78
Zdrav Var 2009; 48: 114-121
GENETSKA OPREDELITEV ZA METICILIN OBČUTLJIVIH IN PROTI METICILINU ODPORNIH SEVOV STAPHYLOCOCCUS AUREUS, IZOLIRANIH IZ HEMOKULTUR V SLOVENSKIH BOLNI[NICAH, S TIPIZACIJO SPA
GENETIC CHARACTERIZATION OF METHICILLIN-SUSCEPTIBLE AND METHICILLIN-RESISTANT STAPHYLOCOCCUS AUREUS STRAINS ISOLATED FROM BLOODSTREAM INFECTIONS IN SLOVENE HOSPITALS USING SPA TYPING
Vesna Cvitković Špik1, Irena Grmek Košnik2, Slavica Lorenčič Robnik3, Tjaša Žohar Čretnik4, Ljudmila Sarjanović5, Martina Kavčič6, Tatjana Harlander7, Iztok Štrumbelj8, Viktorija Tomič9, Irena Piltaver Vajdec10, Jerneja Fišer11, Jana Kolman12, Manica Mueller Premru1
Prispelo: 10. 9. 2008 - Sprejeto: 29. 12. 2008
Pregledni znanstveni ~lanek UDK 616.9
Izvle~ek
Staphylococcus aureus je drugi najpogostejši bakterijski povzročitelj invazivnih okužb v Sloveniji. S tipizacijo izolatov za meticilin občutljivih S. aureus (MSSA) in proti meticilinu odpornih S. aureus (MRSA) iz hemokultur bolnikov z bakteriemijo iz vse Slovenije v 6- mesečnem obdobju smo poskušali ugotoviti, katerim spa tipom pripadajo invazivni izolati MSSA in MRSA v Sloveniji, kakšna je genetska raznolikost MSSA in MRSA ter preveriti uporabnost tipizacije spa za epidemiološke raziskave S. aureus v Sloveniji.
Od 1. septembra 2006 do 28. februarja 2007smo v 11 slovenskih laboratorijih, ki izvajajo mikrobiološko diagnostiko za 15 bolnišnic, zbirali zaporedno izolirane primoizolate MSSA (največ pet) in zaporedno izolirane primoizolate MRSA (največ pet) iz hemokultur bolnikov. Izolate S. aureus smo tipizirali s tipizacijo spa, to je z določanjem nukleotidnega zaporedja polimorfnega X dela gena spa, ki kodira protein A.
Od 58 zbranih izolatov S. aureus iz vse Slovenije smo uspeli tipizirati 54 izolatov. Prevladujoči spa tipi med izolati MSSA so bili t091, t015 in t005, med izolati MRSA pa t041.
Ugotovili smo, da spa tipi, ki prevladujejo med invazivnimi izolati S. aureus pri nas, prevladujejo tudi v sosednjih državah. Tipizacija S. aureus z metodo spa je pokazala veliko genetsko raznolikost invazivnih sevov MSSA in manjšo raznolikost invazivnih sevov MRSA. Tipizacija spa je uporabna tipizacijska metoda za lokalno epidemiologijo MSSA v kratkem in daljšem časovnem obdobju.
