104 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 105Uvodnik zgodovinarja (1959) pomembno pojasnilo: »No- benega znanstvenega eksperimenta ni mogoče narediti, ne da bi si ga raziskovalec prej zamislil v mislih. Samo opazovanje ni mogoče brez ka- kšne interpretacije, to je, razumevanja.« Po Flo- rovskem tudi »prepričanje, da viri obstajajo zunaj historiografske obravnave […], vodi v psevdohi- storično lepljenko oziroma ‚zgodovino brez zgo- dovinskega problema‘. Rezultat, ki ga v tem pri- meru dobimo, je v najboljšem primeru suhoparna kronika, ki pa ni nič drugega kakor ‚truplo zgo- dovine‘«. »Najbolj brezkompromisen je pri opre- delitvi vloge interpreta in predmeta zgodovine. Prepričan je namreč, da zgodovinarja ni mogoče misliti zunaj procesa rekonstrukcije preteklosti. Še več, vsak poskus izključevanja zgodovinar- jevih siceršnjih predstav, predsodkov in prepri- čanj vodi v ‚umski samomor oziroma popolno mentalno sterilnost‘.« Podobno je s predmetom obravnave, ki po Florovskem nima nič skupnega z določenimi objektivnimi dejstvi, pač pa pred- stavlja svojevrstno »srečanje z živimi bitji«. »Pri tem […] verjame, da v zgodovini pravzaprav ni pravih ‚dogodkov‘, ampak dogajanje, ki izraža določene misli in namene vsakokratnega akter- ja, tako da bi zgodovinar moral težiti predvsem k rekonstrukciji akterjevega mišljenja.« Za Flo- rovskega je zgodovina zgodovina človeka v vsej njegovi dvoumni in večplastni eksistenci. Zato je svaril zgodovinarje pred nevarnostjo, da bi svoje konceptualne predstave zamenjevali za empirič- no resničnosti in govorili o njih – konceptualnih predstavah -, kot da so same dejavniki in akterji, medtem ko so dejansko le razumske okrajšave za raznolikost resničnih, dejavnih ljudeh. Florovsky svojo misel razvija naprej takole: »Tako [zgodo- vinarji] opisujejo razvoj ‚fevdalizma‘ ali ‚kapita- listične družbe‘, pozabljajoč, da ti izrazi le pov- zemajo zapleteni skupek različnih pojavov, ki jih imamo za celoto le, če se jih ‚lotimo‘ z razumom. ‚Družbe‘, ‚kategorije« in ‚tipi, vrste‘ niso organiz- mi - ti edini se lahko »razvijajo« -, ampak za- pleteni skupki med seboj delujočih posameznikov, to medsebojno delovanje pa je vedno dinamično, f leksibilno in nestabilno.« Misel Florovskega pa je najbolj pronicljiva in v tej pronicljivosti tudi najbolj presunljiva v zaključku: »Lahko bi celo rekli, da bi ‚dokončna‘ interpretacija dogodkov odpravila ‚zgodovinskost‘ zgodovine, njeno na- ključnost in ‚nenujnost‘, ter jo nadomestila z ra- cionalnim ‚zemljevidom zgodovine‘, ki je lahko bleščeč in berljiv, vendar bivanjsko neresničen. Tudi naše interpretacije so zgodovinska dejstva in v njih upodobljeni dogodki nadaljujejo svoje zgodovinsko bivanje in sodelujejo pri oblikovanju zgodovinskega življenja. Lahko razpravljamo, ali je ‚Platonov Sokrat‘ bil ‚resnični‘ Sokrat, vendar ni dvoma, da je ta Platonov Sokrat zgodovin- sko obstajal kot močan dejavnik pri oblikovanju našega sodobnega pojmovanja ‚f ilozofa‘. Zdi se, da naše interpretacije na neki skrivnostni način razkrivajo skrite možnosti dejanske preteklosti. Na ta način se oblikujejo in rastejo tradicije, naj- večja od vseh človeških tradicij pa je ‚kultura‘. V njej se vsi delni in posebni prispevki zapore- dnih dob stopijo skupaj, v tem procesu taljenja sintetično preoblikujejo in se končno združijo v celoto. Ta proces oblikovanja človeške kulture še ni dokončan in verjetno v zgodovini nikoli ne bo dokončan. To je dodaten razlog, zakaj bi mora- le biti vse zgodovinske interpretacije začasne in približne: prihodnost, ki še ni prišla, lahko osve- tli preteklost.« Razmišljanje Florovskega o zgodovini je sijajno in skrajno pomenljivo - zelo stenografsko pove- dano: pomenljivo in predvsem za naš čas izredno poučno je, ker problematizira vsako ideološko branje zgodovine. Bralkam in bralcem priporo- čam, da ga preberejo večkrat in o njem tudi raz- mišljajo. Florovsky »govori« vsem nam. In tudi meni. Pomagal mi bo pri nadaljevanju razmišlja- nja o odnosu do naše zgodovine v prihodnjem uvodniku. Tomaž Sajovic Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023 Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19: ob Nobelovi nagradi za medicino 2023 Radovan Komel V današnji globalno povezani družbi je tveganje novih pandemij večje kot kadarkoli prej. Pandemije, hitro širjenje nalezljivih bolezni po več celinah oziroma po vsem svetu, običajno povzročajo patogeni dejavniki, kot so glivice, bakterije, virusi, paraziti, ki prečkajo vrstno oviro iz prenašalne živali v človeka in se širijo kapljično, z aerosolom, kar povzroča okužbe dihalnih poti, z uživanjem okuženih živil ali z neposrednim dotikom. Razvijanje in uvajanje cepiv, dovolj hitro za ublažitev pandemije, ki bi lahko povzročila zastoj svetovnega gospo- darstva in velike družbene spremembe, sta bili ogromen izziv, s katerim se pred pandemijo COVID-19 še nismo srečali. Ko se je konec leta 2019 pojavil virus SARS-CoV-2 in se hitro razširil po vsem svetu, si je le malokdo mislil, da bi lahko pravočasno razvili cepiva, s katerimi bi bilo mogoče bolezen zaustaviti in omejiti njene posledice. Katalin Karikó, rojena 17. januarja leta 1955 v mestu Szolnok na Madžarskem, je madžarsko-ameriška biokemičarka, specializirana za preučevanje molekulskih mehanizmov, posredovanih z ribonukleinsko kislino, zlasti z in vitro prepisano sporočilno RNA, za uporabo v proteinskem nadomestnem zdravljenju. Je članica Univerze Szeged v Szegedu na Madžarskem in hkrati tudi Univerze Pensilvanije v Filadelfiji v Združenih državah Amerike. Drew Weissman, rojen 7. septembra leta 1959 v mestu Lexington v zvezni državi Massachusetts v Združenih državah Amerike, je ameriški zdravnik in imunolog, znan po svojih prispevkih v molekularni biologiji RNA. Je nosilni raziskovalec za raziskave cepiv in direktor Inštituta za inovacije RNA in hkrati tudi profesor na Medicinski fakulteti Perelman na Univerzi v Pensilvaniji v Združenih državah Amerike. 106 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 107Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv Virus SARS-CoV-2, poimenovan »korona- virus sindroma akutne respiratorne stiske 2« ali kratko kar »koronavirus«, je bil prvič odkrit v izbruhu v kitajskem mestu Wuhan decembra leta 2019 in se je v začetku leta 2020 razširil na druga območja Azije in na- to po vsem svetu. Virus, ki povzroča koro- navirusno bolezen, COVID-2019 oziroma COVID-19, se najpogosteje širi po zraku v drobnih kapljicah med ljudmi v tesnem sti- ku in povzroča bolj ali manj resne okužbe dihal, pri starejših odraslih in ljudeh z do- ločenimi zdravstvenimi težavami pa lahko povzroči potrebo po bolnišnični oskrbi ali celo smrt. Zaradi širjenja bolezni je Svetov- na zdravstvena organizacija (WHO) 30. ja- nuarja leta 2020 virusni izbruh razglasila za javnozdravstveno nevarnost mednarodnega pomena in, v nadaljevanju, sámo bolezen za javnozdravstveno krizo mednarodnih raz- sežnosti. Do preklica te izjave je prišlo šele 5. maja leta 2023, vendar je pandemija do konca februarja leta 2024 povzročila več kot sedem milijonov potrjenih smrti, kar jo uvr- šča na peto mesto na seznamu najbolj smr- tonosnih epidemij oziroma pandemij v zgo- dovini. Na seznamu epidemij in pandemij z najmanj enim milijonom smrti si tako deli neslavno mesto z boleznimi, kot so bubon- ska kuga, črne koze, (španska, hongkonška) gripa, kolera, tifus in