Celično zdravljenje s tolerogenimi dendritičnimi celicami - vzročno zdravljenje avtoimunskih bolezni
Tolerogenic dendritic cell therapy - causal treatment of autoimmune diseases
Urban Švajger,1'3 Matjaž Jeras:
C2'3
1	Zavod Republike Slovenije za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana
2	Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7,
1000 Ljubljana
3	Celica, Biomedicinski center d.o.o, Tehnološki park 24,1000 Ljubljana
Korespondenca/ Correspondence:
Urban Svajger, Zavod RS za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6 1000 Ljubljana email: urban.svajger@ ztm.si
Ključne besede:
tolerogene dendritične celice, imunoterapija, imunosupresivni mehanizmi
Key words:
tolerogenic dendritic cells, immunotherapy, immunosuppressive mechanisms
Citirajte kot/Cite as:
Zdrav Vestn 2013; 82: 47-54
Prispelo: 25. okt. 2011, Sprejeto: 26. okt. 2012
Izvleček
Izhodišča: Dendritične celice (DC) v človeškem organizmu so poglavitni prenašalci antigenske (Ag) informacije. Le-to posredujejo Ag-speci-fičnim limfocitom T v različnem smislu imunske aktivacije, ki je lahko imunostimulativna oz. imunosupresivna. Slednje je odvisno od njihovega aktivacijskega stanja, pri čemer izražajo DC izjemno funkcijsko plastičnost. Tolerogene DC, ki jih označujejo izrazite imunosupresivne značilnosti, lahko inducirajo nastanek regulacijskih limfocitov T ter povzročijo nastanek T celične anergije. V zadnjih dveh desetletjih se je nabralo dovolj eksperimentalnih dokazov na živalskih modelih, ki nakazujejo varnost in učinkovitost uporabe DC za zdravljenje imunsko posredovanih bolezni. Imunoterapija z DC tako postaja klinična stvarnost. Trenutno je v okviru NIH (National Institutes of Health) registrirana klinična študija za uporabo avtolognih DC, pridobljenih iz človeških monocitov, spremenjenih v pogojih ex vivo v smislu indukcije imunosupresivnih lastnosti, za zdravljenje avtoimunskega diabetesa tipa 1.
Zaključki: Pregledni članek opisuje poglavitne lastnosti DC, primernih za uporabo v celičnem zdravljenju avtoimunskih bolezni, njihovo vlogo pri tovrstnem zdravljenju ter načine priprave te vrste celičnih pripravkov v laboratoriju. Zdravljenje avtoimunskih bolezni s tolerogenimi DC je izjemen potencial, pri čemer pa je poglavitna ovira ustrezna pridobitev celičnega proizvoda ob upoštevanju strogih načel dobre proizvodne prakse (GMP).
Abstract
Background: Dendritic cells (DCs) are considered as primary carriers of antigenic (Ag) information in the human body. This information is later presented to Ag-specific T lymphocytes in various ways that can be either immunostimu-lating or immunosuppressive. The latter depends on the activation status of DCs, in which way the DCs display extreme plasticity in terms of their function. Tolerogenic DCs, which are characterized by extensive immunosuppressive properties, can induce the generation of regulatory T lymphocytes or cause T-cell anergy. In the last two decades, considerable evidence has accumulated using animal models, which points to safety and efficacy of DC application in terms of treating immune-mediated diseases. Im-muntherapy using DCs is nowadays becoming a clinical reality. At present, a clinical study using autologous DCs derived from human monocytes and treated ex vivo to induce their immunosup-pressive potential, with the aim to treat autoimmune type 1 diabetes, is registered within NIH (National Institutes of Health).
Conclusion: The review discusses the characteristics of DCs, suitable for use in cellular therapy of autoimmune diseases, their role in such therapies and the way in which such cells can be generated in the laboratory. Therapy of autoimmune diseases using tolerogenic DCs represents an outstanding potential, however the major obstacles lay in the way of proper preparation of cellular products, where all procedures should follow the strict demands of good manufacturing practice (GMP).
