Centralni laboratorij MULTIREZIDUALNI GC-MS METODI ZA DOLOČANJE OSTANKOV FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV IZ OKOLJA V CVETNEM PRAHU IN MEDU Helena Baša Česnik Ljubljana 2021 Izdal in založil Kmetijski inštitut Slovenije Ljubljana, Hacquetova ulica 17 Avtor dr. Helena Baša Česnik, univ.dipl. inž. kemije Urejanje Lili Marinček Publikacija bo izšla v elektronski obliki in bo dostopna na spletni strani Kmetijskega inštituta Slovenije https://www.kis.si/Druge_publikacije/ Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID 70632707 ISBN 978-961-6998-48-2 (PDF) Vpeljava metod je bila financirana s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS), v okviru raziskovalnega programa št. P4-0133 iz državnega proračuna. 2 Vsebina 1 Uvod ……………………………………………………………………………………..……...… 4 2 Multirezidualna GC-MS metoda za določanje ostankov fitofarmacevtskih sredstev iz okolja v cvetnem prahu…………………………………………………….……………………. 5 2.1 Uvod …………………………………………………………………………………………..… 5 2.2 Ekstrakcija in čiščenje …………………………………………............................................ 5 2.3 Določitev ……………………………………………………………………………………..…. 6 2.4 Validacija ………………………………………..……………………………………………... 7 3 Multirezidualna GC-MS metoda za določanje ostankov fitofarmacevtskih sredstev iz okolja v medu ....…………………………………………………………………….................. 12 3.1 Uvod ……………………………………………………………………………………………. 12 3.2 Ekstrakcija …………………………………………............................................................ 12 3.3 Določitev ………………………………………………………………………………………. 13 3.4 Validacija ………………………………………..……………………………………………. 13 4 Zaključki …………………………………...…………………………………………...………... 21 5 Literatura ……………………..…………………………………………………………….……. 22 3 1 UVOD Cvetni prah je prehransko dopolnilo, ki je tako kot med spoštovan zaradi svoje hranilne vrednosti. Ker potrošniki na tržišču iščejo varna in kvalitetna živila, je v obeh živilih nujno spremljanje ostankov fitofarmacevtskih sredstev (FFS). Čebele letijo v radiju 4,8 km od čebelnjaka (Eckert; 1933), da nabirajo cvetni prah. Če se čebelnjaki nahajajo blizu obdelovalnih kmetijskih površin na katerih pridelovalci uporabljajo FFS, lahko čebele pridejo v stik z ostanki FFS preko nektarja, cvetnega prahu in listov rastline, ali preko zraka, prsti in vode, na katere je pri tretiranju zaneslo FFS (Crenna in sod.; 2020). Ostanke FFS tako čebele zanesejo v panj, od koder pridejo v med. Zato smo v Centralnem laboratoriju Kmetijskega inštituta Slovenije vpeljali dve multirezidualni metodi, s katerima lahko spremljamo ostanke FFS v cvetnem prahu in medu. Obe metodi smo objavili v znanstvenima člankoma (Baša Česnik; 2021, Baša Česnik in sod.; 2019). 4 2 MULTIREZIDUALNA GC-MS METODA ZA DOLOČANJE OSTANKOV FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV IZ OKOLJA V CVETNEM PRAHU 2.1 Uvod V literaturi obstajajo številne metode za določanje ostankov FFS v cvetnem prahu. Najmodernejši pristop je uporaba QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) metode, kjer ostanke FFS ekstrahirajo z acetonitrilom. Prednost tega topila je, da pri ekstrakciji zmanjšuje ko-ekstrakcijo beljakovin z njihovim obarjanjem (Wang in sod.; 2012) in omejuje topnost maščob (Lozano in sod.; 2014). Zato smo ga uporabili tudi v našem laboratoriju. Za čiščenje ekstraktov so v literaturi navedli uporabo: (a) primarnega sekundarnega amina (primary secondary amine, PSA), ki zadržuje maščobne kisline (Cabrera de Oliveria; 2016, Kasiotis in sod.; 2014, Stenerson; 2018), (b) PSA in C18 adsorbenta, kjer slednji odstranjuje maščobe (Lehotay; 2007, Mullin in sod.; 2010), (c) PSA, C18 in grafitiziranega črnega ogljika (Graphitized carbon black), kjer slednji odstranjuje planarne molekule, kot so pigmenti (npr. klorofil) (David in sod.; 2016, Stenerson; 2018) in (d) PSA in C18 in Z-Sep adsorbenta, kjer slednji odstranjuje oljne ostanke in nekatere pigmente (Hakme in sod.; 2017, Stenerson; 2018, Vázquez in sod.; 2015). V Centralnem laboratoriju, smo uporabili komercialno dostopne kolonce za ekstrakcijo na trdni fazi (Solid Phase Extraction, SPE) Supelclean Ultra 2400, ki vsebujejo Grapsphere (grafitiziran ogljik), PSA, C18 in Z-Sep. Na ta način smo združili vsa v literaturi poročana čiščenja ekstraktov. Določitev aktivnih spojin smo izvajali s plinskim kromatografom, sklopljenim z masnim spektrometrom (GC-MS). 