AIDS. Tako kot drugi koronavirusi ima tudi viru- sni delec (virion) SARS-CoV-2 štiri struk- turne beljakovine, poznane kot S (protein bodice oziroma konice, angleško spike - S), E (protein ovojnice, angleško envelope - E), M (protein membrane - M) in N (protein nukleokapside – N). Protein N obdaja in vzdržuje zgradbo/obliko virusnega RNA-ge- noma, proteini S, E in M pa skupaj tvorijo virusno ovojnico. Koničasti izrastek oziroma bodica je odgovorna za to, da se virus lah- ko pritrdi na membrano gostiteljeve celice. Potem ko se virion SARS-CoV-2 pritrdi na ciljno celico, celični encim razgradi protein bodice in virion nato v celico sprosti svojo RNA in jo prisili, da ustvarja kopije virusa, ki se potem širijo v sosednje celice. Neomejeno širjenje porajajočega se virusa v novem gostitelju ima navadno za posledico nabiranje mutacij v virusnem genomu, to pa pojav novih virusnih različic. Poseben problem so podaljšane, dolgotrajne okužbe s SARS-CoV-2 pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom. Te lahko povzročijo nastanek virusnih različic z mutacijami, ki virusom omogočajo, da se izognejo imuno- sti gostitelja. Virus SARS-CoV-2 mutira v povprečju enkrat ali dvakrat na mesec, kar je sicer manj kot virus gripe, vendar če je hkrati okuženih zelo veliko ljudi, to pome- ni veliko naključnih mutacij, med katerimi se, sicer redko, lahko pojavijo tudi takšne, ki so za virus koristne. Najbolj skrb vzbuja- joče so mutacije, ki povzročijo aminokislin- ske spremembe v zgradbi in s tem v obli- ki bodičastega proteina S. Že malenkostno spremenjena oblika tega proteina virusu lahko omogoči, da se bolj učinkovito veže na sprejemno mesto na človeških celicah in tako lažje oziroma pogosteje vstopa v celi- ce. To pomeni, da je ta različica bolj kužna kot virusi, ki take mutacije nimajo. Dodatna težava je, da sprememba v zgradbi proteina S lahko oteži tudi vezavo že obstoječih pro- titeles, ki jih je imunski sistem razvil med okužbo s starejšimi različicami virusa in ki sicer virus inaktivirajo s tem, da se vežejo na mesto, s katerim se virus pritrdi na celico. S cepivi in cepljenjem pomagamo ljudem, da se obranijo pred okužbo Obrambo telesa na virusno okužbo v glav- nem delimo v tri dele: (A) izločanje citoki- nov, sporočevalnih molekul, ki v napadenih celicah sprožijo procese proti pomnoževa- nju virusne RNA in razmnoževanju virusa ter spodbudijo imunski odziv; (B) ubijanje z virusom okuženih celic z naravnimi celi- cami ubijalkami (vrste belih krvničk, NK – angleško natural killer cells) in citotoksičnimi levkociti (CTL); (C) preprečevanje sposob- nosti virusa, da okuži (nove) celice, z nev- tralizirajočimi protitelesi. Te tri dele lahko povzamemo kot prirojeno in prilagoditveno imunost. Pri virusnih okužbah naj bi prirojeni imunski sistem gostitelja deloval kot prva obrambna Prirejeno po: J. Fu, 2020: Molecular Biology Reports, 47 (6): 4383-4392. Protein bodice (S) Ovojnični protein (E) Ovojnica Nukleokapsidni protein (N) RNA Membranski protein (M) Prirejeno po: J. Tseng: Adgene Blog, 12. 7. 2021. Vstopni prejemnik virusa 106 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 107Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv Virus SARS-CoV-2, poimenovan »korona- virus sindroma akutne respiratorne stiske 2« ali kratko kar »koronavirus«, je bil prvič odkrit v izbruhu v kitajskem mestu Wuhan decembra leta 2019 in se je v začetku leta 2020 razširil na druga območja Azije in na- to po vsem svetu. Virus, ki povzroča koro- navirusno bolezen, COVID-2019 oziroma COVID-19, se najpogosteje širi po zraku v drobnih kapljicah med ljudmi v tesnem sti- ku in povzroča bolj ali manj resne okužbe dihal, pri starejših odraslih in ljudeh z do- ločenimi zdravstvenimi težavami pa lahko povzroči potrebo po bolnišnični oskrbi ali celo smrt. Zaradi širjenja bolezni je Svetov- na zdravstvena organizacija (WHO) 30. ja- nuarja leta 2020 virusni izbruh razglasila za javnozdravstveno nevarnost mednarodnega pomena in, v nadaljevanju, sámo bolezen za javnozdravstveno krizo mednarodnih raz- sežnosti. Do preklica te izjave je prišlo šele 5. maja leta 2023, vendar je pandemija do konca februarja leta 2024 povzročila več kot sedem milijonov potrjenih smrti, kar jo uvr- šča na peto mesto na seznamu najbolj smr- tonosnih epidemij oziroma pandemij v zgo- dovini. Na seznamu epidemij in pandemij z najmanj enim milijonom smrti si tako deli neslavno mesto z boleznimi, kot so bubon- ska kuga, črne koze, (španska, hongkonška) gripa, kolera, tifus in AIDS. Tako kot drugi koronavirusi ima tudi viru- sni delec (virion) SARS-CoV-2 štiri struk- turne beljakovine, poznane kot S (protein bodice oziroma konice, angleško spike - S), E (protein ovojnice, angleško envelope - E), M (protein membrane - M) in N (protein nukleokapside – N). Protein N obdaja in vzdržuje zgradbo/obliko virusnega RNA-ge- noma, proteini S, E in M pa skupaj tvorijo virusno ovojnico. Koničasti izrastek oziroma bodica je odgovorna za to, da se virus lah- ko pritrdi na membrano gostiteljeve celice. Potem ko se virion SARS-CoV-2 pritrdi na ciljno celico, celični encim razgradi protein bodice in virion nato v celico sprosti svojo RNA in jo prisili, da ustvarja kopije virusa, ki se potem širijo v sosednje celice. Neomejeno širjenje porajajočega se virusa v novem gostitelju ima navadno za posledico nabiranje mutacij v virusnem genomu, to pa pojav novih virusnih različic. Poseben problem so podaljšane, dolgotrajne okužbe s SARS-CoV-2 pri bolnikih z oslabljenim imunskim sistemom. Te lahko povzročijo nastanek virusnih različic z mutacijami, ki virusom omogočajo, da se izognejo imuno- sti gostitelja. Virus SARS-CoV-2 mutira v povprečju enkrat ali dvakrat na mesec, kar je sicer manj kot virus gripe, vendar če je hkrati okuženih zelo veliko ljudi, to pome- ni veliko naključnih mutacij, med katerimi se, sicer redko, lahko pojavijo tudi takšne, ki so za virus koristne. Najbolj skrb vzbuja- joče so mutacije, ki povzročijo aminokislin- ske spremembe v zgradbi in s tem v obli- ki bodičastega proteina S. Že malenkostno spremenjena oblika tega proteina virusu lahko omogoči, da se bolj učinkovito veže na sprejemno mesto na človeških celicah in tako lažje oziroma pogosteje vstopa v celi- ce. To pomeni, da je ta različica bolj kužna kot virusi, ki take mutacije nimajo. Dodatna težava je, da sprememba v zgradbi proteina S lahko oteži tudi vezavo že obstoječih pro- titeles, ki jih je imunski sistem razvil med okužbo s starejšimi različicami virusa in ki sicer virus inaktivirajo s tem, da se vežejo na mesto, s katerim se virus pritrdi na celico. S cepivi in cepljenjem pomagamo ljudem, da se obranijo pred okužbo Obrambo telesa na virusno okužbo v glav- nem delimo v tri dele: (A) izločanje citoki- nov, sporočevalnih molekul, ki v napadenih celicah sprožijo procese proti pomnoževa- nju virusne RNA in razmnoževanju virusa ter spodbudijo imunski odziv; (B) ubijanje z virusom okuženih celic z naravnimi celi- cami ubijalkami (vrste belih krvničk, NK – angleško natural killer cells) in citotoksičnimi levkociti (CTL); (C) preprečevanje sposob- nosti virusa, da okuži (nove) celice, z nev- tralizirajočimi protitelesi. Te tri dele lahko povzamemo kot prirojeno in prilagoditveno imunost. Pri virusnih okužbah naj bi prirojeni imunski sistem gostitelja deloval kot prva obrambna Prirejeno po: J. Fu, 2020: Molecular Biology Reports, 47 (6): 4383-4392. Protein bodice (S) Ovojnični protein (E) Ovojnica Nukleokapsidni protein (N) RNA Membranski protein (M) Prirejeno po: J. Tseng: Adgene Blog, 12. 