funkcionalnih celic, med drugim tudi matičnih celic, v poškodovano ali okvarjeno tkivo; (2) uporabo različnih sintetičnih materialov ali materialov naravnega izvora, ki pomagajo
pri ponovnem oblikovanju poškodovanega ali okvarjenega tkiva ter (3) uporabo ustreznih nosilcev z nasajenimi tkivno specifičnimi celicami, ki spodbujajo rast in oblikovanje novega tkiva.^'^ V vseh treh pristopih tkivnega inženirstva je ključnega pomena nizka imunogenost vsadka, njegova tkivna skladnost z organizmom ter funkcionalna vključitev v celoto organa.^
Tkivni nosilci v tkivnem inženirstvu sečil
Tkivni nosilci so zasnovani tako, da s posnemanjem zgradbe in delovanja zunajce-ličnega matriksa omogočajo pritrjanje, rast
Slika i: Rekonstrukcija humane sečnice. (A) Rentgenska sLika boLnika z zožitvijo sečnice. (B) 6 mesecev po rekonstrukciji sečnice. Zožen del sečnice so odstranili in ga nadomestili z brezcelično submukozo sečnega mehurja. (C) Pregled sečnice s cistoskopom - Levo pred operacijo in desno 4 mesece po rekonstrukciji.23
in diferenciacijo tkivno specifičnih celic ter obenem predstavljajo oporo pri oblikovanju novo nastajajočega tkiva. Gradijo jih biološko skladni in razgradljivi materiali, t. i. biomateriali, ki so za rast in diferenciacijo tkivno specifičnih celic ključnega pomena.
V tkivnem inženirstvu sečil se za tkivne nosilce uporabljajo: (1) materiali naravnega izvora, kot so kolagen, alginat ali amnijska membrana;3 (2) brezcelična tkiva - submu-koza tankega črevesa (SIS) in submukoza sečnega mehurja ter (3) sintetični polime-
ri, med katere spadajo poliglikolna kislina (PGA), polimlečna kislina (PLA) ter kopo-limer mlečne in glikolne kisline (PLGA).!'^
Ožiljenje in oživčenje s tkivnim inženirstvom vzpostavljenega tkiva ali organa
Izmenjava hranil in kisika z difuzijo je v organizmu mogoča le pri vsadkih prostornine do 3 mm3,5 zato je pri oblikovanju kompleksnejših tkiv in organov ožiljenje tkiva ključnega pomena. Za spodbujanje žiljenja tkivnih nadomestkov se uporabljajo različni pristopi: (1) dodajanje faktorjev angioge-neze, kot sta bazični fibroblastni rastni faktor (bFGF), in žilni endotelni rastni faktor (VEGF), ki pospešita nastajanje kapilar,®'^ (2) gojenje celic v ko-kulturi z endotelnimi celicami^ ter (3) ovitje vsadka v omentum.^'^'® Omentum je del trebušne mrene in je bogato ožiljen. Ob ovitju vsadka v omentum se kapilare iz omentuma razvejajo po vsadku, kar vodi do vzpostavitve ožiljenega tkiva.
Poleg ožiljenja je za normalno delovanje organa nujno tudi njegovo oživčenje. Oberpenning in sodelavci^^ so pri psih dokazali rast živčevja na periferiji v organizem vsajenih s tkivnim inženirstvom vzgojenih sečnih mehurjev, t. i. neosečnih mehurjev. Kljub temu pa je pot do vzpostavitve funkcionalnega senzorično-motoričnega sistema organov, oblikovanih s tkivnim inženirstvom, najverjetneje še dolga. Bolniki z vstavljenim neosečnim mehurjem so zaenkrat praznjenje mehurja prisiljeni nadzorovati s časovno določenim uriniranjem ali samokatetriza-cijo, obetavna pa postaja možnost kontrole uriniranja s pomočjo mikroelektronskih na-prav.i3
Tkivno inženirstvo specifičnih tkiv in organov sečil
Urotelij
Primarna naloga urotelija, t.j. epitela, ki prekriva proksimalno sečnico, sečni mehur, sečevod in ledvični meh,i4 je zagotavljanje krvno-urinske pregrade. Ob poškodbah ali okvarah urotelija je krvno-urinska pregrada
Slika 2: CistopLastika podganjega sečnega mehurja z uporabo humane amnijske membrane. (A) Amnijska membrana.
(B)	Avgmentacija sečnega mehurja z amnijsko membrano.