Uvod
Dendritične celice so v imunološki znanosti pridobile na pomenu z odkritjem, da lahko kot profesionalne Ag predstavljajoče celice (APC), poleg vzpostavitve Ag-spe-cifičnih efektorskih imunskih odzivov, v enakem obsegu povzročijo tudi nastanek tolerogenih imunskih odzivov, pri čemer botrujejo nastanku T-celične neodzivnosti ter regulacijskih celic T in na tak način v veliki meri prispevajo k vzdrževanju periferne imunske tolerance.1 V človeškem perifernem obtoku je moč najti nizko število DC, več pa se jih nahaja ob telesnih površinah, kot je sluznica, in pod kožo. Dendritične celice v veliki meri migrirajo, pri čemer lahko potujejo iz tkiv v območja celic T in B v sekundarnih limfnih organih, kjer uravnavajo odzive celic T.2'3 Slednja dejavnost poteka tako v fizioloških pogojih, kakor med stanjem okužbe, prav tako pa je od teh pogojev odvisen način, preko katerega DC aktivirajo odzivne limfocite T. Pred kratkim so prikazali, da lahko nezrele oz. neaktivirane DC prav tako potujejo v sekundarna limfna tkiva, kjer namesto efektorskih imunskih odzivov povzročijo delecijo celic T oz. njihovo neodzivnost.4 Pod fiziološkimi pogoji je poglavitna naloga DC vzorčenje Ag na mestu, kjer prebivajo. Ob tem prav tako shranjujejo lastno Ag informacijo, ki izvira iz odmrlih in apoptotičnih celic okoliškega tkiva.5 Smiselno je predpostaviti, da bi v primeru odsotnosti prej omenjenega procesa delecije in povzročitve neodzivnosti celic T, specifičnih na lastne Ag, v primeru aktivacije DC, le-te lahko aktivirale naivne celice T s specifiko T-celičnega receptorja (TCR), usmerjeno proti istim Ag. Aktivacija oz. zorenje DC je namreč proces, ki popolnoma spremeni tako morfologijo, fenotip kakor tudi funkcijske lastnosti DC. Slika 1 prikazuje morfološke razlike nezrelih in zrelih DC. Ob izpostavitvi DC dejavnikom, ki povzročajo njihovo zorenje (bakterijski lipopolisaharid - LPS, vnetni citokini - TNF-a, IL-iß itd.), DC prenehajo z vzorčenjem Ag in jih začnejo predstavljati na lastni površini v kompleksu z molekulami poglavitne tkivne skladnosti razreda I in II (molekule MHC - major hi-stocompatibility complex).6 Ob tem prene-
hajo izražati kemokinske receptorje, ki jih vodijo na odgovorna tkivna mesta in pričnejo izražati kemokinski receptor CCR7,7 ki vodi DC v sekundarne limfne organe. Prav tako se izrazito poveča površinsko izražanje ko-stimulacijskih molekul CD40, CD80 in CD86, s pomočjo katerih aktivirajo odzivne celice, zato se spremeni njihov citokinski profil6 (različno povečano izražanje IL-12, TNF-a, IL-1, IL-8, kakor tudi IL-10), kar pa je v veliki meri odvisno od načina njihove aktivacije DC.8
Tolerogene dendritične celice
Glede aktivacijskega stanja je dolgo veljalo prepričanje, da se DC nahajajo v dveh končnih oblikah razvoja, nezrelem in zrelem stanju, pri čemer nezrele DC botrujejo nastanku tolerogenih imunskih odzivov, zrele pa inducirajo močne efektorske odzive z nastankom celic T tipa Thi oz. Th29. Danes je znano, da se lahko DC poleg obeh omenjenih stanj nahajajo tudi v vmesnem akti-vacijskem stanju, ki v primerjavi z nezrelimi DC v večjem obsegu zagotavlja tolerogen imunski odziv. Takšne DC imajo povečano izražanje kostimulacijskih molekul, njihova poglavitna značilnost pa je nizka proizvodnja provnetnega citokina IL-12 ob sočasno povečanem izražanju imunosupresivnega citokina IL-1010. Povečano izražanje IL-10 je eden poglavitnih dejavnikov, ki usmerja razvoj celic T ob njihovem stiku s takšnimi DC v smer regulacijskih limfocitov T. Ena od vrst regulacijskih celic T, ki nastanejo na tak način, so celice vrste Tri, ki lahko po akti-vaciji same proizvajajo IL-iow. Takšne vrste D C so bile kmalu označene kot tolerogene DC. Danes je znano, da obstajajo tudi v kontekstu tolerogenih DC številne razlike glede izražanja različnih citokinov in drugih imu-nosupresivnih dejavnikov, ter vrste regulacijskih celic T, ki jih le-te inducirajo. Tolero-gene DC namreč poleg imunosupresivnega citokinskega profila izražajo tudi različne površinsko vezane inhibicijske molekule, ki ob interakciji s celicami T in odgovornimi ligandi oz. receptorji sprožajo v notranjost celic negativne signale," pri čemer lahko povzročijo apoptozo odzivnih celic T^ ter nadzorujejo delovanje aktiviranih celic T."
