ERK'2021, Portorož, 419-422 419 Generatorizmeničnenapetostizaelektroformacijo orjaškihfosfolipidnihveziklov MarinGazvodadeReggi 1 ,UrbanMalavašič 1 ,MarkoJeran 12 ,SamoPenič 1 1 Laboratorijzafiziko,Fakultetazaelektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Tržaška cesta 25, SI-1000 Ljubljana 2 Laboratorijzakliničnobiofiziko,Zdravstvena fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zdravstvena pot 5, SI-1000 Ljubljana E-pošta: samo.penic@fe.uni-lj.si, marko.jeran@fe.uni-lj.si Voltagesourceforelectroformationofgiant unilamellarvesicles Cells are the main building blocks of all living organ- isms and are therefore subject of intensive research. Cell membranes are their vital components as their structure and properties influence many important functions of the cell. Due to the complicated structure of the cell mem- brane, researchers use simpler structures that resemble the membrane, called unilamellar vesicles, especially gi- antunilamellarvesicles,duetotheirsize. Therearemany methodsforacquiringthevesiclesusingtheirmainbuild- ing blocks – phospholipids, electroformation being the mostcommonlyused. Inthiswork,anopen-sourcesinusoidalvoltagesource designed for electroforming giant unilamellar vesicles will be presented. The device has been successfully used to produce vesicles from the phospholipid POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) and amixtureofPOPCandcholesterol(4/1). 1 Uvod Celica je temeljna gradbena in dejavna enota živih bitij. Njeno zunanjost in notranjost ločuje tanka plast, imeno- vana celična membrana, skozi katero prehajajo snovi v celico in iz nje. Celično membrano primarno sestavljajo molekule fosfolipidov, ki so organizirane v dvojno plast [1],vsamimembranipanajdemovelikorazličnihmakro- molekul, od različnih beljakovinskih molekul in holeste- roladodrugihbiološkopomembnihgradnikov(slika 1). Najpomembnejši nalogi membrane sta zaščita notra- njosti celice pred zunanjimi vplivi in kontroliran prenos snovi v celico in iz nje. Struktura membrane tako določa specifične funkcije delovanja celice. Tudi v notranjosti celice najdemo podobno zgradbo membran, ki delujejo kot ločnice med dvema področjema (npr. membrane, ki obdajajoceličneorganele)[2]. Preučevanje lastnosti celične membrane na modelu živih celic predstavlja izziv, saj so lastnosti in delovanje membrane pogojeni s številnimi celičnimi mehanizmi in zapleteno biološko zgradbo. Zaradi tega se v raziskavah pogosto uporabljajo poenostavljeni modeli celic. Prilju- bljen nadomestek celic so liposomi ali orjaški enoplastni vezikli GUV (angl. giant unilamellar vesicles) velikosti od 1–200μm. Sestavlja jih dvojna plast fosfolipidov, ki se pod vplivom hidrofobnih interakcij v vodni raztopini (transportni protein) proteinski kanal globularni protein glikoprotein holesterol periferni protein (integralni) globularni protein filamenti citoskeleta površinski protein (integralni protein) protein z α-vija čnico ogljikov hidrat glikolipid lipidna dvojna plast Slika 1: Celična membrana je kompleksna struktura, katere osnovni gradnik je fosfolipidna dvojna plast. Rdeče obarvani