(C)	Rekonstruiran sečni mehur 6 mesecev po operaciji. Puščice kažejo mesta stikov amnijske membrane s tkivom nativnega sečnega mehurja.45
porušena, kar vodi do nekontroliranega prehajanja vode, ionov in strupenih presnovkov iz urina v spodaj ležeče vezivno tkivo in kr-vožilje.i5
Za uspešnejšo rekonstrukcijo uroteli-ja je zaželena vsaditev že diferenciranega urotelija, saj visoko diferencirane površinske urotelij ske celice zagotavljajo takojšnjo vzpostavitev funkcionalne krvno-urinske pregrade.13'16 V izogib zavrnitvenim reakcijam je za oblikovanje urotelija najprimernejša uporaba avtolognih urotelijskih celic. Humane urotelijske celice lahko pridobimo z biopsijo urotelija (običajno iz sečevoda ali sečnega mehurja) ^^ ali iz izpirkov sečnega mehurja.i7
Urotelij, vzgojen in vitro, so uspešno uporabili za rekonstrukcijo humane sečni-ce,i8 humanega sečnega mehurja^ in prašičjih sečevodov.10
Sečnica
Za rekonstrukcijo humane sečnice se uporabljajo naslednji biomateriali: ustna sluznica,i9 koža,^" sluznica sečnega mehur-ja,2i amnijska membrana^^ ter brezcelična submukoza sečnega mehurja^^'^^ (Slika 1) in tankega črevesa^^ (slednji sta v literaturi pogosto navedeni kot kolagenski nosilec). Ustreznost brezcelične submukoze sečnega mehurja so dokazali El-Kassaby in sodelav-ci,24 ki so z 8o-odstotno uspešnostjo rekonstruirali humano sečnico, okvarjeno zaradi obsežnih zožitev. Nasprotno rekonstrukcija sečnice z submukozo tankega črevesa ni bila vedno uspešna, saj Houser in sodelavci^^ pri štirih od petih zdravljenih bolnikov opisujejo ponovno zoženje sečnice eno leto po operaciji.
Vedno bolj se uveljavlja tudi pristop rekonstrukcije sečnice s tkivnimi nosilci z in
vitro nasajenimi celicami. De Filippo in so-delavci^® so s pomočjo cevastih nosilcev iz submukoze sečnega mehurja z nasajenimi avtolognimi gladkomišičnimi in urotelij-skimi celicami uspešno rekonstruirali zajčjo proksimalno sečnico. V podobno zasnovani študiji so za vzpostavitev tkiva sečnice uporabili matične celice, ki so jih osamili iz urina.27 Dokazali so, da se matične celice, pridobljene iz urina, diferencirajo v gladko-mišične in urotelijske celice ter nasajene na tridimenzijske nosilce iz brezcelične submu-koze tankega črevesa po vsaditvi v telo miši tvorijo gladkomišično in epitelno tkivo.
Nedavno so avtologne gladkomišične in urotelijske celice nasadili tudi na ceva-sto oblikovane biološko razgradljive nosilce PGA ter z vnosom vzpostavljenih konstruk-tov uspešno rekonstruirali okvarjeno človeško sečnico.18 Po 3 mesecih so vsadki tvorili funkcionalno proksimalno sečnico.
Sfinkter sečnice
Urinska inkontinenca je pogost zdravstveni problem, saj prizadene več kot 30 "/o ženske in 15 % moške svetovne populacije.^® Zdravljenje obsega kirurške postopke, fizio-terapijo in uporabo različnih zdravil, vedno pogosteje pa se uporabljajo tudi tehnike tkivnega inženirstva.^® Ena takih je uporaba sredstev za povečanje volumna tkiva, kot so teflon, goveji kolagen ter silikonski delčki, ki se vsadijo v prizadeto območje.^" Kljub sicer obetavnim preliminarnim študijam pa imajo vsajena sredstva kratkotrajni učinek in lahko zaradi tkivne neskladnosti z organizmom povzročijo vnetni odziv in številne z njim povezane zaplete.^^
V zadnjem času se je kot uspešno izkazalo zdravljenje urinske inkotinence z avtolo-gnimi matičnimi celicami (op. a. mioblasti),
Slika 3: Rekonstrukcija prašičjega sečnega mehurja s sestavljeno cistopLastiko (A) in uporabo tkivnega nosilca iz brezceLične submukoze tankega črevesa z nasajenimi urotelijskimi in gladkomišičnimi celicami (B-E). (A) Shema konstrukta deepitelizirane črevesne stene in večskladnega urotelija, nameščenega na silikonski balon, obdan z mrežo iz PGA.^^ (B-C) Pritrjanje tkivnega nosilca iz submukoze tankega črevesa z nasajenimi urotelijskimi in gladkomišičnimi celicami (d) na silikonski balon (*) ter (D) ovitje konstrukta v omentum prašiča (►). (E) Sečni mehur po 3 tednih razvoja v omentumu.®
pridobljenimi z biopsijo prečno-progaste mišice.28'32 Vsaditev avtolognih mioblastov v poškodovan podganji sfinkter sečnice na mestu aplikacije sproži nastanek številnih mišičnih vlaken in s tem uspešno regeneracijo tkiva.^^ Strasser in sodelavci^^ so prvi zdravljenje z vsaditvijo matičnih celic preizkusili tudi na človeku. Bolnikom s stresno urinsko inkontinenco so v submukozo sečnice vnesli fibroblaste, primešane v kolagenski gel, ter nato v sfinkter sečnice vsadili še mioblaste. Izboljšanje stanja so ugotovili pri vseh zdravljenih bolnikih. Zdravljenje so nato uspešno ponovili še na večjem številu bolnikov ter obenem dokazali dolgoročno delovanje rekonstruiranega tkiva.^^ Uspešne rezultate so dosegli tudi Mitterberger in so-
delavci,36 ki so z vsaditvijo avtolognih mioblastov pri 79 % zdravljenih bolnic ugotovili vzpostavitev normalnega stanja, ter Carr in sodelavci,37 ki so izboljšanje opazili v 50 % zdravljenih bolnic.