Pomembni inhibicijski receptorji, izraženi na DC, so t. i. imunoglobulinu podobni prepisi (immunoglobulin-like transcript -ILT)3 in ILT4, ligand Fas, PDL-1 (programmed death ligand 1) in druge.14 Slika 2 prikazuje poglavitne lastnosti tolerogenih DC.
Pomembna in zaželena lastnost toleroge-nih DC je stabilnost tolerogenega fenotipa. Slednje pomeni, da so DC s potencialnimi imunosupresivnimi lastnostmi odporne na zorenje z aktivacijskimi dejavniki, kot so LPS, ligand CD40 ter številni vnetni cito-kini. Stabilnost tolerogenih DC je ključna, če jih želimo kasneje uporabiti kot morebitni celični pripravek z namenom reguliranja neželenih imunskih procesov in vivo. Za številne avtoimunske bolezni, kot je npr. revmatoidni artritis, so pogosto značilni imunski odzivi tipa Thi (seveda tudi Thi7), kjer so vnetna stanja zaznamovana s prisotnostjo številnih vnetnih citokinovi5, ki bi lahko potencialno aktivirali DC kot celični pripravek, ko bi ta enkrat dosegel mesto vnetja. Takšen poseg bi v končni fazi prive-del do nasprotnega učinka, saj bi vnešene in kasneje aktivirane DC v povečanem obsegu nadalje aktivirale limfocite, specifične za Ag, pomembne v razvoju določene avtoimunske bolezni.
Načini pridobitve tolerogenih DC v laboratoriju
Do danes so se uveljavili že mnogoteri načini, s pomočjo katerih lahko DC v laboratorijskih pogojih izpostavimo specifičnim pogojem, ki narekujejo njihov razvoj v smer tolerogenih DC, ki so v precejšni meri odporne na posledično aktivacijo tudi s tako močnimi imunogeni, kot sta bakterijski LPS ali ligand receptorja CD40. Ob tej priložnosti je potrebno omeniti, da DC, s katerimi večina znanstvenikov in laboratorijskih delavcev rokuje v in vitro oz. ex vivo pogojih, izhajajo iz človeških monocitov. Zaradi nizkega števila DC v telesu bi bila njihova neposredna osamitev in kasnejša uporaba s tehnološkega vidika neizvedljiva. V ta namen se danes uporablja splošno razširjen model, s katerim iz človeških mo-nocitov (v periferni krvi posameznika so obilno zastopani) v 5-dnevni celični kulturi
ob prisotnosti rekombinantnega humanega (rh) granulocitne in monocitne kolonije sti-mulirajočega dejavnika (GM-CSF) ter IL-4, dosežemo diferenciacijo monocitov v DC. Takšne DC posedujejo številne značilnosti, ki so značilne za DC, naravno prisotne v telesu, kot je izjemna sposobnost privzema Ag ter obširna Ag predstavitev in doseg zrelega stanja po aktivaciji.i®
Klasičen model za dosego tolerogene-ga stanja je izpostavitev nezrelih DC imu-nosupresivnim citokinom, kot sta IL-10 ali transformirajoči rastni dejavnik (TGF)-^. Znano je, da so DC po dodatku IL-10 in vitro nezmožne popolne aktivacije, pri čemer izražajo zmanjšano stopnjo kostimu-lacijskih molekul CD80 in CD86, izražajo IL-10 v večjem obsegu in imajo zmanjšano sposobnost aktivacije alogenskih limfocitov CD4+.17 Po drugi strani so mišje DC, ki so jih inkubirali s TGF-^, po ponovnem vnosu v živali preprečile nastanek eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa (EAE).i® Zanimivo je, da TNF-a sam po sebi po krajši aktivaciji povzroči nastanek delno zrelih DC, ki v večji meri izražajo ko-stimu-lacijske molekule, a ne izkazujejo povečane proizvodnje IL-12, poglavitnega citokina, ki usmerja tip Thi T-celičnega imunskega odziva. Te vrste DC so v miših