Akrosomska reakcija pri morfološko različnih tipih človeških semenčic
Acrosome reaction in morphoLogicaLLy different types of human spermatozoa
Mojca čižek Sajko, Borut Kovačič, VeLjko VLaisavLjevic
Oddelek za
reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5,2000 Maribor
Korespondenca/ Correspondence:
prof. VeLjko VLaisavLjevic, University CLinicaL Centre Maribor, GynecoLogy and PerinatoLogy, Department of Reproductive Medicine LjubLjanska 5, 2000 Maribor, SLovenia eMaiL: vLai@ukc-mb.si
Ključne besede:
akrosomska reakcija, Ca2+ ionofor, čLoveške semenčice, morfoLogija semenčic, stroga meriLa Tygerberg
Key words:
acrosome reaction, Ca2+ ionophore, human sperm, sperm morphoLogy, Tygerberg strict criteria
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2011; 80: I-58-I-63
PrispeLo: 3. dec. 2009, Sprejeto: 16. nov. 2010
Izvleček
Izhodišča: Z našo raziskavo smo želeli ugotoviti, ali se funkcionalnost akrosoma razlikuje med različnimi morfološkimi tipi semenčic pri človeku.
Metode: Štirinajst semenskih izlivov moških smo oprali v gojišču, s čimer smo odstranili semensko plazmo in tako povzročili kapacitacijo semenčic. Iz vzorcev smo osamili samo gibljive semenčice. Vsak oprani vzorec smo razdelili na dva dela. Prvemu smo dodali ionofor Ca2+ za sprožitev akrosomske reakcije (AR). Drugi del je služil kot kontrola za spontano aktiviranje akrosoma. Po obdelavi smo semenčice fiksirali v etanolu in akrosom obarvali s FITC fluorokromom. Preparate smo opazovali z imunofluorescenčnim mikroskopom. Delež semenčic s funkcionalnim akrosomom (angl. acrosome reaction to io-nophore challenge, ARIC) smo izrazili z razliko med deležem semenčic s spodbujeno in deležem semenčič s spontano akrosomsko reakcijo za vsak morfološki tip posebej.
Rezultati: Povprečni odstotek spontane AR pri analiziranih semenskih vzorcih je bil 1,6 ± 1,8 %, spodbujene AR 51,8 ± 18,3 % in ARIC 50,1 ± 19,1 %. Različni morfološki tipi semenčic so se med seboj razlikovali po deležu uspešno induciranih aktivacij akrosoma (x^ = 87,62; p< 0,001) in tudi po izračunanem deležu funkcionalnih akroso-mov (ARIC; = 101,45; p0,001). Vse morfološko neoptimalne semenčice (razen semenčič okrogle oblike in semenčic z nepravilnostmi jedra) so imele v primerjavi z normalnimi semenčicami statistično pomembno nižji odstotek funkcionalnih akrosomov (p < 0,05).
Zaključki: Funkcionalnost akrosoma je povezana z morfološkimi lastnostmi semenčic. Najvišji odstotek normalnih akrosomov imajo morfološko optimalne semenčice, najnižjega pa semenčice elongiranih in amorfnih oblik.
Abstract
Background: The aim of our study was to ascertain if the acrosome functionality differs between various morphological types of spermatozoa in human.
Methods: Fourteen ejaculates were resuspended in the culture medium with the aim to wash the spermatozoa from the seminal plasma and to induce sperm capacitation. Only motile spermatozoa were isolated from the washed sperm. Each sample was divided into two aliquots. The Ca2+ ionophore was added to the first aliquot to induce sperm acrosome reaction. The second aliquot served as control for evaluating the spontaneous activation of the acrosome. After the treatment, the spermatozoa were fixed in ethanol and their acrosomes were stained with FITC fluorochrome. The samples were observed under an immunofluorescence microscope. The proportion of spermatozoa with functional acrosome (ARIC - acrosome reaction to ionophore challenge) was calculated for each morphological type as a difference between the proportions of spermatozoa with induced and spontaneous acrosome reaction.
Results: The mean proportion of spontaneous AR in the analysed sperm samples was 1.6 ± 1.8 %, induced AR 51.8 ± 18.3 % and ARIC 50.1 ± 19.1 %, respectively. Various morphological types of sperm differed significantly from each other by the proportion of successfully induced acrosome reactions (x^ = 87.62, p < 0.001) and also by the proportion of functional acrosomes (ARIC; x^ = 101.45, p0.001). All types of morphologically nonoptimal spermatozoa (except the types with round heads and nuclear abnormalities) had a significantly lower percentage of functional acrosomes (p < 0.05) in comparison with morphologically optimal type.
