UrškaKamenšek1,GregorSerša2 Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka In Situ Vac ci na tion by Gene Elec tro trans fer for Can cer Treat ment IZvLEČEK KLJUČNEBESEDE:cepljenje,rak,genskielektroprenos,plazmidi,elektroporacija,dejavniktumorske nekrozeα,interlevkin-12 Rakjeskupinasistemskihbolezni,kijimjeskupnamotnjavdelovanjuimunskegasi- stema.Različniimunoterapevtskipristopistremijoksprožitvioz.ponovnisprožitviali pakpospešitvidelovanjaimunskegasistemavbojuprotiraku.Edenizmedboljrobust- nihtovrstnihpristopovjet. i.cepljenje in situ,kjerzrazličnimiablacijskiminačinizdrav- ljenjasprožimoimunskiodzivprotitumorskimantigenom,kisesprostijoizumirajočih rakavihcelic.Dabidoseglisistemskiintrajenodgovor,jetenačinezdravljenjatrebazdružiti stakimi,kipospešujejodelovanjebolnikovegaimunskegasistema.Na Oddelkuzaeks- perimentalnoonkologijoOnkološkegainštitutaLjubljanaseukvarjamozoblikogenske- gazdravljenja,t. i.genskimelektroprenosom,kijeprimerentakozasprožitevcepljenja in situ kottudizapospešitevimunskegasistema.Predkratkimsmonamišjemmodelu rakadokazali,dalahkocepljenjein situ dosežemozgenskimelektroprenosomplazmid- nihvektorjev zzapisomzadejavniktumorskenekrozeα inzainterlevkin-12.Vprihodnje želimoopisanpristopinpodobnenačinezdravljenja,kitemeljijonagenskemelektropre- nosu,pripeljatidokliničneuporabe.Tupaostajaodprtovprašanjepripraveplazmidnih vektorjevvkakovosti,primernizakliničnouporabo,inizboraustreznihbolnikov,kijim botakšenpristopkarnajboljkoristil. aBSTRaCT KEYWORDS:vaccination,cancer,geneelectrotransfer,plasmids,electroporation,tumornecrosis factor α,interlevkin-12 Cancerisagroupofsystemicdiseasesthatinvolvemalfunctionsoftheimmunesystem. Differenttypesofimmunotherapyaimtoreactivateorstimulateanticancerimmunity. Amorerobustimmunotherapeuticapproachisaso-calledin situ vaccination,whereva- riouslocalablativetherapiesareusedtoinduceaspecificimmuneresponseagainsttu- morantigensreleasedfromdyingtumorcells.Toachieveasystemicanddurableresponse, thesetherapiesneedtobecombinedwithimmuneadjuvants.AttheDepartmentofEx- perimentalOncology,attheInstituteofOncologyinLjubljana,weareexploringaform 1 Dr.UrškaKamenšek,univ.dipl.biol.,Oddelekzaeksperimentalnoonkologijo,OnkološkiinštitutLjubljana,Zaloška cesta2,1000Ljubljana;ukamensek@onko-i.si 2 Prof. dr.GregorSerša,univ.dipl.biol.,Oddelekzaeksperimentalnoonkologijo,OnkološkiinštitutLjubljana,Zaloška cesta2,1000Ljubljana;Zdravstvenafakulteta,UniverzavLjubljani,Zdravstvenapot5,1000Ljubljana 5MedRazgl.2020;59(1):5–21 • Pregledni članek mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 5 Včlankujepodrobnejeopisanpostopekgen- skega elektroprenosaspoudarkomnaplaz- midnihvektorjih,kijihpritemuporabljamo. Prizadevamo si namreč pripraviti lastne plazmidnevektorjenovegeneracije,ska- terimiželimozagotovitiboljšeciljanjein učinkovitostzdravljenja,predvsempasklad- nostzvarnostnimipriporočiligledeupo- rabe antibiotikov pri klinično uporabnih plazmidih.Nakoncujeopisanašeuporaba genskegaelektroprenosazacepljenje in situ. IMUNOLOšKO ZDRavLJENJE RaKa Rakjeskupinasistemskihbolezni,kijimje skupnamotnjavdelovanjuimunskegasi- stema.Vprocesunastankainrazvojaraka setumorskeceliceuspejoizognitiprepoz- navanjuinodstranitvisstraniimunskega sistema (5–7). Različni pristopi imuno- loškegazdravljenjastremijoksproženjuoz. ponovnemsproženjualipakpospešitvide- lovanjaimunskegasistemavbojuprotiraku (8, 9).Trenutnovpredkliničnihinkliničnih raziskavahpreizkušajoštevilnetakšnepri- stope(10, 11).Nekajjihježeodobrenihza kliničnouporabo:odprotiteles,kidelujejo kotzaviralciimunskihkontrolnihtočk(npr. ipilimumab, nivolumab, pembrolizumab, atezolizumab, durvalumab), do različnih vrstceličnegazdravljenja,kotsonpr.celično cepivoProvenge in zdravljenje z gensko spremenjenimicelicamiT,kiizražajohi- merniantigenskireceptor(angl.chi me ric an - ti gen re cep tor T-cell,CAR-T).Medtespadajo npr.Kymriah®inYescarta®(12). 6 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka ofgenetherapycalledgeneelectrotransfer,whichcanbeusedtoinducein situ vaccina- tionandstimulatetheimmuneresponse.Recently,weprovedtheeffectivenessofcon- comitantgeneelectrotransferofplasmidvectorsencodingtumornecrosisfactorα and interleukin-12inamousemelanomatumormodel.Inthisapproach,thetumornecro- sisfactorα actsasalocalablativetherapyandinterleukin-12asanimmunologicalad- juvant.Inthefuture,wewanttobringthisandsimilargeneelectrotransferapproaches intoclinicalpractice.Butfirstwehavetotackletheproblemofclinicalgradeplasmid vectordesignandselectionofappropriatepatientsthatwouldbenefitthemostfromthe proposedapproach. UvOD Trenutnipostopkizazdravljenjerakasolah- kozeloučinkoviti,ampakvmnogihprime- rihneuspejopopolnomaozdravitibolez- ni.Zasevkisoodgovornizavečkot90% vsehsmrtizaradiraka(1).Dabipozdravi- lirazsejanobolezen,bimoralimunskisi- stemprepoznatiinodstranitirakavecelice pocelemtelesu.Čepravprirakavihbolni- kihnajdemoimunskecelice,uperjenepro- titumorskimantigenom, namdejstvo,da rakkljubtemuvznikne,pove,dajeimun- skisistemzatajil(2, 3).Idealnozdravljenje bitorejmoralosprostititumorskeantige- neinhkratipustitiimunskemusistemu,da seboriprotirakavimcelicam.Izkoriščanje bolnikovegalastnegaimunskegasistemaza bojprotirakujetrenutnonajboljobetavno intudiuspešnoonkološkopodročje.Eden izmedboljrobustnihtovrstnihpristopovje t. i.cepljenje in situ (angl.in situ vac ci na tion), kjerzrazličnimiablacijskiminačinizdrav- ljenjasprožimoimunskiodzivprotitumor- skimantigenom,kisesprostijoizumira- jočihrakavihcelic.Dabidoseglisistemski intrajenodgovor,jetakšnozdravljenje tre- bazdružitizzdravljenjem,kipospešujede- lovanjebolnikovegalastnegaimunskegasi- stemaalipapreprečujeimunskozavrtje. NaOddelkuzaeksperimentalnoonko- logijoOnkološkegainštitutaLjubljanase ukvarjamozoblikogenskegazdravljenja, imenovanegagenskielektroprenos, kijepri- merentakozasprožitevcepljenja in situ kot tudizapospešitevimunskegasistema(4). mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 6 Imu no loš ka na ra va pro ti ra ka vih na či nov zdrav lje nja Zuspehomnovihimunološkihpristopovje postalotudijasno,dajeimunskisistemvple- ten vprotirakavodelovanjenekaterihkli- nično uveljavljenih terapij raka, kot sta radioterapijainkemoterapija(13). Pravza- pravmora prav vsako resnično uspešno zdravljenjeimetitudivplivnaimunskisi- stem.Stemlahkopojasnimopopolneoz- dravitvepotovrstnemzdravljenju,zakatere je potrebno uničenje čisto vseh rakavih celic.Učinkisonamrečvidnitudinatistih celicah,kinisobileneposrednoizpostav- ljene zdravljenju, kar imenujemo posre- dovani(angl.bystan der)učinek,včasihpa izginejotudioddaljeninezdravljenizasev- ki,karimenujemooddaljeni(angl.abs co pal) učinek.Predlaganmehanizemtehučinkov