Čeprav dosedanje klinične izkušnje kažejo na učinkovito zdravljenje urinske in-kontinence z vsaditvijo matičnih celic, pa so potrebna dodatna spoznanja o njeni dolgoročni varnosti.
Sečni mehur
Navadno se pri operacijskih posegih prirojenih okvar ali hujših poškodb sečnega mehurja, ki zahtevajo razširitev ali celo nadomestitev organa, izvaja enterocistoplasti-
Slika 4: Vzpostavitev s tkivnim inženirstvom vzgojenega človeškega sečnega mehurja. (A) Tkivni nosilec v obliki sečnega mehurja z nasajenimi urotelijskimi in gladkomišičnimi celicami. (B) Konstrukt in vitro vzpostavljenega sečnega mehurja, spojen z nativnim sečnim mehurjem. (C) Vsajen sečni mehur, prekrit s fibrinskim lepilom in omentumom. (D-E) Cistogram sečnega mehurja pred (D) in 10 mesecev po rekonstrukciji (E)."
Slika 5: Vzpostavitev prašičjega sečevoda, t. i. neosečevoda v »bioreaktorju iz omentuma«. (A) in vitro vzpostavljen konstrukt brezcelične submukoze tankega črevesa z nasajenimi urotelijskimi in gladkomišičnimi celicami, oblikovan okrog drenažne cevke ter ovit v omentum. (B) Neosečevod po 3 tednih razvoja v omentumu. (C) Prečni prerez neosečevoda po 3 tednih razvoja v omentumu. (D) Barvanje s Hematoksilin-eozinom potrjuje razvoj večskladnega urotelija. Vnetni odgovor ni prisoten. (E) Urotelij leži nad gladko mišičnino (rjavo obarvanje). imunsko označevanje dokazuje prisotnost diferenciranega urotelija, saj je CK7 (citokeratin 7, rjavo obarvanje) prisoten v vseh celičnih skladih urotelija (F), CK20 (rjavo obarvanje) pa le v dobro diferenciranih površinskih urotelijskih celicah (G).i°
ka, pri kateri se kot nadomestno tkivo uporablja segment tankega črevesa.^ Ker pa sta funkciji črevesnega epitela in urotelija popolnoma različni, lahko pride ob presaditvi do številnih zapletov, kot so vnetje, motnje v presnovi, povečana tvorba mukusa, sečni kamni ter rak.^®
Da bi se izognili zapletom enterocisto-plastike ter obenem dosegli učinkovito rekonstrukcijo poškodovanega tkiva, se preizkušajo različni sintetični materiali, kot sta na primer tetrafloroetilen^® in silikon,^" vendar so ti zaradi tkivne neskladnosti pogosto neprimerni. Sečni mehur je bil na živalskih modelih uspešno rekonstruiran šele z uporabo brezcelične submukoze tankega čreve-sa4i'42 ter sečnega mehurja,^^'^^ kot primerna pa se je izkazala tudi uporaba humane amnijske membrane (Slika 2).45
Rekonstrukcija sečnega mehurja je še uspešnejša, če v organizem vnesemo nosilce z nasajenimi avtolognimi gladkomišičnimi in urotelijskimi celicami.^'^^'^^ Turner in so-delavci47 so na prašičjem modelu izvedli t. i. sestavljeno cistoplastiko, ki predstavlja nov pristop k rekonstrukciji sečnega mehurja. Da bi obšli zahtevno vzpostavitev celotne stene sečnega mehurja, so oblikovali sečni mehur, sestavljen iz gladke mišičnine ter in vitro vzgojenega večskladnega urotelija. Ugotovili so, da urotelijske celice v primeru povečanja sečnega mehurja, t. i. avgmenta-cije s sestavljeno cistoplastiko, popolnoma prekrijejo gladko mišičnino ter tvorijo učinkovito krvno-urinsko pregrado (Slika 3A). Poleg vzpostavitve gladkomišičnega sloja in funkcionalnega večskladnega urotelija, sta za normalno delovanje sečnega mehurja potrebni tudi dobra ožiljenost in oživčenost
Slika 6: S tkivnim inženirstvom vzpostavljena funkcionalna ledvična enota. (A) Shema ledvične enote. (B) 3 mesece po vnosu v organizem ledvične enote z nasajenimi ledvičnimi epitelnimi celicami, pridobljenimi s pomočjo terapevtskega kloniranja, tvorijo tekočino, podobno sekundarnemu urinu.^^
Rezervoar \z polietilena (3.5 x 3.5 cm)
LedviCne enote (3 cm)
Sii;asti£nl kateter
Rolika rbonatnar] membrana Kolagenska prevleka
tkiva. Baumert in sodelavci® so v ta namen model prašičjega sečnega mehurja ovili v omentum prašiča (Slika 3B-E). Tri tedne po vsaditvi v organizem so opazili gosto ožilje-nost tkiva, steno mehurja pa sta tvorila diferencirani večskladen urotelij in gladka mi-šičnina s celicami, ki so reagirale na živčni prenašalec acetilholin.