Conclusions: The acrosome functionality is related to morphological characteristics of spermatozoa. Optimal morphology types have the
highest, while elongated and amorphous types of spermatozoa have the lowest proportion of normal acrosome.
Uvod
Eden ključnih dogodkov oploditve pri človeku je vezava semenčice na ovojnico ali zono pellucido (ZP) jajčne celice. Pogoj za vezavo semenčice na ZP, prehod skoznjo in zlitje njene membrane s plazmalemo jajčne celice - oolemo je morfološka in funkcionalna neokrnjenost akrosoma semenčice,i katerega vsebina se mora sprostiti šele ob stiku z zono pellucid. Gre za t. i. akrosomsko reakcijo. Normalno se sproži akrosomska reakcija ob vezavi semenčice na receptorje na zoni pellucid.^ Možno pa je, da akrosom ni funkcionalen in se AR sproži predčasno ali pa se sploh ne sproži. Takšna semenčica, ki ni sposobna normalne akrosomske reakcije, ne more oploditi jajčne celice.^ Motnje v aktiviranju akrosoma so torej lahko vzrok za zmanjšano moško plodnost ali za sterilnost. V praksi obstajajo različni testi za ugotavljanje funkcionalnosti akrosoma: določanje akrosomalnega indeksa, ki predstavlja delež semenčic z morfološko normalnim akrosomom v semenskem vzorcu,^ ugotavljanje aktivnosti akrosomalne hidro-laze-akrozina4 in določanje deleža semenčic v semenskem vzorcu, ki so sposobne akrosomske reakcije po spodbujanju z umetnim dražljajem - Ca2+ ionoforjem A23187 (angl. acrosome reaction to ionophore challenge, ARIC).5 Na podlagi odstotka AR, sprožene z ionoforjem, lahko namreč sklepamo na oploditveno sposobnost semenčic in vitro.^'^
Poleg funkcionalnega akrosoma so za oploditev pomembne tudi morfološke lastnosti semenčic. Zona pellucida in plazma-lema jajčne celice namreč selektivno vežeta samo semenčice normalnih oblik^. Številne raziskave potrjujejo, da je morfologija semena pomemben pokazatelj oploditvene sposobnosti moškega, ter poročajo o klinični pomembnosti tega parametra in njegovi napovedni vrednosti in vitro^ in in vivo.^
Za določanje morfologije semena najpogosteje uporabljamo merila WRO^® in strožja merila, ki so jih določili na kliniki
Tygerberg (angl. Tygerberg strict criteria).® Številni avtorji menijo, da so za ocenjevanje morfologije semenčic stroga merila Tyger-berg primernejša kot merila WHO.^'i^ Prednosti strogih meril so dobra ponovljivost, korelacija s funkcionalnimi testi in dobra napovedna vrednost za stopnjo oploditve in zanositve pri postopkih zunajtelesne oploditve (IVF).ii
V	naši raziskavi smo morfologijo semenčic določali po Tygerberših merilih, ki jih tudi sicer uporabljamo v diagnostičnem postopku pred postopkom IVF. Zanimalo nas je, ali se sposobnost semenčic za akrosom-sko reakcijo razlikuje med različnimi morfološkimi tipi semenčic.
Material in metode Semenski vzorci in priprava semena
V	raziskavi smo analizirali 5600 semenčic iz semenskih vzorcev 14 preiskovancev, ki so prišli na diagnostični pregled pred postopkom IVF. Pri vsakem preiskovancu smo določili koncentracijo semenčic, gibljivost semenčic in odstotek morfološko normalnih semenčic.
Semenske vzorce smo centrifugirali v gojišču Sperm Preparation Medium (Me-dicult, Jyllinge, Danska), da smo odstranili semensko plazmo. Za ločitev gibljivih od negibljivih semenčic smo uporabili tehniko "swim-up", pri kateri so gibljive semenčice izplavale iz usedline v višje plasti čistega gojišča. Koncentracijo gibljivih semenčic smo uravnali na 5-10 x io®/ml. Semenčice smo inkubirali 3 ure v inkubatorju pri 37 °C in atmosferi s 5-odstotnim CO2, da je potekla kapacitacija. Po inkubaciji smo vzorce pripravili za določitev akrosomske reakcije.