2.2 Ekstrakcija in čiščenje K 10 g cvetnega prahu v čaši, smo dodali 50 ml acetonitrila. Z mikserjem smo vsebino čaše mešali 2 minuti. Mešanico smo pustili 30 minut, da se je trdna usedlina posedla na dno čaše. Tekoči del smo prenesli v 50 ml centrifugirko in ga centrifugirali 10 minut pri 7000 obratih na minuto. Tekočino nad oborino smo filtrirali preko 15 g brezvodnega Na2SO4 in filter papirja črni trak v 100 ml Soxhletovo bučko. Potem smo sedimentu v čaši dodali 30 ml acetonitrila in z mikserjem mešali 2 minuti. Vsebino čaše smo prenesli v že uporabljeno 50 ml centrifugirko. Sledilo je 10 minutno centrifugiranje pri 7000 obratih na minuto. Tekočino nad oborino smo filtrirali preko 15 g brezvodnega Na2SO4 in filter papirja črni trak v 100 ml Soxhletovo bučko iz prejšnjega koraka. Na2SO4 smo sprali s 15 ml acetonitrila. Nato smo odparili acetonitril v Soxhletovi bučki na rotavaporju do približno 2 ml in preostanek izpihali z dušikom do suhega. Suhi eluat smo raztopili v 1 ml acetonitrila s pomočjo ultrazvočne kopeli. Ekstrakt smo prenesli na SPE kolonco Ultra 2400 3 ml, ki smo jo predhodno kondicionirali s 3 ml acetonitrila. SPE kolonco smo sprali s 16 ml acetonitrila. 3-4 ml/min pretoka skozi SPE kolonco smo dosegli z vodno vakuumsko 5 črpalko. Celoten eluat (prvi del eluata je iz SPE kolonce pritekel po nanosu vzorca, drugi pa po spiranju kolonce) smo zbrali v čaši. Vsebino čaše smo prenesli v 100 ml Soxhletovo bučko. Čašo smo dvakrat sprali s 5 ml acetonitrila in vsebino prenesli v Soxhletovo bučko. Nato smo acetonitril odparili na rotavaporju do približno 2 ml in preostanek z dušikom izpihali do suhega. Pri vzorcih smo suhi eluat raztopili v 1 ml acetona s pomočjo ultrazvočne kopeli, pri standardih za kalibracijo v matriki (matrix match standards) pa smo suhemu eluatu dodali 1 ml delovnih raztopin z merjenimi aktivnimi snovmi in vsebino raztopili s pomočjo ultrazvočne kopeli. 2.3 Določitev Določitev aktivnih snovi je potekala z GC-MS, katerega nastavitve so podane v preglednici 1. Preglednica 1: Pogoji GC-MS instrumenta za določevanje ostankov FFS iz okolja v cvetnem prahu Liner: RESTEK 23302 Temperatura injektorja: 250 ºC Način injiciranja: Pulsed Splitless Kolona: Agilent J & W, HP-5MS, 30 m x 0.25 mm ID, 0.25 m Temperaturni gradient kolone: 55 ºC; 2 min 25 ºC/min; od 55 ºC do 130 ºC 130 ºC; 1 min 5 ºC/min; od 130 ºC do 180 ºC 180 ºC; 30 min 20 ºC/min; od 180 ºC do 230 ºC 230 ºC; 16 min 20 ºC/min; od 230 ºC do 250 ºC 250 ºC; 13 min 20 ºC/min; od 250 ºC do 280 ºC 280 ºC; 20 min Temperatura ionskega izvora: 230 ºC Temperatura vmesnika: 280 ºC Temperatura detektorja: 150 ºC Nosilni plin: Helij 6.0, 1,2 ml/min Za vrednotenje aktivnih spojin smo uporabili način snemanja izbranih ionov (Selective ion monitoring mode, SIM). Izbrani ioni za vsako aktivno spojino so prikazani v preglednici 2. 6 2.4 Validacija LOQ in linearnost Linearnost odzivov smo preverili s kalibracijskimi standardi v matriki (matrix match standards). Imeli smo 4-6 koncentracijskih nivojev, z dvema ponovitvama na vsakem nivoju. Linearnost in območje linearnosti smo določili z linearno regresijo, s pomočjo F testa. Linearni model ustreza za vseh 47 aktivnih spojin podanih v preglednici 2. Linearnost smo dokazali v območju 0,01 mg/kg – 0,15 mg/kg za 6 aktivnih spojin, v območju 0,05 mg/kg - 0,12 mg/kg za 1 aktivno spojino in v območju 0,05 mg/kg – 0,15 mg/kg za 40 aktivnih spojin. R2 je bil v območju 0,974 do 0,996. Meje kvantitativne določitve metode (Limits of quantification, LOQs) smo ocenili iz kromatogramov kalibracijskih standardov v matriki (matrix match standards). LOQ smo izbrali pri razmerju S/N vsaj 10. Maksimalne dovoljene količine ostankov (Maximum Residue Levels, MRLs) za ostanke FFS iz okolja so podane v Regulativi (EC) 396/2005. Kjer so MRL-ji postavljeni na LOQ, je v Regulativi pri tej vrednosti dodan znak *. To pomeni, da se za analizne metode, ki omogočajo spremljati ostanke FFS zahteva LOQ, ki je enak MRL-jem označenim z *. Naši LOQ so bili v takih primerih postavljeni na MRL. LOQ-ji so podani v preglednici 2. Šest aktivnih spojin je imelo LOQ 0,01 mg/kg, za preostalih 41 aktivnih spojin pa je bil LOQ 0,05 mg/kg. Merilna negotovost Standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti smo določili v skladu z ISO 5725. Kupljeni ekološki cvetni prah smo analizirali, da smo dokazali, da v njem ni bilo ostankov FFS. Nato smo analizirali ekstrakte matrike z dodanim standardom (naspajkan ekološki cvetni prah) na koncentracijskem nivoju pri LOQ. V časovni periodi 10 dni, smo vsak dan pripravili dve paralelki matrik z dodanim standardom. Nato