O prednostih ovitja v omentum poročajo tudi Atala in sodelavci," ki so izvedli prvi klinični preizkus uporabnosti s tkivnim inženirstvom vzpostavljenih sečnih mehurjev. Avtologne gladkomišične in urotelijske celice so nasadili na biološko razgradljive nosilce v obliki sečnega mehurja. Uporabili so kolagenske nosilce ter kombinirane nosilce, sestavljene iz kolagena in PGA. Po 7- do 8-tedenski inkubaciji in vitro so kon-strukte, same ali ovite v omentum, vsadili v organizem. Pri bolnikih, ki so jim vsadili v omentum ovit sečni mehur, vzpostavljen na nosilcih iz kolagena in PGA, so opazili povečanje razteznosti ter prostornine mehurja ter opazno izboljšanje kontinence (Slika 4). Uspešno vzpostavitev stene sečnega mehurja so potrdili tudi s histološkimi in imunoci-tokemičnimi analizami. Kljub spodbudnim preliminarnim rezultatom opozarjajo, da raziskava predstavlja le prvi korak do vzpostavitve funkcionalnega organa in bodo dejansko klinično uporabnost pokazale šele študije dolgotrajnega obnašanja vsadka.
Sečevod
Večina poskusov rekonstrukcije sečevodov s pomočjo tkivnega inženir stva je bila zaenkrat izvedena na živalskih modelih. Ko-ziak in sodelavci^® so med prvimi poskušali



v ^ \ >
rekonstruirati sečevod človeka. Z uporabo humane amnijske membrane so desetim od enajstih bolnikov uspešno rekonstruirali zožitve sečevodov. Pri psih so zožitve sečevodov zdravili z uporabo brezcelične sub-mukoze sečevoda.^® Zdravljenje je bilo neuspešno, saj je ob vsaditvi v organizem prišlo do skrčenja submukoze sečevoda in s tem do zožitve cevi vsadka.
Da bi povečali možnost vzpostavitve funkcionalnega tkiva, so preizkusili tudi nosilce z že nasajenimi celicami. Baumert in sodelavci^" so pri prašičih uspešno vzpostavili model sečevoda. Na brezcelični nosilec iz submukoze tankega črevesa so nasadili gladkomišične in urotelijske celice ter konstrukt z nasajenimi celicami prenesli v omentum prašiča (Slika 5). Ovoj v omentum je pospešil ožiljenost tkiva in tako bistveno prispeval k vzpostavitvi sečevoda z razvitim mišičnim tkivom in visoko diferenciranim urotelijem. V podobni študiji so poleg urote-lijskih celic na brezcelični nosilec iz submu-koze sečevoda nasadili tudi celice kostnega mozga. Ugotovili so, da slednje spodbujajo žiljenje tkiva in s tem prispevajo k uspešnejši regeneraciji tkiva.^"
Ledvice
Celovita rekonstrukcija ledvic zagotovo predstavlja največji izziv regenerativne medicine sečil. Uveljavljata se dva koncepta vzpostavitve umetnih ledvic. Prvi zajema uporabo zunaj telesnih naprav, ki delujejo po načelu hemodialize, v primeru drugega pa poskušajo vlogo ledvic nadomestiti z vnosom in vitro vzpostavljenih ledvičnih struktur.1
Humes in sodelavci^^ so razvili zunajte-lesno napravo, ki poleg hemodializnega mehanizma vsebuje tudi sistem z nasajenimi ledvičnimi epitelnimi celicami in tako učinkoviteje posnema delovanje ledvic. Napravo so preizkusili na psih z akutno uremijo. S
pomočjo kombiniranega sistema so uspešno nadomestili filtracijo krvi ter presnovno in hormonsko delovanje ledvic. Podobno zasnovano napravo so preizkusili tudi na bolnikih z akutno odpovedjo ledvic v kritičnem stanju.52 Kljub optimističnim rezultatom
Tabela 1: Pregled pomembnejših aplikacij tkivnega inženirstva v regenerativni medicini sečil. Študije, narejene na človeku, so poudarjene.