Ključne besede: Staphylococcus aureus, bakteriemija, hemokulture, molekularna tipizacija, tipizacija spa
1	Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, In{titut za mikrobiologijo in imunologijo, Zalo{ka 4, 1000 Ljubljana
2	Zavod za zdravstveno varstvo Kranj, Gosposvetska 12, 4001 Kranj
3	Zavod za zdravstveno varstvo Maribor, Prvomajska 1, 2000 Maribor
4	Zavod za zdravstveno varstvo Celje, Gregorčičeva 5, 3000 Celje
5	Zavod za zdravstveno varstvo Nova Gorica, Vipavska 13, 5000 Nova Gorica
6	Zavod za zdravstveno varstvo Koper, Verdijeva 11, 6000 Koper
7	Zavod za zdravstveno varstvo Novo Mesto, Mej vrti 5, 8000 Novo mesto
8	Zavod za zdravstveno varstvo Murska Sobota, Ulica arhitekta Novaka 2b, 9000 Murska Sobota
9	Bolni{nica Golnik, Klinični oddelek za pljučne bolezni in alergijo-KOPA, Golnik 36, 4204 Golnik
10Splo{na bolni{nica Slovenj Gradec, Gosposvetska 1, 2380 Slovenj Gradec
11Splo{na bolni{nica dr. Franca Derganca Nova Gorica, Ulica padlih borcev 13a, 5290 Šempeter pri Novi Gorici
12Univerzitetni klinični center Ljubljana, Služba za preprečevanje in obvladovanje bolni{ničnih okužb, Japljeva ulica 2, 1525 Ljubljana Kontaktni naslov: e-po{ta: vesna.cvitkovic-spik@mf.uni-lj.si
Cvitković Špik V. et al. Genetska opredelitev za meticilin občutljivih in proti meticilinu odpornih sevov
79
Review article UDC 616.9
Abstract
Staphylococcus aureus is the second leading cause of invasive bacterial infections in Slovenia. The aims of this 6-month study were to identify the most prevalent spa types among invasive isolates of methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in Slovene hospitals, to determine genetic diversity of MSSA and MRSA, and to test the applicability of spa typing to epidemiological studies of S. aureus in Slovenia. Over a period of six months(1 September2006 - 28 February2007), up to five successive methicillin-susceptible (MSSA) blood culture isolates and a maximum of five successive methicillin- resistant (MRSA) blood culture isolates per hospital were obtained from different patients with bacteremia. The isolates were characterized by spa typing based on sequencing of polymorphic region X of the S. aureus protein A gene. Among the 58 isolates collected 54 were succesfully spa typed. The predominant spa types among MSSA isolates were t091, t015, t005, and among MRSA, t041 .
The predominant spa types among invasive S. aureus strains isolated in Slovenia predominated also in the neighbouring countries. The study showed high genetic diversity of invasive MSSA isolates and lower genetic diversity of invasive MRSA isolates in Slovenia. Spa typing is a good typing method for short- and long-term epidemiological studies of MSSA on a local scale.
Key words: Staphylococcus aureus, bacteriemia, blood cultures, molecular typing, spa typing
Uvod
Staphylococcus aureus je drugi najpogostejši povzročitelj invazivnih okužb v Sloveniji in tudi drugod po Evropi (1). Med invazivnimi izolati S. aureus iz hemokultur prevladujejo pri nas izolati S. aureus, ki so za meticilin občutljivi (MSSA). Prevalenca proti meticilinu odpornih S. aureus (MRSA) iz hemokultur je namreč v Sloveniji v primerjavi z nekaterimi sosednjimi državami dokaj nizka. V zadnjih letih smo zaznali uspešno znižanje z 21 % leta 2000, na 7 % leta 2006 (1). Okužbe z MRSA podaljšajo bolnišnično zdravljenje in so vzrok višje umrljivosti (2). Molekularno tipizacijo uporabljamo za nadzor epidemičnih sevov S. aureus, predvsem za odkrivanje bolj virulentnih klonov MSSA, poti širjenja MRSA med posameznimi bolniki in med različnimi kliničnimi oddelki. Z njo lahko potrdimo ali izključimo genetsko sorodnost med izolati S. aureus in s tem ločimo med epidemičnimi in endemičnimi ter sporadičnimi sevi. Trenutno imamo za tipizacijo S. aureus na voljo več molekularnih tipizacijskih metod. Izbira metode ali kombinacije metod je odvisna od namena, za katerega potrebujemo tipizacijo (3). Najpogostejši namen tipizacije S. aureus je nadzor nad epidemičnimi sevi bolnišnično pridobljenih MRSA. Tu je potrebno ločiti med genetsko zelo podobnimi sevi S. aureus, zato se uporabljajo tipizacijske metode z visoko močjo ločljivosti. Tipizacijska metoda analize kromosomske DNK s pulzno elektroforezo (PFGE) je še vedno najpogosteje uporabljena tipizacijska
metoda za raziskave lokalne epidemiologije S. aureus v kratkem časovnem obdobju in velja zaradi visoke moči ločevanja med sevi za zlati standard (4). Ima pa PFGE slabosti kot so: slabša ponovljivost, ločevanje le med omejenim številom izolatov, slaba primerljivost rezultatov med različnimi laboratoriji. Torej PFGE ni primerna metoda za epidemiologijo na širšem geografskem področju in v daljšem časovnem obdobju (5).