smo iz površin vrhov za vsako aktivno spojino izračunali standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti. Negotovost ponovljivosti (Ur) in negotovost obnovljivosti (UR) smo izračunali tako, da smo standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti pomnožili s Studentovim t faktorjem za 9 prostostnih stopenj in 95 % nivojem zaupanja (t95;9 = 2.262). Ur = t95; 9 x sr ; UR = t95; 9 x sR Rezultati merilne negotovosti so prikazani v preglednici 2. Merilna negotovost ponovljivosti je bila v območju 0,001 mg/kg do 0,013 mg/kg, kar predstavlja 10-30 % LOQ-ja. Merilna negotovost obnovljivosti je bila v območju 0,002 mg/kg do 0,015 mg/kg, kar predstavlja 12-30 % LOQ-ja. 7 Merilna negotovost za ostanke FFS mora biti 50%, kot je to predlagano v smernici SANTE/11813/2017, oziroma v Sloveniji zakonsko predpisano v Uradnem listu (Ur. l. RS št. 108/2007). Med validacijo pa je potrebno dokazati, da je merilna negotovost manjša ali enaka predlagani merilni negotovosti. Pri naši metodi je bila merilna negotovost sprejemljiva za vseh 49 aktivnih spojin. Točnost Točnost smo preverili s preverjanjem izkoristkov. Izračunali smo povprečje izkoristkov iz testa za natančnost (2 paralelki matrike z dodanim standardom, 10 dni). Rezultati za izkoristke so podani v preglednici 2. Dobljeni izkoristki so bili v območju 73,0 % do 93,4 %, z RSD 5,6 % do 17,7 %. Natančneje, izkoristki pri LOQ 0,01 mg/kg so se gibali v območju 75,4 % do 93,4 %, z RSD 9,3 % do 17,7 % in izkoristki pri LOQ 0,05 mg/kg so se gibali v območju 73,0 % do 88,2 %, z RSD 5,6 % do 15,9 %. Glede na zahteve smernice SANTE/11813/2017 so sprejemljivi izkoristki med validacijo v območju 70% do 120%, z relativno standardno deviacijo ≤ 20%. Glede na smernice za validacijo, ki jih je podal Alder in sod. (2000), pa so sprejemljivi izkoristki: (a) pri koncentraciji >0.01 mg/kg in ≤ 0.1 mg/kg: 70% do 120%, RSD ≤ 20% in (b) pri koncentraciji >0.001 mg/kg in ≤ 0.01 mg/kg: 60% do 120%, RSD ≤ 30%. Naši izkoristki so sprejemljivi glede na zahteve obeh smernic. 8 Preglednica 2: Validacijski parametri, izbrani ioni in MRL-ji za aktivne spojine v cvetnem prahu Snemani ionib Območje Aktivna snov MRLa R2 LOQ Izkoristek RSDc U d U e U f U g T, Q r r R R 1, Q2 linearnosti (mg/kg) (m/z) (mg/kg) (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (mg/kg) (%) akrinatrin 0,05* 181, 208, 289 0,05-0,15 0,991 0,05 87,8 13,8 0,010 20,0 0,014 28,0 azinfos-metil / 160, 132, 105 0,05-0,15 0,987 0,05 84,2 9,9 0,009 18,0 0,010 20,0 azoksistrobin 0,05* 344, 388, 345 0,05-0,15 0,987 0,05 85,3 11,8 0,011 22,0 0,011 22,0 bifentrin 0,05* 181, 165, 166 0,05-0,15 0,992 0,05 76,6 8,0 0,010 20,0 0,010 20,0 boskalid 0,05* 140, 342, 142 0,05-0,15 0,984 0,05 85,0 11,9 0,009 18,0 0,012 24,0 cihalotrin-lambda 0,05* 181, 197, 208 0,05-0,15 0,987 0,05 88,2 12,3 0,011 22,0 0,012 24,0 deltametrin 0,05* 181, 251, 255 0,05-0,15 0,990 0,05 80,1 14,9 0,010 20,0 0,014 28,0 diazinon 0,01* 179, 304, 199 0,01-0,15 0,994 0,01 81,3 12,9 0,002 20,0 0,002 20,0 difenilamin 0,05* 169, 167, 168 0,05-0,12 0,982 0,05 73,2 9,1 0,008 16,0 0,008 16,0 diklofluanid / 226, 123, 167 0,05-0,15 0,990 0,05 79,1 7,9 0,010 20,0 0,010 20,0 dimetaklor 0,05* 134, 197, 210 0,05-0,15 0,995 0,05 81,2 6,5 0,006 12,0 0,006 12,0 dimetoat / 87, 229, 143 0,05-0,15 0,994 0,05 81,7 5,6 0,010 20,0 0,010 20,0 endosulfan-sulfat 0,01* 272, 274, 387 0,01-0,15 0,995 0,01 82,4 9,3 0,001 10,0 0,002 20,0 fenbukonazol 0,05* 198, 129, 125 0,05-0,15 0,989 0,05 78,9 15,9 0,013 26,0 0,014 28,0 fenitrotion 0,01* 277, 260, 109 0,01-0,15 0,981 0,01 84,7 14,7 0,002 20,0 0,003 30,0 flonikamid 0,05* 174, 146, 229 0,05-0,15 0,992 0,05 79,8 7,7 0,007 14,0 0,007 14,0 fludioksonil 0,05* 248, 154, 127 0,05-0,15 0,990 0,05 85,5 9,8 0,009 18,0 0,010 20,0 flukvinkonazol 0,05* 340, 342, 108 0,05-0,15 0,989 0,05 82,6 10,7 0,010 20,0 0,010 20,0 forat 0,01* 231, 260, 97 0,01-0,15 0,996 0,01 82,4 17,7 0,002 20,0 0,003 30,0 fosalon 0,01* 182, 367, 121 0,01-0,15 0,995 0,01 93,4 13,9 0,003 30,0 0,003 30,0 HCH-alfa 0,01* 219, 181, 183 0,01-0,15 0,996 0,01 75,4 12,3 0,002 20,0 0,002 20,0 HCH-delta / 219, 181, 183 0,05-0,15 0,979 0,05 82,8 12,7 0,007 14,0 0,012 24,0 iprodion 0,05* 314, 316, 187 0,05-0,15 0,986 0,05 81,6 9,8 0,010 20,0 0,010 20,0 karbaril 0,05* 144, 115, 116 0,05-0,15 0,988 0,05 81,9 7,0 0,010 20,0 0,010 20,0 9 Snemani ionib Območje Aktivna snov MRLa R2 LOQ Izkoristek RSDc U d U e U f U g T, Q r r R R 1, Q2 linearnosti (mg/kg) (m/z) (mg/kg) (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (mg/kg) (%) karbofuran 0,05* 164, 149, 131 0,05-0,15 0,992 0,05 80,6 8,2 0,007 14,0 0,008 16,0 klomazon 0,05* 125, 204, 127 0,05-0,15 0,988 0,05 75,2 10,9 0,006 12,0 0,009 18,0 klorprofam 0,05* 213, 127, 154 0,05-0,15 0,983 0,05 74,9 8,0 0,007 14,0 0,007 14,0 krezoksim-metil 0,05* 116, 206, 131 0,05-0,15 0,992 0,05 84,5 9,3 0,008 16,0 0,009 18,0 kvinalfos 0,05* 146, 298, 157 0,05-0,15 0,992 0,05 81,2 7,8 0,010 20,0 0,010 20,0 kvinoklamin 0,05* 207, 172, 209 0,05-0,15 0,990 0,05 76,9 12,8 0,010 20,0 0,010 20,0 mekarbam 0,05* 131, 159, 329 0,05-0,15 0,974 0,05 79,7 10,8 0,010 20,0 0,010 20,0 metakrifos 0,05* 208, 180, 240 0,05-0,15 0,993 0,05 73,0 8,4 0,006 12,0 0,007 14,0 metrafenon 0,05* 393, 408, 379 0,05-0,15 0,992 0,05 80,5 9,2 0,010 20,0 0,010 20,0 paration / 291, 292, 235 0,05-0,15 0,993 0,05 82,3 15,7 0,009 18,0 0,015 30,0 permetrin / 183, 163, 165 0,05-0,15 0,989 0,05 78,3 10,2 0,008 16,0 0,008 16,0 piridafention / 199, 340, 188 0,05-0,15 0,992 0,05 83,9 9,2 0,008 16,0 0,009 18,0 pirimifos-metil 0,05* 290, 305, 276 0,05-0,15 0,992 0,05 78,4 7,0 0,010 20,0 0,010 20,0 pirimikarb 0,05* 166, 238, 167 0,05-0,15 0,983 0,05 79,5 7,2 0,006 12,0 0,007 14,0 procimidon 0,05* 283, 285, 96 0,05-0,15 0,981 0,05 80,1 9,6 0,010 20,0 0,010 20,0 propizamid 0,05* 173, 175, 145 0,05-0,15 0,993 0,05 78,3 9,8 0,007 14,0 0,009 18,0 tetradifon 0,05* 159, 229, 356 0,05-0,15 0,990 0,05 82,1 10,7 0,009 18,0 0,010 20,0 tolilfluanid 0,05* 238, 137, 240 0,05-0,15 0,985 0,05 80,8 7,7 0,007 14,0 0,007 14,0 tolklofos-metil 0,05* 265, 267, 250 0,05-0,15 0,994 0,05 78,4 7,9 0,010 20,0 0,010 20,0 triadimefon 0,05* 208, 210, 181 0,05-0,15 0,993 0,05 80,4 9,0 0,007 14,0 0,008 16,0 triazofos 0,05* 161, 162, 285 0,05-0,15 0,982 0,05 84,1 10,4 0,010 20,0 0,010 20,0 trifloksistrobin 0,05* 116, 222, 186 0,05-0,15 0,992 0,05 83,7 8,7 0,008 16,0 0,008 16,0 vinklozolin 0,05* 285, 124, 187 0,05-0,15 0,995 0,05 83,9 8,1 0,008 16,0 0,008 16,0 10 LEGENDA PREGLEDNICE 2: a Regulativa (EC) 396/2005, * pomeni, da je MRL postavljen na LOQ analizne metode b T = ciljni ion (target ion), Q = kvalitativni ion (qualifier ion) c RSD je bila izračunana za izkoristke d,e Ur = merilna negotovost ponovljivosti f,g UR = merilna negotovost obnovljivosti 11 3 MULTIREZIDUALNA GC-MS METODA ZA DOLOČANJE OSTANKOV FITOFARMACEVTSKIH SREDSTEV IZ OKOLJA V MEDU 3.1 Uvod V literaturi so podane številne metode za določanje ostankov FFS v medu. Le-te za ekstrakcijo uporabljajo organska topila acetonitril, etilacetat ali aceton. Najpogosteje se uporablja QuEChERS metoda, pri kateri se ekstrakcijo izvaja z acetonitrilom. Vendar ima to topilo slabost, da se pri ekstrakciji matrik, ki vsebujejo veliko količino sladkorja, tvori dvojna plast. Zato smo mi za ekstrakcijo tekoče-tekoče izbrali aceton, kjer pri ekstrakciji matrik, ki vsebujejo veliko količino sladkorja, ne nastaja dvojna plast (Luke in sod.; 1975). Acetonu smo dodali diklorometan in petroleter, da smo omogočili ekstrakcijo širokega nabora aktivnih snovi: od zelo polarnih, kot je flonikamid, do nepolarnih, kot je cihalotrin-lambda. Določitev aktivnih spojin smo izvajali z GC-MS. 3.2 Ekstrakcija V čaši smo 20 g vzorca medu raztopili v 15 ml MilliQ vode. Dodali smo 40 ml acetona. Mešanico smo z mikserjem mešali 2 minuti. Dodali smo 80 ml mešanice petroletra in diklorometana v volumskem razmerju 1:1 in mešali še nadaljnji 2 minuti. Mešanico smo prenesli v lij ločnik, ki je vseboval 3 g NaCl. Čašo smo sprali z 80 ml mešanice petroletra in diklorometana v volumskem razmerju 1:1. Topilo smo dodali v lij ločnik, katerega smo stresali 1 minuto. Zgornjo organsko fazo smo filtrirali preko filtrirnega papirja črni trak, ki je vseboval 15 g brezvodnega Na2SO4, v 500 ml Soxhletovo bučko. Spodnjo vodno fazo smo z istim postopkom ekstrahirali še dvakrat. Topila iz zbranih organskih faz smo odparili do približno 2 ml na rotavaporju in jih nato z dušikom izpihali do suhega. Pri vzorcih smo suhi eluat raztopili v 2 ml mešanice etilacetat : cikloheksan v volumskem razmerju 1:1 s pomočjo ultrazvočne kopeli, pri standardih za kalibracijo v matriki (matrix match standards) pa smo suhemu eluatu dodali 2 ml delovnih raztopin z merjenimi aktivnimi snovmi in vsebino raztopili s pomočjo ultrazvočne kopeli. 