7. 2021. Vstopni prejemnik virusa 108 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 109Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv črta za preprečevanje virusne invazije ali podvojevanja, preden prilagoditveni imun- ski sistem ne ustvari bolj posebne zaščite. V prirojenem imunskem odzivu se prirojeni receptorji imunskih celic za prepoznava- nje vzorcev molekul vključijo v zaznavanje značilnih virusnih sestavin, kot so virusna RNA ali DNA ali vmesni produkti v sesta- vljanju novih enot virusa, ter v spodbujanje interferonov in drugih protivnetnih citoki- nov v okuženih in v imunskih celicah. Prilagoditveni (adaptivni) imunski odziv pa je za tujek (antigen) poseben imunski odziv, ki se razvije v nekaj dneh ali tednih. Začetni dogodek pri vzbuditvi adaptivnega imunskega odziva je aktivacija še nespecifič- nih, »naivnih« T-celic (T-limfocitov) s pred- stavitvijo antigena. Specifično usposobljene celice T so neposredni borci proti tujim napadalcem (celična imunost), hkrati pa tudi proizvajajo citokine, ki pomagajo aktivirati druge dele imunskega sistema, predvsem B- -limfocite, proizvajalce proti tujku usmerje- nih, specifičnih protiteles (humoralna, s pro- titelesi posredovana imunost). Cepljenje je dajanje cepiva, ki pomaga imunskemu sistemu razviti odpornost proti bolezni. Cepiva vsebujejo mikroorganizem oziroma virus v živem, oslabljenem ali mr- tvem stanju ali beljakovine ali toksine iz patogenih organizmov. Z dodajanjem izbra- ne oblike omenjenih imunogenov umetno spodbudimo prilagoditveno telesno imunost (imunizacija) in pomagamo preprečiti zbo- levanje zaradi nalezljive bolezni. Ko je ce- pljen dovolj velik odstotek populacije, pride do tako imenovane čredne imunosti. Čredna imunost varuje tiste, ki so lahko imunsko oslabljeni in ne morejo dobiti cepiva, ker bi jim lahko celo oslabljena različica škodovala. Večina protivirusnih cepiv, ki so danes na voljo, se proizvajajo s tradicionalnimi teh- nikami, ki temeljijo na oslabljenih ali inak- tiviranih celih virusih. Oslabljene virusne seve pridobimo z dolgotrajnim gojenjem v razmerah, ki postopoma oslabijo oziroma onemogočijo njihove virulentne lastnosti, v novejšem času pa tudi z laboratorijskim odstranjevanjem virulentnih genov oziroma njihovih delov. V nekaterih primerih so ži- va cepiva razvili tudi z uporabo sorodnih, tesno povezanih, vendar manj nevarnih vi- rusov, ki tudi lahko ustvarijo širok imunski odziv. Nekatera cepiva pa vsebujejo inakti- virane virulentne viruse, ki so bili uničeni s kemikalijami, toploto ali sevanjem in pri katerih se je zato ohranila samo ovojnica z izpostavljenimi prepoznavnimi proteini. Zaradi napredka molekularne biologije v zadnjih desetletjih so bila razvita tako ime- novana podenotna cepiva, ki temeljijo na po- sameznih virusnih sestavnih delih namesto na celih virusih. Za razvoj cepiv pomembni sestavni deli virusa, ki izzovejo naš imun- ski odziv in spodbujajo tvorbo protiteles, ki onemogočajo virus, so prepoznavni proteini na površini virusa. Površinske beljakovine so v začetku pridobivali iz krvnega seruma kronično okuženih bolnikov. Da bi zago- tovili dovolj velike količine in čistost, za njihovo proizvodnjo danes večinoma upora- bljamo postopke genske tehnologije (gensko inženirstvo): takim proteinom rečemo »re- kombinantni proteini«. Sestavne dele viru- sne genetske kode (gene), ki kodirajo viru- sne površinske proteine, vnesemo v proizvo- dne organizme, kot so bakterije, kvasovke ali celice celičnih kultur, jih v novem okolju pomnožimo in spodbudimo, da se izrazijo v obliki proizvodnje velikih količin želenih proteinov. Po zahtevnih postopkih čiščenja te, za primerno dostavo oblikovane proteine uporabimo kot cepiva. Proizvodnja cepiv na podlagi celih virusov ali njihovih sestavnih proteinov pa zahteva obsežne celične kulture in dolgotrajne po- stopke. Proces, ki je f inančno, infrastruk- turno in časovno zahteven, omejuje možno- sti za hitro proizvodnjo cepiva kot odgovor na izbruh in pandemijo. Zato so raziskoval- ci poskušali razviti tehnologije za razvoj ce- piv, ki so neodvisne od celičnih kultur. Po- javila se je zamisel, da bi kot cepivo lahko uporabili kar genetski material (nukleinske kisline) virusov, ki bi jih neposredno vne- sli v organizem cepljene osebe in izkoristi- li njegovo zmožnost, da sam na licu mesta proizvede virusne proteine in »sam v sebi« izzove ustrezen protivirusen imunski odziv. Nastopilo je obdobje tako imenovanih »genetskih cepiv« V naših celicah se genetske informacije, ko- dirane v DNA, prepišejo v sporočilno RNA (angleško messenger RNA, mRNA), ki se uporablja kot predloga za proizvodnjo belja- kovin. Pri virusih, katerih genom je dvove- rižna molekula DNA, se za prepis izrablja gostiteljev encim RNA-polimeraza in v na- daljevanju njegov celični sistem za prevod tega prepisa v ustrezne (virusne) proteine. Pri virusih, katerih genom je enoverižna Prirejeno po: https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023. 108 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 109Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv črta za preprečevanje virusne invazije ali podvojevanja, preden prilagoditveni imun- ski sistem ne ustvari bolj posebne zaščite. V prirojenem imunskem odzivu se prirojeni receptorji imunskih celic za prepoznava- nje vzorcev molekul vključijo v zaznavanje značilnih virusnih sestavin, kot so virusna RNA ali DNA ali vmesni produkti v sesta- vljanju novih enot virusa, ter v spodbujanje interferonov in drugih protivnetnih citoki- nov v okuženih in v imunskih celicah. Prilagoditveni (adaptivni) imunski odziv pa je za tujek (antigen) poseben imunski odziv, ki se razvije v nekaj dneh ali tednih. Začetni dogodek pri vzbuditvi adaptivnega imunskega odziva je aktivacija še nespecifič- nih, »naivnih« T-celic (T-limfocitov) s pred- stavitvijo antigena. Specifično usposobljene celice T so neposredni borci proti tujim napadalcem (celična imunost), hkrati pa tudi proizvajajo citokine, ki pomagajo aktivirati druge dele imunskega sistema, predvsem B- -limfocite, proizvajalce proti tujku usmerje- nih, specifičnih protiteles (humoralna, s pro- titelesi posredovana imunost). Cepljenje je dajanje cepiva, ki pomaga imunskemu sistemu razviti odpornost proti bolezni. Cepiva vsebujejo mikroorganizem oziroma virus v živem, oslabljenem ali mr- tvem stanju ali beljakovine ali toksine iz patogenih organizmov. Z dodajanjem izbra- ne oblike omenjenih imunogenov umetno spodbudimo prilagoditveno telesno imunost (imunizacija) in pomagamo preprečiti zbo- levanje zaradi nalezljive bolezni. Ko je ce- pljen dovolj velik odstotek populacije, pride do tako imenovane čredne imunosti. Čredna imunost varuje tiste, ki so lahko imunsko oslabljeni in ne morejo dobiti cepiva, ker bi jim lahko celo oslabljena različica škodovala. Večina protivirusnih cepiv, ki so danes na voljo, se proizvajajo s tradicionalnimi teh- nikami, ki temeljijo na oslabljenih ali inak- tiviranih celih virusih. Oslabljene virusne seve pridobimo z dolgotrajnim gojenjem v razmerah, ki postopoma oslabijo oziroma onemogočijo njihove virulentne lastnosti, v novejšem času pa tudi z laboratorijskim odstranjevanjem virulentnih genov oziroma njihovih delov. V nekaterih