je,dazdravljenjesprožiposebnoimunogeno oblikoceličnesmrti,kinatosprožiimun- skiodzivprotirakavimcelicam(14–17). Izrazimunogenaceličnasmrtsovpelja- livzadnjemdesetletju,dabiznjimoznačili posebnofunkcionalnooblikoprogramira- neceličnesmrti,kilahkopovzročinasta- nekvnetnegaodzivabrezprisotnostipato- genov(17, 18). Priimunogeniceličnismrti seizumirajočihcelichkratistumorskimi antigenisproščacelavrstaimunospodbu- jevalnihsporočevalcevnevarnostioz. t. i. spoškodbopovezanihmolekularnihvzorcev (angl.da ma ge-as so cia ted mo le cu lar patterns, DAMP) (19).DAMPso v bistvuobičajne znotrajceličnemolekule,kisesprostijoiz celicealiseizpostavijonaceličnimembra- nipri imunogenihoblikahceličnesmrti. Tri izmedtehmolekulsoizbralikotnajpo- membnejše označevalce imunogene ce- ličnesmrti:kalretikulin,izpostavljennace- ličnimembrani,kromatinskabeljakovina HMGB1(angl.high mo bi lity group box 1)in zunajceličniATP(18).Kotzelopomemben DAMPlahkonastopatudiDNA,sproščena izjederumirajočihcelic(20–22). Sposobnostproženjaimunogenecelične smrtisožepripisalinekaterimustaljenim terapijamraka,kotsonpr.kemoterapevtiki docetaksel,paklitaksel,doksorubicinin radio- terapija (10, 23).Rakavecelicepouporabi tehvrstzdravljenjatorejumirajozimuno- genooblikoceličnesmrti,karlahkoprive- dedonastankasistemskegapridobljenega imunskegaodzivaprotitumorskimantige- nom,sproščenimizumirajočihcelic.Takšno zdravljenjetorejpravzapravdelujekotne- kakšnocepivo (23–25). CEPLJENJE IN SITU Mednačiniimunološkegazdravljenjaraka, kisoserazvilivzadnjihdesetletjih,je tudi terapevtsko cepljenje, namenjeno zdrav- ljenjužeprisotnebolezni.Razvojprotira- kavihterapevtskihcepivtemeljinadejstvu, darakaveceliceizražajotumorskeantige- ne,kijihlahkouporabimokottarčezapri- pravocepiv.Običajnoterapevtskocepljenje zazdravljenjerakajeobrazloženokotdo- stavaizbranihtumorskihantigenov,proti katerimlahkotelosprožipridobljeniimun- skiodziv(26).Čepravseslišizeloobetav- no,sepristopvkliničniuporabiniizkazal zauspešnega,predvsemzaradipomanjka- njavsesplošnihtumorskihantigenovinza- pletenostitercenepripraveposamezniku prilagojenihcepivex vivo (27, 28). Na podlagi zgoraj opisanih imuno- loškihučinkovuveljavljenihterapijrakaso sepojavileideje,dabitapojavizkoristili zacepljenje,takodabizzdravljenjemiz- zvaliimunskiodzivneposrednovnovotvor- bi,in situ (15, 28).Takobilahkoizkoristili številnebolnikovelastnetumorskeantige- neinnesamonekaterihizbranih,kotpri običajnihterapevtskihcepivih.Zapristop se jeprijel izrazcepljenje in situ.Glavna prednostpristopaje,daizkoriščamobolni- kovelastnetumorskeantigene,zatobibil pristoplahkoprimerenzazdravljenjeraz- ličnihtipovraka. Zacepljenjein situ soprimernepred- vsemrazličnevrstelokalnegaablacijskega zdravljenja,oddobrouveljavljeneradiote- rapijedonovejšihpristopov,kotsoonko- 7MedRazgl.2020;59(1): mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 7 litičnivirusi,radiofrekvenčna-inkrioabla- cijaitd.(28–30). Vnaširaziskovalniskupini smoprednekajletipredlagali,dabilahko zacepljenjein situ uporabilielektrokemote- rapijo,skateroseževrstoletukvarjamo(25). Elektrokemoterapijo smo na Onko- loškeminštitutumedprviminasvetuizva- jaliprikliničnemdelu,sedajpaježe priznan lokalniablacijskinačinzdravljenja,kiseiz- vaja v 160 zdravstvenih središčih širom Evrope(31, 32).Postopektemeljinaupora- bielektroporacije,kijefizikalnipostopek, kjerzdovajanjemkratkihvisokonapetost- nihelektričnihpulzovlokalnoomogočimo prehajanjemolekul,zakaterejesicercelična membranaslaboprepustna(33).Prielektro- kemoterapijisotemolekulerazličnikemo- terapevtikioz.citostatiki,predvsemcisplatin inbleomicin,lahkopavnašamotudigen- skimaterial,karimenujemogenskielektro- prenos(slika1). Imu no loš ki spod bu je val ci pri cep lje nju in situ Kotpripodobnihablacijskihzdravljenjihje vprotirakavodelovanjeelektrokemoterapije vpletenimunskisistem,kardokazujevečja učinkovitostzdravljenjanaimunskoodziv- nihmišihvprimerjavizimunskozavrtimi (34).Dokazanojetudipovečanovdiranjean- tigenpredstavitvenihcelicnamestozdrav- ljenja(35, 36).Vendarpavkliničnemdelu ostajaelektrokemoterapijaševednolokal- niablacijskipostopekssicerzelovisokolo- kalnoučinkovitostjo,todabrezdokazanesi- stemskeučinkovitosti(37).Podobnovelja zaostalenačinezdravljenja,kisojihpred- lagalizacepljenje in situ (38).Zgorajopi- sani imunološkiučinkiustaljenih terapij rakasonamrečredekpojav:npr.oddaljeni učinekjedobrodokumentiransamopora- dioterapiji(39, 40).Topomeni,dajecep- ljenju in situ treba dodati spodbujevalce imunskegasistema,alipa,čeježeprišlodo imunskega zavrtja, antagoniste zavrtja. Zistimnamenomsevprotokolihobičaj- negaterapevtskegacepljenapogostoupo- rabljajorazličniimunološkispodbujevalci, najpogostejecitokini,kivodijonastali imun- skiodzivvpravosmer(41).Edenizmednaj- pogostejeuporabljenihimunološkihspod- bujevalcevjecitokininterlevkin-12(IL-12), 8 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka Sli ka 1. Elektrokemoterapijaingenskielektroprenos(26).E–električnopolje. a iin mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 8 edennajučinkovitejšihnačinovzanjegov vnospaježeomenjenigenskielektropre- nos(42–45). GENSKI ELEKTROPRENOS Genski elektroprenos je oblika genskega zdravljenja,kijeopredeljenakotvnosgenov, t. i.transgenov,vcelicebolnikazadoseganje zdravilnegaučinka(46–48).Genskozdrav- ljenjedelimogledenavektorjezavnosge- novnavirusnepristope(t. i.transdukcija) innevirusnepristope(t. i.transfekcija). Dru- gadelitevgenskegazdravljenjapajegle- denanačindostave:napostopke ex vivo in in vivo.Pripostopkih ex vivo celice,odvze- teizbolnikov,genskospremenimovcelični kulturiinjihnatovrnemonazajvtelobol- nikov.Pripostopkihin vivo pazdravljenje izvedemozneposrednimvnosomgenske- gamaterialavtelo.Genskielektroprenos jenajuspešnejšinevirusnipostopekgenske- gazdravljenja,kiomogočalokalnoin vivo dostavogenskegamaterialavtkiva,kotso koža,mišiceintudinovotvorbe(4, 49). Postopekgenskegaelektroprenosaomo- gočadvanačinagenskegazdravljenja,si- stemsko in lokalno zdravljenje. Kadar želimosistemskoizražanje,lahkotransfe- ciramomišicealikožo,kipotemdelujejo kotbiološketovarnezaproizvodnjotrans- gena (50, 51). Takšen sistemski način je obetavenzaproizvodnjocitokinovincep- ljenjezDNA(angl.DNA vac ci na tion).Po drugistanipanampostopekgenskega elek- troprenosazaradiprostorskenatančnosti, kijozagotavljaelektroporacija,omogoča tudilokalninačin,kijeprimerenzaciljanje rakavihcelicaližiljanovotvorbe.Uspešnost 9MedRazgl.2020;59(1): Sli ka 2. Sestavaplazmidnihvektorjev.Ekspresijskokasetosestavljajopromotor,transgen,zaporedjeza konecprepisovanjainpoliadenilacijskozaporedje.Bakterijskoogrodjejesestavljenoizmestazazačetek podvojevanja(angl.ori gin