12 3.3 Določitev Določitev aktivnih snovi je potekala z GC-MS, katerega nastavitve so podane v preglednici 3. Preglednica 3: Pogoji GC-MS instrumenta za določevanje ostankov FFS iz okolja v medu Liner: Agilent 5181-3316 Temperatura injektorja: 250 ºC Način injiciranja: Pulsed Splitless Kolona: Agilent J & W, HP-5MS, 30 m x 0.25 mm ID, 0.25 m Temperaturni gradient kolone: 55 ºC; 2 min 25 ºC/min; od 55 ºC do 130 ºC 130 ºC; 1 min 5 ºC/min; od 130 ºC do 180 ºC 180 ºC; 30 min 20 ºC/min; od 180 ºC do 230 ºC 230 ºC; 16 min 20 ºC/min; od 230 ºC do 250 ºC 250 ºC; 13 min 20 ºC/min; od 250 ºC do 280 ºC 280 ºC; 20 min Temperatura ionskega izvora: 230 ºC Temperatura vmesnika: 280 ºC Temperatura detektorja: 150 ºC Nosilni plin: Helij 6.0, 1,2 ml/min Za vrednotenje aktivnih spojin smo uporabili način snemanja izbranih ionov (Selective ion monitoring mode, SIM). Izbrani ioni za vsako aktivno spojino so prikazani v preglednici 4. 3.4 Validacija LOQ in linearnost Linearnost odzivov smo preverili s kalibracijskimi standardi v matriki (matrix match standards). Imeli smo 3-8 koncentracijskih nivojev, s petimi ponovitvami na vsakem nivoju. Linearnost in območje linearnosti smo določili z linearno regresijo, s pomočjo F testa. Linearni model ustreza za vseh 72 aktivnih spojin podanih v preglednici 4. Linearnost smo dokazali v območju 0,01 mg/kg – 0,15 mg/kg za 16 aktivnih spojin, v območju 0,02 mg/kg - 0,1 mg/kg za 1 aktivno spojino, v območju 0,02 – 0,15 mg/kg za 4 aktivne spojine, v območju 0,03 mg/kg – 0,15 mg/kg za 2 aktivni spojini, v 13 območju 0,05 mg/kg – 0,1 mg/kg za 1 aktivno spojino, v območju 0,05 mg/kg – 0,15 mg/kg za 46 aktivnih spojin in v območju 0,05 mg/kg – 0,2 mg/kg za 2 aktivni spojini. R2 je bil v območju 0,960 do 0,988. Meje kvantitativne določitve metode (Limits of quantification, LOQs) smo ocenili iz kromatogramov kalibracijskih standardov v matriki (matrix match standards). LOQ smo izbrali pri razmerju S/N vsaj 10. Maksimalne dovoljene količine ostankov (Maximum Residue Levels, MRLs) za ostanke FFS iz okolja so podane v Regulativi (EC) 396/2005. Kjer so MRL-ji postavljeni na LOQ, je v Regulativi pri tej vrednosti dodan znak *. To pomeni, da se za analizne metode, ki omogočajo spremljati ostanke FFS zahteva LOQ, ki je enak MRL-jem označenim z *. Naši LOQ so bili v takih primerih postavljeni na MRL. LOQ-ji so podani v preglednici 4. 16 aktivnih spojin je imelo LOQ 0,01 mg/kg, 5 aktivnih spojin je imelo LOQ 0,02 mg/kg, 2 aktivni spojini sta imeli LOQ 0,03 mg/kg, za preostalih 49 aktivnih spojin pa je bil LOQ 0,05 mg/kg. Merilna negotovost Standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti smo določili v skladu z ISO 5725. Kupljeni ekološki med smo analizirali, da smo dokazali, da v njem ni bilo ostankov FFS. Nato smo analizirali ekstrakte matrike z dodanim standardom (naspajkan ekološki med) na koncentracijskem nivoju pri LOQ. V časovni periodi 10 dni, smo vsak dan pripravili dve paralelki matrik z dodanim standardom. Nato smo iz površin vrhov za vsako aktivno spojino izračunali standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti. Negotovost ponovljivosti (Ur) in negotovost obnovljivosti (UR) smo izračunali tako, da smo standardni odklon ponovljivosti in standardni odklon obnovljivosti pomnožili s Studentovim t faktorjem za 9 prostostnih stopenj in 95 % nivojem zaupanja (t95;9 = 2.262). Ur = t95; 9 x sr ; UR = t95; 9 x sR Rezultati merilne negotovosti so prikazani v preglednici 4. Merilna negotovost ponovljivosti je bila v območju 0,0007 mg/kg do 0,01 mg/kg, kar predstavlja 7-25 % LOQ-ja. Merilna negotovost obnovljivosti je bila v območju 0,0007 mg/kg do 0,02 mg/kg, kar predstavlja 7-40 % LOQ-ja. Merilna negotovost za ostanke FFS mora biti 50%, kot je to predlagano v smernici SANTE/11813/2017, oziroma v Sloveniji zakonsko predpisano v Uradnem listu (Ur. l. RS št. 108/2007). Med validacijo pa je potrebno dokazati, da je merilna negotovost manjša ali enaka predlagani merilni negotovosti. Pri naši metodi je bila merilna negotovost sprejemljiva za vseh 72 aktivnih spojin. 