Referenca	Pristop	Tkivni nosilec/celice	Uporabljeno na:	Organ	Uspešnost rekonstrukcije organa (+/-)
Koziak in sod., 2004 [22]	uporaba tkivnega nosilca	amnijska membrana	človek	sečnica	+
Wu in sod., 2011 [27]	uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami/ uporaba matičnih celic	3D nosilci iz submukoze tankega črevesa/ matične celice izolirane iz urina	miš	proksimalna sečnica	+
Raya-Rivera in sod., 2011 [18]	uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami	biorazgradljivi nosilci iz poliglikolne kisline / avtologne mišične in urotelijske celice	človek	proksimalna sečnica	+
Carr in sod., 2008 [37]	vbrizganje matičnih celic	mioblasti	človek	sfinkter sečnice	+
lijima in sod., 2007 [45]	uporaba tkivnega nosilca	amnijska membrana	podgana	sečni mehur	+
Turner in sod., 2010 [47]	uporaba tkivnega nosilca ter in vitro vzgojenega urotelija (sestavljena cistoplastika)	deepitelizirana črevesna stena/ avtologne urotelijske celice	prašič	sečni mehur	+
Baumert in sod., 2007 [9]	uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami, ovitega v omentum	submukoza tankega črevesa / avtologne mišične in urotelijske celice	prašič	sečni mehur	+
Atala in sod., 2006 [11]	uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami, ovitega v omentum	biorazgradljivi nosilci iz poliglikolne kisline / avtologne mišične in urotelijske celice	človek	sečni mehur	+
Koziak in sod., 2007 [48]	uporaba tkivnega nosilca	amnijska membrana	človek	sečevod	+
Baumert in sod., 2007 [10]	uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami, ovitega v omentum	submukoza tankega črevesa / avtologne mišične in urotelijske celice	prašič	sečevod	+
Humes in sod., 2003 [52]	uporaba zunajtelesne hemodializne naprave s sistemom z nasajenimi celicami	celice ledvične cevke nefrona	človek	ledvice -	
Lanza in sod., 2002 [53]	terapevtsko kloniranje in uporaba tkivnega nosilca z nasajenimi celicami	nosilec iz polikarbonatne membrane / metanefrične predniške celice	miš	ledvice	+
Ross in sod., 2009 [54]	uporaba tkivnega nosilca / uporaba matičnih celic	decelualrizirana ledvica / embrionalne matične celice	podgana	ledvice	+
na živalskih modelih pa odziv zdravljenih bolnikov ni bil enoten. Za popolno razumevanje delovanja sistema ter varno klinično uporabo so zato nujne nadaljnje predklinič-ne raziskave.52
Kompleksnejši pristop izboljšanja delovanja ledvic vključuje prenos in vitro oblikovanih tkiv v organizem. Lanza in sodelavci^^ so si za vzpostavitev funkcionalnega, bio-kompatibilnega ledvičnega tkiva pomagali s terapevtskim kloniranjem. Iz zgodnjega govejega zarodka so osamili metanefrične predniške celice ter jih nasadili na cevasto oblikovane sintetične nosilce, povezane z zbiralnikom izcedne tekočine. Konstrukte so zatem prenesli v telo živali, ki je darovala jedro za zarodek. Med in vivo inkubacijo so celice oblikovale visoko organizirane cevaste ter ledvičnim telescem podobne strukture, tekočina, zbrana v zbiralniku, pa je bila po sestavi podobna sekundarnemu urinu (Slika 6). Na podlagi rezultatov sklepajo, da ima vzpostavljeni konstrukt sposobnost filtracije, reabsorpcije ter izločanja snovi.^^
Nekoliko drugačen pristop so izbrali Ross in sodelavci,^^ ki so decelularizirali podganjo ledvico in na brezcelični zunajce-lični matriks nasadili embrionalne matične celice. Uspešno rast in tkivno specifično diferenciacijo celic so dokazali s histološkimi in imunocitokemičnimi analizami.
Različni modeli umetnih ledvic dokazujejo, da je s tkivnim inženirstvom mogoče vzpostaviti funkcionalno ledvično tkivo. Želja za prihodnost pa je vzpostavitev celostne strukture tega kompleksnega organa.
Zaključki
Tkivno inženirstvo postaja vedno pomembnejši del regenerativne medicine. Študije na živalskih modelih kot tudi klinične študije dokazujejo, da tehnike tkivnega in-ženirstva omogočajo vzpostavitev funkcionalnega tkiva, primernega za uspešno rekonstrukcijo tkiv in organov sečil (Tabela 1). Kljub obetavnim rezultatom pa se je potrebno zavedati, da bodo za uspešno in predvsem varno uporabo tkivnega inženirstva v regenerativni medicini sečil nujne nadaljnje raziskave razvoja novih biomaterialov in ustreznih celičnih virov kot tudi razumevanje razvojne biologije ter mehanizmov regeneracije tkiv in organov.
Literatura
1.	Atala A. Regenerative medicine and tissue engineering in urology. Urol Clin N Am 2009; 36: 199-209.
2.	Feil G, Daum L, Amend B, Maurer S, Renninger M, Vaegier M, et al. From tissue engineering to regenerative medicine in urology-the potential and the pitfalls. Adv Drug Deliv Rev. 2011; 63: 375-8.
3.	Kreft ME, Dragin U. Amnijska membrana v tkivnem inženirstvu in regenerativni medicini. Zdrav Vest 2010; 79: 707-15.
4.	Kim BS, Baez CE, Atala A. Biomaterials for tissue engineering. Word J Urol 2000; 18: 2-9.
5.	Folkman J, Hochberg M. Self - regulation of growth in three dimensions. J Exp Med 1973; 138:
745-53.