Drugi najpogostejši namen tipizacije je nadzor nad okužbami z invazivnimi MSSA, tretji namen pa nadzor nad okužbami z zelo virulentnimi, v domačem okolju pridobljenimi sevi MRSA (CA-MRSA- community-acquired MRSA) (6), ki izdelujejo toksin Panton-Valentine levkocidin (PVL) (7, 8). Zaradi prednosti v primerjavi s PFGE (3) se v zadnjem času za tipizacijo S. aureus vedno bolj uveljavljajo metode, ki temeljijo na določanju nukleotidnega zaporedja, med katerimi je tudi tipizacija spa. S to metodo tipiziramo seve glede na razlike v nukleotidnem zaporedju polimorfnega dela X gena spa, ki kodira protein A (Staphylococcus aureus protein A) (9, 10). Glavne prednosti tipizacije spa v primerjavi s PFGE so: hitra pridobitev rezultatov, nedvoumni in dobro ponovljivi številčni rezultati, možnost dodajanja rezultatov v spletne baze podatkov, ki so dostopne vsem, enostavno elektronsko izmenjavanje rezultatov znotraj laboratorijev in med njimi, enostavna uporaba standardizirane nomenklature in uporaba podatkov za preproste filogenetske analize (11). Sevi CA-MRSA se pojavljajo sporadično ali v izbruhih in se genetsko
80
Zdrav Var 2009; 48: 114-121
precej razlikujejo od bolnišničnih klonov MRSA, zato za tipizacijo ni potrebna tako visoka moč ločljivosti in lahko uporabimo tipizacijo spa. Kljub naštetim prednostim v primerjavi z metodo PFGE pa ima tipizacija spa premajhno moč ločevanja med izolati, če želimo dokazovati prenos MRSA med bolniki na oddelkih ali med bolnišnicami, kjer v visokem deležu prevladujejo sevi epidemične MRSA posameznega spa tipa (11). To je tudi glavni razlog, ki ga navaja Faria s sod., ko svetuje kombinacijo tipizacije spa in PFGE kot najboljšo izbiro za tipizacijo S. aureus (12).
Za ugotavljanje evolucijske sorodnosti S. aureus, pri čemer se ločuje med posameznimi sevi oz. kloni na osnovi razlik v nukleotidnem zaporedju, ki so posledica zelo redkih mutacij, torej v daljšem časovnem obdobju, pa je najprimernejša večgenska sekvenčna tipizacija- MLST (multilocus - sequence typing). MLST temelji na sekveniranju delov sedmih genov, pomembnih za esencialne metabolične funkcije bakterij (nevtralni geni, ki niso pod selekcijskim pritiskom) (13). Njena prednost v primerjavi z drugimi tipizacijskimi metodami je ta, da zanesljivo in z zelo dobro ponovljivostjo prepoznava sorodnosti med kloni S. aureus tekom dolgih obdobij in na geografsko oddaljenih področjih, slabost pa je visoka cena in zahtevnost izvedbe (3).
S sekvenčnim tipom (ST), ki ga določimo z metodo MLST, spa tipom, ki ga določimo s tipizacijo spa in s tipom genskega elementa SCCmec (SCCmec l-V), so enoznačno definirani posamezni glavni epidemični kloni MRSA, ki trenutno krožijo po svetu (14).
V naši raziskavi smo s tipizacijo izolatov S. aureus iz hemokultur bolnikov z bakteriemijo iz cele Slovenije v 6-mesečnem obdobju poskušali ugotoviti, katerim spa tipom pripadajo invazivni izolati MSSA in MRSA v Sloveniji, kakšna je genetska raznolikost MSSA in MRSA ter preveriti uporabnost tipizacije spa za epidemiološke raziskave S. aureus v Sloveniji.