14 Točnost Točnost smo preverili s preverjanjem izkoristkov. Analizirali smo 10 ekstraktov matrik z dodanim standardom (naspajkan ekološki med) na koncentracijskem nivoju pri LOQ. Vsako paralelko smo injicirali dvakrat. Izračunali smo povprečje izkoristkov. Rezultati so podani v preglednici 4. Dobljeni izkoristki so bili v območju 77,4 % do 99,2 %, z RSD 5,4 % do 16,7 %. Natančneje, izkoristki pri LOQ 0,01 mg/kg so se gibali v območju 77,5 % do 94,2 %, z RSD 5,7 % do 11,7 % in izkoristki pri LOQ > 0.01 do ≤ 0,05 mg/kg so se gibali v območju 77,4 % do 99,2 %, z RSD 5,4 % do 16,7 %. Glede na zahteve smernice SANTE/11813/2017 so sprejemljivi izkoristki med validacijo v območju 70% do 120%, z relativno standardno deviacijo ≤ 20%. Glede na smernice za validacijo, ki jih je podal Alder in sod. (2000), pa so sprejemljivi izkoristki: (a) pri koncentraciji >0.01 mg/kg in ≤ 0.1 mg/kg: 70% do 120%, RSD ≤ 20% in (b) pri koncentraciji >0.001 mg/kg in ≤ 0.01 mg/kg: 60% do 120%, RSD ≤ 30%. Naši izkoristki so sprejemljivi glede na zahteve obeh smernic. Točnost smo preverili tudi s sodelovanjem v medlaboratorijski primerjavi BIPEA. Rezultati so pokazali, da je z vrednost v sprejemljivih mejah za vse analizirane aktivne spojine (-2≤ z ≤2). 12 od 13 aktivnih spojin (92,3% analiziranih aktivnih spojin) je imelo z vrednost v območju -1 to 1, kar je zelo zadovoljivo. Le 1 aktivna snov (akrinatrin) je imela z vrednost nižjo od -1, vendar je bila še vedno v zahtevanem območju za pravilen rezultat. Rezultati so predstavljeni v preglednici 5. 15 Preglednica 4: Validacijski parametri, izbrani ioni in MRL-ji za aktivne spojine v medu Območje Aktivna snov MRLa Snemani ionib R2 LOQ Izkoristek RSDc U d U e U f U g linearnosti r r R R T, Q (mg/kg) 1, Q2, Q3 (mg/kg) (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (mg/kg) (%) (m/z) akrinatrin 0,05* 181, 208, 289 0,02-0,15 0,978 0,02 94,7 6,6 0,003 15,0 0,003 15,0 aldrin 0,01 263, 265, 261 0,01-0,15 0,984 0,01 88,4 6,1 0,0008 8,0 0,0007 7,0 azinfos-metil / 160, 132, 105 0,01-0,15 0,984 0,01 81,2 7,2 0,001 10,0 0,001 10,0 azoksistrobin 0,05* 344, 388, 345 0,05-0,15 0,976 0,05 83,5 13,9 0,010 20,0 0,010 20,0 bifentrin 0,05* 181, 165, 166 0,01-0,15 0,984 0,01 88,8 6,9 0,001 10,0 0,001 10,0 boskalid 0,05* 140, 342, 142 0,05-0,15 0,963 0,05 83,7 8,8 0,008 16,0 0,009 18,0 bromopropilat 0,01* 183, 341, 185 0,01-0,15 0,982 0,01 92,4 7,5 0,001 10,0 0,001 10,0 bupirimat 0,05* 273, 316, 208 0,05-0,15 0,972 0,05 77,6 11,3 0,008 16,0 0,009 18,0 cihalotrin-lambda 0,05* 181, 197, 208 0,05-0,15 0,977 0,05 89,9 6,7 0,006 12,0 0,006 12,0 cipermetrin 0,05* 181, 163, 165 0,05-0,15 0,967 0,05 93,5 7,1 0,007 14,0 0,008 16,0 ciprodinil 0,05* 224, 225, 210 0,05-0,15 0,974 0,05 84,2 7,2 0,006 12,0 0,006 12,0 ciprokonazol 0,05* 222, 139, 224 0,05-0,15 0,973 0,05 82,7 9,0 0,008 16,0 0,008 16,0 deltametrin 0,05* 181, 251, 255 0,03-0,15 0,983 0,03 92,9 7,8 0,004 13,3 0,004 13,3 diazinon 0,01* 179, 304, 199 0,01-0,15 0,985 0,01 84,7 8,5 0,001 10,0 0,001 10,0 diklofluanid / 226, 123, 167 0,05-0,15 0,975 0,05 87,3 6,0 0,004 8,0 0,004 8,0 diklorvos / 109, 185, 145 0,02-0,1 0,982 0,02 83,0 16,7 0,005 25,0 0,006 30,0 dimetaklor 0,05* 134, 197, 210 0,01-0,15 0,983 0,01 94,2 9,7 0,001 10,0 0,002 20,0 dinikonazol 0,05* 268, 270, 70 0,05-0,15 0,972 0,05 84,1 7,5 0,007 14,0 0,007 14,0 endrin 0,01 263, 261, 265 0,01-0,15 0,984 0,01 89,3 6,2 0,001 10,0 0,001 10,0 esfenvalerat + 0,05* 125, 167, 225 0,05-0,15 0,971 0,05 99,2 7,5 0,007 14,0 0,007 14,0 fenvalerat fenamidon 0,05* 238, 268, 237 0,05-0,15 0,974 0,05 84,1 7,8 0,007 14,0 0,007 14,0 fenbukonazol 0,05* 198, 129, 125 0,05-0,15 0,974 0,05 83,0 13,0 0,010 20,0 0,010 20,0 16 Snemani ionib Območje Aktivna snov MRLa R2 LOQ Izkoristek RSDc U d U e U f U g T, Q r r R R 1, Q2, Q3 linearnosti (mg/kg) (m/z) (mg/kg) (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (mg/kg) (%) fention 0,01* 278, 279, 280 0,01-0,15 0,985 0,01 89,6 6,0 0,001 10,0 0,001 10,0 flonikamid 0,05* 174, 146, 229 0,05-0,2 0,982 0,05 78,2 11,4 0,009 18,0 0,010 20,0 fludioksonil 0,05* 248, 154, 127 0,05-0,15 0,969 0,05 83,6 7,3 0,008 16,0 0,008 16,0 flukvinkonazol 0,02* 340, 342, 108 0,02-0,15 0,982 0,02 85,0 9,9 0,003 15,0 0,003 15,0 folpet 0,05* 260, 262, 130 0,05-0,15 0,971 0,05 88,5 6,0 0,010 20,0 0,020 40,0 fosalon 0,01* 182, 367, 121 0,01-0,15 0,982 0,01 90,6 10,1 0,001 10,0 0,001 10,0 HCH-delta / 219, 181, 183 0,02-0,15 0,985 0,02 86,7 6,0 0,002 10,0 0,002 10,0 heksaklorobenzen 0,01* 284, 286, 282 0,01-0,15 0,985 0,01 84,7 7,2 0,0008 8,0 0,0009 9,0 heptaklor 0,01 272, 274, 270 0,01-0,15 0,985 0,01 89,0 6,0 0,0007 7,0 0,0008 8,0 indoksakarb 0,05* 218, 264, 527 0,05-0,15 0,976 0,05 89,9 8,9 0,008 16,0 0,008 16,0 iprodion 0,05* 314, 316, 187 0,05-0,15 0,974 0,05 86,4 7,2 0,006 12,0 0,007 14,0 kaptan 0,05* 79, 107, 119, 149 0,05-0,15 0,972 0,05 88,9 5,9 0,009 18,0 0,015 30,0 karbaril 0,05* 144, 115, 116 0,05-0,15 0,973 0,05 85,8 8,2 0,006 12,0 0,007 14,0 karbofuran 0,05* 164, 149, 131 0,03-0,15 0,987 0,03 82,1 7,2 0,004 13,3 0,004 13,3 klorotalonil 