of re pli ca tion, ORI)ingenazaodpornostprotiantibiotikus svojimpromotor- jeminzaporedjemzakonecprepisovanja.Bp –baznipar. mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 9 takolokalnegakotsistemskeganačinaje bilažedokazanavštevilnihpredkliničnih raziskavah,takodajepostopektrenutnože vfazikliničnegapreizkušanjavZDA(52–56). Vektorjizatransgeneprigenskemelektro- prenosu soplazmidi,kiimajonizkointegra- cijskozmogljivost(senevključijovDNA), zato je izražanje transgenovpogenskem elektroprenosuprehodnenarave,karje var- nejšeinpriuporabizacepljenjeingensko zdravljenjerakapravzapravzaželeno(48). PLaZMIDNI vEKTORJI Plazmidisokrožna,dvoverižna,episomalna DNA,kijenaravnoprisotnavbakterijah. Genskospremenjenebakterijeizkoriščamo zanamnožitevvelikihkoličinplazmidne DNAzauporabovgenskemzdravljenju(57, 58).PlazmidnaDNAjeobstojnanasobni temperaturi,njenoizdelovanjejepoceniin varnovprimerjavizizdelovanjemvirusnih vektorjev. Zgradbaplazmidnihvektorjevimalahko velikvplivnamestoindinamikoizražanja transgena (57).Polegtegajepripripravi plazmidov,kisonamenjenikliničniupora- bi,trebaupoštevatitudivarnostnapripo- ročilanadzornihagencij,kotstaEvropska agencijazazdravila(EuropeanMedicines Agency,EMA)inameriškaUpravazaživi- lainzdravila(FoodandDrugAdministra- tion,FDA).Natržiščujeomejennaborte- rapevtskihplazmidovzazdravljenjeraka. Zatosevnaširaziskovalniskupiniukvar- jamospripravolastnihplazmidov,takoda preurejamo in spreminjamo različne se- stavnedelegledenapredvidenouporabo plazmida.Glavnesestavnedeleplazmidnih vektorjevlahkodelimonaekspresijskoka- seto,kinosinaš transgen, inbakterijsko ogrodje,kigapotrebujemozaproizvodnjo plazmidovvbakterijah(slika2). Gen za od por nost pro ti an ti bio ti ku Bakterijskoogrodjenosizapiszaselekcij- skioznačevalec,kijeobičajnogenzaodpor- nostprotiantibiotiku,karjeprikliničniupo- rabilahkosporno(58–60). Obstajanamreč tveganjezahorizontalniprenosodpornosti naokoljskeinkomenzalnemikroorganizme tertveganjezaalergijskiodzivnaostanke antibiotika,kiseuporabljapriproizvodnji plazmidov(60, 61).Zatonadzorniagenciji, odgovornizalicenciranjezdravil,EMAin FDA,priporočataizogibanjegenomzaod- pornostalivsajuporaboodpornostiproti takšnimantibiotikom,kiseneuporablja- jozazdravljenjeljudi(62, 63).Takoplazmid, kiseuporabljavameriškihkliničnihrazi- skavah,vsebujegenzaodpornostprotika- namicinu,kisezazdravljenjeljudipraktično neuporablja(54). Dabizadostilivarnostnimpriporočilom, soznanstvenikirazvilištevilnenadomestne načinezapripravoplazmidov,kinetemelji- jonaselekcijizantibiotikom.Edentakšnih načinov je operator-represorska titracija (ORT), ki jo je razvilo podjetje CobraBio (Keele,ZdruženokraljestvoVelikeBritani- jeinSeverneIrske) (64).ORTtemeljinado- polnitviavksotrofije(tj.nezmožnostorga- nizmazaizdelovanjedoločenesnovi,kijo potrebujezasvojorast)priposebnemmu- tiranemsevubakterijEs he ric hia coli.Vnos plazmidovvbakterijerazrešiavksotrofijo, saj omogoči izražanje manjkajoče esen- cialneaminokisline.ORTsouporabilizapri- pravoplazmidovzacepljenjezDNAproti virusuHIVinplazmidasprotiangiogenim delovanjem(angl.an tian gio ge nic me tar gi din pep ti de,AMEP),kisogapreizkusilivedi- ni evropski klinični raziskavi genskega elektroprenosa(65, 66).ORTuporabljatudi naša raziskovalna skupina in smo z njo pripraviliževečplazmidov(67–71). Poleg očitnihvarnostnihprednostisoplazmidi, pripravljenina tanačin, tudimanjši,kar zagotavljavečjouspešnosttransfekcijein manjšoimunogenost,sajjezmanjšanbak- terijskidelplazmida(72, 73). Eks pre sij ska ka se ta Dejavnidelplazmidnegavektorja jeeks- presijskakasetastransgenominnadzorno 10 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 10 regijo,tj.promotor,kinadzorujeizražanje transgena.Promotornajbipodpiraldolgo- trajnoizražanjetransgenaalipavsajnad- zorovano izražanje (57). V preteklosti je večinaplazmidovvsebovalacitomegalovi- rusni (CMV)promotor.Zdajpavemo,da CMV-promotorvčasihnezagotavljadolgo- trajnegaizražanja,sajjezaradivirusnega izvoradovzetenzatranskripcijskoutišanje vevkariontskihcelicah(74).Tosmopoka- zali tudinaOddelkuzaeksperimentalno onkologijoveniizmedraziskavgenskega elektroprenosa(75).Polegtegaseizražanje podnadzoromCMV-promotorjasprožitudi vstresnihpogojih,npr.poobsevanju.Zato sezadnječasenamestovirusnihpromotor- jevvednoboljuporabljajocelicamlastni promotorji(76). Primernazamenjavazavirusnepromo- torje s stalnim izražanjem (konstitutivni promotorji)sopromotorjiceličnihhišnih genov(angl.hou se kee ping ge nes),kisestalno izražajovvsehtkivihtelesa.Semspadajo npr.promotorgenazapodaljševalnidejav- nik1α (angl.elon ga tion fac tor 1α, EF-1α),za ubikvitinCalizafosfogliceratkinazo1(57). V pristopu, imenovanem transkripcijsko ciljanje,pauporabimopromotorjegenov,ki seizražajosamovnekaterihtkivih(tkivno specifičnipromotorji)alipostanejodejav- nipodvplivomdoločenihzunanjihalino- tranjihdejavnikov(inducibilnipromotorji). Med tkivno specifične promotorje spada npr.promotorgenazaendoglin,kiseizraža levžilah,medinducibilnimipromotorjipa jenajboljznantetraciklin-inducibilnipro- motor(angl.te tracyc li ne res pon sive ele ment, TRE)(57, 77–81). NaOddelkuzaeksperimentalnoonko- logijosmopreizkusiliževečtkivnospeci- fičnihpromotorjev(67).Zanajuspešnejšega oz.najboljuporabnegazapotrebegenskega elektroprenosa se je izkazal kolagenski promotor(68, 80).Tapromotornamreč omo- goča specifično izražanje v fibroblastih, kar je ustrezno, kadar želimo izražanje vkožialikadarciljamorakavomikrookolje. 11MedRazgl.2020;59(1): Preizkusilismotudiinducibilnipromotor genazaodciklinaodvisnikinazniinhibi- tor 1 (angl.cyclin-de pen dent ki na se in hi bi tor 1, CDKN1A),boljznanegakotp21.Genp21 sepovišanoprepisujeobgenotoksičnem stresu,zatojenjegovpromotoruporaben, kadar želimo združiti gensko zdravljenje skemoterapijoaliradioterapijo(81, 82). Glavnidelekspresijskekasetejezapisza transgen,tj.gen,kateregaizražanježelimo koristitivzdravstvenenamene.Izberemojih lahkoizštirihrazličnihrazredov(tabela1). Lahkodelamozamenjavoalipopravilook- varjenihgenov,kerpajerakposledicašte- vilnihmutacij,tapristopnivednonajbolj smiselninučinkovit.Primernejšisopristo- pi,prikaterihsprožimosmrtrakavihcelic. Tolahkodosežemozneposrednimciljanjem rakavihcelicstransfekcijosamomorilskih alicitotoksičnihgenov(genskakemoterapi- ja),posrednosciljanjemrakavegažilja(žilno ciljanogenskozdravljenje),alipašebolje, ssprožitvijoprotirakavegaimunskegaod- ziva(genskoimunološkozdravljenje).Pri- stopislednjegavključujejocepljenjezDNA, torejvnoszapisazarazličnetumorskean- tigene,intransfekcijoimunospodbujevalnih citokinov(83–85).Najboljeraziskaninnaj- pogostejeuporabljencitokinzagenskielek- troprenosjeIL-12(54, 86, 