6.	Guan Y, Ou L, Hu G, Wang H, Xu Y, Chen J, et al. Tissue engineering of urethra using human vascular endothelial growth factor gene-modified bladder urothelial cells. Artif Organs 2008; 32: 91-9.
7.	Soker S, Machado M, Atala A. Systems for therapeutic angiogenesis in tissue engineering. World J Urol 2000; 18: 10-8.
8.	Schultheiss D, Gabouev AI, Cebotari S, Tudorache I, Walles T, Schlote N, et al. Biological vasculari-zed matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J Urol 2005; 173: 276-80.
9.	Baumert H, Simon P, Hekmati M, Fromont G, Levy M, Balaton A, et al. Development of a seeded scaffold in the great omentum: Feasibility of an in vivo bioreactor for bladder tissue engineering. Eur Urol 2007; 52: 884-90.
10.	Baumert H, Mansouri D, Fromont G, Hekmati M, Simon P, Massoud W,et al. Terminal urothelium differentiation of engineered neoureter after in vivo maturation in the »omental bioreactor«. Eur Urol 2007; 52: 1492-8.
11.	Atala A, Bauer SB, Soker S, Yoo JJ, Retik AB. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet 2006; 367: 1241-6.
12.	Oberpenning F, Meng J, Yoo J, Atala A. De novo reconstruction of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nat Biotechnol
1999; 17: 149-55.
13.	Wood D, Southgate J. Current status of tissue engineering in urology. Curr Opin Urol 2008; 18:
564-9.
14.	Romih R, Korosec P, de Mello Jr W, Jezernik K. Differentiation of epithelial cells in the urinary tract. Cell Tissue Res 2005; 320: 259-268.
15.	Kreft ME, Jezernik K, Kreft M, Romih R. Apical plasma membrane traffic in superficial cells of bladder urothelium. Ann NY Acad Sci 2009; 1152: 18-29.
16.	Višnjar T, Kocbek P, Kreft ME. Hyperplasia as a mechanism for rapid resealing urothelial injuries and maintaining high transepithelial resistance. Histochem Cell Biol 2012; 137: 177-86.
17.	Nagele U, Maurer S, Feü G, Bock C, Krug J, Sievert KD,e tal. In vitro investigations of tissue-engineered multilayered urothelium established from bladder washings. Eur Urol 2008; 54: 1414-22.
18.	Raya-Rivera A, Esquüiano DR, Yoo JJ, Lopez--Bayghen E, Soker S, Atala A. Tissue-engineered
autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet 2011; 377: 1175-82.
19.	Mungadi IA, Ugboko VI. Oral mucosa graft for urethral reconstruction. Ann Afr Med 2009; 8:
203-9.
20.	Dalpiaz O, Kerschbaumer A, Pelzer A, Radmayr C, Gozzi C, Horninger W, et al. Single-stage dorsal inlay split-skin graft for salvage anterior urethral reconstruction. BJU Int 2008; 101: 1565-70.
21.	Ozgök Y, Ozgür Tan M, Kücüer M, Tahmaz L, Erduran D. Use of bladder mucosal graft for urethral reconstruction. Int J Urol 2000; 7: 355-60.
22.	Koziak A, Marcheluk A, Dmowski T, Szczesni-ewski R, Kania P, Dorobek A. Reconstructive surgery of male urethra using human amnion membranes (grafts)-first announcement. Ann Transplant 2004; 9: 21-4.
23.	Atala A, Guzman L, Retik AB. A novel inert collagen matrix for hypospadias repair. J Urol 1999; 162: 1148-51.
24.	El-Kassaby A, AbouShwareb T, Atala A. Randomized comparative study between buccal mucosa and bladder matrix grafts in patients with complex urethral strictures. J Urol 2008; 179: 1432-6.
25.	Hauser S, Bastian PJ, Fechner G, Müller SC. Small intestine submucosa in urethral stricture repair in consecutive series. Urology 2006; 68: 263-6.
26.	De Filippo RE, Yoo JJ, Atala A. Urethral replacement using cell seeded tubularized collagen matrices. J Urol 2002; 168: 1789-92.
27.	Wu S, Liu Y, Bharadwaj S, Atala A, Zhang Y. Human urine-derived stem cells seeded in a modified 3D porous small intestinal submucosa scaffold for urethral tissue engineering. Biomaterials 2011; 32: 1317-26.
28.	Mitterberger M, Pinggera GM, Marksteiner R, Margreiter E, Plattner R, Klima G, Strasser H. Functional and histological changes after myo-blast injections in the porcine rhabdosphincter. Eur Urol 2007; 52: 1736-43.
29.	Lukanovic A. Zdravljenje stresne urinske inkon-tinence z matičnimi celicami-vizija prihodnosti? Zdrav Vest 2009; 78: 1423-5.
30.	Pannek J, Brands FH, Senge T. Particle migration after transurethral injection of carbon coated beads for stress urinary incontinence. J Urol 2001; 166: 1350-3.
