Structure-based design, synthesis and biological evaluation of novel O-ß-N-acetylglucosaminyltransferase inhibitors - Loi, Elena Maria (visokošolska dela, 2023)
Na tisoče jedrskih in citosolnih proteinov je podvrženo posttranslacijski modifikaciji na serinskih ali treoninskih ostankih z O-ß-N-acetilglukozaminom (O-GlcNAc). Ta edinstvena vrsta glikozilacije, znana kot O-GlcNAciliranje, ne povzroči pripenjanja kompleksnih glikanov, ampak gre za ciklično pripenjanje in odstranjevanje monosaharidnega ostanka (GlcNAc), kar katalizirata dva encima: O-GlcNAc transferaza (OGT) in O-GlcNAcaza (OGA). Delovanje obeh encimov je prepleteno s fosforilacijo na istih aminokislinskih ostankih in uravnava široko paleto bioloških procesov, vključno z izražanjem genov, napredovanjem celičnega cikla, epigenetiko in odzivom na stres. O-GlcNAciliranje je tako ključnega pomena pri vzdrževanju celične homeostaze, njena disregulacija pa je povezana s hudimi človeškimi patološkimi stanji, kot so rak, sladkorna bolezen ter kardiovaskularne in nevrodegenerativne bolezni. To nakazuje, da sta encima OGT in OGA potencialni tarči za zdravljenje omenjenih bolezni. Na primer, povečanje ravni O-GlcNAciliranja in izražanja OGT je mogoče opaziti pri številnih vrstah raka pri ljudeh, saj so različne študije pokazale, da zaviranje OGT zmanjša proliferacijo rakavih celic. Čeprav so razpoložljivi podatki o OGT kot potencialni tarči za zdravilne učinkovine obetavni, še zdaleč ne razumemo natančne vloge O-GlcNAciliranja v patogenezi tumorjev in drugih stanj. Ena od glavnih ovir pri preučevanju te posttranslacijske modifikacije je omejena razpoložljivost močnih in celično prepustnih zaviralcev OGT. Večino zaviralcev so načrtovali na osnovi substrata glikozil-donorja uridin difosfat N-acetilglukozamina (UDP-GlcNAc) ali stranskega produkta encimske reakcije UDP, zato običajno slednji niso celično prepustni niti selektivni za OGT. Šele v zadnjih letih je bila razvita prva serija močnih zaviralcev OGT z majhnimi molekulami, znanih kot OSMI, vendar spojine niso primerne za študije in vivo, saj so v esterski obliki nestabilne v plazmi in celicah z izraženimi esterazami. V okviru te disertacije smo se osredotočili na zapolnitev te vrzeli z načrtovanjem presnovno stabilnih zaviralcev OGT za preučevanje vloge OGT v različnih bioloških sistemih. Uporabili smo štiri različne strategije za oblikovanje novih zaviralcev OGT. Začeli smo z razvojem dveh novih knjižnic fragmentom-podobnih zaviralcev z 2-hidroksikinolinom kot osnovnim ogrodjem, ki posnema uridin pri interakcijah z vezavnim mestom. Spojine so bile učinkoviti zaviralci OGT in vitro pri mikromolarnih koncentracijah, najboljši zadetek pa je pokazal vrednost IC50 13 µM. Potencialne zaviralce OGT smo testirali z dvema različnima biokemičnima testoma, pri čemer smo ugotovili, da je potrebna posebna previdnost pri preskušanju mimetikov UDP s komercialnim testom UDP Glo?, saj ta lahko generira lažno pozitivne rezultate. Naš drugi pristop je temeljil na virtualnem rešetanju obsežne knjižnice spojin podobnih učinkovinam. To nam je omogočilo identifikacijo novih kemotipov, ki posnemajo uridin, in izbiro najbolj obetavnih komercialno dostopnih zadetkov za testiranja in vitro. Najmočnejši odkriti zaviralci OGT so zavirali encim pri nizkih mikromolarnih koncentracijah, najboljši zadetek pa je pokazal vrednost IC50 7 µM, kar ga uvršča med najmočnejše zaviralce OGT. Na osnovi tega zadetka smo načrtovali in pripravili ožjo knjižnico spojin, da bi preučili odnos med strukturo in delovanjem te serije. Najmočnejši zadetek iz te serije spojin je bil testiran tudi v celičnih testih, vendar žal ni bil aktiven pri uporabljenih mikromolarnih koncentracijah. Med potekom našega projekta so S. Walker in sodelavci objavili prve nanomolarne zaviralce OGT, zato smo se odločili ponovno sintetizirati najmočnejšega med njimi (OSMI-4) in ga uporabiti za preučevanje O-GlcNAciliranja v različnih človeških rakavih celičnih linijah. Naši rezultati so pokazali, da se presnovna stabilnost spojine razlikuje med celičnimi linijami in bi jo lahko izboljšali z zamenjavo labilnega etilnega estra v strukturi zaviralca s stabilnejšimi funkcionalnimi skupinami. Zato smo oblikovali in sintetizirali knjižnico derivatov OSMI-4 z amidnimi in aminskimi strukturami ter dokazali, da zamenjava estra ne vpliva bistveno na zaviralno jakost spojine. Medtem ko celično prepustnost molekul še preiskujemo, se je njihova stabilnost na hidrolizo s plazemskimi esterazami močno izboljšala. Zato verjamemo, da bomo s to strategijo razvili prve zaviralce OGT primerne za študije in vivo. Nazadnje smo predstavili nov žep v bližini aktivnega mesta OGT. Žep obdaja Asp554 s prostim karboksilatom, za katerega se domneva, da je vključen v encimsko katalizo, zato bi ta žep lahko uporabili za načrtovanje novih zaviralcev OGT. Naš pristop je bil sestavljen iz oblikovanja majhne serije fragmentov z uporabo različnih računalniških orodij, čemur je sledila njihova sinteza in in vitro testiranje. En fragment je pokazal obetavne rezultate z zaviranjem encima z vrednostjo IC50 1,4 mM. Ker pa je treba vezavno mesto teh spojin še eksperimentalno potrditi, je treba pridobiti rentgenske kristalografske podatke kompleksa ligand-protein, da bi na osnovi tega oblikovali močnejše zaviralce OGT.
Keywords: Bolezni; Farmacevtska kemija; hidroliza estrov; metabolna stabilnost; OGA; O-GlcNAciliranje; OGT; posttranslacijske modifikacije; računalniško podprto načrtovanje učinkovin; virtualno rešetanje; zaviralci OGT