plastistasestavljeniizmnožicepolarnihglavfosfolipidov,med- tem ko rumeno obarvan pas predstavlja nepolarne repe fosfoli- pidnihmolekul. Povzeto po [3]. začnejo združevati v lipidne dvojne sloje [4, 5, 6, 7]. Za- radi ustrezne velikosti jih lahko neposredno opazujemo pod svetlobnim faznokontrastnim mikroskopom. Obi- čajno raziskovalci vezikel ali manjšo skupino osamijo, jo izpostavijo spremembi okolice in skozi daljše časovno obdobje spremljajo spremembe [8, 9, 10]. Za pripravo orjaških unilamelarnih (enoplastnih) fo- solipidnihveziklovuporabljamovečmetod,kotsohidra- cija lipidnega filma, elektroformacija, emulgiranje lipi- dov, mikrofluidne metode (usmerjanje hidrodinamičnega toka) in druge [11]. Natančnejši pregled metod priprave veziklov opisujejo Walde in sodelavci [12]. Elektroformacija je v laboratoriju najpogosteje upo- rabljen postopek priprave veziklov iz fosfolipidnih kom- ponent, saj je hiter (v povprečju 1–3ure) in učinkovit. V znanstveni literaturi sta metodo prvič opisala Angelova in Dimitrov leta 1986 [13]. Predlagani postopek elek- troformacije se izvede tako, da se na platinasti elektrodi nanese lipidno raztopino. Ko topilo izhlapi, se na elek- trodah tvori lipidni film. Elektrodi se preneseta v vodno raztopino sladkorja ali soli, izmenično električno polje medelektrodamapaspodbudiinpospešiprocestvorjenja lipidnih veziklov. Kot vir izmenične napetosti sinusne oblike se najpo- gostejeuporabljafunkcijskigenerator. Elektroformiranje veziklovpotekavšibkemelektričnempolju( 100V/m), ki ga pri majhni razdalji med elektrodama dobimo že pri nizkih napetostih (1–5V) in se harmonično spreminja s frekvencami 1–10Hz, zato lahko za postopek uporabimo preprostejše, cenejše in manjše naprave. V prispevku bomo predstavili pristop zamenjave funkcijskega genera- 420 torja z mikrokrmilnikom in uporabo filtriranega pulzno- širinskomoduliranega(PWM,angl.pulse-widthmodula- tion) digitalnega izhoda. Tako je lahko celoten protokol za elektroformacijo zapisan v pomnilniku mikrokrmil- nikaingasprožimospritiskomnagumb,brezpotrebepo nastavljanjuvira. Ključnidelštudijezajemaizdelavoprototipaizmenič- negageneratorjainkončnoverifikacijodelovanjanaprave. Vezje smo zgradili okoli odprtokodnega mikrokrmilni- škega sistema Arduino. Vezje in programsko kodo smo objavili pod odprtokodno licenco MIT. Z namenom da je končniizdelekmajhenintakoprenosljiv,preprostzaupo- rabotersevcelotinapajaprekvodilaUSB,smouporabili le lahko dobavljive in cenovno ugodne elektronske kom- ponente. Dokumentacijazaizdelavoizmeničnegaviraza elektroformacijojenavoljonastraniGitHub[14]. 2 Protokolelektroformacijeveziklov Protokol za pripravo enoplastnih orjaških veziklov dolo- čimo vnaprej, da dosežemo ponovljivost rezultatov eks- perimentalnega dela. V tem razdelku se bomo omejili le na del protokola, ki je neposredno povezan z virom ele- ktrične napetosti med elektrodama, neodvisno od izbire lipidov,raztopin,tipaelektrodindrugihdejavnikov. Osnovni protokol postopka elektroformacije zajema tri faze. V prvi fazi med elektrodama postopoma pove- čujemo amplitudo električne poljske jakosti do največje vrednosti (tipično 𝐸 max 100V/m). Tej fazi sledi op- cijska faza nabrekanja veziklov, kjer določen časovni in- terval vzdržujemo amplitudo poljske jakosti na največji vrednosti. Sledi zadnja faza, kjer praviloma zmanjšamo frekvencoinvzpodbudimo,dasefosfolipidnadvojnaplast sklenevsferičnevezikle[15]. Oblikaelektrod,predvsem pa njuna medsebojna razdalja, sta pomembna dejavnika, ki določata napetost generatorja, da je dosežena pravilna električna poljska jakost v raztopini. Napetost med elek- trodama,frekvencainčastrajanjaposameznefazeskupno lahko vplivajo na velikost in mehanske lastnosti nastalih veziklov[16]. Delovni protokol lahko ustrezno spremenimo tudi ob dodatku ali zamenjavi različnih reagentov, kot na primer uporaba raztopine soli namesto sladkorja [15]. V aplika- tivnihštudijahponavadiprvidelovnifazizdružimoveno [17]. V rutinskih laboratorijskih poskusih proces elektro- formacijenajpogostejeizvajamovvodnihraztopinahglu- koze. V nadaljevanju sledimo ključnim korakom, ki so jih opisali Stein in sodelavci [8]. Platinasti žični elekt- rodi premera 2mm sta na medsebojni razdalji 5mm. Delovni parametri sistema elektroformiranja veziklov so zajetitudivtabeli1. Postopno zmanjševanje frekvence in napetosti elek- tričnega polja povzroči, da se nabrekli lipidni vezikli po- časi odlepijo od površine elektrod in ostanejo prosto pla- vajočivraztopini. 3 Opisvezjageneratorja Z uporabo mikrokrmilniške platforme Arduino Uno smo generirali PWM signal s frekvenco 31,4kHz. Delovno Tabela 1: Parametrinapetostnegavira. Časovniinterval Napetost Frekvenca [min] [V pp ] [Hz] 120 10,0 5,0 15 5,0 2,5 15 2,5 2,5 15 1,0 1,0 razmerje posameznega cikla je bilo določeno na podlagi predhodno izračunane tabele sinusnih vrednosti. Signal smo filtrirali z nizkoprepustnim filtrom prvega reda, ki je utišalfrekvence nad150Hz,dasmo dobiliželenisinusni signal. Izhod nizkoprepustnega filtra je povezan z neinverti- rajočim vhodom operacijskega ojačevalnika, ki smo mu nastaviliojačanjezafaktor2. Uporabljenoperacijskioja- čevalnik LM358 podjetja Texas Instruments ima v DIP-8 ohišjudveenoti. Drugoenotosmouporabilikotinvertira- jočioperacijskiojačevalnik. SpotenciometromRV1smo nastaviliojačanjenafaktor2,5;spotenciometromRV2pa smo nastavili offset napetost operacijskega ojačevalnika, da ga signal ni spravil v nasičenje. Zaradienojneganapajanjaoperacijskegaojačevalnika smopriklopelektrodizvedlidiferencialnomedizhodoma obeh operacijskih ojačevalnikov. Kalibracijosmoizvedlizosciloskopom. Najprejsmo nastavili ojačanje s potenciometrom RV1 tako, da smo pri nastavljeni največji amplitudi izhoda mikrokrmilnika dobilimedizhodnimasponkamanapetostvršnevrednosti 10V pp ,sledilojeizničenjeenosmernekomponentenape- tosti s potenciometrom RV2. Operacijskiojačevalniksmonapajaliznapetostjo15V, ki smo jo iz napajalne napetosti mikrokontrolniškega sis- tema Arduino dobili s preklopnim pretvornikom navzgor (angl. boost converter). Uporabili smo modul na osnovi konverterja SX1308 proizvajalca Sunrom. Največjadopustnafrekvencanaizhodujeomejenana približno 150Hz, napetost na 10V pp . Tokovna zmoglji- vost izhoda je omejena s karakteristiko izbranega opera- cijskega ojačevalnika in je 40mA, kar pri visokoohm- skem bremenu, ki ga predstavlja viala z elektrodama in raztopino, ne predstavlja praktičnega problema (slika2). 