0,05* 266, 264, 268 0,05-0,15 0,974 0,05 84,7 6,2 0,005 10,0 0,005 10,0 klorpirifos-metil 0,05* 286, 288, 125 0,01-0,15 0,983 0,01 88,2 5,7 0,0008 8,0 0,0008 8,0 klorprofam 0,05* 213, 127, 154 0,05-0,15 0,978 0,05 86,2 6,4 0,004 8,0 0,004 8,0 krezoksim-metil 0,05* 116, 206, 131 0,05-0,15 0,974 0,05 87,3 5,7 0,005 10,0 0,005 10,0 kvinalfos 0,05* 146, 298, 157 0,05-0,15 0,974 0,05 86,5 5,6 0,005 10,0 0,005 10,0 kvinoklamin 0,05* 207, 172, 209 0,05-0,15 0,964 0,05 77,4 5,9 0,005 10,0 0,008 16,0 kvinoksifen 0,05* 237, 272, 307 0,05-0,15 0,977 0,05 85,1 6,1 0,006 12,0 0,006 12,0 malation 0,05* 173, 174, 211 0,05-0,15 0,974 0,05 86,6 5,6 0,005 10,0 0,005 10,0 matakrifos 0,05* 208, 180, 240 0,05-0,15 0,977 0,05 97,0 14,5 0,006 12,0 0,008 16,0 mekarbam 0,05* 131, 159, 329 0,05-0,15 0,974 0,05 87,1 5,9 0,005 10,0 0,005 10,0 metalaksil + 0,05* 249, 206, 234 0,05-0,15 0,974 0,05 83,5 8,7 0,007 14,0 0,008 16,0 metalaksil-M 17 Snemani ionib Območje Aktivna snov MRLa R2 LOQ Izkoristek RSDc U d U e U f U g T, Q r r R R 1, Q2, Q3 linearnosti (mg/kg) (m/z) (mg/kg) (mg/kg) (%) (%) (mg/kg) (%) (mg/kg) (%) metidation 0,02* 145, 85, 125 0,02-0,15 0,977 0,02 84,0 10,5 0,002 10,0 0,002 10,0 metrafenon 0,05* 393, 408, 379 0,05-0,15 0,977 0,05 88,3 6,7 0,006 12,0 0,006 12,0 miklobutanil 0,05* 179, 288, 150 0,05-0,15 0,970 0,05 81,1 9,6 0,008 16,0 0,009 18,0 oksadiksil 0,01* 163, 105, 132 0,01-0,15 0,982 0,01 77,5 11,7 0,002 20,0 0,002 20,0 paration / 291, 292, 235 0,01-0,15 0,984 0,01 87,6 8,1 0,001 10,0 0,001 10,0 penkonazol 0,05* 248, 159, 161 0,05-0,15 0,972 0,05 84,7 7,1 0,006 12,0 0,007 14,0 permetrin / 183, 163, 165 0,02-0,15 0,987 0,02 89,8 5,9 0,002 10,0 0,002 10,0 piridafention / 199, 340, 188 0,01-0,15 0,986 0,01 84,4 8,2 0,001 10,0 0,001 10,0 pirimetanil 0,05* 198, 199, 200 0,05-0,1 0,960 0,05 84,9 6,3 0,008 16,0 0,008 16,0 pirimifos-metil 0,05* 290, 305, 276 0,05-0,15 0,977 0,05 87,5 6,0 0,004 8,0 0,004 8,0 pirimikarb 0,05* 166, 238, 167 0,05-0,15 0,979 0,05 79,5 11,6 0,009 18,0 0,010 20,0 procimidon 0,05* 283, 285, 96 0,05-0,15 0,973 0,05 86,7 5,5 0,005 10,0 0,005 10,0 profenofos 0,05* 208, 139, 339 0,05-0,15 0,973 0,05 86,9 5,4 0,005 10,0 0,006 12,0 propargit 0,05* 135, 173, 350, 201 0,05-0,2 0,971 0,05 86,6 5,9 0,006 12,0 0,006 12,0 propizamid 0,05* 173, 175, 145 0,05-0,15 0,976 0,05 84,0 6,4 0,005 10,0 0,005 10,0 tebukonazol 0,05* 125, 250, 127 0,05-0,15 0,973 0,05 83,7 8,3 0,009 18,0 0,009 18,0 tetradifon 0,05* 159, 229, 356 0,05-0,15 0,977 0,05 88,1 5,9 0,005 10,0 0,006 12,0 tetrakonazol 0,02* 336, 338, 337 0,02-0,15 0,979 0,02 83,8 9,1 0,003 15,0 0,003 15,0 tolilfluanid 0,05* 238, 137, 240 0,05-0,15 0,975 0,05 87,8 5,5 0,005 10,0 0,005 10,0 tolklofos-metil 0,05* 265, 267, 250 0,05-0,15 0,976 0,05 87,5 5,9 0,004 8,0 0,004 8,0 triadimefon 0,05* 208, 210, 181 0,05-0,15 0,973 0,05 85,1 6,6 0,006 12,0 0,006 12,0 triadimenol 0,05* 112, 168, 128 0,05-0,15 0,962 0,05 83,7 9,1 0,007 14,0 0,009 18,0 triazofos 0,05* 161, 162, 285 0,01-0,15 0,988 0,01 86,5 6,0 0,002 20,0 0,002 20,0 trifloksistrobin 0,05* 116, 222, 186 0,05-0,15 0,978 0,05 87,8 6,3 0,005 10,0 0,005 10,0 vinklozolin 0,05* 285, 124, 187 0,05-0,15 0,976 0,05 87,9 5,5 0,004 8,0 0,004 8,0 18 LEGENDA PREGLEDNICE 4: a Regulativa (EC) 396/2005, * pomeni, da je MRL postavljen na LOQ analizne metode b T = ciljni ion (target ion), Q = kvalitativni ion (qualifier ion) c RSD je bila izračunana za izkoristke d,e Ur = merilna negotovost ponovljivosti f,g UR = merilna negotovost obnovljivosti 19 Preglednica 5: Rezultati medlaboratorijske primerjave za aktivne spojine v medu (BIPEA; 2017) Aktivna snov Referenca Toleranca Minimum Maksimum Naš rezultat Enote Pravilnost z akrinatrin 0,026 0,013 0,013 0,039 0,016 mg/kg + -1,54 bifentrin 0,128 0,061 0,067 0,189 0,142 mg/kg + 0,46 boskalid 0,131 0,062 0,069 0,193 0,115 mg/kg + -0,52 bromopropilat 0,146 0,068 0,078 0,214 0,160 mg/kg + 0,41 cihalotrin-lambda 0,076 0,038 0,038 0,114 0,072 mg/kg + -0,21 cipermetrin 0,134 0,064 0,070 0,198 0,143 mg/kg + 0,28 deltametrin 0,027 0,014 0,013 0,041 0,029 mg/kg + 0,29 karbaril 0,153 0,071 0,082 0,224 0,151 mg/kg + -0,06 klorpirifos 0,095 0,048 0,047 0,143 0,098 mg/kg + 0,13 malation 0,114 0,056 0,058 0,170 0,111 mg/kg + -0,11 metalaksil+metalaksil-M 0,073 0,037 0,036 0,110 0,070 mg/kg + -0,36 permetrin 0,134 0,064 0,070 0,198 0,133 mg/kg + -0,03 tetradifon 0,028 0,014 0,014 0,042 0,029 mg/kg + 0,14 20 4 ZAKLJUČKI Multirezidualna GC-MS metoda za določanje ostankov FFS v