primerih so ži- va cepiva razvili tudi z uporabo sorodnih, tesno povezanih, vendar manj nevarnih vi- rusov, ki tudi lahko ustvarijo širok imunski odziv. Nekatera cepiva pa vsebujejo inakti- virane virulentne viruse, ki so bili uničeni s kemikalijami, toploto ali sevanjem in pri katerih se je zato ohranila samo ovojnica z izpostavljenimi prepoznavnimi proteini. Zaradi napredka molekularne biologije v zadnjih desetletjih so bila razvita tako ime- novana podenotna cepiva, ki temeljijo na po- sameznih virusnih sestavnih delih namesto na celih virusih. Za razvoj cepiv pomembni sestavni deli virusa, ki izzovejo naš imun- ski odziv in spodbujajo tvorbo protiteles, ki onemogočajo virus, so prepoznavni proteini na površini virusa. Površinske beljakovine so v začetku pridobivali iz krvnega seruma kronično okuženih bolnikov. Da bi zago- tovili dovolj velike količine in čistost, za njihovo proizvodnjo danes večinoma upora- bljamo postopke genske tehnologije (gensko inženirstvo): takim proteinom rečemo »re- kombinantni proteini«. Sestavne dele viru- sne genetske kode (gene), ki kodirajo viru- sne površinske proteine, vnesemo v proizvo- dne organizme, kot so bakterije, kvasovke ali celice celičnih kultur, jih v novem okolju pomnožimo in spodbudimo, da se izrazijo v obliki proizvodnje velikih količin želenih proteinov. Po zahtevnih postopkih čiščenja te, za primerno dostavo oblikovane proteine uporabimo kot cepiva. Proizvodnja cepiv na podlagi celih virusov ali njihovih sestavnih proteinov pa zahteva obsežne celične kulture in dolgotrajne po- stopke. Proces, ki je f inančno, infrastruk- turno in časovno zahteven, omejuje možno- sti za hitro proizvodnjo cepiva kot odgovor na izbruh in pandemijo. Zato so raziskoval- ci poskušali razviti tehnologije za razvoj ce- piv, ki so neodvisne od celičnih kultur. Po- javila se je zamisel, da bi kot cepivo lahko uporabili kar genetski material (nukleinske kisline) virusov, ki bi jih neposredno vne- sli v organizem cepljene osebe in izkoristi- li njegovo zmožnost, da sam na licu mesta proizvede virusne proteine in »sam v sebi« izzove ustrezen protivirusen imunski odziv. Nastopilo je obdobje tako imenovanih »genetskih cepiv« V naših celicah se genetske informacije, ko- dirane v DNA, prepišejo v sporočilno RNA (angleško messenger RNA, mRNA), ki se uporablja kot predloga za proizvodnjo belja- kovin. Pri virusih, katerih genom je dvove- rižna molekula DNA, se za prepis izrablja gostiteljev encim RNA-polimeraza in v na- daljevanju njegov celični sistem za prevod tega prepisa v ustrezne (virusne) proteine. Pri virusih, katerih genom je enoverižna Prirejeno po: https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2023. 110 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 111Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv molekula DNA, pa sta v začetni proces vključena dva gostiteljeva encima, DNA- -polimeraza, ki ustvari dvoverižno DNA, in nato še že omenjena RNA-polimeraza. V nasprotju z DNA-virusi pa je genom RNA- -virusov sestavljen iz ribonukleinske kisline, enoverižne ali dvoverižne RNA. Ti virusi so povzročitelji pomembnih bolezni pri ljudeh, kot so prehlad, gripa, SARS, MERS, virus denge, hepatitis C, hepatitis E, mrzlica Za- hodnega Nila, bolezen virusa ebole, stekli- na, otroška paraliza, mumps, ošpice in tudi COVID-19. Skupina genetskih cepiv zajema virusna vektorska cepiva, DNA-cepiva in RNA-ce- piva. Pri njihovem sestavljanju dele virusne genetske kode premaknemo v neškodljiv prenašalec, »voziček« ali »vektor«. Pri vi- rusnih vektorskih cepivih je tak vektor nek razmeroma varen virus, na primer inaktivi- ran virus prehlada, ki zlahka vstopa v naše ciljne celice in je tako učinkovit prenašalec želenega antigena, sam pa se ne more raz- množevati ali povzročati prehladno bolezen. Ko vbrizgamo vektorsko cepivo, se v naših celicah s pomočjo celične mašinerije za sin- tezo proteinov iz njegove sestave proizvaja samo izbrani protein patogenega virusa, ki v nadaljevanju v telesu spodbudi proti njemu usmerjen imunski odziv. Za razliko od tega DNA-cepivo kot »voziček« uporablja plaz- mid, umetno sestavljeno majhno molekulo DNA, ki jo običajno v genskem inženirstvu uporabljajo za prenos delcev DNA oziroma genov med izvornimi in proizvodnimi or- ganizmi, v tem primeru pa vanj vnesemo DNA (gen), ki kodira antigenski protein, ki izvira iz patogenega virusa, na katerega bo cepivo usmerjeno. Plazmidna DNA je po- ceni, obstojna in razmeroma varna, zaradi česar je odlična možnost za dostavo DNA- -cepiva, DNA-cepivo je v taki obliki zelo obstojno in ga odlikujeta odsotnost kakr- šnega koli povzročitelja okužbe in razmero- ma enostavna proizvodnja v velikem obsegu. DNA-cepiva imajo še eno odliko: so zelo prilagodljiva, saj je gensko zaporedje mo- goče enostavno spreminjati in s tem dovolj hitro ustvarjati še bolj učinkovite različice cepiv. Povsem novo in neposredno obliko cepiv pa predstavljajo RNA-cepiva (mRNA- -cepiva), ki so sestavljena iz ribonukleinske kisline, RNA, zapakirane v posebne »vozič- ke«, kot so lipidne kapljice, umetno sesta- vljeni lipidni nanodelci, imenovani liposomi. Od prepričanja o neobstojni RNA do uspešnih RNA-cepiv Sprva so kot bolj obetavna obravnavali ce- piva, izdelana na osnovi DNA, saj je DNA mnogo bolj obstojna kot RNA. V telo vne- sena DNA sicer mora prestopiti dve pregra- di, celično in jedrno membrano, da doseže celični predel, kjer poteka prepis DNA v sporočilno mRNA, kar pa zahteva razvoj razmeroma zapletenih dostavnih sistemov. Dodatna skrb je mogoča, sicer majhna mo- žnost, da se dostavljena nukleinska kislina obstojno integrira v genom gostitelja, kar je pomemben varnostni vidik pri razvoju teh cepiv. Nasprotno bi mRNA-cepiva potre- bovala le dostop do celične citoplazme, kjer neposredno pride do prevoda sporočila, za- poredja nukleotidov, v zaporedje aminokislin proteina. Dodatna prednost mRNA-cepiv bi bila, da se dostavljena nukleinska kislina ne more integrirati v genom gostitelja. Kljub vsem tem prednostim pa so pomisleki gle- de uporabnosti RNA za razvoj cepiv osta- li veliki, predvsem zaradi njene (pre)velike neobstojnosti. Odkritje laboratorijskega prepisovanja zapo- redja nukleotidov DNA v zaporedje mRNA, imenovano prepisovanje in vitro, je v osem- desetih letih preteklega stoletja omogočilo proizvodnjo velikih količin mRNA brez po- trebe po obsežnih celičnih kulturah. S tem je RNA postala dostopna za neposredno uporabo v klinične namene. Vendar, kot rečeno, je in vitro prepisana mRNA veljala za neobstojno in zahtevno za dostavo, kar je zahtevalo razvoj zelo izpopolnjenih/sofisti- ciranih nosilnih lipidnih sistemov. Poleg te- ga se je pokazalo, da je in vitro proizvedena mRNA po neposrednem vnosu v telo v šte- vilnih primerih povzročila neželene vnetne reakcije. Do pomembnega preloma je prišlo z odkritjem majhnih, celičnim membranam podobnih veziklov, umetnih liposomov, se- stavljenih iz različnih fosfolipidov in hole- sterola. S sintetiziranimi kationskimi lipidi so uspeli sestaviti obstojne liposome in vanje vgraditi negativno nabite nukleinske kisline, jih tako zaščititi pred prezgodnjo razgradnjo in jih prenesti do celične membrane, s ka- tero so se zlili in sprostili RNA v celično citoplazmo. Približno v tem času je Katalin Karikó, raziskovalka madžarskega rodu, na Univer- zi Pensilvanije v Združenih državah Ame- rike izvajala poskuse z