zavrle nastanek avtoimunskega tiroiditisa.19 Poleg aktivacije že razvitih DC, je za kasnejšo funkcijo DC pomembna njihova razvojna pot iz mono-citov. Monociti, ki jih gojimo v prisotnosti makrofagne kolonije stimulirajočega dejavnika (M-CSF) ter IL-4, se razvijejo v DC z izrazitimi tolerogenimi lastnostmi, za katere je značilno obsežno proizvajanje IL-10 in odsotnost proizvajanja IL-12.20 Podoben to-lerogeni značaj pridobijo tudi DC, ki jih ob razvoju iz monocitov spremljajo interakcije z ligandi lektinskega receptorja DC-SIGN.21 Poleg obdelovanja DC z različnimi imunosupresivnimi biomolekulami lahko vplivamo na ključne točke v njihovi biologiji z različnimi farmakološkimi sredstvi. Dobro je znano, da aktivna oblika vitamina D, ia,25-dihidroksi-vitamin D3 [ia,25(OH)2D3], kakor tudi kortikosteroidi, pomembno vplivajo tako na diferenciacijo kot zorenje DC, zlasti v negativnem smislu. Dodatek teh snovi v kulture DC prepreči, da
jih aktivirata LPS ali ligand CD40. Slednje se kaže v zmanjšanem obsegu izražanja molekul CD80 in CD86, kakor tudi majhnem izločanju provnetnih citokinov in občutno povečanem izločanju IL-1022. Tako obdelane DC lahko preprečijo nastanek avtoimunskih bolezni pri živalih in botrujejo nastanku regulacijskih celic T.22 V našem laboratoriju smo pokazali, da DC, obdelane bodisi z niflumsko kislino ali z resveratrolom (prva deluje kot nesteroidna protivnetna učinkovina, druga pa kot rastlinski antioksidant), pridobijo izrazit tolerogeni fenotip/3 pri čemer omogoči resveratrol pridobitev DC, ki inducirajo nastanek Tri regulacijskih celic
T 24
Mehanizmi, preko katerih DC nadzorujejo imunsko reaktivnost
Indukcija apoptoze naivnih in spominskih limfocitov T ter vzpostavitev T-celične neodzivnosti
Mnoge študije navajajo, da lahko nepopolno aktivirane oz. nezrele DC ob interakciji z alogensko specifičnimi celicami T izzovejo njihovo neodzivnost na kasnejšo stimulacijo z odgovarjajočim Ag, kar razumemo pod pojmom T-celična anergija. Blokada kostimulacijskih molekul B7, vpliv imunosupresivnih citokinov karkšna sta IL-10 ter TGF-P oz. gensko spremenjene D C, ki izražajo zvečano stopnjo virusnega IL-10, citotoksičnega T-limfocitnega Ag, vezanega na protitelo (CTLA4)Ig ter liganda Fas (CD95L), lahko inducirajo aloantigensko--specifično T-celično anergijo kakor tudi apoptozo odzivnih celic T in na tak način pomembno prispevajo k zaviranju imunske reaktivnosti.12'14'25'26 Kot smo omenili, lahko DC z nepopolnim zrelostnim fenotipom pod določenimi pogoji usmerijo razvoj naivnih limfocitov T v anergične celice T, ki se po aktivaciji obnašajo povsem drugače kot bodisi efektorske ali regulacijske celice T. Za anergične celice T je ob stimulaciji T-ce-ličnega receptorja (TCR) značilna izjemno nizka stopnja proliferacije. Prav tako takšne celice niso sposobne izločati večjih količin
imunomodulacijskih citokinov, kot sta IL-2 in IFN-y, ter zelo malo oz. nič IL-4 kakor tudi ne imunosupresivnega IL-10,^'27 cito-kin, katerega izločanje je za regulacijske celice T tipa Tri značilno v izobilju/8