87).Tegapreiz- kušamotudivnaširaziskovalniskupini. GENSKI ELEKTROPRENOS INTERLEvKINa-12 IL-12jevnetnicitokin,kispodbujapriro- jeniinpridobljeniimunskiodzivtergavodi vsmernastankacelicT-pomagalk1(angl. hel per T-cells 1, Th1). Posledično vodi vsprožitevdelovanjacitotoksičnihlimfo- citovTinnaravnihcelicubijalk,kisošepo- sebejpomembnezarazvojimunskegaod- zivaprotirakavimcelicam(88, 89).IL-12 delujetudiprotiangiogenoinspodbujana- stanekkemokinov,zatojenujno,dagado- stavimosamovnovotvorbo(42, 90).Toso dokazalivprvihkliničnihraziskavah,kjer sejesistemskivnosrekombinantnegaIL-12 mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 11 izkazalzaškodljivega(91–93).Genskielek- troprenosjetakopopolnzadostavoIL-12 neposrednovnovotvorbe(lokalnadostava), karsodokazalivštevilnihpredkliničnihra- ziskavah(87).LokalnadostavaIL-12zgen- skim elektroprenosom je dosegla že kli- nično fazo preizkušanja v ZDA. V prvi kliničniraziskavinabolnikihzrazsejanim melanomomsopokazali,dajepristopva- renintudiučinkovit,takolokalnokottudi sistemsko,sajsozabeležilicelooddaljeni učineknanezdravljenezasevkedrugjena telesu(52, 54).Pristopsezdajrazvijanaprej zazdravljenjedrugihtipovpovršinskihno- votvorbinzdruženospembrolizumabom (94).Polegtegajepristoppredkratkimod FDA pridobil položaj zdravila sirote za zdravljenjerazsejanegamelanoma,kinipri- merenzakirurškozdravljenje(95). Zanimivoje,dakljubvelikiučinkovito- stiomenjenegapristopaIL-12nineposred- noškodljivza rakavecelice indeluje iz- ključno preko sprožitve in pospešitve imunskega odziva (89). Zato je genski elektroprenosIL-12uporabentudizado- dajanjekcepivom(43–45). Trenutnopote- kakarnekajkliničnihraziskav,vkaterih preizkušajogenskielektroprenosIL-12za spodbujanjeimunološkegaodzivakcepi- vomzaaidsinhepatitis(96).Sevedapaje genskielektroprenosIL-12ustrezentudikot imunološkispodbujevaleckcepljenju in situ. CEPLJENJE IN SITU Z GENSKIM ELEKTROPRENOSOM Zauspešnocepljenjein situ potrebujemolo- kalno ablacijsko zdravljenje, ki ga lahko opravimozgenskimelektroprenosomgena scitotoksičnimproduktom.Vnaširaziska- vismoseodločilizagenzadejavniktumor- skenekrozeα (angl.tu mor ne cro sis fac tor α, TNF-α).TNF-α jeimeočitnodobilpospo- sobnosti,dapovzročanekrozonovotvorb. Kasnejesoznanstvenikidoločili,dapov- zročaapoptozorakavihcelic,zdajpapostaja jasno,dacelicevprisotnostiTNF-α vbis- tvuumirajoznekroptozo,kijeimunogena oblikaprogramiraneceličnesmrti.Sicerpa jeTNF-α imunospodbujevalencitokininje kottaktrenutnotudivuporabivkliničnem deluvobliki rekombinantnebeljakovine (97).Polegspodbujanjaimunskegaodziva imatudimočnoneposrednoprotirakavode- lovanjeprekocitotoksičnegaučinkanara- 12 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka Ta be la 1. Delitevtransgenovzarazličnevrstegenskegazdravljenja(81).p53 –beljakovina53(angl.pro - tein 53),CTS1 –himernitumorskizaviralec1(angl.chi me ric tu mor sup pres sor 1),anti-Bcl-2 –utišanjegena zaB-celičnilimfom2(angl.B-cell lympho ma 2),anti-survivin –utišanjegenazasurvivin,HSV-tk –timidin- skakinazavirusaherpessimpleks(angl.her pes sim plex vi rus thymi di ne ki na se),CD –citozinskadeaminaza, CD/HSV-tk –združengenzacitozinskodeaminazointimidinskokinazovirusaherpessimpleks(angl.cytosine dea mi na se/her pes sim plex vi rus thymi di ne ki na se fu sion gene),HRP –hrenovaperoksidaza(angl.hor se - ra dish pe ro xi da se),IAA –indolocetnakislina(angl. in dol-3-ace tic acid),iNOS –inducibilnasintaza dušikove- gaoksida(angl.in du cib le nitric oxi de syntha se),TNF-α –dejavniktumorskenekrozeα (angl.tumor ne cro sis fac tor α),anti-VEGF –utišanjegenazažilnirastnidejavnik(angl.vas cu lar en dot he lial growth factor),sFlt-1 – topnamačjemuMcDonoughovemusarkomupodobnatirozinkinaza1(angl.so lub le feline Mc Donough sar - co ma-like tyro si ne ki na se 1),anti-endoglin –utišanjegenazaendoglin,IL-12 –interlevkin-12,IFN-α –inter- feronα,GM-CSF –granulocitneinmonocitnekolonijespodbujajočidejavnik(angl.gra nu locy te macrop ha ge co lony-sti mu la ting fac tor),PSA –zaprostatospecifičniantigen,MAGE –genmelanomskegaantigena(angl. me la no ma an ti gen gene). Stra te gi ja gen ske te ra pi je Trans ge ni Zamenjavaalipopravilookvarjenihgenov p53,CTS1,anti-Bcl-2,anti-survivin Genskakemoterapija HSV-tk,CD,CD/HSV-tk;HRP,IAA,iNOS,TNF-α Žilnociljanogenskozdravljenje anti-VEGF,sFlt-1,anti-endoglin,TNF-α,IL-12 Genskoimunološkozdravljenje IL-12,TNF-α,IFN-α,GM-CSF,tumorskiantigeni:PSA,MAGE mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 12 kaveceliceinžilnorazdiralnihučinkov(98). SistemskadostavaTNF-α ješkodljiva,zato se trenutno rekombinantni TNF-α v kli- ničnemdeluuporabljasamozaizolirano perfuzijoudovzazdravljenjenapredovanih rakovnaokončinah(99–101).Vpreteklosti sopreizkusilitudižedostavoTNF-α,ome- jenonanovotvorbo z različnimipristopi genskegazdravljenja(102, 103).Mednjimi sejezanajučinkovitejšegaizkazalTNFerade® (GenVecInc.),adenovirusnivektorzaizra- žanjeTNF-α podnadzorominducibilnega promotorja,kiseaktivirazradioterapijo. TNFerade®jeprišeldotretjefazekliničnih raziskavzazdravljenjerakatrebušneslinav- ke,vendarjebilanjegovaučinkovitostpre- nizka,dabiprišelvsplošnokliničnoupo- rabo. Lokalnadostavavnovotvorbopaje možnatudizgenskimelektroprenosom. Prednost genskega elektroprenosa je, dalahkovnašamovečgenovhkrati(104, 105). Topomeni,dalahkohkratisTNF-α vnašamo tudigenzaspodbujevalcaimunskegaodzi- va.Vnaširaziskavismoizbraližepreizkušen IL-12.Dodatnaprednostuporabegenskega elektroprenosazacepljenesoimunospodbu- jevalniučinkisameDNA,kijovnašamovce- lice(106).Kotžeomenjeno,DNAlahkode- lujekotpomembenDAMP,šeposebejtuja DNA.Vnaširaziskovalniskupinivsodelo- vanjuskolegizuniverzeOldDominionUni- versityvNorfolkuvZDAnamrečugotav- ljamo,dagrevelikdeluspešnostigenskega elektroprenosadejanskopripisatisprožitvi imunskegaodzivaprotivnesenitujiDNA in nesamoizražanjuterapevtskebeljakovi- ne (107, 108). PolegvnašanjatujeDNApa sproščanje DAMP lahko povzroči že tudi samaelektroporacija(109–111). DOKaZ KONCEPTa Našahipotezaje,dalahkouspešnoceplje- njein situ dosežemoshkratnimelektropre- nosomgenovzaTNF-α inIL-12(slika3). 