Določitev akrosomske reakcije
Akrosomsko reakcijo smo ocenili po metodi, ki jo je opisal Cummins in sod.^ Opran in kapacitiran vzorec semenčic smo razdelili na dva dela. Enemu smo dodali Ca2+ iono-
Slika i: Semenčice z neaktiviranim akrosomom (intenzivna zeLena fluorescenca v celotnem akrosomu) in semenčice s sproženo akrosomsko reakcijo (intenzivno zeleno obarvano samo ekvatorialno območje glave); 1000-kratna povečava.
for A23187 (Sigma-Aldrich Chemie, Deisenhofen, Nemčija) za sprožitev akrosomske reakcije, drugi pa nam je služil kot kontrola za spontano aktiviranje akrosoma. Po eni uri inkubacije pri 37 °C in 5-odstotnim CO2 smo vzorec centrifugirali skozi 60-odsto-tnim gostotni gradient Percoll (Medicult, Danska), ga sprali z gojiščem HT9 in seme resuspendirali v 95-odstotnem etanolu. Fiksirane semenčice smo nanesli na objektno steklo in naredili razmaz. Za določitev sprememb v akrosomalnem delu smo preparate semenčic označili s FITC konjugiranim lektinom PSA (Sigma) in jih nato opazovali z epifluorescenčnim mikroskopom (Op-tiphot, Nikon) pri 1000-kratni povečavi. Če
so imele semenčice obarvano samo ekvatorialno območje glavice ali ekvatorialno območje in delno obarvan apikalni del akro-soma, smo jih ovrednotili kot semenčice z aktiviranim akrosomom. Če je bil močno obarvan celoten akrosom, smo ocenili, da akrosomska reakcija še ni bila sprožena (Slika 1). Pri vsakem preparatu smo pregledali 200 semenčic in hkrati z ugotavljanjem aktiviranja akrosoma ocenili tudi morfologijo semenčic. Določili smo delež semenčic s spontano AR, delež semenčic z akrosomsko reakcijo po spodbudi s Ca2+ ionoforjem in delež semenčic, ki so sposobne odziva na spodbudo akrosomske reakcije s Ca2+ iono-forjem, t. j. funkcionalnost akrosoma.
Funkcionalnost akrosoma (ARIC) smo izrazili po formuli:^
ARIC (%) = spodbujena AR (%) - spontana AR (%).
Morfološka analiza
Hkrati z določitvijo akrosomske reakcije smo ovrednotili tudi morfologijo semenčic. Semenčice smo ocenjevali po strogih merilih Tygerberg.8 Kruger in sod.® vključujejo semenčice med morfološko normalne le, če so te brez nepravilnosti v vseh treh območjih: glavi, vratu in repu. Semenski vzorec je po strogih merilih morfološko normalen, če ima 14 "/o ali več semenčic normalno obliko. Za razliko pa merila WHO postavljajo za mejno vrednost 30 / morfološko normalnih semenčic.10 Glede na morfološke značilnosti glave, vratu in repa smo semenčice po Menkveldui3 razdelili v 14 skupin (Tabela 1). Morfoloških nepravilnosti, kot so makroce-falna oblika, citoplazmatski ostanek, prelom vratu, aplazija mitohondrijev, nepravilnosti repa in pomnožene semenčice, pri naših vzorcih nismo opazili oziroma so bile izražene pri manj kot 5 / semenčic. Zato smo teh šest skupin pri vrednotenju povezanosti morfoloških lastnosti semenčic s sposobnostjo semenčic za aktiviranje akrosoma izpustili.
Statistična analiza
Za mejo statistične pomembnosti smo upoštevali p < 0,05. Povezanost morfoloških lastnosti semenčic s spodbujeno AR in
Tabela i: DeLeži semenčic posameznih morfoLoških tipov v skupnem vzorcu 5600 semenčic.