Metode
V obdobju od 1. septembra 2006 do 28. februarja 2007 smo v 11 slovenskih laboratorijih, ki so vključeni v mrežo EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System), zbirali zaporedno izolirane primoizolate MSSA (največ pet) in zaporedno izolirane primoizolate MRSA (največ pet) iz hemokultur bolnikov v 15 vključenih bolnišnicah. Zbrali smo 58 primoizolatov iz 12 bolnišnic, od tega je bilo 48 izolatov MSSA in 10 izolatov MRSA (Tabela 1). Tri
bolnišnice izolatov S. aureus iz hemokultur v tem obdobju niso imele.
lzolate S. aureus smo tipizirali z metodo tipizacije spa. Metoda temelji na sekveniranju in analizi kromatograma nukleotidnega zaporedja polimorfnega dela X gena spa za protein A. Ta polimorfni del je sestavljen iz različnega števila različnih ponavljajočih se, največkrat 24 baznih parov dolgih zaporedij. Bakterijsko DNK smo iz 24-urne bakterijske kulture izolirali z reagentom Insta Gene Matrix (BioRad, Hercules, CA). Polimorfno zaporedje X smo pomnoževali z oligonukleotidnima začetnikoma spa-1113f ( 5'TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C3) in spa-1514r (5'CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT3), kot je opisal Harmsen s sod. (11). Produktom smo določili nukleotidno zaporedje po protokolu, ki ga opisuje Strommengerjeva s sod. (15) z reagenti BigDye Terminator v3.1 MasterMix (Applied Biosystems, Foster City, CA) in aparatom ABI 310 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Spa tip smo določili s pomočjo programa za tipizacijo spa, Ridom StaphType (Ridom GmbH, Wurzburg, Germany), ki z analizo kromatograma prepozna posamezna ponavljajoča se zaporedja ter glede na njihovo razporeditev in število določi, kateremu spa tipu ustrezajo (11). Kromatogram nukleotidnega zaporedja smo po končani analizi poslali preko spleta na strežnik http://www.ridom.de/ spaserver/, s čimer smo ponovno preverili kakovost kromatograma in shranili podatek o izolaciji seva z določenim spa tipom v podatkovno bazo. Glede na to, da za tipizacijo S. aureus vedno več in pogosteje uporabljamo tipizacijo spa, stalno odkrivamo tudi nove spa tipe in podatkovna baza na strežniku http://www. ridom.de/spaserver/ se stalno povečuje. Ta baza hrani tudi podatke o frekvenci in geografski lokaciji posameznih spa tipov.
Rezultati
Od 58 zbranih izolatov S. aureus, med katerimi je bilo 48 MSSA in 10 MRSA, smo s tipizacijo spa uspeli tipizirati 54 (93 %) izolatov. Treh izolatov MSSA in enega MRSA nismo uspeli tipizirati. Tipizirani izolati so spadali v 32 različnih spa tipov, od tega 45 izolatov MSSA v 29 in devet izolatov MRSA v tri različne spa tipe.
Med MSSA je prevladoval spa tip t091. Temu je pripadalo 9 izolatov, našli pa smo ga v obdobju trajanja študije v sedmih bolnišnicah. Drugi najpogostejši je bil spa tip t015, ki mu je pripadalo pet izolatov v treh bolnišnicah. Tretji najpogostejši je bil spa tip t005, ki
Cvitković Špik V. et al. Genetska opredelitev za meticilin občutljivih in proti meticilinu odpornih sevov
81
Tabela 1. Zbrani invazivni izolati MSSA in MRSA po laboratorijih in bolnišnicah in njihovi tipi spa. Table 1. Invasive MSSA and MRSA isolates collected in laboratories from different hospitals and their spa types.
Laboratorij / Laboratory	Bolnišnica / Hospital	Število izolatov MSSA in MRSA / No. of MSSA and MRSA isolates	Spa tip / Spa type
1	SI 001 A	MSSA (5)	t091, t116, t331, t761, t1469
		MRSA (5)	t041,t041,t041,t041,t041
2	SI 002 A	MSSA (3)	t015, t073, t757
3	SI 003 A	MSSA (5)	t091, t091, t015, t056, t156
		MRSA (1)	t003
4	SI 004 A SI 004 C	MSSA (4) MSSA (1)	t091, t015, t015, t2830 t012
5	SI 005 A	MSSA (5)	t091, t116, t084, t846, t1132
		MRSA (1)	t041
6	SI 006 A	MSSA (1)	NT
7	SI 007 A	MSSA (5)	t091, t643, t102, NT, NT
		MRSA (1)	t041
8	SI 008 A	MSSA (5)	t005, t334, t382, t550, t541
		MRSA (2)	t001, NT
9	SI 009 A	MSSA (5)	t091, t091, t122, t2471, t2829
10	SI 010 A	MSSA (4)	t015, t026, t435, t548
11	SI 011 A	MSSA (5)	t091, t005, t005, t026, t474
MSSA: za meticilin občutljiv Staphylococcus aureus; MRSA: proti meticilinu odporen Staphylococcus aureus; NT- neuspešna tipizacija
so ga imeli trije izolati v treh bolnišnicah. Sledila sta spa tipa t026 in t116, ki sta jima pripadala po dva izolata. Kar 24 spa tipov je bilo sporadičnih oz. so jim pripadali posamezni izolati MSSA. Med njimi sta bila dva nova oziroma prvič vnešena v podatkovno bazo v strežniku Ridom spaserver, spa tipa t2829 in t2830 (Tabela 1, 2).