13MedRazgl.2020;59(1): Sli ka 3.Prikazcepljenjain situ s hkratnimelektroprenosomgenovTNF-α inIL-12.DAMP –sporočevalcinevarno- sti(angl.da ma ge-as so cia ted mo le cu lar pat tern),TAA –tumorskiantigeni(angl.tu mor-as so ciated an ti gens),DC – dendritskecelice,IL-12 –interlevkin-12,TNF-α –dejavniktumorskenekrozeα (angl. tumor ne cro sis fac tor α). mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 13 14 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka Sli ka 4. Sistemskiučinkipolokalnemzdravljenju.Pribolnikuz razsejanoboleznijoz lokalnimzdravljenjem primarnenovotvorbesprožimosistemskiimunskiodzivprotirakavimcelicamins temuničenjezasevkov terpopolnoozdravitevbolnika. PritemnajbigenskielektroprenosTNF-α igralvlogolokalnegaablacijskegazdravlje- nja,kipovzročicepljenjein situ protitumor- skimantigenom,sproščenimizubitihcelic, genskielektroprenosIL-12pakotspodbu- jevalecimunskegaodziva,kisproženiimun- skiodzivpospešiinrazširivsistemskiter trajenodziv(slika4). Predvidenpotekdogodkovpogenskem elektroprenosuTNF-α inIL-12jeprikazan nasliki3:izražanjeTNF-α vrakavihceli- cahpovzročiumiranjeceliczimunogeno oblikoceličnesmrti,karpomeni,dase hkra- tisproščajotumorskiantigeniinDAMP.Tu- morskeantigeneujamejodendritskecelice, kijihpritegnejoDAMPinIL-12,kise izraža iz transfeciranih celic. Dendritske celice natopotujejovbezgavke,kjersprožijonam- noževanje efektorskihlimfocitovprotipred- stavljenimtumorskimantigenom.Nasta- leimunskecelicepotempokrvipotujejo vnovotvorbo invoddaljenezasevke,kjer napadejorakavecelice. Hipotezosmodosedajpreizkusilina mišjemtumorskemmodelumelanoma(112). Rezultatisopotrdiliizvedljivostpristopa, sajsmovzdravljenihnovotvorbahdokaza- li izražanje obeh citokinov, kar je pov- zročiloizrazitzaostanekvrastinovotvorb vzdravljeniskupini,podaljšanopreživetje inskoraj80% popolnihozdravitev.Spro- žitevprotirakavegaimunskegaodzivajepo- trdilobseženvdorefektorskih limfocitov vzdravljenenovotvorbeinnamnoževanje efektorskihlimfocitovvbezgavkah.Vse oz- dravljeneživalisotudizavrnilenastanek novotvorbpoponovnemizzivuzrakavimi celicami 100 dni po izginotju novotvorb mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 14 (primerljivopetletnemupreživetjuprilju- deh),karnakazujenanastanekimunskega spomina.Polegtegajeprivsehozdravlje- nihmišihnamestu,kjerjebilanovotvor- ba,prišlodorazbarvanjadlakeoz.vitiliga. Tojelokalenavtoimunskiodziv,kijeprav- zapravdokazuspešnosticepljenja in situ,saj jeočitnoprišlodorazširitveimunskegaod- zivaprotirakavimcelicam,kivsebujejoveli- komelanina,nanormalnemelanocite(113). ODPRTa vPRašaNJa Učinkovitostcepljenja in situ shkratnim genskimelektroprenosomTNF-α inIL-12 smotorejdokazali,vendarzazdajsamona enemtumorskemmodelu,tj.mišjemmela- nomu.Odprtoostajavprašanje,alijepristop učinkovit tudinadrugihmišjihmodelih rakainpapredvsem,nakateretipečlove- škegarakajemoženprenostegaznanja.Ker pricepljenjuin situ izkoriščamolastnetu- morske antigene, ima pristop načeloma možnostzaučinkovitostprotirazličnimti- pomraka. Nauspešnostimunološkegazdravljenja nasplošnovplivapredvsemantigenost no- votvorbe(tj.sposobnostpovzročitipridob- ljenimunskiodziv)innjenomikrookolje (114, 115). Vzadnjemdesetletjusejepoja- vilapreprostadelitevnovotvorbgledena mikrookoljev»hladne«in»vroče«napodla- giravnivdoraimunskihcelicvnovotvorbo, karodraža,aliimunskisistemprepoznava inseboriprotinovotvorbialine(116).Vroči tumorjivsebujejovelikošteviloimunskih celic,hladnipamalo.Vdorimunskihcelic vnovotvorbejeposledicanjenetujostioz. antigenosti, kipa jeodvisnaodmutacij- skega bremena. Novotvorbe z visokim bremenomsomočnospremenjene,zatojih imunskisistemlažjezaznainvanjevdre več imunskihcelic.Takšnenovotvorbelah- ko skozipostopekimunskegapreurejanja (angl.im mu noe di ting)hitropostanejoimun- sko zavrte oz. sekundarnohladne (5). Po drugistranipasolahkonovotvorbetudiin- trinzičnohladne,kerimajonizkomutacij- skobremeinjihimunskisistemnitinezaz- na.Zapletenajetudidoločitevantigenosti novotvorbe,kinevključujesamomutacij- skega bremena, ampak tudi morebitne spremembe,kisoskoziprocesimunskega preurejanjanaredilenovotvorbomanjan- tigeno.Najboljznanaprilagoditevvisoko mutiranih novotvorb je npr. zmanjšano izražanje poglavitnegakompleksa tkivne skladnostirazreda1(angl.ma jor hi sto com - pa ti bility com plex class 1,MHC1)naraka- vihcelicah ins temskrivanjemutiranih antigenov,t. i.neoantigenov,predimunskim sistemom(117). Zzdravljenjem,kotjecepljenjein situ, kiizkoriščalastnetumorskeantigene,tako nemoremopozdravitinovotvorb,kisoin- trinzičnohladne.Primernapajezanovo- tvorbe z velikim številom neoantigenov. Če takšna novotvorba ne vsebuje veliko imunskihcelic,jesmiselnododatispodbu- jevalceimunskegaodziva.Čepanovotvor- bazvelikimštevilomneoantigenovvsebuje maloimunskihcelic,kerjeočitnožeposta- lasekundarnohladna,jesmiselnozdruženo zdravljenjezzaviralciimunskihkontrolnih točk(slika5) (118).Spodobnimidvomise zdravnikisoočajotudipriostalihpristopih imunološkegazdravljenja.Danessezatove- likopozornostinapodročjuimunoonkolo- gijenamenjaiskanjuustreznihnapovednih dejavnikov,kibodoonkologomvpomočpri odločanjuozdravljenju (119). ZaKLJUČEK Cepljenjein situ jeoblikaterapevtskegacep- ljenja,prikateriizkoristimobolnikulast- netumorskeantigene,takodazzdravlje- njemsprožimoimunskiodzivneposredno vnovotvorbi.NaOddelkuzaeksperimen- talnoonkologijosmopredlagaliintudido- kazali,dalahkocepljenjein situ dosežemo zgenskimelektroprenosomTNF-α inIL-12, kjerTNF-α igra vlogo lokalnega ablacij- skegazdravljenja,kipovzročicepljenjein situ protitumorskimantigenom,sprošče- nimizubitihrakavihcelic,genskielektro- 15MedRazgl.2020;59(1): mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 15 prenosIL-12pajespodbujevalecimunskega odziva,kižesproženiimunskiodzivpos- pešiinrazširivsistemskitertrajenodziv. Genskielektroprenosjenajuspešnejši način lokalnega vnosa genov, zapisanih naplazmidih, in vivo,kisehitropribližuje kliničniuporabi(54).Uporabenjetakoza cepljenjekottudilokalnociljanjezaradipro- storskenatančnosti,kijozagotavljaelek- troporacija.Slednjaimažedolgozgodovino kliničneuporabevelektrokemoterapiji (32). Plazmidejepodrugistranitrebašelevpe- ljativkliničnouporabo,pričemermoramo upoštevatistrogezahtevenadzornih agencij. Pripravitimoramoplazmidebrezgenovza odpornostprotiantibiotikominpripravljeni morajobitivpogojiht. i.dobreproizvodne prakse.Zatoželimovnaširaziskovalni sku- pinivsodelovanjuzdrugimislovenskimi znanstvenikiinindustrijoustvaritiploščad zaprenosznanja,kibopovezovalastrokov- njakezrazličnihpodročij:strokovnjake,ki načrtujejonoveplazmide, strokovnjake, ki proizvajajoteplazmidevkliničnikakovosti, strokovnjake,kinačrtujejoelektoporatorje,in strokovnjake,kivsetopreizkušajovpredkli- ničnihraziskavah.Našskupenciljbopripe- ljatipristopdokliničneuporabe,kjer bomo lahkozlokalnimzdravljenjemprimarneno- votvorbesprožilisistemskiimunskiodzivpro- tirakavimcelicaminstemuničenjezasevkov terpopolnoozdravitevbolnika(slika4). vIRI FINaNCIRaNJa Raziskavesobileizvedenevokviruprojek- taJ3-4259,kigafinanciraJavnaagencija zaraziskovalnodejavnostrepublikeSlove- nijevsklopuprogramaP3-0003.Delo je potekalovsklopuLEA-EBAM(Francosko- slovenskizdruženievropskilaboratorijza aplikacijepulznihelektričnihpoljvbiologi- ji inmedicini).Naložbostasofinancirala RepublikaSlovenija inEvropskiskladza regionalnirazvoj. 