Morfološki tip semenčic	Število (%) semenčic / skupni vzorec
normaLne	562 (10,0)
mejno normalne	964 (17,2)
okrogLe	281 (5,0)
nepravilnosti jedra	440 (7,9)
mikrocefalne	319 (5,7)
makrocefaLne	47 (0,8)
elongirane	775 (13,8)
amorfne/nepravilnosti akrosoma	726 (12,9)
nepravilnosti vseh območij semenčice	1222 (21,8)
citoplazmatski ostanek	5 (0,1)
preLom vratu	81 (1,4)
aplazija mitohondrijev	1 (0,0)
nepraviLnosti repa	178 (3,2)
pomnožene semenčice	4 (0,1)
skupaj	5600 (100,0)
s funkcionalnostjo akrosoma (ARIC) smo ugotavljali s testom hi-kvadrat. Pri spontani AR so bili deleži semenčic z akrosomsko reakcijo pri posameznih morfoloških tipih prenizki, da bi lahko razliko med njimi statistično ovrednotili. Posamezne nepravilne oblike semenčic smo pri spodbujeni AR in pri ARIC primerjali z normalnimi oblikami s testom hi-kvadrat z Yatesovo korekcijo. Za statistično analizo smo uporabili program Statistika (StatSoft Inc., USA).
Rezultati
Koncentracija semenčic v uporabljenih semenskih izlivih je bila od 8,8 x 10® do 208,0 x io®/ml (srednja vrednost 81,4 x 10®/ ml), gibljivost semenčic je bila 45 do 74 »/o (srednja vrednost 61,1 %). Med analiziranimi semenčicami je bil povprečni odstotek spontane AR 1,6 ± 1,8 »% (spodnja in zgornja meja 0,0-6,5). Povprečni odstotek spodbujene AR je bil višji (51,8 ± 18,3 /o, spodnja in zgornja meja 17,0-77,6) in temu primerna tudi ARIC (50,1 ± 19,1 /o, spodnja in zgornja meja 14,0-76,6).
V povprečju je bilo normalnih oblik v semenskih vzorcih 10,0 ± 4,5 /o, pri čemer so imeli trije preiskovanci več kot 14 /o normalnih oblik, devet preiskovancev je imelo normalnih oblik med 4 in 14 /, dva preiskovanca pa sta imela manj kot 4 / morfološko normalnih semenčic.
Semenčice z nedotaknjenim akrosomom in semenčice, pri katerih je prišlo do akro-somske reakcije, so prikazane na Sliki 1.
Akrosomsko reakcijo pri morfološko različnih tipih semenčic prikazuje Tabela 2. Morfoloških skupin, ki so vključevale le nekaj semenčic (< 5 %), nismo upoštevali pri analizi. Tako smo izključili vse oblike nepravilnosti repa, makrocefalne semenčice in pomnožene semenčice. Morfološko različne semenčice se med seboj razlikujejo glede na akrosomsko reakcijo, spodbujeno z ionoforjem (x^ = 87,62; p < 0,001). Prav tako je odzivnost različnih oblik semenčic na spodbudo akrosomske reakcije s Ca2+ iono-forjem (ARIC) statistično značilno različna (X^ = 101,45; p < 0,001).
Razpravljanje in sklep
Naša raziskava je pokazala, da imajo morfološko različne semenčice različno sposobnost za aktiviranje akrosoma. Najvišji odstotek semenčic s funkcionalnim akroso-mom smo ugotovili pri morfološko normalnih semenčicah in najnižjega pri amorfnih semenčicah. Prav amorfne semenčice pa so tiste, ki imajo največje nepravilnosti v akro-somalnem območju. Lahko bi sklepali, da je za uspešno akrosomsko reakcijo pomembna ustrezna oblika akrosoma. O podobnih rezultatih poročajo Carrell in sod.^^ Semenčice so po merilih WHO razdelili v sedem morfoloških skupin. Za spodbujanje AR so uporabili kumulusne celice in kalcijev iono-for A23187. V obeh primerih so ugotovili, da je bil odstotek semenčic z akrosomsko reakcijo pri morfološko nepravilnih semenčicah nižji kot pri normalnih.
Nasprotno pa nekatere raziskave kažejo, da morfološke lastnosti semenčic niso v povezavi z njihovo sposobnostjo za aktiviranje akrosoma po spodbujanju z umetnimi dra-žljaji.i5 Pampiglione in sod.^^ so ugotavljali, kakšna je akrosomska reakcija pri morfolo-
Tabela 2: FunkcionaLnost akrosoma (ARIC), spontana in spodbujena AR pri različnih morfoloških tipih semenčic.