cvetnem prahu omogoča analizo 47 aktivnih spojin in primerjavo njihove koncentracije z veljavnimi evropskimi MRL-ji. Multirezidualna GC-MS analiza za določanje ostankov FFS v medu omogoča analizo 72 aktivnih spojin in primerjavo njihove koncentracije z veljavnimi evropskimi MRL-ji. 21 5 LITERATURA Alder L., Hill A., Holland P.T., Lantos J., Lee S.M., MacNeil J.D., O'Rangers J., van Zoonen P., Ambrus A. 2000. Guidelines for single-laboratory validation of analytical methods for trace-level concentrations of organic chemicals, Principles and practices of method validation (ed.: A. Fajgelj, A. Ambrus). The Royal Society of Chemistry, str. 179 – 252. Baša Česnik H. 2021. Pesticide residues in bee pollen - validation of the gas chromatography-mass spectrometry multiresidual method and a survey of bee pollens from Slovenia. Acta Agriculturae Slovenica, 117: 1-11, DOI: 10.14720/aas.2021.117.2.1822. Baša Česnik H., Kmecl V., Velikonja Bolta Š. 2019. Pesticide and veterinary drug residues in honey - validation of methods and a survey of organic and conventional honeys from Slovenia. Food additives & contaminants. Part A., Chemistry, analysis, control, exposure & risk assessment, 36: 1358-1375, DOI: 10.1080/19440049.2019.1631492. BIPEA. 2017. Bureau interprofessionnel d´études analytiques. Laboratory comparisons report, Honey, 29-3619. October 2017. Gienevilliers, BIPEA. Cabrera de Oliveira R. C., Queiroz S. C. do N., da Luz C. F. P., Porto R. S., Rath S. 2016. Bee pollen as a bioindicator of environmental pesticide contamination. Chemosphere, 163:525-534. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2016.08.022. Crenna E., Jolliet O., Collina E., Sala S., Fantke P. 2020. Characterizing honey bee exposure and effects from pesticides for chemical prioritization and life cycle assessment. Environment International, 138: 105642. DOI: 10.1016/j.envint.2020.105642. Eckert J.E. 1933. The flight range of the honeybee. Journal of Agricultural Research, 47: 257-285. Hakme E., Lozano A., Gómez-Ramos M. M., Hernando M. D., Fernández-Alba A. R. 2017. Non-target evaluation of contaminants in honey bees and pollen samples by gas chromatography time-of-flight mass spectrometry. Chemosphere, 184: 1310-1319. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2017.06.089. ISO 5725. 1994. Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results - Part2: Basic method for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method, pp. 1-42. Kasiotis K. M., Anagnostopoulos C., Anastasiadou P., Machera K. 2014. Pesticide residues in honeybees, honey and bee pollen by LC-MS/MS screening: Reported death incidents in honeybees. Sciience of the Total Environment, 485-486: 633-642. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2014.03.042. Lehotay S. J. 2007. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: collaborative study. Journal of AOAC International, 90: 485-520. DOI: 10.1093/jaoac/90.2.485. Lozano A., Rajski Ł., Uclés S., Belmonte-Valles N., Mezcua M., Fernández-Alba A. R. 2014. Evaluation of zirconium dioxide-based sorbents to decrease the matrix effect in avocado and almond multiresidue pesticide analysis followed by gas chromatography tandem mass spectrometry. Talanta, 118: 68-83. DOI: 10.1016/j.talanta.2013.09.053. 22 Luke M.A., Froberg J.E, Masumoto H.T. 1975. Extraction and cleanup of organochlorine, organophosphate, organonitrogen, and hydrocarbon pesticides in produce for determination by gas-liquid chromatography. Journal of AOAC, 58: 1020-1026. SANTE/11813/2017. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. DG SANTE, European Comission, 2017. Stenerson K. K, 2018. Analysis of pesticides in turmeric powder by LC-MS/MS and GC-MS/MS after cleanup with a novel dual-layer SPE cartridge. Supelco Analytical Products, Analytix reporter, št. 1, 2018. Uradni list Republike Slovenije št. 108/2007, str. 14834. Vázquez P. P., Lozano A., Uclés S., Ramos M. M. G., Fernández-Alba A. R. 2015. A sensitive and efficient method for routine pesticide multiresidue analysis in bee pollen samples using gas and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1426: 161-173. DOI: 10.1016/j.chroma.2015.11.081. Wang P.-C., Lee R.-J., Chen C.-Y., Chou C.-C., Lee M.-R. 2012. Determination of cyromazine and melamine in chiken eggs using quick, easy, cheap, effective, rugged and safe (QuEChERS) extraction coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 752: 78-86. DOI: 10.1016/j.aca.2012.09.029. 23