31.	Kiilholma PJ, Chancellor MB, Makinen J, Hirsch IH, Klemi PJ. Complications of teflon injection for stress urinary incontinence. Neurourol Urodyn
1993; 12: 131-7.
32.	Blagajne M, Lukanovic A. Intrasphincteric autologous myoblast injections with electrical stimulation for stress urinary incontinence. Int J Gynaecol Obstet 2012. In press.
33.	Cannon TW, Lee JY, Somogyi G, Pruchnic R, Smith CP, Huard J, et al. Improved sphincter contractility after allogenic muscle-derived progenitor cell injection into the denervated rat urethra. Urology 2003; 62: 958-63.
34.	Strasser H, Marksteiner R, Margreiter E, Mitter-berger M, Pinggera GM, Frauscher F et al. Transu-rethral ultrasonography-guided injection of adult autologous stem cells versus transurethral endoscopy injection of collagen in treatment of urinary incontinence. World J Urol 2007; 25: 385-92.
35.	Strasser H, Marksteiner R, Margreiter E, Mitter-berger M, Pinggera M, Frauscher F, et al. Transurethral ultrasound guided stem cell therapy of urinary incontinence. J Urol 2006; 175: 219.
36.	Mitterberger M, Marksteiner R, Margreiter E, Pin-ggera GM, Frauscher F, Ulmer H, et al. Myoblast and fibroblast therapy for post-prostatectomy urinary incontinence: 1-year follow-up of 63 patients. J Urol 2008; 179: 226-31.
37.	Carr LK, Steele D, Steele S, Wagner D, Pruchnic R, Jankowski R, et al. 1-year follow up of autologous muscle -derived stem cell injection pilot study to treat stress urinary incontinence. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct 2008; 19: 881-3.
38.	McDougal WS. Metabolic complications of urinary intestinal diversion. J Urol 1992; 147: 1199-208.
39.	Bono AV, De Gresti A. Partial substitution of urinary bladder with Teflon prosthesis. Minerva Urol 1966; 18: 43-7.
40.	Rohrmann D, Albrecht D, Hannappel J, Gerlach R, Schwarzkopp G, Lutzeyer W. Alloplastic replacement of the urinary bladder. J Urol 1996; 156:
2094-7.
41.	Kropp BP, Rippy MK, Badylak SF, Adams MC, Keating MA, Rink RC, et al. Regenerative urinary bladder augumentation using small intestine submucosa. Urodynamic and histopathologic assessment in log-term canine bladder augumenta-tions. J Urol 1996; 155: 2098-104.
42.	Ayyildiz A, Akgül T, Huri E, Nuhoglu B, Kili^oglu B, Ustün H, et al. Use of porcine small intestinal submucosa in bladder augmentation in rabbit: long-term histological outcome. ANZ J Surg 2008; 78: 82-6.
43.	Piechota HJ, Dahms SE, Nunes LS, Dahiya R, Lue TF, Tanagho EA. In vitro functional properties of the rat bladder regenerated by the bladder acellu-lar matrix graft. J Urol 1998; 159: 1717-24.
44.	Probst M, Piechota HJ, Dahiya R, Tanagho EA: Homologous bladder augmentation in dog with the bladder acellular matrix graft. BJU Int 2000;
85: 362-71.
45.	lijima K, Igawa Y, Imamura T, Moriizumi T, Ni-kaido T, Konishi I, et al. Transplantation of preserved human amniotic membrane for bladder augmentation in rats. Tissue Eng 2007; 13: 513-24.
46.	Zhang Y, Kropp BP, Lin HK, Cowan R, Cheng Y. Bladder regeneration with cell-seeded small intestinal submucosa. Tissue Eng 2004; 10: 181-7.
47.	Turner A, Subramanian R, Thomas DF, Hinley J, Abbas SK, Stahlschmidt J, et al. Transplantation of autologous differentiated urothelium in an experimental model of composite cystoplasty. Eur Urol
2011; 59: 447-54.
48.	Koziak A, Salagierski M, Marcheluk A, Szczesni-ewski R, Sosnowski M. Early experience in reconstruction of long ureteral strictures with allogenic amniotic membrane. Int J Urol 2007; 14: 607-10.
49.	Osman Y, Shokeir A, Gabr M, El-Tabey N, Mo-hsen T, El-Baz M. Canine ureteral replacement with long acellular matrix tube: is it clinically applicable? J Urol 2004; 172: 1151-4.
50.	Matsunuma H, Kagami H, Narita Y, Hata K, Ono Y, Ohshima S, Ueda M. Constructing a tissue -engineered ureter using a decelullarized matrix with cultured uroepithelial cells and bone marrow derived mononuclear cells. Tissue Eng 2006; 12: 509-18.
51.	Humes HD, Buffington DA, MacKay SM, Funke AJ, Weitzel WF. Replacement of renal function in uremic animals with a tissue-engineered kidney. Nat Biotechnol 1999; 17: 451-5.