16 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka Sli ka 5. Izborimunološkegazdravljenjagledenavrstonovotvorbe(111).IL-2 –interlevkin-2,IFN-α –in- terferonα,GM-CSF –granulocitneinmonocitnekolonijespodbujajočidejavnik(angl.gra nu locy te ma crop - ha ge co lony-sti mu la ting fac tor),IL-12 –interlevkin-12,CTLA-4 –antigencitotoksičnihlimfocitovT4(angl. cyto to xic T-lymphocy te-as so ciated an ti gen 4),PD-1 –beljakovinaprogramiraneceličnesmrti1(angl.pro - gram med cell death pro tein 1),PD-L1 –ligandbeljakovineprogramiraneceličnesmrti1(angl.pro gram med cell death pro tein li gand 1),IDO –indolamin2,3-dioksigenaza,MDSC –mieloidnezaviralnecelice(angl.mye - loid-de ri ved sup pres sor cells),Treg –regulatornilimfocitT(angl.re gu la tory T-cells). mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 16 LITERaTURa 1. MehlenP,PuisieuxA.Metastasis:a questionoflifeordeath.NatRevCancer.2006;6(6):449–58. 2. BoonT,CerottiniJC,VandenEyndeB,etal.TumorantigensrecognizedbyTlymphocytes.AnnuRevImmunol. 1994;12(1):337–65. 3. GonzalezH,HagerlingC,WerbZ.Rolesoftheimmunesystemincancer:fromtumorinitiationtometastatic progression.GenesDev.2018;32(19–20):1267–84. 4. YoungJL,DeanDA.Electroporation-mediatedgenedelivery.AdvGenet.2015;89:49–88. 5. DunnGP,OldLJ,SchreiberRD.Theimmunobiologyofcancerimmunosurveillanceandimmunoediting.Immunity. 2004;21(2):137–48. 6. PrestwichRJ,ErringtonF,HatfieldP,etal.Theimmunesystem –isitrelevanttocancerdevelopment,progres- sionandtreatment?ClinOncol(RCollRadiol).2008;20(2):101–12. 7. OchsenbeinAF.Immunologicalignoranceofsolidtumors.SpringerSeminImmunopathol.2005;27(1):19–35. 8. MellmanI,CoukosG,DranoffG.Cancerimmunotherapycomesofage.Nature.2011;480(7378):480–9. 9. ChenDS,MellmanI.Elementsofcancerimmunityandthecancer-immunesetpoint.Nature.2017;541(7637): 321–30. 10. GalluzziL,VacchelliE,Bravo-SanPedroJM,etal.Classificationofcurrentanticancerimmunotherapies.Onco- target.2014;5(24):12472–508. 11. TangJ,ShalabiA,Hubbard-LuceyVM.Comprehensiveanalysisoftheclinicalimmuno-oncologylandscape. AnnOncol.2018;29(1):84–91. 12. EuropeanMedicinesAgency:FirsttwoCAR-TcellmedicinesrecommendedforapprovalintheEuropeanUnion: developmentofKymriahandYescartasupportedthroughPRIME[internet].2018[citirano2018Dec6].Doseg- ljivona:https://www.ema.europa.eu/en/documents/press-release/first-two-car-t-cell-medicines-recommen- ded-approval-european-union_en.pdf 13. ZitvogelL,KroemerG.Introduction:theimmuneresponseagainstdyingcells.CurrOpinImmunol.2008;20 (5):501–3. 14. denBrokMH,SutmullerRP,vanderVoortR,etal.Insitutumorablationcreatesanantigensourceforthe generationofantitumorimmunity.CancerRes.2004;64(11):4024–9. 15. ApetohL,GhiringhelliF,TesniereA,etal.Cancerisnotjusta diseaseofa tissue:itisa hostdisease.Howto reactivatehostdefenseagainsttumorsusingconventionaltherapiesofcancer?AnnEndocrinol.2008;69(2): 151–2. 16. TesniereA,ApetohL,GhiringhelliF,etal.Immunogeniccancercelldeath:a key-lockparadigm.CurrOpinImmunol. 2008;20(5):504–11. 17. GhiringhelliF,ApetohL,HousseauF,etal.Linksbetweeninnateandcognatetumorimmunity.CurrOpin Immunol.2007;19(2):224–31. 18. KeppO,SenovillaL,VitaleI,etal.Consensusguidelinesforthedetectionofimmunogeniccelldeath.Oncoim- munol.2014;3(9):e955691. 19. ApetohL,GhiringhelliF,TesniereA,etal.Molecularinteractionsbetweendyingtumorcellsandtheinnate immunesystemdeterminetheefficacyofconventionalanticancertherapies.CancerRes.2008;68(11):4026–30. 20. HeS,MaoX,SunH,etal.Potentialtherapeutictargetsintheprocessofnucleicacidrecognition:opportunities andchallenges.TrendsPharmacolSci.2015;36(1):51–64. 21. JounaiN,KobiyamaK,TakeshitaF,etal.Recognitionofdamage-associatedmolecularpatternsrelatedto nucleicacidsduringinflammationandvaccination.FrontCellInfectMicrobiol.2013;2:168. 22. DempseyA,BowieAG.InnateimmunerecognitionofDNA:a recenthistory.Virology.2015;479–80: 146–52. 23. DeplanqueG,ShabafrouzK,ObeidM.CanlocalradiotherapyandIL-12synergisetoovercometheimmuno- suppressivetumormicroenvironmentandallow»insitutumorvaccination«?CancerImmunolImmunother. 2017;66(7):833–40. 24. PierceRH,CampbellJS,PaiSI,etal.In-situtumorvaccination:bringingthefighttothetumor.HumVaccines Immunother.2015;11(8):1901–9. 25. SeršaG,TeissieJ,ČemažarM,etal.Electrochemotherapyoftumorsasinsituvaccinationboostedbyimmu- nogeneelectrotransfer.CancerImmunolImmunother.2015;64(10):1315–27. 26. StevensonFK,OttensmeierCH,RiceJ.DNAvaccinesagainstcancercomeofage.CurrOpinImmunol.2010; 22(2):264–70. 17MedRazgl.2020;59(1): mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 17 27. JacobsJJ,SnackeyC,GeldofAA,etal.Inefficacyoftherapeuticcancervaccinesandproposedimprovements. Casusofprostatecancer.AnticancerRes.2014;34(6):2689–700. 28. HammerichL,BinderA,BrodyJD.Insituvaccination:cancerimmunotherapybothpersonalizedandoff-the- shelf.MolOncol.2015;9(10):1966–81. 29. BartlettDL,LiuZ,SathaiahM,etal.Oncolyticvirusesastherapeuticcancervaccines.MolCancer.2013;12 (1):103. 30. NierkensS,denBrokMH,RuersTJ,etal.Radiofrequencyablationincancertherapy:tuningintoin situ tumor vaccines.In:KeisariY,ed.Tumorablation:effectsonsystemicandlocalanti-tumorimmunityandonother tumor-microenvironmentinteractions.Dordrecht:SpringerNetherlands;2013.p.39–59. 31. MiklavčičD,MaliB,KosB,etal.Electrochemotherapy:fromthedrawingboardintomedicalpractice.Biomed EngOnline.2014;13(1):29. 32. CampanaLG,MiklavčičD,BertinoG,etal.Electrochemotherapyofsuperficialtumors–currentstatus:basic principles,operatingprocedures,sharedindications,andemergingapplications.SeminOncol.2019;46(2): 173–91. 33. KotnikT,RemsL,TarekM,etal.Membraneelectroporationandelectropermeabilization:mechanismsand models.AnnuRevBiophys.2019;48:63–91. 34. SeršaG,MiklavčičD,ČemažarM,etal.ElectrochemotherapywithCDDPonLPBsarcoma:comparisonofthe anti-tumoreffectivenessinimmunocompetentandimmunodeficientmice.BioelectrochemBioenerg.1997; 43(2):279–83. 35. RouxS,BernatC,Al-SakereB,etal.TumordestructionusingelectrochemotherapyfollowedbyCpGoligo- deoxynucleotideinjectioninducesdistanttumorresponses.CancerImmunolImmunother.2008;57(9):1291–300. 36. GerliniG,SestiniS,DiGennaroP,etal.Dendriticcellsrecruitmentinmelanomametastasistreatedbyelec- trochemotherapy.ClinExpMetastasis.2013;30(1):37–45. 37. MaliB,JarmT,SnojM,etal.Antitumoreffectivenessofelectrochemo-therapy:a systematicreviewandmeta- analysis.EurJSurgOncol.2013;39(1):4–16. 38. WennerbergE,LhuillierC,Vanpouille-BoxC,etal.Barrierstoradiation-inducedin situ tumorvaccination. FrontImmunol.2017;8(10):229. 39. RödelF,FreyB,MulthoffG,etal.Contributionoftheimmunesystemtobystanderandnon-targetedeffects ofionizingradiation.CancerLett.2015;356(1):105–13. 