,
&&2
	
 %
	



ONKOLOGIJA / z Onkolo{kega in{tituta
114
Nastanek Oddelka za molekularno diagnostiko na
Onkolo{kem in{titutu Ljubljana
Ob zdru`evanju laboratorijske diagnostike znotraj Oddelka
za laboratorijsko diagnostiko (hematologija, biokemija in
imunologija) se je del Oddelka za tumorsko biologijo
preusmeril v molekularno diagnostiko. S pridru`itvijo dela
molekularne diagnostike Oddelka za patologijo smo
oblikovali nov Oddelek za molekularno diagnostiko. Svoje
prostore ima v prvem nadstropju stavbe A, skupaj z
Oddelkom za eksperimentalno onkologijo.
Programska usmeritev Oddelka za molekularno
diagnostiko
Oddelek za molekularno diagnostiko smo zasnovali kot
diagnosti~no-raziskovalni oddelek. To pomeni, da del
programa vklju~uje uvajanje in izvajanje diagnosti~nih
metod s podro~ja molekularne diagnostike za potrebe
Onkolo{kega in{tituta in drugih zainteresiranih zunaj
in{tituta. Drugi del programa pa predstavlja raziskovalno
delo v molekularni in tumorski biologiji. Tudi ta del je
usmerjen predvsem v potrebe Onkolo{kega in{tituta, vendar
je odprt za sodelovanje tudi z drugimi in{titucijami v
Sloveniji in drugod. Sodelovanje poteka prek povezav na
raziskovalnih projektih in programih ter tudi v izobra`evanju.
Diagnostika
Na Oddelku za molekularno biologijo trenutno izvajamo
diagnosti~ne teste za potrebe genskega svetovanja s podro~ja
raka dojke in molekularno diagnostiko pri limfomih.
Rak dojke
Avtosomne dominantne mutacije, ki so najpogosteje
povezane s karcinomom dojke, so mutacije v supresorskih
genih BRCA1 in BRCA2. Verjetnost, da se avtosomna
mutacija prenese v naslednjo generacijo, je 50 %, s ~imer
se pomembno pove~a ogro`enost za nastanek raka na dojki
(pri nosilcih mutacije). Zato je smiselno dolo~ati prisotnost
teh mutacij in tako pravo~asno predvideti ogro`enost za
nastanek raka na dojki pri preiskovani osebi ter pravilno
ukrepati. S temi testi `elimo zajeti ~im ve~je {tevilo mutacij,
ki so zna~ilne za dedni rak dojke. Zato bomo nadaljevali
iskanje in dolo~anje najzna~ilnej{ih mutacij tako v genu
BRCA1 kot v BRCA2. Trenutno dolo~amo naslednje:
BRCA1:
• Mutacija 1806 C>T ex 11
• 300 T>G (C61G) ex 5
• 310 G>A (C64Y) ex 5
• 5382insC (stop 1829) ex 20
BRCA2:
• Slovenska mutacija IVS-16
Limfomi
Eden od izzivov v onkologiji je pravilna opredelitev
hematolo{kih malignomov na podlagi molekularnobiolo{kih
znakov. Podobna ali enaka morfologija tumorskih celic ne
pomeni vedno tudi molekularne podobnosti. Prav zaradi
tega je molekularnobiolo{ka opredeljenost tumorskih celic
pomembna za pravilno na~rtovanje zdravljenja in
spremljanje bolezni.
Klonalnost je diagnosti~no merilo za lo~evanje neoplazije
in reaktivnega procesa. Ve~ina neoplasti~nih procesov je
monoklonalnih (izhajajo iz ene patolo{ko spremenjene
celice), reaktivne (benigne) limfoidne proliferacije pa so
ve~inoma poliklonalne.
• Dolo~anje klonalnosti limfoidnih proliferacij z metodo
PCR
o Dokazovanje preurejenega gena za te`ko verigo
imunoglobina (IgH) – limfomi tipa B.
o Dokazovanje preurejenega gena za gamaverigo
receptorja T (TcRg) – limfomi tipa T.
• Dokazovanje kromosomske translokacije
t(14;18)(q32;q21) pri folikularnem limfomu (bcl-2);
klasi~na PCR ali kvantitativna PCR.
• Dokazovanje kromosomske translokacije
t(11;14)(q13;q32) pri limfomu pla{~nih celic (bcl-1) z
metodo PCR (klasi~na).
Raziskovanje
Raziskovalno dejavnost Oddelka za molekularno
diagnostiko sooblikujeta dva celostna pristopa:
1) razvijanje in uvajanje novih metod v molekularni
diagnostiki (za potrebe razli~nih rakavih bolezni);
2) temeljne raziskave s podro~ja tumorske imunologije.