4 Potekizvajanjaprogramskekode Na napravi so v električno izbrisljivem programirljivem bralnem pomnilniku EEPROM (angl. electrically erasa- ble programmable read-only memory) shranjeni parame- tri za izvedbo protokola priprave veziklov (tabela 1). Po vklopunapravesebarvnasvetlečadiodaprižgeinobarva svetlo modro. Spritiskomnagumbsepričneizvajatishranjenproto- kol,diodapaseobarvavijolično. Koseprotokolzaključi, sediodaobarvazeleno. Izvajanjeprotokolalahkomedde- lovanjem prekinemo s pritiskom na gumb, pri čemer se diodaobarvardeče. Diagrampotekadelovanjanapraveje predstavljen na sliki 3. 421 GND R6 320 R5 320 1 2 3 4 5 6 7 8 P1 Power Socket_Arduino_Uno:Socket_Strip_Arduino_1x08 +3.3V GND GND 1 2 3 4 5 6 P2 Analog Socket_Arduino_Uno:Socket_Strip_Arduino_1x06 1 2 3 4 5 6 7 8 P4 Digital Socket_Arduino_Uno:Socket_Strip_Arduino_1x08 GND V- 4 V+ 8 U1C LM358 +15V +5V GND C2 2,2 1 2 3 RV1 100k R3 100k 1 2 J1 Conn_Coaxial 1 10 2 3 4 5 6 7 8 9 P3 Digital Socket_Arduino_Uno:Socket_Strip_Arduino_1x10 R2 100k GND +15V 1 2 3 RV2 100k GND B G R 1 2 3 4 D1 LED_RCBG SW1 SW_Push GND 1 P5 Socket_Arduino_Uno:Arduino_1pin 1 P6 1 P7 1 P8 Socket_Arduino_Uno:Arduino_1pin GND R4 320 C1 22n R1 47k + 5 - 6 7 U1B LM358 1 - 2 + 3 U1A LM358 7 4 3(**) 5(**) IOREF 6(**) 3(**) A5(SCL) 8 9(**) 1(Tx) 2 Vin A0 A1 0(Rx) A2 A3 A4(SDA) 5(**) 11(**/MOSI) 2 Reset 6(**) 10(**/SS) A5(SCL) A4(SDA) 11(**/MOSI) 12(MISO) 13(SCK) AREF Shield for Arduino that uses the same pin disposition like "Uno" board Rev 3. 1 Holes Slika2: Shemaelektričnegavezja. Naprava je prižgana Pritisnjen gumb Nov protokol se zapiše v pomnilnik Nov protokol Izvaja se shranjen protokol Pritisnjen gumb Izvajanje se preneha Izvajanja je konec Konec korakov Slika3: Diagram poteka delovanja generatorjanapetosti. V pomnilniku naprave je vedno shranjen zadnji upo- rabljen protokol, ki ga lahko spremenimo s priklopom naprave prek vodila USB na računalnik in uporabo apli- kacije, razvite v programskem jeziku Python. Naprava sprejema novo navodilo za izvajanje protokola prek se- rijskih vrat pri hitrosti 115200Bd. Navodilo sestavljajo z vejico ločeni parametri električnega polja, posamezne korake pa med seboj ločuje podpičje. Začetek in ko- nec navodila omejujeta znaka “<” in “>”. Ko ga naprava sprejme,starprotokolprepišeznovim,diodapaseobarva temno modro. Shematski prikaz izvajanja protokola ele- ktroformacijejepredstavljennasliki4. 5 Rezultatiinzaključek Harmonični vir napetosti smo preizkusili v laboratoriju, kjer smo sledili navodilom za pripravo po literaturi [8]. Orjaške fosfolipidne vezikle smo z elektroformacijo naj- prej pripravili iz sintetičnega lipida POPC (1-palmitoil- 2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholina) in nato še iz njegove mešanice s holesterolom (proizvajalec obeh: Avanti Po- lar Lipids). Na vsako platinasto žično elektrodo smo s polzenjem kapljice nanesli 20μL omenjenega lipida raz- redčenega v mešanici