različnimi oblikami RNA, da bi v poskusih genskega zdravljenja izboljšala izražanje terapevtskih proteinov. Dokazala je, da se izražanje vnesene mRNA lahko močno izboljša, če ji na njen konec dodamo daljši »rep«, sestavljen iz adeno- zinskih nukleotidov (rep poli-A), kar je bil spodbuden dosežek v prizadevanjih za načr- tovanje in izdelovanje za klinično uporabo primernih oblik mRNA. V poznih devetde- setih letih se je Karikó združila z Drewom Weissmanom, zdravnikom raziskovalcem, ki se je Univerzi Pensilvanije pridružil le- ta 1997, zanimala pa sta ga osnovna imu- nologija in razvoj cepiv, predvsem uporaba dendritičnih celic za pripravo imunskega odziva. Dendritične celice so antigen pred- stavitvene celice imunskega sistema sesal- cev. Njihova naloga je prepoznavanje an- tigenskega materiala in njegova izpostavitev (»predstavitev«) na celični površini celicam T imunskega sistema. Delujejo kot posre- dniki med prirojenim in prilagoditvenim imunskim sistemom. Karikó in Weissman sta opazila, da dendritične celice prepozna- jo in vitro prepisano mRNA kot tujo snov, kar vodi do njihove aktivacije in sproščanja vnetnih signalnih molekul (citokinov). Spra- ševala sta se, zakaj je bila in vitro prepisa- na mRNA prepoznana kot tuja, medtem ko 110 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 111Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv molekula DNA, pa sta v začetni proces vključena dva gostiteljeva encima, DNA- -polimeraza, ki ustvari dvoverižno DNA, in nato še že omenjena RNA-polimeraza. V nasprotju z DNA-virusi pa je genom RNA- -virusov sestavljen iz ribonukleinske kisline, enoverižne ali dvoverižne RNA. Ti virusi so povzročitelji pomembnih bolezni pri ljudeh, kot so prehlad, gripa, SARS, MERS, virus denge, hepatitis C, hepatitis E, mrzlica Za- hodnega Nila, bolezen virusa ebole, stekli- na, otroška paraliza, mumps, ošpice in tudi COVID-19. Skupina genetskih cepiv zajema virusna vektorska cepiva, DNA-cepiva in RNA-ce- piva. Pri njihovem sestavljanju dele virusne genetske kode premaknemo v neškodljiv prenašalec, »voziček« ali »vektor«. Pri vi- rusnih vektorskih cepivih je tak vektor nek razmeroma varen virus, na primer inaktivi- ran virus prehlada, ki zlahka vstopa v naše ciljne celice in je tako učinkovit prenašalec želenega antigena, sam pa se ne more raz- množevati ali povzročati prehladno bolezen. Ko vbrizgamo vektorsko cepivo, se v naših celicah s pomočjo celične mašinerije za sin- tezo proteinov iz njegove sestave proizvaja samo izbrani protein patogenega virusa, ki v nadaljevanju v telesu spodbudi proti njemu usmerjen imunski odziv. Za razliko od tega DNA-cepivo kot »voziček« uporablja plaz- mid, umetno sestavljeno majhno molekulo DNA, ki jo običajno v genskem inženirstvu uporabljajo za prenos delcev DNA oziroma genov med izvornimi in proizvodnimi or- ganizmi, v tem primeru pa vanj vnesemo DNA (gen), ki kodira antigenski protein, ki izvira iz patogenega virusa, na katerega bo cepivo usmerjeno. Plazmidna DNA je po- ceni, obstojna in razmeroma varna, zaradi česar je odlična možnost za dostavo DNA- -cepiva, DNA-cepivo je v taki obliki zelo obstojno in ga odlikujeta odsotnost kakr- šnega koli povzročitelja okužbe in razmero- ma enostavna proizvodnja v velikem obsegu. DNA-cepiva imajo še eno odliko: so zelo prilagodljiva, saj je gensko zaporedje mo- goče enostavno spreminjati in s tem dovolj hitro ustvarjati še bolj učinkovite različice cepiv. Povsem novo in neposredno obliko cepiv pa predstavljajo RNA-cepiva (mRNA- -cepiva), ki so sestavljena iz ribonukleinske kisline, RNA, zapakirane v posebne »vozič- ke«, kot so lipidne kapljice, umetno sesta- vljeni lipidni nanodelci, imenovani liposomi. Od prepričanja o neobstojni RNA do uspešnih RNA-cepiv Sprva so kot bolj obetavna obravnavali ce- piva, izdelana na osnovi DNA, saj je DNA mnogo bolj obstojna kot RNA. V telo vne- sena DNA sicer mora prestopiti dve pregra- di, celično in jedrno membrano, da doseže celični predel, kjer poteka prepis DNA v sporočilno mRNA, kar pa zahteva razvoj razmeroma zapletenih dostavnih sistemov. Dodatna skrb je mogoča, sicer majhna mo- žnost, da se dostavljena nukleinska kislina obstojno integrira v genom gostitelja, kar je pomemben varnostni vidik pri razvoju teh cepiv. Nasprotno bi mRNA-cepiva potre- bovala le dostop do celične citoplazme, kjer neposredno pride do prevoda sporočila, za- poredja nukleotidov, v zaporedje aminokislin proteina. Dodatna prednost mRNA-cepiv bi bila, da se dostavljena nukleinska kislina ne more integrirati v genom gostitelja. Kljub vsem tem prednostim pa so pomisleki gle- de uporabnosti RNA za razvoj cepiv osta- li veliki, predvsem zaradi njene (pre)velike neobstojnosti. Odkritje laboratorijskega prepisovanja zapo- redja nukleotidov DNA v zaporedje mRNA, imenovano prepisovanje in vitro, je v osem- desetih letih preteklega stoletja omogočilo proizvodnjo velikih količin mRNA brez po- trebe po obsežnih celičnih kulturah. S tem je RNA postala dostopna za neposredno uporabo v klinične namene. Vendar, kot rečeno, je in vitro prepisana mRNA veljala za neobstojno in zahtevno za dostavo, kar je zahtevalo razvoj zelo izpopolnjenih/sofisti- ciranih nosilnih lipidnih sistemov. Poleg te- ga se je pokazalo, da je in vitro proizvedena mRNA po neposrednem vnosu v telo v šte- vilnih primerih povzročila neželene vnetne reakcije. Do pomembnega preloma je prišlo z odkritjem majhnih, celičnim membranam podobnih veziklov, umetnih liposomov, se- stavljenih iz različnih fosfolipidov in hole- sterola. S sintetiziranimi kationskimi lipidi so uspeli sestaviti obstojne liposome in vanje vgraditi negativno nabite nukleinske kisline, jih tako zaščititi pred prezgodnjo razgradnjo in jih prenesti do celične membrane, s ka- tero so se zlili in sprostili RNA v celično citoplazmo. Približno v tem času je Katalin Karikó, raziskovalka madžarskega rodu, na Univer- zi Pensilvanije v Združenih državah Ame- rike izvajala poskuse z različnimi oblikami RNA, da bi v poskusih genskega zdravljenja izboljšala izražanje terapevtskih proteinov. Dokazala je, da se izražanje vnesene mRNA lahko močno izboljša, če ji na njen konec dodamo daljši »rep«, sestavljen iz adeno- zinskih nukleotidov (rep poli-A), kar je bil spodbuden dosežek v prizadevanjih za načr- tovanje in izdelovanje za klinično uporabo primernih oblik mRNA. V poznih devetde- setih letih se je Karikó združila z Drewom Weissmanom, zdravnikom raziskovalcem, ki se je Univerzi Pensilvanije pridružil le- ta 1997, zanimala pa sta ga osnovna imu- nologija in razvoj cepiv, predvsem uporaba dendritičnih celic za pripravo imunskega odziva. Dendritične celice so antigen pred- stavitvene celice imunskega sistema sesal- cev. Njihova naloga je prepoznavanje an- tigenskega materiala in njegova izpostavitev (»predstavitev«) na celični površini celicam T imunskega sistema. Delujejo kot posre- dniki med prirojenim in prilagoditvenim imunskim sistemom. Karikó in Weissman sta opazila, da dendritične celice prepozna- jo in vitro prepisano mRNA kot tujo snov, kar vodi do njihove aktivacije in sproščanja vnetnih signalnih molekul (citokinov). Spra- ševala sta se, zakaj je bila in vitro prepisa- na mRNA prepoznana kot tuja, medtem ko 112 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 113Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv mRNA iz naših celic oziroma celic sesal- cev ne povzroča enake