Razvijanje in uvajanje novih metod v molekularni
diagnostiki
V tem sklopu potekajo raziskave, kjer ocenjujemo uporabno
vrednost razli~nih molekularnobiolo{kih ozna~evalcev za
spremljanje bolezni, napovedovanje poteka bolezni in
odgovora na zdravljenje ali za zgodnje odkrivanje
raz{irjenosti bolezni.
Iz tega sklopa `elim omeniti:
• molekularnobiolo{ko dolo~anje telomeraznih podenot v
plazmi bolnikov z razli~nimi vrstami raka (rak dojke,
{~itnice, maligni melanom, limfomi ...);
• molekularnobiolo{ko dolo~anje mRNA za tirozinazo pri
bolnikih z malignim melanomom.
2_2005_nov.qxd  11/29/05  7:45 PM  Page 114
ONKOLOGIJA / z Onkolo{kega in{tituta
in 2, sta narekovala preventivno testiranje oseb s pove~anim
tveganjem. Pri bolnikih, pri katerih je dokazana dedna
oblika medularnega raka {~itnice (MTC), je zgodnja
odstranitev {~itnice pogosto povezana z ozdravitvijo. Za
nastanek razli~nih sindromov tipa 2 (MEN 2A, MEN 2B,
MTC, FMTC) so odgovorne dedne mutacije v onkogenu RET
(lociran na kromosomu 10). Najpogosteje spremenjena
obmo~ja tega gena so eksoni 10, 11, 13, 14, 15 in 16.
Najpogostej{a vrsta mutacij so mutacije s spremenjenim
pomenom (missense mutacije).
Za rutinsko diagnostiko nameravamo pripraviti sonde in
primere za znane to~kovne mutacije na razli~nih kodonih.
Upo{tevali bomo pojavnost mutacij v slovenski populaciji
in poskusili bomo pokriti ~im ve~ji odstotek populacije.
Poleg tega nameravamo uvesti tudi metodo za odkrivanje
mutacij na podlagi razlik v temperaturi taljenja vezi med
baznimi pari in sekveniranje le-teh.
Temeljne raziskave s podro~ja tumorske imunologije
Pri ve~ini temeljnih raziskav na Oddelku za molekularno
diagnostiko posku{amo uporabiti pridobljeno znanje iz
molekularne in tumorske biologije. ^e je na{e rutinsko delo
usmerjeno v razvoj in uvajanje novih metod za odkrivanje
in spremljanje rakavih bolezni, je ve~ina temeljnih raziskav
usmerjenih v pripravo in testiranje novih biolo{kih zdravil –
predvsem tumorskih vakcin.
Tako smo v preteklosti pripravili klasi~no tumorsko vakcino
in ekspresijske kasete za nekaj rekombinantnih vakcin (glej
prej{njo {tevilko Onkologije). Na{a sedanja usmeritev na
tem podro~ju je oblikovanje in testiranje tumorskih vakcin,
ki temeljijo na uporabi dendritskih celic. Teko~e raziskave
zajemajo razli~no uporabo dendritskih celic in spremljanje
mehanizmov, prek katerih ti pripravki spro`ijo protitumorski
imunski odgovor.
Sedanji raziskovalni projekti
• Priprava tumorskih vakcin: hibridomi in gensko
spremenjene vakcine. Od leta 2004 do 2007. Odgovorni
nosilec dr. Srdjan Novakoviæ.
Povezave z drugimi raziskovalnimi in{titucijami
Oddelek za molekularno diagnostiko je nastal {ele letos
(2005), tako da se bodo prave povezave z doma~imi in
tujimi ustanovami {ele oblikovale. Navajam samo nekatere
od ustanov, s katerimi trenutno sodelujemo:
• Medicinska fakulteta v Ljubljani
o Medicinski center za molekularno biologijo, In{titut za
biokemijo
o In{titut za mikrobiologijo in imunologijo
• Kemijski in{titut Ljubljana
V tujini sodelujemo z Vrije Universiteit Brussel pri iskanju
mutacij v genih BRCA v slovenskih dru`inah z dednim
rakom dojke in/ali jaj~nikov, v okviru projekta Genetic and
environmental risk factors for melanoma: translation into
behavioural change pa sodelujemo pri iskanju in
ocenjevanju razli~nih dejavnikov tveganja za nastanek
melanoma. V okviru projekta je predvidena ocena
prevalence in penetrance pomembnej{ih mutacij pri
bolnikih z melanomom.
115
V ta sklop raziskav spada {e prenos (uvajanje) v literaturi `e
opisanih molekularnobiolo{kih metod v rutinsko delo
oddelka. Predvsem gre za metode, ki imajo veliko uporabno
vrednost pri genskem svetovanju, zgodnjem odkrivanju
bolezni ali pri postavljanju diferencialne diagnoze. Med
slednje spadajo metode za dokazovanje mutacij pri
naslednjih vrstah raka.