Morfološki tip semenčic	Spontana AR %	Spodbujena AR %	ARIC
	(n / vse ocenjene)	(n / vse ocenjene)	%
normalne	2,2 (7/320)	63,6 (154/242)	61,4
mejno normalne	2,1 (10/486)	55,4 (265/478) a	53,4 a
okrogle	0,0 (0/166)	60,9 (70/115)	60,9
nepravilnosti jedra	1,0 (2/203)	54,9 (130/237)	53,9
mikrocefalne	1,0 (2/196)	45,5 (56/123) b	44,5 b
elongirane	1,8 (7/395)	45,8 (174/380) c	44,0 c
amorfne/nepravilnosti akrosoma	1,6 (6/388)	30,8 (104/338) c	29,2 c
nepravilnosti vseh območij semenčice	1,8 (9/497)	53,1 (385/725) a	51,3 a
Statistično pomembna razlika med morfološko nepravilnimi semenčicami in semenčicami normalnih oblik: a p < 0,05; b p < 0,005; c p < 0,0001
ško različnih semenčicah po spodbujanju s folikularno tekočino. Pri semenčicah, ki jim niso dodali folikularne tekočine, je bila spontana akrosomska reakcija med različnimi morfološkimi skupinami značilno različna. Pri semenčicah, ki so jih inkubirali s folikularno tekočino, pa se deleži semenčic s spodbujeno AR med morfološkimi skupinami niso razlikovali. Razliko med našimi rezultati in omenjeno raziskavo lahko poskušamo pojasniti z uporabo drugačnega dražljaja za sprožitev akrosomske reakcije. Folikularna tekočina je biološki material in lahko zaradi vsebnosti različnih bioloških snovi izraža različno aktivnost.^®
Zanimalo nas je tudi, kako se posamezne nepravilne oblike semenčic v funkcionalnosti akrosoma razlikujejo od normalnih. Ugotovili smo statistično pomembno nižji odstotek akrosomske reakcije pri morfološko nepravilnih tipih, razen pri okroglih oblikah in pri semenčicah z nepravilnostmi jedra. Morfološke tipe smo določili na podlagi modificirane Menkveldove klasifi-kacije.i3 Tako smo uvrstili semenčice med okrogle, če je bila dolžina glave enaka njeni širini. Nekateri avtorji pa uvrščajo med okrogle semenčice tiste, ki so povsem brez akrosoma.i7 Te semenčice seveda niso sposobne akrosomske reakcije in zato ne morejo oploditi jajčne celice. Na podlagi naših rezultatov ne moremo trditi, da imajo okrogle
semenčice zmanjšano sposobnost za AR v primerjavi z normalnimi. To lahko pomeni, da pri okroglih semenčicah akrosom ni toliko spremenjen, da se ne bi mogel normalno aktivirati. Enako tudi pri semenčicah z nepravilnostmi jedra nismo mogli potrditi zmanjšane sposobnosti za akrosomsko reakcijo v primerjavi z normalnimi. Če primerjamo odstotek ARIC pri semenčicah z nepravilnostmi jedra in pri mejno normalnih, je ta ugotovitev na videz presenetljiva. Možno je, da bi se tudi tu ob večjem številu semenčic pokazala statistično značilna razlika. To bi pomenilo, da na sposobnost za akrosomsko reakcijo ne vpliva le oblika akrosoma, ampak je pomembna morfologija celotnega območja glave.
Pričujoča študija kaže, da ima morfologija semenčic vpliv na akrosomsko reakcijo, spodbujeno s Ca2+ ionoforjem. V literature so opisane še druge metode, pri katerih so uporabili bolj naravne sprožilce AR, zono pellucidoi8 ali progesteron.^^ Z nadaljnjimi
raziskavami bi bilo potrebno ugotoviti, kateri dražljaj - kemijski ali fiziološki - je najboljši napovedni dejavnik.
Z vpeljavo funkcijskega testa, kot je določanje akrosomske reakcije, v klinične preiskave lahko pridobimo pomembne informacije o moški plodnosti. Ugotavljanje te dinamične značilnosti semenčic lahko pomaga pri reševanju uganke nepojasnjene
(idiopatske) neplodnosti in primerov ponavljajočih se ciklov zunajtelesne oploditve pri normozoospermikih, ki se končajo brez oploditve.19 Dokazano je bilo namreč, da ima ARIC najvišjo napovedno vrednost za zanositev, višjo kot jo imajo drugi parametri, kot so delež samo tistih semenčic ki so imele inducirano akrosomsko reakcijo, morfologija semenčic po strogih merilih in parameter gibljivosti semenčic.^®
Literatura
1.	Yanagimachi R. Mechanisms of fertilization in mammals. In: L. Mastroianni Jr and Biggers JD, eds. Fertilization and Embryonic Development In Vitro. New York: Plenum Press; 1981. p. 81-182.