kloroforma in metanola v volum- skem razmerju 2:1 na koncentracijo 1mg/mL. Nanos na elektrodahsmo45minutsušiliveksikatorjuprikonstan- tnem vakumu. Po sušenju smo elektrodi vstavili v 2mL Novi parametri Množenje tabele sinusnih vrednosti Pisanje trenutne sinusne vrednosti v obliki PWM signala Časovnik sproži ukaz Napetost Hitrost časovnika Frekvenca Začetek protokola Pretečen časovni interval Nov korak Konec protokola Konec korakov Slika 4: Diagrampoteka izvajanjaprotokolaelektroformacije. plastično vialo z 1,8mL 0,3M raztopine saharoze. Elektrodismopriključilinasponkiharmoničnegavira napetosti ter sprožili program po protokolu, opisanem v razdelku 2. Po skupno 165 minutah smo odklopili elek- trodi in vsebino viale previdno prenesli v 3,60mL 0,3M glukoze (vol. razmerje saharoze in glukoze v končni me- šanici je znašalo 1:2). Po 200μL suspenzije smo odpipe- tiraliveksperimentalnekamrice(proizvajalecGraceBio- Labs), ki omogočajo kvantitativno analizo polj in ena- komeren zajem slike pod mikroskopom. Kamrice smo postavili pod mikroskop in počakali 30 minut, da se je vsebina posedla na dno. Pregled s svetlobnim mikrosko- pom (Nikon Eclipse TE2000-S) smo opravili s pomočjo imerzijskega olja pri 100-kratni povečavi. Predstavnikaorjaškihfosfolipidnihveziklovobehfor- macij smo zajeli z mikroskopsko kamero (model UI- 3280CP proizvajalca IDS Imaging). Na sliki 5a je pred- stavljen vezikel, katerega membrana sestavlja le fosfoli- pid POPC brez dodanega holesterola, medtem ko je na 5b skupek veziklov, katerih membrane vsebujejo njuno mešanico. Zaradi dodatka holesterola je membrana tudi nekoliko debelejša, kar mikroskopija lepo poudari. Količini nastalih veziklov v obeh primerih formacije stabiliprimerljiviskoličinama,pridobljenimazuporabo 422 (a) (b) Slika 5: Posnetek orjaških fosfolipidnih veziklov pri 100-kratni povečavi. NaslikahsomembranesfosfolipidiPOPCbrez(a)in zdodanimholesterolom vrazmerju1:4(b). komercialnega funkcijskega generatorja. Postopek elek- troformacije ne zahteva natančne sinusne oblike signala, zato je konstrukcija signala z uporabo modulacije PWM zadovoljiva. Protokoli, ki jih zasledimo v literaturi celo navajajo druge oblike signalov. Méléard v preglednem članku [15] omenja uporabo izmeničnega vira pravoko- tne ali sinusne oblike, pri posebnih pogojih pa določeni avtorji (npr. [18]) uporabljajo protokole, ki kombinirajo obasignala–takosinusnekottudipravokotneoblike. Predstavljen generator sinusne napetosti nastavljive amplitude in frekvence predstavlja mobilno ter cenovno ugodno rešitev za elektroformacijo orjaških fosfolipidnih veziklov. Dodatna prednost je popolna avtomatizacija postopka elektroformacije in enostavna uporaba genera- torja, saj so koraki protokola zapisani v pomnilniku ter se po vrsti samodejno izvajajo, zato naprave med izvaja- njemprotokolanipotrebnododatnonastavljati. Generator ne potrebuje dodatnega električnega napajanja, saj lahko za njegovo delovanje uporabimo kar računalniški izhod USB. Dodatna prednost povezave z računalnikom je tudi možnostimplementacijekomuniciranjazračunalnikomin obveščanja prek internetne povezave o