Poleg vloge prenašalca Ag informacije in krojenja T-celičnih odzivov lahko DC preko izražanja določenih površinskih molekul prav tako nastopijo v vlogi efektorskih celic. Ena takšnih molekul je ligand Fas. Po vezavi receptorja Fas na limfocitih T lahko ob zmanjšani prisotnosti molekul B7 na površini DC, slednje privede do apoptoze celic T, zlasti predhodno aktiviranih celic T. i2'26 Dodatno je vloga receptorja Fas večnamenska in odvisna tudi od tipa celic T. Tako ob vezavi liganda Fas pri naivnih celicah T le--ta povzroči njihovo zmanjšano aktivacijo in proliferacijo, ne pa apoptoze/9
Drugače je pri spominskih limfocitih T. Ti potrebujejo namreč zelo malo kosti-mulacijskih signalov za doseganje polnega aktivacijskega stanja, zaradi česar igrajo zelo pomembno vlogo pri vrstah neželenih imunsko posredovanih procesov, kot je npr. zgodnja zavrnitvena reakcija pri presaditvi alogenskega tkiva/0 Zaradi izjemnega potenciala aktivacije je dolgo časa veljalo prepričanje, da so spominske celice T, izvzete iz možnosti deaktivacije s strani ostalih imunskih akterjev. Pred kratkim pa so dokazali, da lahko nezrele DC, ki konstitutivno predstavljajo Ag spominskim CD8+ celicam T, zavrejo njihove odzive preko mehanizmov delecije in deaktivacije/i
Indukcija regulacijskih celic T
Prej smo omenili, da tako nezrele kot tolerogene DC omogočajo nastanek regulacijskih imunskih odzivov ter da je vrsta T--celičnega odziva, ki ga inducirajo tovrstne DC, odvisna od številnih dejavnikov, ki so vezani na specifično aktivacijsko stanje DC. Danes lahko v grobem trdimo, da nezrele DC zaradi pomanjkanja imunostimulacij-skih elementov izzovejo toleranco prek t. i. pasivnih mehanizmov, in sicer predvsem s T-celično anergijo, pri čemer toleregene DC zaradi imunosupresivnega citokinskega profila in izražanja številnih inhibicijskih molekul preko teh elementov aktivne tolerance v
večji meri omogočajo nastanek regulacijskih celic T (Treg). Regulacijskih celic T poznamo danes že več vrst in jih prepoznamo tako med CD4+ kot tudi CD8+ celicami T. Pomemben mejnik v imunologiji predstavlja odkritje t. i. naravno prisotnih regulacijskih celic T (nTreg), ki nastanejo kot samostojna celična vrsta v priželjcu, s čimer so bile postavljene nove osnove v mehanizmih vzdrževanja periferne tolerance.32 Druga možnost je, da Treg nastanejo na periferiji pod specifičnimi okoljskimi pogoji iz naivnih celic T, pri čemer pa igrajo pomembno vlogo tolerogene D C. Takšen tip regulacijskih celic T imenujemo pridobljene regulacijske celice T, med katerimi so najbolje opisane celice Tri.33 Poznamo pa še številne druge, kot so celice Th3, CD8+CD28—supresorske celice in ostale. Za vzdrževanje kompleksne mreže imunske regulacije je ključnega pomena obojestranska komunikacija med regulacijski limfociti in DC. Tako kot lahko namreč tolerogene DC prispevajo k nastanku regulacijskih limfocitov, lahko le-ti delujejo na druge DC, v katerih izzovejo tolerogene lastnosti, tako se ojača krog imunske tolerance.
Potencialna terapevtska uporabnost tolerogenih DC
Z namenom vzpostaviti protitumorske imunosti so do danes opravili številne klinične študije (več sto jih je trenutno v teku - vir National Institues of Health), s pomočjo katerih so dokazali, da je uporaba DC za predstavljanje tumorskih Ag ter stimulacijo imunskega odziva varna in potencialno klinično učinkovita metoda. Funkcijska plastičnost DC pa je spodbudila tudi razmišljanja o možnosti uporabe DC za preprečevanje avtoimunskih bolezni ali kroničnih vnetnih procesov.