Pri MRSA je prevladoval spa tip t041, ki mu je pripadalo sedem izolatov iz treh bolnišnic. V spa tipa t001 in t003 je bil uvrščen po en izolat MRSA iz posameznih bolnišnic (Tabela 1, 2).
Razpravljanje
Ugotovili smo, da je genetska heterogenost S. aureus velika, saj je 54 tipiziranih izolatov spadalo v kar 32 spa tipov. K veliki genetski heterogenosti so najbolj prispevali MSSA, saj je 45 tipiziranih izolatov spadalo v 29 različnih spa tipov. Pri MRSA je bila heterogenost majhna, saj je devet izolatov spadalo le v tri spa tipe.
Tipizirati nam ni uspelo štirih izolatov, od tega treh izolatov MSSA in enega izolata MRSA. Pri izolatu
82
Zdrav Var 2009; 48: 114-121
Tabela 2. Število tipiziranih izolatov MSSA in MRSA, tipi spa in njihova frekvenca.
Table 2. The number of spa typed isolates of MSSA and MRSA, spa types and their frequence.
Skupina	Število tipiziranih izolatov	Število spa tipov	Najpogostejši tipi spa (št. izolatov)
MSSA	45	29	t091 (9) t015 (5) t005 (3) t026 (2) t116 (2) sporadični (24)
MRSA	9	3	t041 (7) t001 (1) t003 (1)
Skupaj	54	32	32/ 54
MSSA nam z uporabljenima oligonukleotidnima začetnikoma ni uspelo pomnožiti polimorfnega dela X gena spa, o čemer poročajo pri približno 1 % izolatov Staphylococcus aureus tudi Faria s sod. (12) in Strommengerjeva s sod. (15). Pri ostalih treh neuspešno tipiziranih izolatih pa nam ni uspelo pridobiti dovolj kakovostnega nukleotidnega zaporedja za vnos v Ridom spaserver, ki ima zelo stroge zahteve glede kakovosti nukleotidnega zaporedja, s čimer se zagotavlja kakovost baze podatkov (11).
Prevladujoči spa tip t091 smo določili pri devetih izolatih MSSA bolnikov z bakteriemijo in je predstavljal 16,7 % vseh tipiziranih izolatov. Bolniki s tem spa tipom so bili iz sedmih bolnišnic, kar kaže na razširjenost po celi Sloveniji. Spa tip t091, ki z metodo MLST spada v sekvenčni tip (sequence type) ST-7, je precej razširjen po Evropi, vključno v naših sosednjih državah Avstriji in Italiji (16). Glede na podatkovno bazo v Ridom spaserver, kjer so vnešeni spa tipi S. aureus iz različnih kužnin iz večinoma evropskih držav, je od vseh 4231 dosedaj vnešenih spa tipov ta spa tip na 15. mestu najpogosteje izoliranih spa tipov (16). Frekvenca vnosa tega spa tipa v Ridom spaserver je 1,06 % vseh spa tipov (16). Drugi najpogostejši spa tip med izolati MSSA je bil t015, ki mu je pripadalo pet izolatov v treh bolnišnicah, kar je 9,3 % vseh izolatov S. aureus tipiziranih v naši raziskavi. Tudi ta spa tip (ST-45) je zelo razširjen po Evropi in je hkrati tudi 10. najpogosteje izolirani spa tip (frekvenca v Ridom spaserver je 1,30 %). Prisoten je v vseh naših sosednjih državah (16).