^revesni rak
Nastanek ~revesnega raka je povezan z genetskimi
spremembami, ki jih v grobem lahko razdelimo v dve
kategoriji: kromosomske nestabilnosti (85 % primerov) in
mikrosatelitne nestabilnosti (15 % primerov). Kromosomske
nestabilnosti so najpogostej{e na kromosomih 5q, 18q, 17p
in v predelih, kjer se nahaja onkogen kRAS. Najpogosteje
prizadeti geni so APC (5q), DCC/MADH2/MADH4 (18q) in
p53 (17q). Med mutacije, ki so tudi sicer med prvimi
mutacijami v zgodnjih fazah nastanka ~revesnega raka in so
potrjene kot germinalne mutacije, spadajo mutacije v genu
APC. Mikrosatelitna nestabilnost je posledica mutacij v
popravljalnih genih (MMR – mismatch repair genes), ki niso
ve~ sposobni kodiranja normalnih popravljalnih proteinov.
Posledica tega so pomno`eni ali manjkajo~i deli DNA
(najve~krat v nekodirajo~ih obmo~jih), ki spremenijo bralne
okvirje v razli~nih genih. Za nastanek raka pa so
pomembne mutacije, ki na tak{en na~in nastanejo v
onkogenih in tumorskih supresorskih genih, kjer povzro~ijo
maligno transformacijo. Take mutacije so lahko germinalne
in somatske.
Za potrebe genetskega svetovanja in spremljanja dedno
predpogojenih oblik ~revesnega raka na~rtujemo:
• dolo~anje APC mutacij pri FAP (familiarna
adenomatozna polipoza) 
del (AAAAG) kodon 1309
APC I1307K – T>A
• dolo~anje mikrosatelitne nestabilnosti in mutacij v genih
MMR pri HNPCC (dedni nepolipozni ~revesni rak)
hMSH2
hMLH1
Maligni melanom
Dominantno podedovane mutacije pri bolnikih z malignim
melanomom so opisane v dveh genih – CDKN2A in CDK4.
Gen CDKN2A kodira protein p16, ki zavira delovanje
proteinske kinaze CDK4, s ~imer blokira delovanje
tumorskega supresorskega gena RB (retinoblastomski gen).
Ve~ina mutacij CDKN2A se pri dednemu melanomu
pojavlja v eksonih 1á in 2 (redko v eksonu 1â), medtem ko
do sedaj ni bilo opisanega primera z mutacijami v eksonu
3. Mutacije v genu CDK4 lahko povzro~ijo nastanek
nefunkcionalnega proteina ali pa preprosto prepre~ijo
vezavo proteina p16 na konsenzno sekvenco gena CDK4,
zaradi ~esar postane gen nefunkcionalen.
Glede na navedeno na~rtujemo uvajanje:
• mutacije v genu CDKN2A,
• mutacije v genu CDK4.
Medularni rak {~itnice
Identifikacija germinalnih mutacij, povezanih z multiplo
endokrino neoplazijo (MEN), ter izra`anje sindromov tipa 1
2_2005_nov.qxd  11/29/05  7:45 PM  Page 115
ONKOLOGIJA / z Onkolo{kega in{tituta
116
Sedanje stanje in perspektiva
Razumevanje vzrokov za nastanek ve~ine rakavih bolezni
je {e vedno omejeno. Zadnja odkritja v molekularni
biologiji, genetiki in tumorski biologiji predstavljajo temelj
za razvoj novih diagnosti~nih metod in za pripravo novih
zdravil. Nova diagnostika omogo~a bolj{o molekularno
definicijo raka in uvajanje celo vrsto novih dejavnikov
(spremembe v posameznih genih, razli~ni genski profili,
proteinska ekspresija), na podlagi katerih lahko
predvidevamo potek rakave bolezni. Cilja molekularne
diagnostike sta identifikacija tipov celic, ki so
predisponirane za nastanek tumorja, in identifikacija
mehanizmov, ki privedejo do maligne transformacije.
Onkolo{ki in{titut je kot osrednja ustanova za raka zavezan
k temu, da spremlja in uvaja nove diagnosti~ne in
terapevtske pristope v korist bolnikov z rakom. S tem
namenom je nastal tudi Oddelek za molekularno
diagnostiko, kjer zdru`ujemo vse tovrstne dejavnosti
Onkolo{kega in{tituta na enem mestu. @e v tem trenutku
izvajamo nekaj metod, ki so nepogre{ljive pri sodobni
rutinski diagnostiki raka. Veliko dela pa bo treba vlo`iti v
razvoj novih in prenos obstoje~ih metod v rutinsko
diagnostiko. Prav zaradi tega je raziskovalni del novega
oddelka v tem trenutku ob{irnej{i kot njegova rutinska
dejavnost. Pri~akujemo, da se bo to razmerje z leti
spremenilo v korist uporabne diagnostike.
■
2_2005_nov.qxd  11/29/05  7:45 PM  Page 116