Številne predklinične študije, opravljene na različnih živalskih modelih avtoimun-skih bolezni kakor tudi transplantacij z uporabo DC z zmanjšano imunostimulacijsko sposobnostjo, so prinesle zelo obetajoče rezultate. Trenutno se strokovno mnenje močno nagiba k prenosu tega znanja v klinično prakso. Pri tem velja poudariti, da velika funkcijska plastičnost DC, v ožjem smi-
slu tudi tolerogenih DC, narekuje uporabo pravilno pripravljenih tolerogenih DC za uporabo pri zdravljenju bolezni, kot je npr. T1D. Znanstveniki danes razumejo, da iste tolerogene DC, ki so zmožne zavreti imunsko reaktivnost na alogenski presadek, morda ne bi bile zmožne nadzirati in ozdraviti stanja avtoimunske bolezni/4 Pred kratkim so na mišjem modelu T1D dokazali zelo dobro učinkovitost DC, ki so jih zadržali v stanju nezrelosti z uporabo protismiselnih oligodeoksinukelotidov (AS-ODN) proti kostimulacijskim molekulam CD40, CD80 in CD86. Takšne DC so pri miših NOD, nagnjenih k razvoju T1D, popolnoma preprečile nastanek avtoimunskega diabetesa/5 Te in podobne študije so pred kratkim botrovale odobritvi prve faze klinične študije s strani FDA (Food and Drug Administration), za uporabo tolerogenih DC pri odraslih prostovoljcih z razvitim T1D (vir NIH). V konkretnem primeru so pridobili bolnikove levkocite z uporabo afereze ter v pogojih in vitro ustvarili DC pod GMP pogoji. To-lerogenost DC so zagotovili z uporabo AS--ODN. Te DC z nizkim izražanjem CD40, CD80 in CD86 so nato vbrizgali bolnikom intradermalno ali subkutano na mestu blizu trebušne slinavke/4 Mesto vnosa celičnega pripravka je pri tovrstnih posegih zelo pomembna in izbira takšnega anatomskega mesta zaradi obstoja limfnega mikrožilja na tem mestu zagotavlja prenos vbrizganih DC v bezgavke trebušne slinavke. Antigen-ska informacija potrebna za vzpostavitev tolerance, bi prispela do injiciranih DC preko limfe iz okolice pankreasa, njen vir pa bi zagotavljale apoptotične ^-celice Lan-gerhansovih otočkov. Na podoben način je pred kratkim opravljena študija z namenom vzpostavitve imunosupresivnih lastnosti DC, uvedla uporabo mikrosfer, v katerih se nahajajo AS-ODN proti prej omenjenim ko-stimulacijskim molekulam. Namen tega je, da se mikrosfere injicirajo na prej omenjeno anatomsko mesto. Dendritične celice bi te mikrosfere na tem mestu prevzele in na ta način pridobile imunosupresivne lastnosti in vivo.36
Praktičen vidik uporabe DC v zdravljenju pri ljudeh
Uporaba DC za celično zdravljene imun-sko-posredovanih bolezni je trenutno v fazi dokazovanja varnosti uporabe tovrstnih terapij pri ljudeh. Večina kliničnih študij, ki so vključevale vakcinacijo z DC je bila do sedaj opravljena na bolnikih z rakom, pri čemer so poročali o pojavu nekaterih neželenih učinkov kljub avtolognosti pripravka. Med temi so bili najpogostejši glavoboli, vročinski simptomi, vitiligo, obstrukcija pljuč in v redkih primerih šok.37'38 Čez čas so ugotovili, da DC same niso povzročitelji teh neželenih učinkov, ampak so to pripisali sočasni uporabi citokinov, kot sta npr. GM-CSF in IL-2, s katerimi so dopolnjevali zdravlje-
39
nje.
Poleg specifičnih lastnosti posameznih tipov tolerogenih DC je treba upoštevati tudi biologijo teh celic po vbrizganju. Zaenkrat še namreč ni dokazano, koliko zaporednih aplikacij vodi v zagotovitev daljše oz. trajne sistemske tolerance, z delovanjem na ostale celice imunskega sistema. Ve se, da je življenjska doba DC po vbrizganju v miši omejena in enako se pričakuje pri ljudeh.40 Ker so DC vrsta celic s kratko življensko dobo, je potrebno imeti v mislih morebiten nastanek spominskih regulatornih celic T, oz. v nasprotnem primeru potrebo po periodičnem zdravljenju s tolerogenimi DC. Zaenkrat velja prepričanje, da povzročijo vbrizgane DC nastanek na novo induciranih regulacijskih celic T z omejeno življenjsko dobo, kar narekuje ponavljanje terapije.