reakcije. Ugotovila sta, da se morajo nekatere kritične lastnosti razlikovati med različnimi vrstami mRNA. Molekula RNA vsebuje štiri baze, okrajša- ne A, U, G in C, ki ustrezajo A, T, G in C v DNA, črkam genetske kode. Karikó in Weissman sta vedela, da se baze v RNA iz celic sesalcev v procesu prepisovanja iz za- poredij DNA pogosto kemično spremenijo (»posttranskripcijska modifikacija«), medtem ko in vitro prepisana mRNA tega pojava ne pozna. Ali bi lahko odsotnost spremenjenih baz v in vitro prepisani RNA pojasnila nje- no prepoznavo kot tujko in posledično ne- želeno vnetno reakcijo? Da bi to raziskali, sta izdelala številne različice mRNA, od katerih je vsaka imela edinstvene kemične spremembe v svojih bazah, ki sta jih nato dostavila dendritičnim celicam. Rezultati so bili presenetljivi: vnetni odziv je bil praktič- no odpravljen, ko so bile v mRNA vključene modifikacije/spremembe baz, hkrati pa se je tudi močno povečala učinkovitost transla- cije - prevedbe njenega nukleotidnega zapo- redja v procesu sinteze ustreznega proteina. Šlo je za prelomno odkritje, ki pove, da se z vključitvijo spremenjenih nukleotidov iz- ognemo neželeni obliki imunske aktivacije, to je preveliki proizvodnji vnetnih citokinov, in hkrati povečamo proizvodnjo proteinov v celicah, ki so prevzele mRNA. To je seveda močno spremenilo naše razumevanje, kako celice prepoznajo in se odzivajo na različne oblike mRNA in je imelo velik pomen za medicinsko uporabo mRNA. Zanimanje za tehnologijo mRNA se je za- čelo krepiti. V letih od 2000 do 2010 so bila ustanovljena tri podjetja, CureVac, Bi- oNTech in Moderna. Njihova izhodišča so bile temeljne raziskave in ugotovitve Katalin Karikó, Drewa Weissmana in njunih sode- lavcev, namen pa je bil razvoj terapevtskih proteinov in cepiv proti virusnim boleznim in cepiv proti raku. Vsa tri podjetja so te- sno sodelovala z akademskimi raziskovalci, da bi izboljšala tehnologijo in vzpostavila raziskovalno-proizvodne zmogljivosti za bo- lezni, ki so predmet njihovega zanimanja. Prvo cepivo mRNA za ljudi se je pojavi- lo približno osem let po ustanovitvi druž- be CureVac. Genetski material iz tumorjev melanoma so odvzeli za ustvarjanje mRNA. Uporabili so jo kot cepivo, ki je po njihovih ugotovitvah pri nekaterih bolnikih izboljšalo protitumorski imunski odziv. Leta 2012 je ekipa CureVac poročala o zaščitnih imun- skih odzivih na poskusnih živalih med ra- zvojem cepiva proti gripi, že leta 2017 pa so poročali o uspešnih kliničnih testih novih cepiv mRNA proti steklini. Obetavni za- četni uspehi na področju cepiv mRNA so bili velika spodbuda za odločnejši vstop na področje ogrožujočih epidemičnih bolezni. V letu 2017 so poročali o dobrih rezulta- tih predkliničnega testiranja novo razvitega cepiva mRNA proti virusu Zika, pri kate- rem so uporabili mRNA s spremenjenimi mukleozidnimi bazami. Ta študija, pri ka- teri so cepili breje samice poskusnih živali, je dokazala uspešno zaščito pred prenosom virusa na plod, zato je še istega leta druž- ba Moderna napovedala začetek klinične- ga preizkušanja s cepivom proti virusu Zika na osnovi mRNA, skoraj hkrati z njihovimi kandidatnimi cepivi mRNA proti virusom gripe in ptičje gripe. Približno v času pre- skušanja cepiva Zika je družba Moderna v sodelovanju z raziskovalci iz akademskih krogov začela preizkušati tudi možnosti za razvoj cepiva mRNA proti koronavirusu bližnjevzhodnega respiratornega sindroma, MERS-CoV. Pomembna odkritja iz vseh omenjenih raziskav so bila odlična podlaga za učinkovit in hiter raziskovalni odziv v prihajajoči pandemiji COVID-2019. Do danes so raziskovalci odkrili več kot sto različnih posttranskripcijskih modif ikacij (poprepisovalnih sprememb) v RNA in do- kazali, da so te bolj pogoste pri evkariontih kot prokariontih, pri čemer izstopa psevdo- uridin (Ψ), rotacijski izomer nukleozidne baze uridin (U), kot ena izmed najpogo- stejših sprememb RNA. Encimsko vodena biokemijska sprememba, posledica zasuka uridina okrog osi med njegovima atomoma N3 (dušikov atom na mestu 3 v uridinskem obroču) in C6 (ogljikov atom na mestu 6 v uridinskem obroču), povzroči spremembo nukleotidne povezave uridina s sladkorjem riboza, ki je pri uridinu N-C, v bolj gi- bljivo povezavo C-C pri psevdouridinu. Ta molekuli mRNA podeli večjo oblikovno prilagodljivost in boljšo umestitev na ribo- Prikaz prepisovanja in vitro prepisanih mRNA s spremenjenimi ali nespremenjenimi nukleozidnimi bazami po uvedbi v primarne dendritične celice DC1: (a) prepisovalni sistem T7 so uporabili za in vitro proizvodnjo mRNA z ustaljenimi bazami RNA (A, U, G in C) oziroma različic s spremenjenimi bazami, m5C (5-metilcitidin), m6A (N6-metiladenozin), Ψ (psevdouridin), m5U (5-metiluridin), s2U (2-tiouridin), m6A/Ψ in m6a + Ψ. (b) Različice z bazami oziroma nukleotidi, ki niso povzročile biosinteze in izločanja vnetnega citokina TNF-alfa, so označene z oranžnim senčenjem. Prirejeno iz: Karikó in sod., 2005: Immunity. Karikó in Weissman sta v primerjavi z matično, nespremenjeno obliko mRNA pokazala višje ravni izražanja bazno spremenjene mRNA, v katero so namesto uridina vstavili psevdouridin. V isti študiji so potrdili, da je dostava spremenjene mRNA v vranico miši povzročila povečano proizvodnjo proteinov in zmanjšanje imunske aktivacije. To je imelo za posledico izostanek vnetnega odziva organizma, v katerega so vnesli spremenjeno mRNA. Objava teh ugotovitev je imela velik pomen za prihodnje medicinske namene. Prirejeno po: https://www.nobelprize. org/uploads/2023/10/advanced- medicinprize2023-3.pdf. NespremenjenamRNA Psevdouridin In vitro transkripcija Sprememba baz/ nukleotidov: priprava različic mRNA 112 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 113Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv mRNA iz naših celic oziroma celic sesal- cev ne povzroča enake reakcije. Ugotovila sta, da se morajo nekatere kritične lastnosti razlikovati med različnimi vrstami mRNA. Molekula RNA vsebuje štiri baze, okrajša- ne A, U, G in C, ki ustrezajo A, T, G in C v DNA, črkam genetske kode. Karikó in Weissman sta vedela, da se baze v RNA iz celic sesalcev v procesu prepisovanja iz za- poredij DNA pogosto kemično spremenijo (»posttranskripcijska modifikacija«), medtem ko in vitro prepisana mRNA tega pojava ne pozna. Ali bi lahko odsotnost spremenjenih baz v in vitro prepisani RNA pojasnila nje- no prepoznavo kot tujko in posledično ne- želeno vnetno reakcijo? Da bi to raziskali, sta izdelala številne različice mRNA, od katerih je vsaka imela edinstvene kemične spremembe v svojih bazah, ki sta jih nato dostavila dendritičnim celicam. Rezultati so bili presenetljivi: vnetni odziv je bil praktič- no odpravljen, ko so bile v mRNA vključene modifikacije/spremembe baz, hkrati pa se je tudi močno povečala učinkovitost transla- cije - prevedbe njenega nukleotidnega zapo- redja v procesu sinteze ustreznega proteina. Šlo je za prelomno odkritje, ki pove, da se z vključitvijo spremenjenih nukleotidov iz- ognemo neželeni obliki imunske aktivacije, to je preveliki proizvodnji vnetnih citokinov, in hkrati povečamo proizvodnjo proteinov v celicah, ki so prevzele mRNA. To je seveda močno spremenilo naše razumevanje, kako celice prepoznajo in se odzivajo na različne oblike mRNA in je imelo velik pomen za medicinsko uporabo mRNA. Zanimanje za tehnologijo mRNA se je za- čelo krepiti. V letih od 2000 do 2010 so