Spa tip t005 (ST-22, 23, 60), ki so mu pripadali trije izolati MSSA iz treh bolnišnic (5,6 % vseh S. aureus), so po podatkih Ridom spaserver izolirali med našimi sosednjimi državami samo v Italiji (16). Ta spa tip ima frekvenco izolacije v Evropi 0,76 %. Štiriindvajset izolatov MSSA (53 %) pa je spadalo v sporadične spa tipe. Med njimi smo dokazali dva nova, še neopisana spa tipa in ju dodali v podatkovno bazo Ridom spaserver kot t2829 in t2830. Heterogenost sevov MSSA izoliranih iz hemokultur v Sloveniji je primerljiva z rezultati tipizacije spa MSSA iz objav (15).
Med izolati MRSA je prevladoval spa tip t041, ki mu je pripadalo sedem izolatov iz treh bolnišnic. V eni bolnišnici smo dokazali izolat MRSA spa tipa t003, v eni pa izolat spa tipa t001. Vsi ti trije spa tipi spadajo, glede na podatkovno bazo Ridom spaserver, v klonalni kompleks CC5, kar pomeni, da imajo skupnega prednika (14).
Spa tip t001 so pri izolatih MRSA iz različnih kužnin iz Slovenije iz obdobja 1981 -1998 dokazali že Cookson in sod. (3). Z MLST so določili, da spada v ST-228 in z določanjem tipa genskega elementa SCCmec, da je nosilec SCCmec I. V ta klon (ST-228-MRSA-I), znan kot južnonemški epidemični klon MRSA, so uvrščeni tudi spa tipi t041, t023, t188, t201 (5). V Evropi je zelo razširjen, tudi v vseh naših sosednjih državah (16). Spa tip t001 je osmi najpogosteje izolirani spa tip v Evropi (frekvenca izolacije v podatkovni bazi Ridom spaserver je 1,94 %), spa tip t041 pa je nekoliko manj pogost (frekvenca izolacije med vsemi S. aureus je 0,78 %) (16).
Cvitković Špik V. et al. Genetska opredelitev za meticilin občutljivih in proti meticilinu odpornih sevov
83
Cookson in sod. (3) spa tipa t003 med slovenskimi izolati niso našli, zato bi lahko le ugibali, v kateri klon sodi (Rhine Hesse MRSA, EMRSA-3 ali klon New York). Glede na Ridom spaserver je t003 najpogosteje izoliran spa tip s frekvenco izolacije 13,45 % (16). V naši okolici je opisan tudi v Avstriji in na Hrvaškem. Tudi v raziskavi Strommengerjeve s sod. je spadalo med 1176 tipiziranimi izolati MRSA več kot 50 % v samo dva spa tipa, t032 in t003 (15), kar je posledica klonalnega širjenja MRSA. V naši študiji zaradi premajhnega vzorca tipiziranih izolatov MRSA ne moremo sklepati o genetski heterogenosti MRSA v celi Sloveniji v daljšem obdobju. Obstajajo lahko namreč še drugi spa tipi MRSA in je zato dejanska heterogenost višja, kot jo prikazujejo naši rezultati. Možno je, vendar redko, da spadajo v isti spa tip izolati MRSA in tudi MSSA. Tak je npr. t008, kamor spadajo MSSA in MRSA sevi (15). V naši raziskavi tega nismo opazili. V raziskavi Strommengerjeve s sod. je bilo med 221 spa tipi pri 1459 izolatih S. aureus takih spa tipov 28 (15).
Zaključek
V Sloveniji so prevladovali med izolati MSSA iz hemokultur v obdobju 6 mesecev spa tipi t091, t015 in t005, ki so med najpogostejšimi spa tipi tudi v naših sosednjih državah in drugod po Evropi. Med izolati MSSA smo dokazali dva nova spa tipa, t2829 in t2830.
Med 9 izolati MRSA iz hemokultur v istem časovnem obdobju smo v več bolnišnicah dokazali spa tip t041 (v sedmih primerih), ki je med najpogostejšimi MRSA spa tipi tudi v drugih evropskih državah. Velika genetska heterogenost MSSA, ki smo jo dobili v tej raziskavi, in podatki iz literature kažejo, da je tipizacija spa primerna za lokalno epidemiologijo MSSA v kratkem in daljšem časovnem obdobju in tudi za epidemiologijo MSSA na širšem geografskem področju. Ta metoda namreč omogoča nedvoumno primerjanje in sledenje posameznih spa tipov tudi izven naših meja z izolati S. aureus v drugih evropskih državah in drugod.