2.	Florman HM, Storey BT. Mouse gamete interactions: the zona pellucida is the site of the acrosome reaction leading to fertilization in vitro. Develop Biol 1982; 91: 121-130.
3.	Menkveld R, Rhemrev JPT, Franken DR, Vermeiden JPW, Kruger TF. Acrosomal morphology as a novel criterion for male fertility diagnosis: relation with acrosin activity, morphology (strict criteria), and fertilization in vitro. Fertil Steril 1996; 65: 637-644.
4.	Kennedy WP, Kaminski JM, Van der Ven HH, Je-yendran RS, Reid DS, Blackwell J, et al. A simple, clinical assay to evaluate the acrosin activity of human spermatozoa. J Androl 1989; 10: 221-231.
5.	Cummins JM, Pember SM, Jequier AM, Yovich JL, Hartmann PE. A test of the human sperm acroso-me reaction following ionophore challenge. Relationship to fertility and other seminal parameters. J Androl 1991; 12: 98-103.
6.	Yovich JM, Edirishinge WR, Yovich JL. Use of the acrosome reaction to ionophore challenge test in managing patients in am assisted reproduction program: a prospective, double-blind, randomized controlled study. Fertil Steril 1994; 61: 902-10.
7.	Liu DY, Baker HWG. Acrosome status and morphology of human spermatozoa bound to the zona pellucida and oolemma determined using oocytes that failed to fertilize in vitro. Hum Re-prod 1994; 9: 673-9.
8.	Kruger TF, Menkveld R, Stander FS, Lombard CJ, Van der Merwe JP, van Zyl JA, et al. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization. Fertil Steril 1986; 46: 1118-23.
9.	Ombelet W, Bosmans E, Janssen M, Cox A, Vlas-selaer J, Gyselaers W, et al. Semen parameters in a fertile versus subfertile population: a need for change in interpretation of semen testing. Hum Reprod 1997; 12: 987-93.
10.	World Health Organization. WHO Manual for the Standardized Investigation, Diagnosis and Management of the Infertile Male. Cambridge: Cambridge University Press; 2000.
11.	Menkveld R, Kruger TF. Advantages of strict (Tygerberg) criteria for evaluation of sperm morphology. Int J Androl 1995; 18: 36-42.
12.	Grow DR, Oehninger S, Seltman HJ, Toner JP, Swanson RJ, Kruger TF, et al. Sperm morphology as diagnosed by strict criteria: probing the impact of teratozoospermia on fertilization rate and pregnancy outcome in a large in vitro fertilization population. Fertil Steril 1994; 62: 559-67.
13.	Menkveld R, Oettle EE, Kruger TF, Swanson RJ, Acosta AA, Oehninger S. Atlas of human sperm morphology. Baltimore: Williiams & Wilkins;
1991.
14.	Carrell DT, Zobell RL, Middleton RG, Urry RL. A functional analyssis and the potential clinical significance of 7 categories of sperm morphology. J Urol 1994; 151: 376-80.
15.	Pampiglione JS, Tan SL, Campbell S. Acrosome reactivity in spermatozoa of different morphology in response to stimulation with follicular fluid. Hum Reprod 1993; 8: 412-5.
16.	Morales P, Llanos M, Gutierrez G, Kohen P, Vigil P, Vantman D. The acrosome reaction-inducing activity of individual human follicular fluid samples is highly variable and is related to the steroid content. Hum Reprod 1992; 7: 646-51.
17.	Aitken RJ, Kerr L, Bolton V, Hargreaves T. Analysis of sperm function in globozoospermia: implications for the mechanisms of sperm-oocyte interaction. Fertil Steril 1990; 54: 701-7.
18.	Franken DR, Bastiaan HS, Oehninger SC. Physiological induction of the acrosome reaction in human sperm: validation of a microassay using minimal volumes of solubilized, homologous zona pellucida. J Assist Reprod Genet 2000; 17: 347-8.
19.	Allgeyer M, Kirschenhofer N, Mann U, Brucker C. Measurement of induced acrosome reactions in human sperm using physiologic stimuli relevance for the prediction of fertilization outcome. Andro-logia 2006; 38: 99-105.
20.	Makkar G, Ng EH, Yeung WS, Ho PC. The significance of the inonophore-challenged acrosome reaction in the prediction of successful outcome of controlled ovarian stimulation and intrauterine insemination. Hum Reprod 2003; 18: 534-9.