40. ReyndersK,IllidgeT,SivaS,etal.Theabscopaleffectoflocalradiotherapy:usingimmunotherapytomake a rareeventclinicallyrelevant.CancerTreatRev.2015;41(6):503–10. 41. LimYT.Vaccineadjuvantmaterialsforcancerimmunotherapyandcontrolofinfectiousdisease.ClinExp Vaccine Res.2015;4(1):54–8. 42. LasekW,ZagozdzonR,JakobisiakM.Interleukin12:stilla promisingcandidatefortumorimmunotherapy? CancerImmunolImmunother.2014;63(5):419–35. 43. JacobsonJM,ZhengL,WilsonCC,etal.Thesafetyandimmunogenicityofaninterleukin-12–enhancedmul- tiantigenDNAvaccinedeliveredbyelectroporationforthetreatmentofHIV-1infection.JAcquirImmuneDefic Syndr.2016;71(2):163–71. 44. FournillierA,FrelinL,JacquierE,etal.A heterologousprime/boostvaccinationstrategyenhancestheimmu- nogenicityoftherapeuticvaccinesforhepatitisCvirus.JInfectDis.2013;208(6):1008–19. 45. JalahR,PatelV,KulkarniV,etal.IL-12DNAasmolecularvaccineadjuvantincreasesthecytotoxicTcellrespon- sesandbreadthofhumoralimmuneresponsesinSIVDNAvaccinatedmacaques.HumVaccinesImmunother. 2012;8(11):1620–9. 46. KumarSR,MarkusicDM,BiswasM,etal.Clinicaldevelopmentofgenetherapy:resultsandlessonsfromrecent successes.MolTherMethodsClinDev.2016;3:16034. 47. DunbarCE,HighKA,JoungJK,etal.Genetherapycomesofage.Science.2018;359(6372):4672. 48. ElsabahyM,NazaraliA,FoldvariM.Non-viralnucleicaciddelivery:keychallengesandfuturedirections.Curr DrugDeliv.2011;8(3):235–44. 49. RosazzaC,HaberlMegličS,ZumbuschA,etal.Geneelectrotransfer:a mechanisticperspective.CurrGene Ther.2016;16(2):98–129. 50. GothelfA,GehlJ.Electroporation-basedDNAdeliverytechnology:methodsforgeneelectrotransfertoskin. MethodsMolBiol.2014;1143:115–22. 51. LambrichtL,LopesA,KosS,etal.ClinicalpotentialofelectroporationforgenetherapyandDNAvaccinedelivery. ExpertOpinDrugDeliv.2016;13(2):295–310. 18 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 18 52. DaudAI,DeContiRC,AndrewsS,etal.PhaseItrialofinterleukin-12plasmidelectroporationinpatientswith metastaticmelanoma.JClinOncol.2008;26(36):5896–903. 53. ChaE,DaudA.PlasmidIL-12electroporationinmelanoma.HumVaccinImmunother.2012;8(11):1734–8. 54. CantonDA,ShirleyS,WrightJ,etal.Melanomatreatmentwithintratumoralelectroporationoftavokinogene telseplasmid(pIL-12,tavokinogenetelseplasmid).Immunotherapy.2017;9(16):1309–21. 55. TrimbleCL,MorrowMP,KraynyakKA,etal.Safety,efficacy,andimmunogenicityofVGX-3100,a therapeutic syntheticDNAvaccinetargetinghumanpapillomavirus16and18E6andE7proteinsforcervicalintraepithelial neoplasia2/3:a randomised,double-blind,placebo-controlledphase2btrial.Lancet.2015;386(10008):2078–88. 56. VasanS,HurleyA,SchlesingerSJ,etal.InvivoelectroporationenhancestheimmunogenicityofanHIV-1DNA vaccinecandidateinhealthyvolunteers.PLoSOne.2011;6(5):e19252. 57. TolmachovO.Designingplasmidvectors.MethodsMolBiol.2009;542:117–29. 58. HusainSR,HanJ,AuP,etal.Genetherapyforcancer:regulatoryconsiderationsforapproval.CancerGene Ther. 2015;22(12):554–63. 59. VandermeulenG,MarieC,SchermanD,et.al.Newgenerationofplasmidbackbonesdevoidofantibioticresi- stancemarkerforgenetherapytrials.MolTher.2011;19(11):1942–9. 60. MignonC,SodoyerR,WerleB.Antibiotic-freeselectioninbiotherapeutics:nowandforever.Pathogens.2015; 4(2):157–81. 61. SolenskyR.Hypersensitivityreactionstobeta-lactamantibiotics.ClinRevAllergyImmunol.2003;24(3):201–19. 62. TheEuropeanAgencyfortheEvaluationofMedicinalProducts:Guidelineonthequality,non-clinicaland clinical aspectsofgene therapymedicinalproducts [internet].2018 [citirano2018Dec6].Dosegljivona: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-as- pects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf 63. U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,FoodandDrugAdministration,CenterforBiologicsEvaluation andResearch.Guidanceforindustry:considerationsforplasmidDNAvaccinesforinfectiousdiseaseindications. BiotechnolLawRep.2007;26(6):641–8. 64. CranenburghRM,HanakJA,WilliamsSG,etal.Esc he ric hia coli strainsthatallowantibiotic-freeplasmidselec- tionandmaintenancebyrepressortitration.NucleicAcidsRes.2001;29(5):26. 65. Cranenburgh RM. Operator-repressor titration: stable plasmidmaintenance without selectable marker genes.In:SchleefM,ed.MinicircleandminiplasmidDNAvectors:thefutureofnonviralandviralgenetransfer. NewJersey:Wiley;2013.p.7–21. 66. SpanggaardI,SnojM,CavalcantiA,etal.Geneelectrotransferofplasmidantiangiogenicmetargidinpepti- de(AMEP)indisseminatedmelanoma:safetyandefficacyresultsofa phaseIfirst-in-manstudy.HumGene TherClinDev.2013;24(3):99–107. 67. KamenšekU,TešićN,SeršaG,etal.Constructingclinicallyapplicableplasmidsforcancergenetherapy.In: JarmT,KramarP,eds.1stWorldcongressonelectroporationandpulsedelectricfieldsinbiology,medicine andfood&environmentaltechnologies.Vol53.Singapur:Springer;2016.p.313–6. 68. KamenšekU,TešićN,SeršaG,etal.Tailor-madefibroblast-specificandantibiotic-freeinterleukin12plasmid forgeneelectrotransfer-mediatedcancerimmunotherapy.Plasmid.2017;89:9–15. 69. TešićN,KamensekU,SeršaG,etal.Evaluationofsmoothmuscleγ actinpromotersuitabilityfortissue-specific genedeliveryofinterleukin-12.In:JarmT,KramarP,eds.1stWorldcongressonelectroporationandpulsed electricfieldsinbiology,medicineandfood&environmentaltechnologies.Vol53.Singapur:Springer;2016. p.317–20. 70. KamenšekU,TešićN,SeršaG,etal.Clinicallyusableinterleukin12plasmidwithoutanantibioticresistance gene:functionalityandtoxicitystudyinmurinemelanomamodel.Cancers.2018;10(3):60. 71. LamprehtTratarU,KosS,KamenšekU,etal.Antitumoreffectofantibioticresistancegene-freeplasmids encodinginterleukin-12incaninemelanomamodel.CancerGeneTher.2018;25(9–10):260–73. 72. HornsteinBD,RomanD,Arévalo-SolizLM,etal.EffectsofcircularDNAlengthontransfectionefficiencyby electroporationintoHeLacells.PLoSOne.2016;11(12):e0167537 73. SumCH,WettigS,SlavcevRA.ImpactofDNAvectortopologyonnon-viralgenetherapeuticsafetyandefficacy. CurrGeneTher.2014;14(4):309–29. 74. BrooksAR,HarkinsRN,WangPY,etal.Transcriptionalsilencingisassociatedwithextensivemethylation oftheCMVpromoterfollowingadenoviralgenedeliverytomuscle.JGeneMed.2004;6(4):395–404. 75. KamenšekU,SeršaG,VidicS,etal.Irradiation,cisplatinand5-azacytidineup-regulatecytomegaloviruspromo- terintumorsandmuscles:implementationofnoninvasivefluorescenceimaging.MolImagingBiol.2011;13 (1): 43–52. 19MedRazgl.2020;59(1): mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 19 76. GillDR,PringleIA,HydeSC.Progressandprospects:thedesignandproductionofplasmidvectors.GeneTher. 2009;16(2):165–71. 77. ScottSD,JoinerMC,MarplesB.Optimizingradiation-responsivegenepromotersforradiogeneticcancertherapy. GeneTher.2002;9(20):1396–402. 78. RobsonT,HirstDG.Transcriptionaltargetingincancergenetherapy.JBiomedBiotechnol.2003;2003(2):110–37. 