samem stanju iz- vajanja protokola. Z namenom širše uporabe generatorja smo načrt in programsko kodo objavili pod odprtokodno licencoMIT. Literatura [1] G. Cevc and D. Marsh, Phospholipid bilayers: physicalprinciplesandmodels. Wiley,1987. [2] Ü. Coskun and K. Simons, “Cell membranes: the lipid perspective,” Structure, vol. 19, no. 11, pp.1543–1548,2011. [3] Wikipedia contributors, “Celična membrana – Wikipedia, the free encyclopedia.” https:// sl.wikipedia.org/wiki/Celi£na_membrana, 2021. [Naspletu;dostopano20.julij2021]. [4] U. Seifert, “Configurations of fluid membranes and vesicles,” Adv. Phys., vol. 46, no. 1, pp. 13–137, 1997. [5] S. A. Safran, “Curvature elasticity of thin films,” Adv.Phys.,vol.48,no.4,pp.395–448,1999. [6] J.F.Nagle,“Introductorylecture: Basicquantitiesin model biomembranes,” Faraday Discuss., vol. 161, pp. 11–29, 2013. [7] R. Dimova, “Recent developments in the field of bending rigidity measurements on membranes,” Adv. Coll. Interf. Sci., vol. 208, pp. 225–234, 2014. [8] H. Stein, S. Spindler, N. Bonakdar, C. Wang, and V. Sandoghdar, “Production of isolated giant uni- lamellar vesicles under high salt concentrations,” Frontiers in physiology, vol. 8, p. 63, 2017. [9] J. Zupanc and D. Drobne, “Populacije orjaških li- pidnih veziklov kot model za studij bio-nano inte- rakcij/giant lipid vesicle populations as a model for bio-nanointeractionstudies,”inInformaticaMedica Slovenica,vol.16,p.1,SlovenianMedicalInforma- tics Association (SIMIA), 2011. [10] S.Penič,L.Mesarec,M.Fošnarič,L.Mrówczyńska, H. Hägerstrand, V. Kralj-Iglič, and A. Iglič, “Bud- ding and fission of membrane vesicles: A mini re- view,”Frontiers in Physics, vol. 8, p. 342, 2020. [11] V. Pereno, D. Carugo, L. Bau, E. Sezgin, J. Ber- nardino de la Serna, C. Eggeling, and E. Stride, “Electroformation of giant unilamellar vesicles on stainlesssteelelectrodes,”ACSOmega,vol.2,no.3, pp. 994–1002, 2017. [12] P.Walde,K.Cosentino,H.Engel,andP.Stano,“Gi- ant vesicles: preparations and applications,” Chem- BioChem, vol. 11, no. 7, pp. 848–865, 2010. [13] M.I.AngelovaandD.S.Dimitrov,“Liposomeelec- troformation,”FaradaydiscussionsoftheChemical Society, vol. 81, pp. 303–311, 1986. [14] “RepozitorijnastraniGitHub.”https://github. com/umalavasic/electroformation. [15] P.Méléard,L.A.Bagatolli,andT.Pott,“Giantuni- lamellarvesicleelectroformation: Fromlipidmixtu- restonativemembranesunderphysiologicalcondi- tions,” Methods in enzymology, vol. 465, pp. 161– 176, 2009. [16] D. Drabik, J. Doskocz, and M. Przybyło, “Effects of electroformation protocol parameters on quality of homogeneous guv populations,” Chemistry and physics of lipids, vol. 212, pp. 88–95, 2018. [17] P. Santhosh, J. Genova, A. Iglic, V. Kralj-Iglic, and N. P. Ulrih, “Influence of cholesterol on bilayer flu- idity and size distribution of liposomes,” Comptes rendusdel’AcadémiebulgaredesSciences,vol.73, no. 7, 2020. [18] M. Breton, M. Amirkavei, and L. M. Mir, “Opti- mization of the electroformation of giant unilamel- larvesicles(guvs)withunsaturatedphospholipids,” The journal of membrane biology, vol. 248, no. 5, pp. 827–835, 2015.