bila ustanovljena tri podjetja, CureVac, Bi- oNTech in Moderna. Njihova izhodišča so bile temeljne raziskave in ugotovitve Katalin Karikó, Drewa Weissmana in njunih sode- lavcev, namen pa je bil razvoj terapevtskih proteinov in cepiv proti virusnim boleznim in cepiv proti raku. Vsa tri podjetja so te- sno sodelovala z akademskimi raziskovalci, da bi izboljšala tehnologijo in vzpostavila raziskovalno-proizvodne zmogljivosti za bo- lezni, ki so predmet njihovega zanimanja. Prvo cepivo mRNA za ljudi se je pojavi- lo približno osem let po ustanovitvi druž- be CureVac. Genetski material iz tumorjev melanoma so odvzeli za ustvarjanje mRNA. Uporabili so jo kot cepivo, ki je po njihovih ugotovitvah pri nekaterih bolnikih izboljšalo protitumorski imunski odziv. Leta 2012 je ekipa CureVac poročala o zaščitnih imun- skih odzivih na poskusnih živalih med ra- zvojem cepiva proti gripi, že leta 2017 pa so poročali o uspešnih kliničnih testih novih cepiv mRNA proti steklini. Obetavni za- četni uspehi na področju cepiv mRNA so bili velika spodbuda za odločnejši vstop na področje ogrožujočih epidemičnih bolezni. V letu 2017 so poročali o dobrih rezulta- tih predkliničnega testiranja novo razvitega cepiva mRNA proti virusu Zika, pri kate- rem so uporabili mRNA s spremenjenimi mukleozidnimi bazami. Ta študija, pri ka- teri so cepili breje samice poskusnih živali, je dokazala uspešno zaščito pred prenosom virusa na plod, zato je še istega leta druž- ba Moderna napovedala začetek klinične- ga preizkušanja s cepivom proti virusu Zika na osnovi mRNA, skoraj hkrati z njihovimi kandidatnimi cepivi mRNA proti virusom gripe in ptičje gripe. Približno v času pre- skušanja cepiva Zika je družba Moderna v sodelovanju z raziskovalci iz akademskih krogov začela preizkušati tudi možnosti za razvoj cepiva mRNA proti koronavirusu bližnjevzhodnega respiratornega sindroma, MERS-CoV. Pomembna odkritja iz vseh omenjenih raziskav so bila odlična podlaga za učinkovit in hiter raziskovalni odziv v prihajajoči pandemiji COVID-2019. Do danes so raziskovalci odkrili več kot sto različnih posttranskripcijskih modif ikacij (poprepisovalnih sprememb) v RNA in do- kazali, da so te bolj pogoste pri evkariontih kot prokariontih, pri čemer izstopa psevdo- uridin (Ψ), rotacijski izomer nukleozidne baze uridin (U), kot ena izmed najpogo- stejših sprememb RNA. Encimsko vodena biokemijska sprememba, posledica zasuka uridina okrog osi med njegovima atomoma N3 (dušikov atom na mestu 3 v uridinskem obroču) in C6 (ogljikov atom na mestu 6 v uridinskem obroču), povzroči spremembo nukleotidne povezave uridina s sladkorjem riboza, ki je pri uridinu N-C, v bolj gi- bljivo povezavo C-C pri psevdouridinu. Ta molekuli mRNA podeli večjo oblikovno prilagodljivost in boljšo umestitev na ribo- Prikaz prepisovanja in vitro prepisanih mRNA s spremenjenimi ali nespremenjenimi nukleozidnimi bazami po uvedbi v primarne dendritične celice DC1: (a) prepisovalni sistem T7 so uporabili za in vitro proizvodnjo mRNA z ustaljenimi bazami RNA (A, U, G in C) oziroma različic s spremenjenimi bazami, m5C (5-metilcitidin), m6A (N6-metiladenozin), Ψ (psevdouridin), m5U (5-metiluridin), s2U (2-tiouridin), m6A/Ψ in m6a + Ψ. (b) Različice z bazami oziroma nukleotidi, ki niso povzročile biosinteze in izločanja vnetnega citokina TNF-alfa, so označene z oranžnim senčenjem. Prirejeno iz: Karikó in sod., 2005: Immunity. Karikó in Weissman sta v primerjavi z matično, nespremenjeno obliko mRNA pokazala višje ravni izražanja bazno spremenjene mRNA, v katero so namesto uridina vstavili psevdouridin. V isti študiji so potrdili, da je dostava spremenjene mRNA v vranico miši povzročila povečano proizvodnjo proteinov in zmanjšanje imunske aktivacije. To je imelo za posledico izostanek vnetnega odziva organizma, v katerega so vnesli spremenjeno mRNA. Objava teh ugotovitev je imela velik pomen za prihodnje medicinske namene. Prirejeno po: https://www.nobelprize. org/uploads/2023/10/advanced- medicinprize2023-3.pdf. NespremenjenamRNA Psevdouridin In vitro transkripcija Sprememba baz/ nukleotidov: priprava različic mRNA 114 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 115Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv somih, kjer se odvija njen prevod v zgrad- bo ustreznega proteina. Učinek psevdouri- dina so v nadaljnjih raziskavah še povečali s kemijskim dodatkom metilne skupine na njegov dušikov atom N1, tako da je danes N1-metil-psevdouridin (m1Ψ) najpogosteje spremenjena baza, ki se uporablja pri pro- izvodnji cepiv mRNA. Vnos takega cepiva mRNA ima za posledico slabše prepoznava- nje zaradi Ni-metil-psevdouridina spreme- njene molekule mRNA s strani receptorjev T-celic prirojenega imunskega odziva, zato tudi manjšo proizvodnjo vnetnih citokinov in s tem tudi bistveno slabši vnetni odziv. Po drugi strani pa boljše prileganje spreme- njene mRNA ribosomom na mestu biosin- teze v telesnih celicah pomeni tudi boljše prevajanje njenega koda v ustrezen protein in s tem bistveno bogatejšo proizvodnjo že- lenega antigena v telesu samem in njegovo izpostavljenost prilagoditvenemu imunske- mu odzivu oziroma razpoložljivost za tvorbo ustreznih protiteles. Trenutek je bil zrel za sestavo mRNA cepiva proti COVID-19 Ko je v začetku leta 2020 izbruhnila pan- demija COVID-19, so podjetja, ki so raz- iskovala cepiva na osnovi mRNA, lahko hitro ukrepala. Pomagale so ugotovitve iz raziskav MERS-CoV, da ta virus za vstop v celice gostitelja uporablja površinske protei- ne svoje bodičaste zgradbe in da so virusi iz različnih družin razvili podobne rešitve za svoje zlivanje s ciljnimi celicami. V rekor- dno hitrem času so (McLellan s sodelavci, 2020) razvozlali in objavili tudi natančno aminokislinsko zgradbo ter prostorsko obli- ko konice virusa SARS-CoV-2 in njenega sestavnega proteina, kar je imelo neprecen- ljivo vrednost za razvoj uspešnih cepiv proti COVID-19, predvsem za opredelitev tistih delov proteinske konice virusa (epitopov), ki jih prepoznavajo celice imunskega sistema (T-celice, B-celice) in kamor se končno ve- žejo tudi nevtralizirajoča protitelesa. Znanje o tem je bilo zelo pomembno tudi pri ka- snejšem pojavu »ubežnih mutacij« v tem de- lu virusne konice, ki so povzročile nastanek virusnih različic, proti katerim je bilo treba najti rešitve v najkrajšem možnem času. Pandemija SARS-CoV-2 je bila odločilen dogodek, ki je pripeljal do obsežnih na- ložb v tehnologijo cepiv mRNA in obli- kovanje kliničnih preizkušanj, ki so zaradi znanja, nakopičenega v pravem trenutku, v nasprotju s predhodno prakso lahko poteka- la vzporedno z razvojem cepiv. Kolektivno financiranje in podpora vlad, mednarodnih organizacij in industrije sta povzročila do- končanje preizkušanj varnosti in učinkovito- sti cepiv mRNA družb Pfizer/BioNTech in Moderna v rekordnem času, v enem letu po izbruhu epidemije SARS-CoV-2. Odobritev dveh učinkovitih in varnih cepiv mRNA proti COVID-19 je konec leta 2020 pognala področje cepiv mRNA v novo dobo. Tak ra- zvoj, petnajst let po objavi temeljnih ugoto- vitev Katalin Karikó in Drewa Weissmana, je bil mogoč zaradi desetletja temeljnih raz- iskav in izboljšane tehnologije mRNA. Nju- no odkritje, da se z uporabo spremenjenih baz v in vitro prepisanih mRNA po dostavi v celice izognemo neželenemu vnetnemu odzivu organizma in hkrati v njem poveča- mo proizvodnjo želenih proteinov – antige- nov, dokazuje