79. HallahanDE,MauceriHJ,SeungLP,etal.Spatialandtemporalcontrolofgenetherapyusingionizingradiation. NatMed.1995;1(8):786–91. 80. KosS,TešićN,KamenšekU,etal.ImprovedspecificityofgeneelectrotransfertoskinusingpDNAunder thecontrolofcollagentissue-specificpromoter.JMembrBiol.2015;248(5):919–28. 81. KamenšekU,SeršaG.Targetedgenetherapyinradiotherapy.RadiolOncol.2008;42(3):115–35. 82. KamenšekU,SeršaG,ČemažarM.Evaluationofp21promoterforinterleukin12radiationinducedtranscrip- tionaltargetingina mousetumormodel.MolCancer.2013;12(1):136. 83. TütingT,StorkusWJ,LotzeMT.Gene-basedstrategiesfortheimmunotherapyofcancer.JMolMed.1997; 75(7):478–91. 84. RibasA,WolchokJD.Cancerimmunotherapyusingcheckpointblockade.Science.2018;359(6382):1350–5. 85. RosenbergSA.Immunotherapyandgenetherapyofcancer.CancerRes.1991;51(18):5074–9. 86. YamashitaYI,ShimadaM,HasegawaH,etal.Electroporation-mediatedinterleukin-12genetherapyforhepa- tocellularcarcinomainthemicemodel.CancerRes.2001;61(3):1005–12. 87. ČemažarM,JarmT,SeršaG.Cancerelectrogenetherapywithinterleukin-12.CurrGeneTher.2010;10(4): 300–11. 88. TrinchieriG.Interleukin-12:a proinflammatorycytokinewithimmunoregulatoryfunctionsthatbridgeinnate resistanceandantigen-specificadaptiveimmunity.AnnuRevImmunol.1995;13:251–76. 89. TuguesS,BurkhardSH,OhsI,etal.NewinsightsintoIL-12-mediatedtumorsuppression.CellDeathDiffer. 2015;22(2):237–46. 90. JinushiM,TaharaH.Cytokinegene-mediatedimmunotherapy:currentstatusandfutureperspectives.Cancer Sci.2009;100(8):1389–96. 91. CohenJ.IL-12deaths:explanationanda puzzle.Science.1995;270(5238):908. 92. LotzeMT,ZitvogelL,CampbellR,etal.Cytokinegenetherapyofcancerusinginterleukin-12:murineand clinicaltrials.AnnNYAcadSci.1996;795:440–54. 93. LeonardJP,ShermanML,FisherGL,etal.Effectsofsingle-doseinterleukin-12exposureoninterleukin-12- associatedtoxicityandinterferon-gammaproduction.Blood.1997;90(7):2541–8. 94. ClinicalTrials.gov:interleukin12electroporation|cancer[internet].Bethesda:U.S.NationalLibraryofMe- dicine[citirano2018Dec6].Dosegljivona:https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=interleukin+12+elec- troporation&cond=cancer 95. Immuno-oncologynews:MetastaticmelanomatherapycandidateImmunoPulseIL-12winsFDAorphandrug status[internet].Philadelphia:Immuno-OncologyNews;c2013–2020[citirano2018Dec6].Dosegljivona: https://immuno-oncologynews.com/2017/06/13/oncosecs-metastatic-melanoma-therapy-candidate-pil- 12-granted-fda-orphan-drug-status/ 96. ClinicalTrials.gov:Interleukin12electroporationvaccine[internet].Bethesda:U.S.NationalLibraryofMedicine [citirano2018Dec6].Dosegljivona:https://clinicaltrials.gov/ct2/results?cond=&term=interleukin+12+elec- troporation+vaccin&cntry=&state=&city=&dist= 97. vanHorssenR,TenHagenTL,EggermontAM.TNF-alphaincancertreatment:molecularinsights,antitumor effects,andclinicalutility.Oncologist.2006;11(4):397–408. 98. RobertsNJ,ZhouS,DiazLAJr,etal.Systemicuseoftumornecrosisfactoralphaasananticanceragent. Oncotarget.2011;2(10):739–51. 99. HoekstraHJ,VeermanK,vanGinkelRJ.Isolatedlimbperfusionforin-transitmelanomametastases:melphalan orTNF-melphalanperfusion?JSurgOncol.2014;109(4):338–47. 100. vanGinkelRJ,ThijssensKMJ,PrasE,etal.Isolatedlimbperfusionwithtumornecrosisfactoralphaandmelpha- lanforlocallyadvancedsofttissuesarcoma:threetimeperiodsatriskforamputation.AnnSurgOncol.2007; 14(4):1499–506. 101. HayesAJ,NeuhausSJ,ClarkMA,etal.Isolatedlimbperfusionwithmelphalanandtumornecrosisfactor alphaforadvancedmelanomaandsoft-tissuesarcoma.AnnSurgOncol.2007;14(1):230–8. 102. HermanJM,WildAT,WangH,etal.RandomizedphaseIIImulti-institutionalstudyofTNFeradebiologic withfluorouracilandradiotherapyforlocallyadvancedpancreaticcancer:finalresults.JClinOncol.2013;30 (15):886–94. 20 UrškaKamenšek,GregorSerša Cep lje nje in situ z gen skim elek tro pre nosom za zdrav lje nje raka mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 20 103. HernandezJ,CooperJ,BabelN,etal.TNFalphagenedeliverytherapyforsolidtumors.ExpertOpinBiolTher. 2010;10(6):993–9. 104. QinW,DionSL,KutnyPM,etal.EfficientCRISPR/Cas9-mediatedgenomeeditinginmicebyzygoteelec- troporationofnuclease.Genetics.2015;200(2):423–30. 105. LambrichtL,VanvarenbergK,DeBeuckelaerA,etal.Coadministrationofa plasmidencodingHIV-1gagenhances theefficacyofcancerDNAvaccines.MolTher.2016;24(9):1686–96. 106. HerradaAA,Rojas-ColonelliN,Gonzalez-FigueroaP,etal.HarnessingDNA-inducedimmuneresponsesfor improvingcancervaccines.HumVaccinImmunother.2012;8(11):1682–93. 107. BošnjakM,JesenkoT,KamenšekU,etal.Electrotransferofdifferentcontrolplasmidselicitsdifferentantitumor effectivenessinB16.F10melanoma.Cancers.2018;10(2):37. 108. KamenšekU,RolsMP,ČemažarM,etal.Visualizationofnonspecificantitumoreffectivenessandvascular effectsofgeneelectro-transfertotumors.CurrGeneTher.2016;16(2):90–7. 109. RolsMP,TeissiéJ.Electropermeabilizationofmammaliancells.Quantitativeanalysisofthephenomenon. BiophysJ.1990;58(5):1089–98. 110. CalvetCY,FaminD,AndréFM,etal.Electrochemotherapywithbleomycininduceshallmarksofimmunogenic celldeathinmurinecoloncancercells.Oncoimmunology.2014;3(4):e28131. 111. KamenšekU,KosS,SeršaG.Adjuvantimmunotherapyasa tooltoboosteffectivenessofelectrochemothe- rapy.In:MiklavčičD,ed.Handbookofelectroporation.Cham:SpringerInternationalPublishing;2016.p.1–16. 112. KamenšekU,ČemažarM,LamprehtTratarU,etal.AntitumorinsituvaccinationeffectofTNFα andIL-12 plasmidDNAelectrotransferina murinemelanomamodel.CancerImmunolImmunother.2018;67(5):785–95. 113. TeulingsH,LimpensJ,JansenSN,etal.Vitiligo-likedepigmentationinpatientswithstageIII-IVmelanoma receivingimmunotherapyanditsassociationwithsurvival:a systematicreviewandmeta-analysis.JClinOncol. 2015;33(7):773–81. 114. WhitesideTL.Immuneresponsestomalignancies.JAllergyClinImmunol.2010;125(2):272–83. 115. BlankCU,HaanenJB,RibasA,etal.Cancerimmunology:the»cancerimmunogram«.Science.2016;352(6286): 658–60. 116. GalonJ,MlecnikB,BindeaG,etal.Towardstheintroductionofthe»Immunoscore«intheclassificationof malignanttumours.JPathol.2014;232(2):199–209. 117. BeckerJC,AndersenMH,SchramaD,etal.Immune-suppressivepropertiesofthetumormicroenvironment. CancerImmunolImmunother.2013;62(7):1137–48. 118. MakkoukA,WeinerGJ.Cancerimmunotherapyandbreakingimmunetolerance:newapproachestoanold challenge.CancerRes.2015;75(1):5–10. 119. InsightfromDana-Farbercancerinstitute:EnhancingImmunotherapy:theracetomakecoldtumorshot [internet].Boston:Dana-FarberCancerInstitute;2018[citirano2018Dec12].Dosegljivona:https://blog.dana- farber.org/insight/2018/06/enhancing-immunotherapy-race-make-cold-tumors-hot/ Prispelo15. 2. 2019 21MedRazgl.2020;59(1): mr20_1_Mr10_2.qxd 23.3.2020 10:27 Page 21