Uporabnosti metode tipizacije spa za lokalno epidemiologijo MRSA v kratkem časovnem obdobju pa nismo uspeli preveriti, ker je bil vzorec premajhen.
Literatura
1. Anon. European Antimicrobial Resistance Surveillance System (EARSS) Annual Report 2006. Pridobljeno 21.08.2008 s spletne strani: http://www.rivm.nl/earss/result/Monitoring_reports/.
2.	Cosgrove SE, Sakoulas G, Perencevich EN, Schwaber MJ, Karchmer AW, Carmeli Y. Comparison of mortality associated with methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus bacteremia: a meta-analysis. Clin Infect Dis 2003; 36: 53-9.
3.	Cookson BD, Robinson DA, Monk AB, Murchan S, Deplano A, de Ryck R, Struelens MJ, Scheel C, Fussing V, Salmenlinna S, Vuopio-Varkila J, Cuny C, Witte W, Tassios PT, Legakis NJ, van Leeuwen W, van Belkum A, Vindel A, Garaizar J, Haeggman S, Olsson-Liljequist B, Ransjo U, Muller-Premru M, Hryniewicz W, Rossney A, O'Connell B, Short BD, Thomas J, O'Hanlon S, Enright MC. Evaluation of molecular typing methods in characterizing a European collection of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains: the HARMONY collection. J Clin Microbiol 2007; 45: 1830-7.
4.	Murchan S, Kaufmann ME, Deplano A, de Ryck R, Struelens M, Zinn CE et al. Harmonization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for epidemiological typing of strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a single approach developed by consensus in 10 European laboratories and its application for tracing the spread of related strains. J Clin Microbiol 2003; 41: 1574-85.
5.	Deurenberg RH, Vink C, Kalenic S, Friederich AW, Bruggeman CA, Stobbering EE. The molecular evolution of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 222-35.
6.	Grmek- Košnik I, Dermota U, Juteršek B. Proti meticilinu odporna bakterija Staphylococcus aureus domačega okolja (CA-MRSA) (Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Zdrav Vestn 2005; 74: 159-65.
7.	Müller-Premru M, Strommenger B, Alikadic N, Witte W, Friedrich AW, Seme K, Švent Kučina N, Smrke D, Spik V, Gubina M. New strains of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Valentine leukocidin causing an outbreak of severe soft tissue infection in a football team. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 848-50.
8.	Berglund C, Prevost G, Laventie BJ, Keller D, Söderquist B. The genes for Panton Valentine leukocidin (PVL) are conserved in diverse lines of methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus. Microbes Infect 2008; 10: 878-84.
9.	Frenay HME, Bunschoten AE, Schouls LM, van Leeuwen WJ, Vandenbroucke- Grauls CM, Verhoef J et al. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphism. Eur J Clin Microbiol Inf Dis 1996; 15: 60-4.
10.	Shopsin B, Gomez M, Montgomery SO, Smith DH, Waddington M, Dodge DE et al. Evaluation of protein A gene polymorphic region DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 1999; 37: 3556-63.
11.	Harmsen D, Claus H, Witte W, Rothgaenger J, Claus H, Turnwald D, Vogel U. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol 2003; 41: 5442-8.
12.	Faria NA, Carrico JA, Oliveira DC, Ramirez M, de Lencastre H. Analysis of typing methods for epidemiological surveillance of both methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol. 2008; 46: 136-44.
13.	Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, SprattBG. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2000; 38: 1008-15.
14.	Enright MC, Robinson DA, Rundle G, Feil EJ, Grundmann H, Spratt BG. The evolutionary history of methicillin-resistant
84
Zdrav Var 2009; 48: 114-121
Staphylococcus aureus. Proc Natl Acad Sci USA2002; 99: 7687- 92.
15. Strommenger B, Braulke C, Heuck D, Schmidt C, Pasemann B, Nübel U, Witte W. spa typing of Staphylococcus aureus as
a frontline tool in epidemiological typing., J Clin Microbiol 2008; 46:574-81.
16. Ridom spaserver Database. Pridobljeno 25.08.2008. s spletne strani: http://www.ridom.de/spaserver/.