Poleg izbire primernega tipa tolerogenih DC za zdravljenje določene vrste bolezni, kar se nanaša na pripravo kakovostnih laboratorijskih protokolov, je naslednji pomemben korak spoštovanje načel dobre proizvodne prakse. Uporaba brezserumskih celičnih medijev in reagentov GMP predstavlja poleg dodatne optimizacije protokolov tudi večji finančni zalogaj. Vsi procesi priprave DC se morajo po današnjih standardih nujno odvijati v prostorih, ki zadoščajo standardoma GMP in GLP (Good Laboratory Practice). Temu primerno pa mora biti tudi osebje, ki z zadostnimi izušnjami zagotovi neoporečnost pripravka.
Zaključek
Po dosedanjih rezultatih, kljub številnim izzivom, obeta celično zdravljenje av-toimunskih bolezni s tolerogenimi DC velik potencial. Pri tem se moramo zavedati, da je namen tovrstnih terapij v svoji osnovi celostno in vzročno zdravljenje bolezni. Poglavitna vprašanja postajajo čedalje bolj tehnične in izvedbene narave, in sicer strogo upoštevanje načel GMP in seveda visoki finančni stroški, ki bodo zelo verjetno spremljali tovrstno zdravljenje. Ne glede na številne ovire oz. izzive pa ostaja ideja o bodoči imunote-rapiji z imunskimi celicami, kot so DC, ena najpoglavitnejših tem naprednega zdravljenja imunsko posredovanih bolezni.
Literatura
1.	Banchereau, J. et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol 18, 767-811 (2000).
2.	Alvarez, D., Vollmann, E.H. & von Andrian, U.H. Mechanisms and consequences of dendritic cell migration. Immunity 29, 325-342 (2008).
3.	Randolph, G.J., Ochando, J. & Partida-Sanchez, S. Migration of dendritic cell subsets and their precursors. Annu Rev Immunol 26, 293-316 (2008).
4.	Hawiger, D. et al. Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo. J Exp Med 194, 769-779 (2001).
5.	Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. & Inaba, K. The induction of tolerance by dendritic cells that have captured apoptotic cells. J Exp Med 191, 411-416 (2000).
6.	Banchereau, J. & Steinman, R.M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, 245-252
(1998).
7.	Sallusto, F. et al. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur J Immunol 28, 2760-2769
(1998).
8.	Svajger, U., Anderluh, M., Jeras, M. & Obermajer, N. C-type lectin DC-SIGN: an adhesion, signalling and antigen-uptake molecule that guides dendritic cells in immunity. Cell Signal 22, 1397-1405 (2010).
9.	Moser, M. & Murphy, K.M. Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development. Nat Immunol 1, 199-205 (2000).
10.	Lutz, M.B. & Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol 23,
445-449 (2002).
11.	Chang, C.C. et al. Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4. Nat Immunol 3, 237-243 (2002).
12.	Suss, G. & Shortman, K. A subclass of dendritic cells kills CD4 T cells via Fas/Fas-ligand-induced apoptosis. J Exp Med 183, 1789-1796 (1996).
13.	Keir, M.E., Francisco, L.M. & Sharpe, A.H. PD-1 and its ligands in T-cell immunity. Curr Opin Immunol 19, 309-314 (2007).
14.	Morelli, A.E. & Thomson, A.W. Tolerogenic dendritic cells and the quest for transplant tolerance. Nat Rev Immunol 7, 610-621 (2007).
15.	Luger, D. et al. Either a Th17 or a Th1 effector response can drive autoimmunity: conditions of disease induction affect dominant effector category. J Exp Med 205, 799-810 (2008).
16.	Sallusto, F. & Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 179, 1109-1118 (1994).
17.	Steinbrink, K., Wolfl, M., Jonuleit, H., Knop, J. & Enk, A.H. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J Immunol 159, 4772-4780 (1997).
18.	Faunce, D.E., Terajewicz, A. & Stein-Streilein, J. Cutting edge: in vitro-generated tolerogenic APC induce CD8+ T regulatory cells that can suppress ongoing experimental autoimmune encephalom-yelitis. J Immunol 172, 1991-1995 (2004).