vrednost temeljnih raziskav. Rezultati, ki sta jih objavila Karikó in We- issman v svojem temeljnem članku iz leta 2005, so bili takrat deležni razmeroma ma- lo pozornosti, vendar so ustvarili osnovo za kritično pomemben znanstveni in tehnolo- ški preboj, ki je omogočil človeštvu uspešen spopad z grozečo pandemijo COVID-19. Kot take jih je tudi prepoznal Nobelov od- bor na švedskem Karolinskem inštitutu in se zato odločil, da obema znanstvenikoma podeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino za leto 2023 za njuna odkritja, povezana s spremembami nukleozidnih baz, ki so omogočila razvoj učinkovitih cepiv mRNA proti COVID-19. Viri: The Nobel Assembly at Karolinska Institutet: Press release 2023-10-02; https://www.nobelprize.org/prizes/ medicine/2023/press-release/. The Nobel Assembly at Karolinska Institutet: Scientific background 2023 - Discoveries concerning nucleoside base modifications that enabled the development of effective mRNA vaccines against COVID-19; https:// www.nobelprize.org/uploads/2023/10/advanced- medicinprize2023-3.pdf. SARS-CoV-2, Wikipedia: https://sl.wikipedia.org/wiki/ SARS-CoV-2. Dolenc, S., 2021: Nove različice virusa SARS-CoV-2. Kvarkadabra, 20. 3. 2021: https://kvarkadabra. net/2021/03/razlicice-sars-cov-2/. Immune System, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/ wiki/Immune_system. Vaccine, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/ Vaccine. Prikaz proizvodnje virusnih konic po cepljenju z mRNA in prepoznavanje konic s strani celic B. Po prevzemu mRNA v celice, ki ga olajšajo lipidni nanodelci, mRNA deluje kot matrica za proizvodnjo proteina virusne konice. Ta se začasno izrazi na površini celic, v katere smo vnesli cepilno mRNA, kjer ga celice B prepoznajo prek svojega B-receptorja (angleško B-Cell Receptor, BCR), kar spodbudi njihovo izločanje za konico specifičnih protiteles. Prirejeno po: Scientific background 2023; https://www.nobelprize.org/uploads/2023/10/advanced-medicinprize2023-3.pdf. 114 ■ Proteus 86/3, 4 • November, december 2023 115Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv proti COVID-19 • Nobelove nagrade za leto 2023Nobelove nagrade za leto 2023 • Odkritje, ki je omogočilo hiter razvoj cepiv somih, kjer se odvija njen prevod v zgrad- bo ustreznega proteina. Učinek psevdouri- dina so v nadaljnjih raziskavah še povečali s kemijskim dodatkom metilne skupine na njegov dušikov atom N1, tako da je danes N1-metil-psevdouridin (m1Ψ) najpogosteje spremenjena baza, ki se uporablja pri pro- izvodnji cepiv mRNA. Vnos takega cepiva mRNA ima za posledico slabše prepoznava- nje zaradi Ni-metil-psevdouridina spreme- njene molekule mRNA s strani receptorjev T-celic prirojenega imunskega odziva, zato tudi manjšo proizvodnjo vnetnih citokinov in s tem tudi bistveno slabši vnetni odziv. Po drugi strani pa boljše prileganje spreme- njene mRNA ribosomom na mestu biosin- teze v telesnih celicah pomeni tudi boljše prevajanje njenega koda v ustrezen protein in s tem bistveno bogatejšo proizvodnjo že- lenega antigena v telesu samem in njegovo izpostavljenost prilagoditvenemu imunske- mu odzivu oziroma razpoložljivost za tvorbo ustreznih protiteles. Trenutek je bil zrel za sestavo mRNA cepiva proti COVID-19 Ko je v začetku leta 2020 izbruhnila pan- demija COVID-19, so podjetja, ki so raz- iskovala cepiva na osnovi mRNA, lahko hitro ukrepala. Pomagale so ugotovitve iz raziskav MERS-CoV, da ta virus za vstop v celice gostitelja uporablja površinske protei- ne svoje bodičaste zgradbe in da so virusi iz različnih družin razvili podobne rešitve za svoje zlivanje s ciljnimi celicami. V rekor- dno hitrem času so (McLellan s sodelavci, 2020) razvozlali in objavili tudi natančno aminokislinsko zgradbo ter prostorsko obli- ko konice virusa SARS-CoV-2 in njenega sestavnega proteina, kar je imelo neprecen- ljivo vrednost za razvoj uspešnih cepiv proti COVID-19, predvsem za opredelitev tistih delov proteinske konice virusa (epitopov), ki jih prepoznavajo celice imunskega sistema (T-celice, B-celice) in kamor se končno ve- žejo tudi nevtralizirajoča protitelesa. Znanje o tem je bilo zelo pomembno tudi pri ka- snejšem pojavu »ubežnih mutacij« v tem de- lu virusne konice, ki so povzročile nastanek virusnih različic, proti katerim je bilo treba najti rešitve v najkrajšem možnem času. Pandemija SARS-CoV-2 je bila odločilen dogodek, ki je pripeljal do obsežnih na- ložb v tehnologijo cepiv mRNA in obli- kovanje kliničnih preizkušanj, ki so zaradi znanja, nakopičenega v pravem trenutku, v nasprotju s predhodno prakso lahko poteka- la vzporedno z razvojem cepiv. Kolektivno financiranje in podpora vlad, mednarodnih organizacij in industrije sta povzročila do- končanje preizkušanj varnosti in učinkovito- sti cepiv mRNA družb Pfizer/BioNTech in Moderna v rekordnem času, v enem letu po izbruhu epidemije SARS-CoV-2. Odobritev dveh učinkovitih in varnih cepiv mRNA proti COVID-19 je konec leta 2020 pognala področje cepiv mRNA v novo dobo. Tak ra- zvoj, petnajst let po objavi temeljnih ugoto- vitev Katalin Karikó in Drewa Weissmana, je bil mogoč zaradi desetletja temeljnih raz- iskav in izboljšane tehnologije mRNA. Nju- no odkritje, da se z uporabo spremenjenih baz v in vitro prepisanih mRNA po dostavi v celice izognemo neželenemu vnetnemu odzivu organizma in hkrati v njem poveča- mo proizvodnjo želenih proteinov – antige- nov, dokazuje vrednost temeljnih raziskav. Rezultati, ki sta jih objavila Karikó in We- issman v svojem temeljnem članku iz leta 2005, so bili takrat deležni razmeroma ma- lo pozornosti, vendar so ustvarili osnovo za kritično pomemben znanstveni in tehnolo- ški preboj, ki je omogočil človeštvu uspešen spopad z grozečo pandemijo COVID-19. Kot take jih je tudi prepoznal Nobelov od- bor na švedskem Karolinskem inštitutu in se zato odločil, da obema znanstvenikoma podeli Nobelovo nagrado za fiziologijo ali medicino za leto 2023 za njuna odkritja, povezana s spremembami nukleozidnih baz, ki so omogočila razvoj učinkovitih cepiv mRNA proti COVID-19. Viri: The Nobel Assembly at Karolinska Institutet: Press release 2023-10-02; https://www.nobelprize.org/prizes/ medicine/2023/press-release/. The Nobel Assembly at Karolinska Institutet: Scientific background 2023 - Discoveries concerning nucleoside base modifications that enabled the development of effective mRNA vaccines against COVID-19; https:// www.nobelprize.org/uploads/2023/10/advanced- medicinprize2023-3.pdf. SARS-CoV-2, Wikipedia: https://sl.wikipedia.org/wiki/ SARS-CoV-2. Dolenc, S., 2021: Nove različice virusa SARS-CoV-2. Kvarkadabra, 20. 3. 2021: https://kvarkadabra. net/2021/03/razlicice-sars-cov-2/. Immune System, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/ wiki/Immune_system. Vaccine, Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/ Vaccine. Prikaz proizvodnje virusnih konic po cepljenju z mRNA in prepoznavanje konic s strani celic B. Po prevzemu mRNA v celice, ki ga olajšajo lipidni nanodelci, mRNA deluje kot matrica za proizvodnjo proteina virusne konice. Ta se začasno izrazi na površini celic, v katere smo vnesli cepilno mRNA, kjer ga celice B prepoznajo prek svojega B-receptorja (angleško B-Cell Receptor, BCR), kar spodbudi njihovo izločanje za konico specifičnih protiteles. Prirejeno po: Scientific background 2023; https://www.nobelprize.org/uploads/2023/10/advanced-medicinprize2023-3.pdf.