52.	Humes HD, Weitzel WF, Bartlett RH, Swaniker FC, Paganini EP. Renal cell therapy is associated with dynamic and individualized responses in patients with acute renal failure. Blood Purif 2003; 21: 64-71.
53.	Lanza RP, Chung HY, Yoo JJ, Wettstein PJ, Blackwell C, Borson N, et al. Generation of histo-compatible tissues using nuclear transplantation. Nat Biotechnol 2002; 20: 689-96.
54.	Ross EA, Williams MJ, Hamazaki T, Terada N, Clapp WL, Adin C, et al. Embryonic stem cells proliferate and differentiate when seeded onto kidney scaffolds. J Am Soc Nephrol 2009; 20:
2338-47.
Sladkorna bolezen in nosečnost
diabetes in pregnancy
Simona kovačec, Mitja krajnc, Miro GokoLič, andrej Zavratnik
UKC Maribor, Klinika za interno medicino, Oddelek za endokrinologijo in diabetologijo, Ljubljanska 5, 2000 Maribor
Korespondenca/ Correspondence:
asist. dr. andrej Zavratnik, dr. med., Oddelek za diabetologijo in endokrinologijo, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor, Slovenija TeL.: +386-2-321-23-36; Fax +386-2-331-23-93; e-maiL naslov: Andrej. Zavratnik@ukc-mb.si
Ključne besede:
hipergLikemija v nosečnosti, nosečnostna sladkorna bolezen, diabetična embriopatija, diabetična fetopatija, slovenske smernice
Key words:
hypergLycaemia in pregnancy, gestational diabetes meLLitus,diabetic embriopathy, diabetic fetopathy, SLovenian guideLines
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2012; 81: 745-52
PrispeLo: 21. feb. 2012, Sprejeto: 13. jun. 2012
Izvleček
Zaradi naraščanja prevalence debelosti, sladkorne bolezni tipa 2 (SB2) in nosečnostne sladkorne bolezni (NSB) se s hiperglikemijo v nosečnosti srečujemo vse pogosteje. Sladkorna bolezen (SB) v nosečnosti pomeni večje tveganje za perinatal-no smrtnost in obolevnost ter zaplete pri materi. Ker je glavni dejavnik tveganja za zaplete izpostavitev ploda hiperglikemiji matere, je ne glede na tip SB čim prejšnja vzpostavitev normoglike-mije ključnega pomena za izboljšanje izidov nosečnosti pri plodu in tudi pri materi. V tej luči je potrebno poudariti pomen zgodnjega odkrivanja verjetne prednosečnostne SB, ki pred zanositvijo ni bila diagnosticirana, večinoma SB2, in pomen prednosečnostnega svetovanja pri bolnicah z znano SB2 in sladkorno boleznijo tipa 1 (SB1).
Namen preglednega prispevka je razpravljati o prednosečnostni SB in NSB ter posledičnih tveganjih za plod in mater. Sočasno želimo poudariti pomen obravnave SB v nosečnosti v skladu s priporočili za zdravljenje SB2, ki jih je pred kratkim objavilo Slovensko endokrinološko združenje v juniju 2011.
Abstract
Given the increasing prevalence of obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and gestational diabetes mellitus (GDM), the number of women who have some form of diabetes during their pregnancies is increasing. Diabeti pregnance entails an increased risk of perinatal mortality and morbidity , as well as complications in mother. These are mainly the result of fetal exposure to maternal hyperglycaemia. Undelayed achievement of normoglycemia is therefore crucial for optimizing maternal and fetal outcomes in all women with diabetes during pregnancy, regardless of the type of diabetes. In light of this, we would like to address the importance of early detection of likely prepregnancy diabetes - mostly T2DM, and the value of preconception care in women with preexisting T2DM and type 1 diabetes mellitus (T1DM).
This review is aimed to discus pregestational and gestational diabetes and the associated health risk to the developing fetus and the mother. The management should take account of the clinical evidence-based guidelines for the treatment of T2DM published by the Slovenian Endocrine Society in June 2011.
1. Uvod
Število žensk s sladkorno boleznijo (SB) v nosečnosti narašča kot posledica večjega pojavljanja debelosti, pogostejšega oboleva-nja žensk za SB tipa 2 (SB2) v rodni dobi in odločitev za nosečnost v kasnejših letih.^'^ SB v nosečnosti predstavlja večje tveganje za pojav zapletov v nosečnosti pri materi in pri otroku. Ker je zvečana raven glukoze pri nosečnici glavni vir zapletov, lahko pojavnost
le-teh uspešno zmanjšamo z dobro urejeno glikemijo že v času spočetja in vzdrževanjem le-te med celotno nosečnostjo. Nosečnost je zato potrebno v primeru že znane SB dobro načrtovati, pri nosečnicah, pri katerih SB pred zanositvijo ni bila prepoznana ali se je šele pojavila med nosečnostjo, pa je SB potrebno čimprej prepoznati ter ustrezno zdraviti.1-3 Le s takšnim pristopom lahko dosežemo leta 1989 ambiciozno zastavljeni cilj v St. Vincentski deklaraciji, da je potreb-