19.	Verginis, P., Li, H.S. & Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. J Immunol 174, 7433-7439 (2005).
20.	Li, G., Kim, Y.J. & Broxmeyer, H.E. Macrophage colony-stimulating factor drives cord blood mo-nocyte differentiation into IL-10(high)IL-12absent dendritic cells with tolerogenic potential. J Immunol 174, 4706-4717 (2005).
21.	Svajger, U., Obermajer, N., Anderluh, M., Kos, J. & Jeras, M. DC-SIGN ligation greatly affects dendritic cell differentiation from monocytes compromising their normal function. J Leukoc Biol 89, 893-905 (2011).
22.	Hackstein, H. & Thomson, A.W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immuno-suppressive drugs. Nat Rev Immunol 4, 24-34 (2004).
23.	Svajger, U., Vidmar, A. & Jeras, M. Niflumic acid renders dendritic cells tolerogenic and up-regu-lates inhibitory molecules ILT3 and ILT4. Int Im-munopharmacol 8, 997-1005 (2008).
24.	Svajger, U., Obermajer, N. & Jeras, M. Dendritic cells treated with resveratrol during differentiation from monocytes gain substantial tolerogenic properties upon activation. Immunology 129,
525-535 (2010).
25.	Lu, L. et al. Genetic engineering of dendritic cells to express immunosuppressive molecules (viral IL-10, TGF-beta, and CTLA4Ig). J Leukoc Biol 66,
293-296 (1999).
26.	Lu, L. et al. Fas ligand (CD95L) and B7 expression on dendritic cells provide counter-regulatory signals for T cell survival and proliferation. J Immunol 158, 5676-5684 (1997).
27.	Steinbrink, K. et al. Interleukin-10-treated human dendritic cells induce a melanoma-antigen-specific anergy in CD8(+) T cells resulting in a failure to lyse tumor cells. Blood 93, 1634-1642 (1999).
28.	Roncarolo, M.G., Bacchetta, R., Bordignon, C., Narula, S. & Levings, M.K. Type 1 T regulatory cells. Immunol Rev 182, 68-79 (2001).
29.	Strauss, G. et al. CD95 co-stimulation blocks activation of naive T cells by inhibiting T cell receptor signaling. J Exp Med 206, 1379-1393 (2009).
30.	Bingaman, A.W. & Farber, D.L. Memory T cells in transplantation: generation, function, and potential role in rejection. Am J Transplant 4, 846-852 (2004).
31.	Kenna, T.J., Thomas, R. & Steptoe, R.J. Steady-state dendritic cells expressing cognate antigen terminate memory CD8+ T-cell responses. Blood 111, 2091-2100 (2008).
32.	Sakaguchi, S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol 6,
345-352 (2005).
33.	Battaglia, M., Gregori, S., Bacchetta, R. & Roncarolo, M.G. Tr1 cells: from discovery to their clinical application. Semin Immunol 18, 120-127 (2006).
34.	Phillips, B., Giannoukakis, N. & Trucco, M. Dendritic cell-based therapy in Type 1 diabetes melli-tus. Expert Rev Clin Immunol 5, 325-339 (2009).
35.	Machen, J. et al. Antisense oligonucleotides down-regulating costimulation confer diabetes-preven-
tive properties to nonobese diabetic mouse dendritic cells. J Immunol 173, 4331-4341 (2004).
36.	Phillips, B. et al. A microsphere-based vaccine prevents and reverses new-onset autoimmune diabetes. Diabetes 57, 1544-1555 (2008).
37.	Saito, H., Frleta, D., Dubsky, P. & Palucka, A.K. Dendritic cell-based vaccination against cancer. Hematol Oncol Clin North Am 20, 689-710 (2006).
38.	Ridgway, D. The first 1000 dendritic cell vaccinees. Cancer Invest 21, 873-886 (2003).
39.	Dranoff, G. Cytokines in cancer pathogenesis and cancer therapy. Nat Rev Cancer 4, 11-22 (2004).
40.	Wang, T. et al. Inhibition of activation-induced death of dendritic cells and enhancement of vaccine efficacy via blockade of MINOR. Blood 113, 2906-2913 (2009).